CN114032235B - Ssr标记、引物对及其应用和陆地棉早熟分子育种相关ssr标记位点的筛选方法 - Google Patents

Ssr标记、引物对及其应用和陆地棉早熟分子育种相关ssr标记位点的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了SSR标记、引物对及其应用和陆地棉早熟分子育种相关SSR标记位点的筛选方法。以中晚熟棉花品种鲁棉研37号为母本，以早熟棉花品种鲁棉研19号为父本，杂交1代，再自交1代获得F2，在F2群体中选择1/8的早熟株系和1/8的晚熟株系，种植F3，自交获得F4利用F2群体进行棉花早熟性状相关SSR标记位点的第一次鉴定，卡方分析初步确定受苗蕾期性状选择有效的陆地棉早熟分子育种相关SSR标记。利用F4群体进行早熟相关SSR标记位点的第二次鉴定，卡方分析最终确定受苗蕾期性状选择有效的陆地棉早熟分子育种相关SSR标记。本发明的有益效果是为陆地棉早熟分子育种分子标记位点。

Description

SSR标记、引物对及其应用和陆地棉早熟分子育种相关SSR标 记位点的筛选方法
本申请是申请日为2017年12月13日、申请号为201711328014.6、发明名称为《一种陆地棉早熟分子育种相关SSR标记位点的鉴定方法》的分案申请。
技术领域
本发明属于作物育种技术领域，涉及SSR标记、引物对及其应用和陆地棉早熟分子育种相关SSR标记位点的筛选方法。
背景技术
棉花早熟性是一个优良的综合性状，主要包括全生育期、苗期、蕾期、花铃期、第一果枝位和霜前花率等性状，但这些性状都是数量性状，受多个数量性状基因位点的控制，遗传机理复杂且易受环境因素影响；传统育种方法主要依赖育种家的经验，对早熟性相关性状很难准确把握，因此传统育种方法缺乏预见性，效率低。
棉花早熟性是数量性状，传统的遗传学分析方法很难准确跟踪定位目标基因在杂交后代中的流向，分子标记技术的发展为数量性状的研究提供了有效工具。连锁分析与关联分析是目前研究植物数量性状基因型的主要方法，利用连锁分析已经定位了生育期、苗期、蕾期、花铃期、第一果枝位、第一果枝位高度和霜前花率等与陆地棉早熟性状相关的QTL(Li C,Wang X,Na D,et al.QTL analysis for early-maturing traits in cottonusing two upland cotton(Gossypiumhirsutum L.)crosses[J].Breeding Science,2013,63(2):154-163.)，但QTL作图亲本不是生产上推广面积较大的生产品种，而且QTL作图分析无法检测到构建作图群体亲本中都存在但没有差异的等位基因，而且定位到的QTL具有较强的“群体专一性”，因此基于连锁分析的QTL作图分析研究成果难以直接应用于棉花品种早熟性状的遗传改良。利用连锁分析已得到了与陆地棉早熟相关性状显著关联的3个SSR位点，其中CER0098-400与全生育期显著关联，DPL0375-250和HAU2414-147与果枝始节位显著关联(梁冰等，陆地棉农艺性状与SSR(Simple Sequence Repeats)标记的关联分析，棉花学报，26(5)：387-395)，但是，多年来并未发现利用获得的棉花早熟性相关性状显著关联的分子标记位点指导棉花早熟育种的详细报道，这是因为利用关联分析获得的陆地棉早熟性相关分子标记位点未验证其是否与棉花早熟性目标性状紧密连锁，而且这些分子标记关联的目标性状在早熟育种方面不利于指导辅助选择。
“遗传搭车”(genetic hitch-hiking)效应是指当群体中发生对选择相关的等位基因替代时，由于选择压力的作用，与选择目标有利的基因及其连锁位点的等位基因频率上升，而不利的基因及其连锁位点的等位基因频率下降，理论上那些与目标性状无关的基因位点不会受定向选择的影响，在分离群体中仍符合孟德尔分离规律。基于该原理，可利用陆地棉早熟育种选择群体逆向鉴定陆地棉早熟相关性状的紧密连锁分子标记位点，真正实现分子标记辅助选择在陆地棉早熟育种实践中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种陆地棉早熟分子育种相关SSR标记位点的鉴定方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
本发明提供了SSR标记在陆地棉早熟分子育种中的应用，所述SSR标记包括DPL0354、CGR6185和DPL0041；所述DPL0041和CGR6185可在低世代用于指导棉花早熟育种；所述DPL0354可在高世代用于指导棉花早熟育种；
所述DPL0354为DPL0354引物对扩增得到；所述DPL0354引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述CGR6185为CGR6185引物对扩增得到；所述CGR6185引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述DPL0041为DPL0041引物对扩增得到；所述DPL0041引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明提供了一种检测上述技术方案中所述应用中的SSR标记位点的引物对，所述引物对包括DPL0354引物对、CGR6185引物对和DPL0041引物对；
所述DPL0354引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述CGR6185引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述DPL0041引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明提供了上述技术方案所述引物对在制备检测陆地棉早熟分子育种相关SSR标记位点试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供了一种检测陆地棉早熟分子育种相关SSR标记位点的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述技术方案所述引物对。
优选的，所述试剂或试剂盒还包括DNA模板、dNTPMix、10×PCR Buffer和Taq DNA聚合酶。
本发明提供了上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述试剂或试剂盒在陆地棉早熟分子育种中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述试剂或试剂盒在检测陆地棉早熟分子育种相关SSR标记位点中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述试剂或试剂盒在检测陆地棉早开花性状中的应用。
本发明提供了一种陆地棉早熟分子育种相关SSR标记位点的筛选方法，其特征在于按照以下步骤进行：
1)以中晚熟棉花品种鲁棉研37号为母本，以早熟棉花品种鲁棉研19号为父本，杂交1代，再自交1代获得F2，F2代按单株收获；依据苗蕾期性状，在F2群体中选择1/8的早熟株系和1/8的晚熟株系，种植F3，自交获得F4，每代都是混收混种；
2)利用F2群体进行早熟相关SSR标记位点的第一次鉴定：F2种植，应用CTAB法提取DNA，结合陆地棉早熟性的连锁分析和关联分析研究结果，选择已鉴定到的棉花早熟性相关SSR引物进行PCR扩增，然后对单个SSR标记进行独立性测验，在进行SSR分子标记基因型分析时，将亲本鲁棉研37号的带型记为1，将亲本鲁棉研19号的带型记为2，两个亲本的互补带型记为3；依据苗蕾期性状对F2群体进行选择处理，在F2群体中选择1/6的早熟单株个体构建F2代棉花早熟性定向选择群体；最后进行卡方分析，初步确定受苗蕾期性状选择有效的陆地棉早熟分子育种相关SSR标记；
3)利用构建的F4群体进行早熟相关SSR标记位点的第二次鉴定：F4种植，每株提取DNA后，再利用早熟性相关SSR引物确定F4单株的基因型，依据苗蕾期性状对F4群体进行选择处理，在F4群体中选择1/3的早熟单株个体构建F4代棉花早熟性定向选择群体，然后对单个SSR标记进行独立性测验，最后进行卡方分析，最终确定受苗蕾期性状选择有效的陆地棉早熟分子育种相关SSR标记。
优选的，所述苗蕾期为SSP从播种到棉花开花的天数。
本发明提供了一种陆地棉早熟分子育种相关SSR标记位点的鉴定方法，按照以下步骤进行：
1)以中晚熟棉花品种鲁棉研37号为母本，以早熟棉花品种鲁棉研19号为父本，杂交1代，再自交1代获得F2，F2代按单株收获；依据苗蕾期性状，在F2群体中选择约1/8的早熟株系和约1/8的晚熟株系，种植F3，自交获得F4，每代都是混收混种；
2)利用F2群体进行早熟相关SSR标记位点的第一次鉴定：F2种植，应用CTAB法提取DNA，结合陆地棉早熟性的连锁分析和关联分析研究结果，选择已鉴定到的棉花早熟性相关SSR引物进行PCR扩增。然后对单个SSR标记进行独立性测验，如表1所示，在进行SSR分子标记基因型分析时，将亲本鲁棉研37号的带型记为“1”，将亲本鲁棉研19号的带型记为“2”，两个亲本的互补带型记为“3”；依据苗蕾期性状对F2群体进行选择处理，在F2群体中选择约1/6的早熟单株个体构建F2代棉花早熟性定向选择群体。
表1独立性测验的一般形式为：
最后进行卡方分析，初步确定受苗蕾期性状选择有效的陆地棉早熟分子育种相关SSR标记。
3)利用F4群体进行早熟相关SSR标记位点的第二次鉴定：F4种植，每株提取DNA后，再利用早熟性相关SSR引物确定F4单株的基因型，依据苗蕾期性状对F4群体进行选择处理，在F4群体中选择约1/3的早熟单株个体构建F4代棉花早熟性定向选择群体。然后对单个SSR标记进行独立性测验，如表2所示；
表2独立性测验的一般形式为：
最后进行卡方分析，最终确定受苗蕾期性状选择有效的陆地棉早熟分子育种相关SSR标记。
优选的，所述苗蕾期为SSP从播种到棉花开花的天数。
本发明的有益效果是为陆地棉早熟分子育种提供了可靠的分子标记位点支持，获得能应用于指导棉花早熟育种实践的SSR分子标记提供了有效的鉴定方法。
附图说明
图1为利用早熟性定向选择群体鉴定陆地棉早熟分子育种相关SSR标记位点。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1选择亲本
山东棉花研究中心以中晚熟常规抗虫棉品种鲁棉研37号为母本，抗虫短季棉鲁棉研19号为父本，分别构建F2群体和F4群体，依据苗蕾期(SSP，从播种到棉花开花的天数)性状分别对F2群体和F4群体的早熟单株进行鉴定选择。亲本鲁棉研37号是以鲁棉研16号转Bt基因常规抗虫棉选系鲁S6145为父本，中早熟优良品系鲁9136为母本杂交并选育出的转基因中晚熟抗虫棉新品种，具有株型紧凑，叶片肥大，茎秆坚韧，抗逆能力强等特点；亲本鲁棉研19号是以泗棉3号转Bt基因常规抗虫棉选系鲁55系为父本，短季棉鲁458系为母本杂交选育出的转基因短季抗虫棉新品种，具有早熟性好、衣分高等特点。
实施例2
(1)2014年在山东棉花研究中心临清试验站分别种植鲁棉研37号和鲁棉研19号各1行，鲁棉研37号为母本，鲁棉研19号为父本配制杂交组合产生F1，成熟后混收，于当年冬在海南三亚种植2行F1，自交获得F2，F2代按单株收获，依据苗蕾期(SSP，从播种到棉花开花的天数)性状，在F2群体中选择约1/8的早熟株系和约1/8的晚熟株系，种植F3，自交获得F4，每代都是混收混种。田间管理按常规方法进行。
(2)构建早熟性定向选择群体：2015年在山东棉花研究中心临清试验站种植20行F2，每行22-26株，获得包含477个单株个体的F2群体，按单株调查F2群体的苗蕾期(SSP，从播种到棉花开花的天数)性状，依据苗蕾期性状数据在F2群体中选择约1/6的早熟单株个体构建F2代棉花早熟性定向选择群体。
2016年在山东棉花研究中心临清试验站种植20行F4，每行20-24株，获得包含445个单株个体的F4群体，按单株调查F4群体的苗蕾期(SSP，从播种到棉花开花的天数)性状，依据苗蕾期性状数据在F4群体中选择约1/3的早熟单株个体构建F4代棉花早熟性定向选择群体。
(3)鉴定分子标记基因型：在F2和F4群体中，每株采集1片刚展开的叶片放入2.0mLEppendorf管中，依次加入钢珠和700μL提取缓冲液(0.35MGlucose，0.1M Tris-HCl(pH8.0)，5mM Na-EDTA(pH8.0)，2％PVP，1％(V/V)β-Me)，利用组织研磨仪将叶片磨碎。应用CTAB法(PatersonAH,Brubaker CL,Wendel JF.A rapid method for extraction ofcotton(Gossypium spp.)genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis[J].PlantMol Biol Rep,1993,11,2:122-127)提取DNA，采用24对棉花早熟相关SSR标记进行PCR扩增，扩增体系为10μL，DNA模板2μL，SSR正、反向引物(10μmol/L)各0.6μL，10mM dNTPMix 0.2μL，10×PCR Buffer 1μL、5U Taq DNA聚合酶0.1μL，94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸50s，32个循环后；72℃再延伸5min，扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度为8％，电泳缓冲液为1倍TBE，260V恒压电泳至指示剂(二甲苯青)接近胶板的底部时，结束电泳。将与亲本鲁棉研37号相同的带型记为“1”，将与亲本鲁棉研19号相同的带型记为“2”，两个亲本的互补带型记为“3”，最终获得477个F2群体单株和445个F4群体单株在24个SSR标记上的分子标记基因型。
(4)单个SSR标记的独立性测验：
棉花早熟性状选择与否和SSR分子标记有利带型两个变数之间，若相互独立，表示该早熟性状选择和SSR标记有利带型频率高低无关，早熟性状选择对该SSR分子标记有利带型频率无影响；若不相互独立，则表示该早熟性状选择和SSR标记有利带型频率高低有关，早熟性状选择对该SSR分子标记有利带型频率有影响。应用X2进行独立性测验的无效假设是：H0两个变数相互独立，HA为两个变数彼此相关。当X2＜X2 0.05,1时，便接受H0，即两个变数相互独立；当X2≥X2 0.05,1时，便否定H0，接受HA，即两个变数相关。如表3所示为单个SSR标记基因型独立性测验的一般形式。
表3:单个SSR标记基因型独立性测验的一般形式
根据早熟性定向选择群体的SSR分子标记基因型和相对应的未进行选择群体的SSR分子标记基因型数据，通过以下公式计算单个SSR标记位点的卡方值：
早熟单株选择群体中带型为“2”的理论单株数：E11＝R1×C1/N；
早熟单株选择群体中带型不是“2”的理论单株数：E12＝R1×C2/N；
未选择群体中带型为“2”的理论单株数：E21＝R2×C1/N；
未选择群体中带型不是“2”的理论单株数：E22＝R2×C2/N；
X2＝(∣a11-E11∣-0.5)2/E11+(∣a12-E12∣-0.5)2/E12+(∣a21-E21∣-0.5)2/E21+(∣a22-E22∣-0.5)2/E22；
根据卡方值判定单个SSR标记位点与早熟性状选择是否显著相关：
X2 0.05,1＝3.84，X2 0.01,1＝6.63；
当X2≥X2 0.05,1＝3.84时，P＜0.05，否定H0，接受HA。表明SSR标记早熟有利基因型的选择与否和相应早熟性状的选择显著相关，即利用SSR标记早熟有利基因型判定棉花早熟相关性状有显著效果。
(5)由本发明鉴定得到3个与棉花苗蕾期性状显著相关的SSR标记CGR6185、DPL0041和DPL0354。SSR标记DPL0041在F2和F4群体中的卡方值分别为18.64和11.48(X2 0.01,1＝6.63)，SSR标记CGR6185在F2和F4群体中的卡方值分别为15.47和13.22(X2 0.01,1＝6.63)，因此SSR标记DPL0041和CGR6185可以在低代指导棉花早熟育种；SSR标记DPL0354在F2和F4群体中的卡方值分别为0.79和5.44(X2 0.05,1＝3.84)，因此该标记适合在高代指导棉花早熟育种。
本发明优点还在于利用本发明方法获得的SSR分子标记克服了采用连锁分析和关联分析获得的陆地棉早熟性相关分子标记位点指导棉花早熟育种效果差的缺陷。本发明创新的鉴定方法依据育种选择群体，结合苗蕾期早熟性状选择逆向鉴定分子标记位点，因此该方法鉴定得到分子标记可直接应用于早熟育种实践；此外本发明还鉴定得到3个与陆地棉早开花性状显著相关的SSR标记(CGR6185、DPL0041和DPL0354)，为陆地棉早熟分子育种提供了可靠的分子标记位点支持。
由上述记载的可知，本发明以中晚熟棉花品种鲁棉研37号为母本，以早熟棉花品种鲁棉研19号为父本，杂交1代，再自交1代获得F2，在F2群体中选择1/8的早熟株系和1/8的晚熟株系，种植F3，自交获得F4。结合育种分离群体，采用独立性测验的方法探求SSR分子标记基因型和棉花苗蕾期早熟性状间的相关性，进而确定能应用于指导棉花早熟育种实践的SSR分子标记。首先利用F2群体进行棉花早熟性状相关SSR标记位点的第一次鉴定，明确F2代早熟定向选择群体的单株个数至少达到F2群体总个数的1/6，通过卡方分析初步确定受苗蕾期性状选择有效的陆地棉早熟分子育种相关SSR标记。最后利用简化构建的F4群体进行早熟相关SSR标记位点的第二次鉴定，明确F4代早熟定向选择群体的单株个数至少达到该F4群体总个数的1/3，通过卡方分析最终确定受苗蕾期性状选择有效的陆地棉早熟分子育种相关SSR标记。本发明的有益效果是为获得能应用于指导棉花早熟育种实践的SSR分子标记提供了有效的鉴定方法此外还获得了3个可靠的陆地棉早熟分子育种相关SSR分子标记位点。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 山东棉花研究中心
<120> SSR标记、引物对及其应用和陆地棉早熟分子育种相关SSR标记位点的筛选方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tagtggtggt taagaagaag gtgg 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgcttcagt ctttgcttta acta 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaatgatag tgccaccaaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggtagggaa ttagaactta 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcatcatatc atgtcccatt acac 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggagagagt gtagtatgtt tggg 24

Claims (6)

1.SSR标记在陆地棉苗蕾期缩短性状选育中的应用，其特征在于，所述SSR标记为DPL0041、CGR6185或DPL0354；所述DPL0041和CGR6185可在低世代用于指导棉花早熟育种；所述DPL0354可在高世代用于指导棉花早熟育种；
所述DPL0354为DPL0354引物对扩增得到；所述DPL0354引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述CGR6185为CGR6185引物对扩增得到；所述CGR6185引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述DPL0041为DPL0041引物对扩增得到；所述DPL0041引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
2.DPL0354引物对、CGR6185引物对或DPL0041引物对在制备检测陆地棉苗蕾期缩短性状选育相关SSR标记位点试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述DPL0354引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述CGR6185引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述DPL0041引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
3.DPL0354引物对、CGR6185引物对或DPL0041引物对在陆地棉苗蕾期缩短性状选育中的应用，其特征在于，所述DPL0354引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述CGR6185引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述DPL0041引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
4.DPL0354引物对、CGR6185引物对或DPL0041引物对在检测陆地棉苗蕾期缩短性状选育相关SSR标记位点中的应用，其特征在于，所述DPL0354引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述CGR6185引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述DPL0041引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
5.一种陆地棉苗蕾期缩短性状选育相关SSR标记位点的筛选方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
1）以中晚熟棉花品种鲁棉研37号为母本，以早熟棉花品种鲁棉研19号为父本，杂交1代，再自交1代获得F2，F2代按单株收获；依据苗蕾期性状，在F2群体中选择1/8的早熟株系和1/8的晚熟株系，种植F3，自交获得F4，每代都是混收混种；
2）利用F2群体进行早熟相关SSR标记位点的第一次鉴定：F2种植，应用CTAB法提取DNA，结合陆地棉早熟性的连锁分析和关联分析研究结果，选择已鉴定到的棉花早熟性相关SSR引物进行PCR扩增，然后对单个SSR标记进行独立性测验，在进行SSR分子标记基因型分析时，将亲本鲁棉研37号的带型记为1，将亲本鲁棉研19号的带型记为2，两个亲本的互补带型记为3；依据苗蕾期性状对F2群体进行选择处理，在F2群体中选择1/6的早熟单株个体构建F2代棉花早熟性定向选择群体；最后进行卡方分析，初步确定受苗蕾期性状选择有效的陆地棉早熟分子育种相关SSR标记；
3）利用F4群体进行早熟相关SSR标记位点的第二次鉴定：F4种植，每株提取DNA后，再利用早熟性相关SSR引物确定F4单株的基因型，依据苗蕾期性状对F4群体进行选择处理，在F4群体中选择1/3的早熟单株个体构建F4代棉花早熟性定向选择群体，然后对单个SSR标记进行独立性测验，最后进行卡方分析，最终确定受苗蕾期性状选择有效的陆地棉早熟分子育种相关SSR标记；所述SSR标记包括DPL0354、CGR6185和DPL0041。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于：所述苗蕾期为从播种到棉花开花的天数。
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