CN101824479A - 高粱抗丝黑穗病菌3号生理小种的scar标记 - Google Patents

Abstract

高粱抗丝黑穗病菌3号生理小种的SCAR标记，是以对丝黑穗病免疫的7050B、对丝黑穗病高感的Tx622B以及Tx622B/7050B杂交的F₂为试材，采用BSA法，应用RAPD筛选技术对高粱抗丝黑穗病基因进行了分子标记。该发明建立并优化了高粱RAPD反应体系，获得了三个与高粱抗丝黑穗病基因紧密连锁的RAPD标记S18₇₉₉、S336-1₁₄₁₉和S336-2₇₁₆。同时本发明将S18₇₉₉、S336-1₁₄₁₉和S336-2₇₁₆转化为稳定的SCAR标记并用此标记对F₂代及部分高粱抗感品种进行了快速的PCR检测，从抗性品种中找到了分子标记特异谱带，从而建立了高粱抗丝黑穗病菌3号生理小种的SCAR标记快速PCR检测方法，为分子标记辅助育种提供了依据，为实践分子标记辅助育种、缩短育种周期提供了技术保障。

Description

高粱抗丝黑穗病菌3号生理小种的SCAR标记

技术领域

本发明涉及高粱抗丝黑穗病菌3号生理小种的SCAR标记，特别是高粱抗丝黑穗病的RAPD标记以及由该标记转化的SCAR标记，属于生物技术领域。

背景技术

高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)是世界上重要的禾谷类作物之一，主要分布在热带干旱和半干旱地区，温带和寒带地区也有种植。从世界范围看，它仅次于小麦、水稻、玉米、大麦，居第五位。

高粱丝黑穗病(Sphacelotheca reiliana(Kühn)Clinton)是遍布世界的主要高粱病害。高粱丝黑穗病于1868年首先在埃及发现，之后几乎扩散到世界各高粱产区。丝黑穗病在中国各高粱产区也均有发生，其中以东北和华北地区危害最为严重，是影响我国高粱生产发展的主要病害之一。据记载，1933年时东北各地平均发病率为27.3％；1953年时东北南部严重发病区发病率高达60％以上；1977年海城县发生的高粱丝黑穗病害造成减产约1.95万吨；1994年阜新市高粱丝黑穗病大爆发，影响面积5.8万hm2，最高发病率高达80％以上，损失粮食约5.4万吨。

过去采用化学药剂防治既费工、费时、费钱，又产生抗药性，污染环境。因此选用抗丝黑穗病品种是最为有效的途径。要选育出丝黑穗病品种，需对高粱种子资源的丝黑穗病做鉴定，一般采用田间人工接菌复鉴的方法进行，从而确定抗性等级。再以抗丝黑穗病种子为基础，培育出抗丝黑穗病亲本系及其杂交种。这项工作需时长，见效慢。通过高粱抗丝黑穗病基因的分子标记及基因定位的研究对解决高粱抗丝黑穗病抗性，减少生产损失有重要意义。

高粱抗丝黑穗病性状的遗传研究因病菌生理小种的不断分化、变异及互作而变得复杂。但到目前为止，尚无统一的定论。1982年马宜生发现，绝大多数情况下，亲本之一抗病，其杂交种也抗病，抗病对感病为显性。因此，通常认为：大多数高粱品种中，抗病性对感病性是显性，要获得抗病品种，只要一个抗病亲本就行了。但试验中也发现了特殊情况，即：抗病性遗传为隐性。因此，1981年Rosenow和Frederiksen认为，高粱抗丝黑穗病遗传大多为显性，少数为中间类型或隐性。高粱抗丝黑穗病性状由一对或几对主效基因控制，也可能有许多修饰基因在起作用。

而1988年曹如槐等研究发现，高粱对丝黑穗病的抗性遗传方式因品种而异，大体可分为质量性状和数量性状两种遗传方式。具有质量性状遗传特点的抗病性称为小种专化性抗性(垂直抗性)，受主效基因控制；具有数量性状遗传特点的抗病性成为非小种专化性抗性(水平抗性)，受微效多基因控制。1982年马忠良的研究表明，高粱品种资源中有显性的抗病类型材料，也有不完全显性的抗病类型材料。由于显性的抗病材料在正反交中没有明显差异，故选用显性的抗病不育系与恢复系，对杂种一代的抗性具有同等作用；不育系和保持系在抗丝黑穗病方面不会有明显差异。

1992年杨晓光等研究了高粱对丝黑穗病菌3号生理小种的抗性遗传。结果表明：高粱对3号生理小种的抗性遗传可能是由2～3对非等位基因共同控制的，而且它们之间具有某种互作效应，还可能有一些修饰基因在起修饰作用。2005年邹建秋通过研究认为：高粱对丝黑穗病3号生理小种的抗性属于质量性状遗传，F1代抗性为显性，只要亲本之一抗病，F1代即表现抗病；该抗性可能受2对彼此独立的非等位基因影响，并且基因之间存在互作。

植物病虫害抗性的分子标记研究和利用非常活跃并富有成效，许多学者对水稻、小麦、玉米等作物主要农艺性状基因进行识别、定位和分离研究，构建它们的基因图谱，取得了较大的进展(王京兆1995；李立家1998；李松涛1995；黎裕2004；仪治本2007；杨新泉2007)。在高粱方面，2000年Bhattramakki等将高粱的RFLP标记和SSR标记整和在一起，建立了一个含有232个SSR标记的基因图谱，并将这些标记定位于高粱的十条染色体上，含盖1406.3cM的染色体基因组。Catherine S等(1999)利用RFLP方法分析美国高粱对于麦二叉蚜的抗性，得出抗蚜基因至少分布于9个位点，8个连锁群，其中多数是不完全显性的。2003年，李玥莹等利用RAPD标记筛选出在抗、感亲本间具多态性的引物10对并将其中2对转化为SCAR标记。2006年，常金华等用已定位到连锁群上的微卫星标记和分离群体分析法，对抗蚜基因进行了连锁分析，发现1个与抗蚜基因连锁的微卫星标记(SSR标记)，与抗蚜基因的遗传距离为8.7cM。Wu和Huang2007年对抗蚜基因进行SSR标记，118个SSR位点定位于16个连锁群。绘制的SSR位点分布在高粱的10个染色体上，这些SSR位点涵盖10个染色体，图距单位为997.5cM，2010年邹剑秋等发现了2个在抗病品系中稳定出现、可作为高粱抗丝黑穗病菌3号生理小种基因标记应用的SSR标记：Xtxp13和Xtxp145。与抗病基因的重组率分别为9.6％和10.4％，距离抗病基因的遗传图距分别约为9.6cM和10.4cM。

长期以来，作物育种的选择都是依靠表现型进行的，而分子标记辅助选择MMAS(Molecularr Marker-Assisted Selection)，将给传统的育种研究带来深刻变革。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，而将RAPD和SCAR两种标记技术结合起来，以对丝黑穗病免疫的7050B、对丝黑穗病高感的Tx622B以及Tx622B/7050B杂交的F₂为试材，筛选和高粱抗丝黑穗病紧密连锁的分子标记，并获得了三条高粱抗丝黑穗病的DNA特异谱带。

本发明的目的一：应用PCR扩增技术获得了三个与高粱抗丝黑穗病基因紧密连锁的S18₇₉₉、S336-1₁₄₁₉和S336-2₇₁₆标记。

本发明目的二：将RAPD标记转化为稳定性、重复性强的SCAR标记，并用此标记对F₂代及部分高粱抗感品种进行了检测，建立抗感品种筛选的快速鉴定标准，为实践了分子标记辅助育种、缩短育种周期提供了技术保障。

(1)F₂群体的构建：

亲本材料：对丝黑穗病免疫的7050B；对丝黑穗病高感的Tx622B。F₂群体：2006以感病保持系Tx622B为母本，以抗病保持系7050B为父本，经人工去雄有性杂交，得到F₀种子；2007将F₀代种植并自交，得到F₁种子，2008年获得Tx622B/7050B F₂群体。

抗池、感池分别由F₂代96株抗病株叶片及48株感病株叶片提取的DNA混匀而成，制备时每株均取2ng DNA。

高粱丝黑穗病菌粉：高粱丝黑穗病菌3号生理小种菌粉。

(2)确定提取高粱叶片总DNA的最佳方法。即CTAB-II法。

(3)应用PCR扩增仪，建立并优化了高粱RAPD反应体系，获得了稳定高效的RAPD扩增结果。

(4)首次获得了与高粱抗丝黑穗病基因紧密连锁的RAPD标记。应用RAPD技术筛选400个随机引物，其中引物S18₇₉₉、S336-1₁₄₁₉和S336-2₇₁₆与抗丝黑穗病基因紧密连锁。

(5)首次对抗丝黑穗病基因的RAPD标记进行克隆测序。将特异的DNA片段S18₇₉₉、S336-1₁₄₁₉和S336-2₇₁₆回收纯化之后，测序结果表明，三个片段长分别为799bp、1419bp和716。故将这三个标记命名为S18₇₉₉、S336-1₁₄₁₉和S336-2₇₁₆。

(6)首次将抗蚜基因的RAPD标记转化为SCAR标记。对F₂代进行SCAR检测。抗性品种中也得到了S18₇₉₉、S336-1₁₄₁₉和S336-2₇₁₆三条特异谱带，而感性品种中则未见，从而为分子标记辅助育种提供了可靠的依据。

本发明的特点在于：将该标记应用于高粱抗丝黑穗病品种的早期选择，淘汰感丝黑穗病基因型，加快育种进程，节省选育所需的试验用地和成本，具有较大的实用价值。为分子标记辅助育种提供了依据，克服了那些由于表型鉴定困难用通常的方法辅助选择工作量非常巨大的困难，为实践分子标记辅助育种、缩短育种周期提供了技术保障。同时填补高粱抗丝黑穗病基因分子标记辅助选择研究的国、内外空白。

附图说明：

图1为本发明的RAPD引物S18₇₉₉、S336-1₁₄₁₉和S336-2₇₁₆标记扩增抗感丝黑穗病基因组DNA的电泳图谱。

图2是S18₇₉₉的SCAR标记对部分单株的检测结果。

图3是S336-1₁₄₁₉和S 336-2₇₁₆SCAR标记对部分单株的检测结果。

图4是S18₇₉₉的SCAR标记对部分单株的检测结果。

图5是S336-1₁₄₁₉的SCAR标记对部分单株的检测结果。

图6是S336-2₇₁₆的SCAR标记对部分单株的检测结果。

具体实施方式

参照图1，如图所示抗亲(1，3，5，7)，感亲(2，4，6，8)，F₂抗单株(3-7)，F₂感单株(8-12)，Marker(M)。

参照图2，如图所示RP(抗亲)，SP(感亲)，resistant F₂ individuals(F₂抗单株)，susceptible F₂ individuals(F₂感单株)，Marker(M)。

参照图3，如图所示RP(抗亲)，SP(感亲)，resistant F₂ individuals(F₂抗单株)，susceptible F₂ individuals(F₂感单株)，Marker(M)。

参照图4，如图所示抗亲-1，感亲-2，F₂抗单株(3-7)，F₂感单株(8-12)，Marker(M)。

参照图5，如图所示抗亲-1，感亲-2，F₂抗单株(3-7)，F₂感单株(8-12)，Marker(M)。

参照图6，如图所示抗亲-1，感亲-2，F₂抗单株(3-7)，F₂感单株(8-12)，Marker III。

1.材料和方法

1.1试验材料

亲本材料：对丝黑穗病免疫的7050B；对丝黑穗病高感的Tx622B。F₂群体：2006以感病保持系Tx622B为母本，以抗病保持系7050B为父本，经人工去雄有性杂交，得到F₀种子；2007将F₀代种植并自交，得到F₁种子，2008年获得Tx622B/7050B F₂群体。

高粱丝黑穗病菌粉：高粱丝黑穗病菌3号生理小种菌粉。

1.2高粱丝黑穗病鉴定

采用土壤接种法接种丝黑穗病病菌，播种前4～5d，将从上一年的病穗上收集来的丝黑穗病菌3号生理小种厚垣孢子粉与过筛的细土混合成0.6％的菌土(重量比)，用塑料布盖好菌土，防止菌土风干。播种时，亲本材料采用随机区组设计，顺序排列，无重复，2行区，行长4m，行距0.6m，穴播，每穴留双株；杂交组合F₂随机排列，每组合25行，穴播，每穴留双株，每穴用100g菌土覆盖种子，覆土4～5cm镇压，待植株抽穗后调查植株发病情况。

在中国，高粱对丝黑穗病的抗病能力是根据人工接种条件下被鉴定材料的发病率进行划分，具体分级标准如表1所示：

表1高粱品种抗丝黑穗病分级标准

TableCVStandard of sorghum resistance tohead smut

1.3药品、仪器与设备

400条随机引物(S1-S400)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1U/μl Taq酶(Fermantous)；10mmol/L dNTPs，均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。PCR仪：EN 61010-1。紫外透射反射分析仪，型号NT。

1.4实验总体设计

近等基因池的建立→基因组DNA的提取(CTAB法)→RAPD扩增→琼脂糖电泳→电泳谱带分析→数据处理分析→多态性片段的回收、纯化、克隆与鉴定、序列分析→RAPD标记转化为SCAR标记→用于抗性品种鉴定→确定抗感鉴定方法→选育新品种

1.5近等基因池的建立

应用分离群体分组分析法(Bulked Segregation Analysis)即BSA法。将F₂代分为抗池及感池，抗池和感池是分别由F₂代96株抗病株叶片及48株感病株叶片提取DNA混匀而成，制备时每株均取2ngDNA。

1.6RAPD分析

PCR扩增反应系统总体积为25μL，含1倍扩增缓冲液，1.5UTaq酶，50ng的模板DNA，100μmol/L的dNTP，0.2μmol/L引物，上覆矿物油。反应程序为：预变性94℃3min→变性94℃20s，退火38℃30s，延伸72℃1min，循环35次→延伸72℃10min。

用海生工生物工程技术服务公司合成的400条随机引物(S1-S400)，对亲本及抗池、感池4个样品进行分析，如4个样品扩增出的RAPD产物带型相同，则无多态性，而如扩增产物中的带型有差异，则对这些引物进行重复并进行连锁分析。

1.7产物检测

扩增产物在1.4％含0.5μg/mLEB的琼脂糖凝胶中电泳，电压为每厘米3-4伏，电泳结果用紫外透射反射分析仪观察。

1.8连锁分析

当某一引物在鉴定的抗丝黑穗病基因的F₂代抗感分离群体(即抗池及感池)及抗感亲本间选到稳定的多态性片段(RAPD)标记后，取F₂抗、感单株各10株，用筛选到的引物进行分析。如果存在连锁关系进一步扩大群体分析，统计单株的RAPD标记，计算重组率和遗传距离。若RAPD标记与抗病基因紧密连锁，则进行多态性片段回收。

交换型株数＝抗性单株样本群中不含多态性谱带的株数+感性单株样本群中含有多态性谱带的株数。

再通过Mapmaker 3.0计算机软件分析，可将重组率转换为遗传距离即是图距单位(centimorgan，cM)。

1.9多态性片段的回收、纯化、克隆与鉴定

将回收纯化的片段克隆于pMD 18-T Vector载体上。在ABI PRISMTM377XL测序仪上进行测序。

2.0RAPD标记转化为SCAR标记

根据测序结果，从序列两端按引物的要求设计出一对20-24碱基的引物，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

PCR基本反应体系：10×Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl₂ 2.5μl，10mmol/LdNTPs 0.5μl，1U/μl Taq酶0.5μl，10μmol/μl引物0.8μl，DNA模版10ng，用ddwatwe补足25μl。

扩增参数：94℃5min→(94℃变性20s→57℃退火30s→72℃延伸40s)35次循环→72℃延伸10min→4℃保存。

用这对引物检测7050B(抗亲)、Tx622B(感亲)及二者杂交后的F₂抗池、感池和单株，比较其与RAPD分析的一致性和可靠性。

实施例1：与抗丝黑穗病基因连锁的RAPD多态性标记的获得

本发明用400对(S1-S400)RAPD引物对亲本及其F₂代群体进行了标记分析。其中的355对引物扩增出产物，45对未扩增出产物，扩增率为88.7％。其中引物S18在抗亲、感亲及其F₂代群体扩增出一条稳定的差异谱带，根据Maker显示片段大小大在850bp左右，引物S336在抗亲、感亲及其F₂代群体扩增出二条稳定的差异谱带，根据Maker显示片段大小分别是1500bp和700bp左右(见图1)，对这三个差异谱带进行了共分离分析，共分析了144株F₂代个体，其中抗丝黑穗病96株，感丝黑穗病48株，分析结果表明，重组率分别为8.33％、10.4％及12.5％(见图2，3)。

实施实例2：与抗丝黑穗病基因连锁的RAPD标记的回收及测序

将与抗丝黑穗病基因连锁的S18₇₉₉、S336-1₁₄₁₉和S336-2₇₁₆三条多态性片段回收测序，测序结果表明三条差异片段大小分别为799、1419和716，故将这三个标记命名为S18₇₉₉、S336-1₁₄₁₉和S336-2₇₁₆测序结果如下。

A、多态性差异片段S18₇₉₉的测序结果：

1   TCCACAGCAG  TTGTACATCA  GGTTTGCCTT  CGTCTCCAAT  CTCTTAGCAT

51  TTTTCTCCTG  GTTAATTTGA  CTTCTCATTC  GAGATGGGGA  TAACTTTTGT

101 TACTGTATGG  TGCTATAATA  ATTTCATCAT  TTCTGAGCTT  GTTGGTTTCT

151 TTGTGGAACT  ACTGAAATTG  TGTTCACTAA  TTCACTTGAT  AGATTATGCT

201 CTTAATAGAA  ATTCAGCATA  GTGCAGAGTG  TCATTTCACT  ATATTTTGTT

251 ATTTTTAAGT  AATATATGCT  GGAGAGGGTT  GCATCGCTTT  TCCAAGCTGA

301 GACTTAGGTT  TAAGTAAATA  TGGTCCATAT  GGTGTTGGGT  TATCCTATTT

351 GTGTTAGGAA  ACTACAAATT  GACTGCTTGG  TGCTTTTGTT  GAGCTCTGAA

401 GATATTTTCT  GGTAGTATTC  AAGAGTAGCA  TTCAACTTAT  TCTACCCTAT

451 GTTTTATTAG  GAAGCTCTAG  CTGCAGCTTT  TGGAAATGGT  TTATCTACAG  

501 CTTGTGTTGT  CAACATTGGT  GCTCAAGTTA  CACAAGTAGT  TTGTGTTGAG

551 GTAATAACCC  TTGTATTTTT  TTAATTATTG  CATTAATTGC  ATGGAATGCA

601 GGTCTTATTT  TTAGTTCCGG  GAAATCTTTT  CTTGAAACTC  TATTTAGATA

651 TCAACATACC  ATCTTCCCCC  AATGTTTTAC  AGGATGGAGT  AGCTTTGCCA

701 CACACAGCTT  TGGCGCTTCC  ATATGGTGGA  GATGTATGTT  TTCTTGCACA

751 ATAAATTTTC  ATTACTTTTG  TCGTTCTATC  CATATGGCGT  CATTTTCTCA

801 TGTACTATGG  TGTTTTTTTT  TGGCAATTAT  GTACTGCTGT  GGAA

B、多态性差异片段S336-1₁₄₁₉的测序结果

1  TCCCCATCAC CATGCAACAT TAAATTAAAT GCACCCAAAC TCAATTTTTG

51   CAAAATTCAA  GCTTGGAGAA  AACTTTCTAA  GAACATCCCCTACCATGTTG

101  CTATCTTGGT  TATCCCCTGC  ATGGTGCCTA  GTTTCGGAGTGGTGATCTTG

151  TTTTCAAAGG  CCTTTTAAAT  TAAGCGTGGT  GCTTAGGTTAAAATGCCCTC

201  TTAAGTCAAA  TTAGACATGG  TGTCTAGGTT  GATTTTTGAGCCAATAGTAT    

251  GCTATAGTGG  ATGTTGGATA  CTTTGTTGGA  CTAACCCCTTTAGAGAAACT

301  TTCAGAAGTC  AAACTGGGAA  GTCCTGAGAT  GAACTCAGATGGAGAAAGAA

351  GAGATACATG  AACTTCAACA  ACCTCGCATA  AGGAGAACATAGCTTATGGA

401  GAGATCCATG  GAACAAGAAG  ATGAGTGCCA  CAAAACAAGATCTACAATCA

451  AAACAACCAC  TCCATGGAAG  AGGGTGAACA  AATCACCACCAGGCCCCTTC

501  AAGACAAATA  CCATCATGGA  GAAACTCTTA  AGACAATGAAGGGAGCACAA

551  GGACCAACAA  GAATGCCAAG  ATTAGGAGAA  CAAAAAGATGGTGAAAATAA

601  GCCATTCACA  CCAGCTGGGC  AAGAGAAGCT  TCCACAAGGTTGTTCAATAC

651  CATAACCCTT  CAAATGATAA  GGTAAACACC  TTGACGTATATAATCACTAT

701  TTAGAAAGCT  TTTCTCGATC  TTGGTATGCA  CATAAATGAAGAACCAAACA

751  TGTTTAAGTT  GCAACCACAC  TTGATCCAAC  CTGATCAACTTAACGTGTTT

801  AGTTCTTAAA  TCTTTGTTCT  TTGCTTCACT  CTCTTGATCTCACTGTCTTA

851  ACCAAATGAG  CTAAAAATGT  TGCATATTCA  CACTCATGCTCATCTTCTAA

901  TCTTATCACC  CATAAATATC  ACTTTTATCT  TGTTCACCATGCCTAAGATT

951  AGAGAAGAAC  GAACAAAAAT  TTTGGTTCTG  TTTGTGTTTTTCCACCAATA

1001 GAGCCCATGC  AGTTGATCTT  TGCCTTGTCT  TTATGAGCAG  GACACACTTT

1051 GAGCAAAACA  TGGAGATTGT  CAACTCCCAA  ATTCTACATA  TGAAGGTCCT

1101 GAAGCTACAA  GAACACGCAC  ACTGGACAAG  ATGCTGCCAG  CTTCCACAAT

1151 CAATGCTTCA  CATCAAACTG  TTGGACTAAT  GAAGAACATG  GGTGACACCA

1201 TTGCAAGAGG  TGCAGTTGTC  AAGTCTCCAC  CTTTGGGATT  ATACAATGCA

1251 CCTAAGGCCT  TGTTTAGTTC  CCAAAATTTC  AAGTTTTTGG  ATACTATAGC

1301 AATTTCATTT  TTATTTGGCA  AATATTGTCT  AATCATAGAC  TAACTAAGCT

1351 CAAAAGATTC  ATCTCACGAT  TTACAGGCGA  ACTATGAAAT  TAGTTTTTTT

1401 ATTTTTATCT  ATATTTAATG  CTCCATGCAT  GTGCCGCAAG  ATTCGATGTG

1451 ATGGGGAA

C、多态性差异片段S336-2₇₁₆的测序结果

1   TCCCCATCAC  ATCGAATGTT  GCGGCACATG  CATGGTGCAT  TAAATATACA

51  TGAAAACAAA  AAACTAATTG  CACAGTTCAT  CTATAAAATT  ACTACAATTT

101 TGATCTTGTC  TCACTCACCA  AGGAAGTATT  TTTTCTCTCA  GATTTTTTGT

151 ACTTATTATG  TTTTCTTATC  TATGCATCTT  AATTATTTTG  AACAGGCGCT

201 GCCGCTCCTT  AAGAAATTGG  TGGTGCAATC  GTCTTGGTCG  TTTAGGACAG  

251 GTGTGTCTCC  TTTTGAACAT  GTGTTCTGCT  GCTATGCACA  AGAAAATTGA

301 TAGGATCCGT  TGTAAAATTC  TAATATCTAA  TACATACTCT  CTCTCTCTTC

351 TAAATTCGAA  GATGTTTTGG  CATTTCAACA  TATGTAGCTT  TTGTTGTACA

401 CTTAGGTTTA  TGCTATACTT  AGGTACATAG  TAAAAGCAAT  GTGTCTAGAA

451 ATCCAGCAGC  TAGGGATAGC  AGGAGAGGCC  ATGCTGACTG  GTGGATGCCA

501 GAGCAGCGGA  GATGGGCTGC  GTTGGTAGTC  AAGAGTACGG  TCCACACCAG

551 CCGGTAGGAG  CACGGATCCA  CTGCTCTCCA  GATCTGCCAT  TGGGGGTGCG

601 GATCCGCTGC  TCCGCAGTTG  GGCTCGCTGG  ATCCACCACT  CGCTACCTGT

651 TGCCTGCTCG  GGGATGGGGC  TCGGCAGATC  GCCCCTGCCA  GCTGCCTGCT

701 TGGGCTGGGG  CTCACCAGAT  CTGCTGCTGC  CAGTTGTCTA  CTTGTGATGG

751 GGAA

实施实例3：RAPD标记转化为SCAR标记

根据特异片段S18₇₉₉、S336-1₁₄₁₉和S336-2₇₁₆两端序列和引物设计原则(避免发夹结构，适当的G+C含量)，在序列两端设计了三对特异性引物(引物序列见下表1)，用这三对引物检测7050B(抗亲)、Tx622B(感亲)及二者杂交后的F₂抗池、感池和单株，结果表明SCAR标记和抗丝黑穗病基因的RAPD标记的连锁性完全一致，PCR产物只为一条799bp、1419bp和716bp的条带，易于区分。这样就顺利地将RAPD标记转化为了稳定性重复性很好的SCAR标记(见图4、5、6)。

表1SCAR引物序列

Table 1 primer sequence of SCAR

上述RAPD是Random Amplified Polymorphic DNA的缩写；

上述SCAR是Sequence-Characterized Amplified Regions的缩写。

Claims (3)

1.高粱抗丝黑穗病菌3号生理小种的SCAR标记，其特征在于该SCAR标记具有S18₇₉₉、S336-1₁₄₁₉和S336-2₇₁₆所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的高粱抗丝黑穗病菌3号生理小种的SCAR标记，其特征在于所设计的三对引物S18₇₉₉F、S18₇₉₉R；S336-1₁₄₁₉F、S336-1₁₄₁₉R；S336-2₇₁₆F、S336-2₇₁₆R的核苷酸序列为：

S18₇₉₉F：5’-TCCACAGCAGTTGTACATCAG-3’

S18₇₉₉R：5’-TTCCACAGCAGTACATAATTGCC-3’

S336-1₁₄₁₉F：5’-TCCCCATCACCATGCAAC-3’

S336-1₁₄₁₉R：5’-TTCCCCATCACATCGAATC-3’

S336-2₇₁₆F：5’-TCCCCATCACATCGAATG-3’

S336-2₇₁₆R：5’-TTCCCCATCACAAGTAGACAAC-3’

3.如权利要求1所述的高粱抗丝黑穗病菌3号生理小种的SCAR标记，其特征在于：高粱抗丝黑穗病的快速PCR检测方法，PCR反应体系中含有权利要求2所述的三对引物S18₇₉₉F、S18₇₉₉R；S336-1₁₄₁₉F、S336-1₁₄₁₉R；S336-2₇₁₆F、S336-2₇₁₆R的核苷酸序列。

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