CN104313016A

CN104313016A - 与棉花黄萎病抗性有关的qtl/主效基因的分子标记

Info

Publication number: CN104313016A
Application number: CN201410506198.0A
Authority: CN
Inventors: 石玉真; 卢全伟; 袁有禄; 李文坦; 李爱国; 葛瑞华; 张保才; 李俊文; 刘爱英; 李骏智; 杨泽茂; 王涛; 龚举武; 商海红; 巩万奎; 陈婷婷
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2014-09-26
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2034-09-26
Also published as: CN108018373A; CN108048594B; CN108018372A; CN108048593B; CN104313016B; CN108018372B; CN108018373B; CN108048593A; CN108048594A

Abstract

本发明公开了一种与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因位点qDI-5-1、qDI-5-2、qDI-5-3、qDI-5-4、qDI-5-5连锁的SSR标记，qDI-5-1、qDI-5-2、qDI-5-3、qDI-5-4、qDI-5-5都位于染色体C5上。利用本发明与棉花黄萎病抗性主效基因位点连锁的SSR标记进行辅助选择可提高棉花黄萎病抗性育种效率。

Description

与棉花黄萎病抗性有关的QTL/主效基因的分子标记

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及到一种来自与高抗黄萎病海岛棉海1的黄萎病抗性QTL/主效基因连锁的SSR(Simple Sequence Repeat，简单重复序列)分子标记，可用于棉花黄萎病抗性的分子标记辅助选择，以提高选择的效率，加快育种步伐。

背景技术

棉花是一种重要的经济作物，提供了世界上大多数的天然纤维。我国是世界上最大的棉花生产和消费国之一，棉花生产在整个国家经济中具有重要的战略地位。选育并种植高产、优质和抗病的棉花品种十分重要。黄萎病是棉花生产中的主要病害之一，分布于世界各主要产棉国家，是造成棉花减产的主要原因，成为世界上威胁棉花生产的灾害性病害。近年来，该病在我国3大棉区连续流行危害，且有逐加重的趋势，对棉花生产造成极大危害(简桂良等，2003)。实践证明，种植抗黄萎病品种是控制该病的根本最有效的方法。但是，我国目前棉花品种的抗性只能到抗至耐病水平(简桂良等，2004；王红梅等，2008)，因此抗萎病仍然是棉花品种选育的重要目标。

海岛棉虽然产量偏低，但大多数高抗黄萎病，而陆地棉产量高，适应性广，但缺乏优异的抗病种质系和亲本材料(肖松华等，2007)。因此挖掘海岛棉的优异抗病基因，把海岛棉优异抗病基因转移到陆地棉背景中，对我国陆地棉抗病育种具有重要的意义。

由于传统育种的整个过程中的选择主要是表型选择，而且表型性状易受环境等外在条件的影响，致使传统育种依据表型选择周期长、成本高、准确性差、选择效率低。近年来，生物技术的发展为作物性状改良提供了新的途径，通过转基因或分子标记辅助选择技术，可以从分子水平上操作目标基因，实现对目标性状的改良(杜春芳等，2005)。大量研究表明在育种过程中借助于分子标记技术手段进行辅助选择，可以有效地提高抗病品种的选育效率，进而加快育种进程。

目前，在棉花中利用分子标记技术已经构建了多张遗传图谱(Shappley et al.1998；Ulloa et al.2002；Ma et al.2008；Zhang et al.2005and 2009；Lin et al.2009；Sun et al.2012；Reinisch et al.1994；Rong et al.2004；Kohel et al.2001；Guo et al.2007；Lacape etal.2009；Park et al.2005；Xiao et al.2009；Yu et al.2011；He et al.2007；Yu et al，2007；Zhang et al，2008；Yu et al.2012；Zhao et al.2012)，定位了大量棉花纤维品质和产量的QTL。在棉花抗黄萎病基因/QTL的定位方面，陆续已有报道(Zhang et al.，2014；Zhao et al.，2014；Fang et al.，2013，2014；Ning et al.，2013；蒋锋等，2009；Yang etal.，2008；杨昶等，2007；葛海燕等，2008；王芙蓉等，2007；房卫平等，2001；高玉千等，2003；杜威世等，2004；Bolek et al.，2005；王红梅等，2005；Wang et al.，2008；甄瑞等，2006)，共计100多个与黄萎病抗性有关的QTL。这些研究为抗病育种提供了有用的信息，但是现有遗传图谱构建的饱和程度不高，生产实践可利用的标记不多，而且QTL的定位多数采用的是F₂世代群体，主要集中在单一世代或单个环境的检测，多环境稳定的QTL少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种来自高抗黄萎病材料海岛棉海1与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因相关的分子标记，即：通过筛选来自高抗黄萎病材料海岛棉海1中与黄萎病抗性主效基因连锁的SSR分子标记，进行DNA水平上的早期标记辅助选择，提高育种效率；并提供一种检测棉花黄萎病抗性的方法及利用上述与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因位点相关的分子标记在棉花辅助育种以提高棉花对棉花黄萎病抗性中的应用。

本发明提供的技术方案是：

根据本发明的与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因位点qDI-5-1、qDI-5-2、qDI-5-3、qDI-5-4或qDI-5-5相关的分子标记，所述分子标记为：与qDI-5-1连锁的标记为DPL0247₁₁₀和CIR224₁₆₀；与qDI-5-2连锁的标记为PGML03048₂₇₀、NAU4034₂₂₀和BNL1042₁₅₀；与qDI-5-3连锁的标记为DPL0063₁₃₀、HAU0746₂₁₀、TMB1296₁₈₀、CGR6708₁₁₀和DPL0724₂₁₀；与qDI-5-4连锁的标记为TMB1120₃₉₀、CGR5590₁₆₀、PGML02063₂₁₀、CGR5025₁₆₀和HAU1712₂₂₀；与qDI-5-5连锁的标记为MGHES6₁₉₀、DPL0838₁₆₀、NAU2494₂₁₀、DPL0138₂₄₀和DPL0241₁₃₀，其中，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下表：

根据本发明的一种检测棉花黄萎病抗性的方法，使用上述SSR标记在与海岛棉海1等有关的育种群体中对黄萎病抗性进行分子标记选择，可提高陆地棉抗性。该方法所用的上述分子标记是与黄萎病抗性QTL/主效基因位点qDI-5-1、qDI-5-2、qDI-5-3、qDI-5-4、qDI-5-5(DI是黄萎病病指的英文单词disease index的缩写。QTL的命名：q+性状名称英文缩写+染色体序号+同一染色体上控制该性状QTL的顺序编号。如：qDI-5-1表示在第5条染色体上控制黄萎病抗性的第1个QTL)相关的分子标记，这5个主效基因位点都位于染色体C5上，都来源于海岛棉海1，都能降低病指，提高陆地棉抗性；对棉花黄萎病抗性的贡献率分别为8.10-10.91％、9.76-13.59％、9.80-13.52％、10.13-16.66％和7.72-11.63％，加性效应分别为2.7-7.0、3.0-10.7、3.0-10.6、3.2-9.5和5.8-6.1cN/tex。

本发明不仅有助于筛选高抗黄萎病材料，为今后海岛棉海1杂交、回交后代及其衍生品系的抗黄萎病育种利用提供了极大的便利，同时也为主效QTL的精细定位及基因克隆奠定基础。

根据本发明的与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因位点相关的分子标记辅助育种以提高陆地棉对黄萎病抗性的方法，使用上述分子标记在与海岛棉海1有关的育种群体中进行分子标记选择，可降低病指2.7-7.0、3.0-10.7、3.0-10.6、3.2-9.5和5.8-6.1cN/tex，提高陆地棉黄萎病抗性。该方法包括以下步骤：

(1)DNA提取，使用与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因位点qDI-5-1、qDI-5-2、qDI-5-3、qDI-5-4或qDI-5-5连锁的分子标记，分别为DPL0247₁₁₀和CIR224₁₆₀；PGML03048₂₇₀、NAU4034₂₂₀和BNL1042₁₅₀；DPL0063₁₃₀、HAU0746₂₁₀、TMB1296₁₈₀、CGR6708₁₁₀和DPL0724₂₁₀；TMB1120₃₉₀、CGR5590₁₆₀、PGML02063₂₁₀、CGR5025₁₆₀和HAU1712₂₂₀；MGHES6₁₉₀、DPL0838₁₆₀、NAU2494₂₁₀、DPL0138₂₄₀和DPL0241₁₃₀对群体单株的基因型进行分子检测，并以陆地棉中棉所36和海岛棉海1为对照；

(2)对检测结果进行分析，选择带有海岛棉海1特征条带的植株，获得黄萎病得到提高的单株。

通过这些分子标记选择可获得纤维强度得到提高的陆地棉品种，加速棉花纤维品质的育种进程。

本发明一种与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因位点连锁的分子标记，是通过以下方法获得的：

1)以早熟优异的陆地棉推广品种中棉所36为轮回亲本，高抗黄萎病材料海岛棉海1为供体亲本，配制杂交回交的组合，获得BC₁F₁、BC₁S₁、BC₂F₁群体；

2)考查BC₂F₁大田和病圃不同时期黄萎病病指及BC₁S₁大田黄萎病病指，偏度绝对值都小于1，符合正态分布；

3)用CTAB法，提取亲本、F₁及BC₁F₁群体135个棉花单株叶片DNA；

4)选用不同来源的23569对SSR引物对亲本进行多态性筛选。这些引物包括14个系列的12504对基因组SSRs(NAU6124-NAU6701，578对；BNL113-BNL4108，689对；CIR001-CIR418，392对；CM003-209，49对；COT001-COT165，70对；DC20001-DC40441，465对；CGR5001-CGR7005，1244对；C20001-C20139，93对；DPL0009-DPL0922，849对；GH001-GH700，700对；JESPR1-JESPR311，309对；MUSB0001-MUSB1316，1316对；TMB0010-TMB2963，750对；PGML00001-PGML05000，5000对)，和10个系列的11065对EST-SSRs(CICR0001-CICR1000，1000对；CER0001-CER0170，121对；HAU0001-3407，3407对；MGHES1-MGHES78，82对；MUCS001-MUCS624，624对；MUSS001-MUSS607，554对；NAU0747-NAU5513，3198对；SHIN0011-SHIN1640，295对；STV001-STV192，192对；SWU0001-SWU1592，1592对)；通过对双亲分子标记初步筛选，结果表明有2173对SSR引物在亲本间有差异，用多态性引物对135个BC₁F₁群体进行扩增，用JoinMap 4.0软件(Van Ooijen 2006)构建BC₁F₁群体的分子连锁图谱；

5)利用2个世代(BC₂F₁和BC₁S₁)群体在大田和病圃的不同发病时期下的黄萎病数据并结合BC₁F₁群体的遗传连锁图谱，利用Windows QTL Cartographer 2.5软件的复合区间作图法开展黄萎病抗性主效QTL筛选，其中5个能在2个世代(BC₂F₁和BC₁S₁)或2个环境(病圃和大田)或不同发病时期下稳定检测，而且黄萎病抗性增效基因均来自海岛棉海1，即：qDI-5-1、qDI-5-2、qDI-5-3、qDI-5-4、qDI-5-5，这5个主效基因位点都位于染色体C5上，与qDI-5-1连锁的标记为DPL0247₁₁₀和CIR224₁₆₀；与qDI-5-2连锁的标记为PGML03048₂₇₀、NAU4034₂₂₀和BNL1042₁₅₀；与qDI-5-3连锁的标记为DPL0063₁₃₀、HAU0746₂₁₀、TMB1296₁₈₀、CGR6708₁₁₀和DPL0724₂₁₀；与qDI-5-4连锁的标记为TMB1120₃₉₀、CGR5590₁₆₀、PGML02063₂₁₀、CGR5025₁₆₀和HAU1712₂₂₀；与qDI-5-5连锁的标记为MGHES6₁₉₀、DPL0838₁₆₀、NAU2494₂₁₀、DPL0138₂₄₀和DPL0241₁₃₀。

上述第4)步选用23569对SSR引物进行亲本间多态性筛选，PCR反应体系为10μ1，其中超纯水6.40μ1，10×Buffer 1.0μ1，10mM dNTPs 0.50μ1，10μM正向引物0.50μ1，10μM反向引物0.50μ1，30ng/μ1模板DNA1.0μ1，5U/μ1Taq DNA聚合酶0.10μ1，PCR反应程序为：94℃预变性45s；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环；94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸2min，PCR反应在TGRADIENT及PTC-200上进行，扩增产物在8％的聚丙烯凝胶中进行电泳，记录结果。

本发明具有以下有益效果：

本发明所涉及的与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因有关的5个位点(qDI-5-1、qDI-5-2、qDI-5-3、qDI-5-4和qDI-5-5)，增效基因均来自高抗黄萎病材料海岛棉海1，且在不同环境或不同发病时期或不同世代中均能稳定检测到。qDI-5-1在BC₂F₁群体9月17日大田和7月19日病圃两个环境的2个不同发病时期分别解释表型变异的10.91％和8.10％，加性效应分别为7.0和2.7；qDI-5-2在BC₂F₁群体的9月17日大田、7月19日病圃和8月15日病圃及BC₁S₁群体9月17日大田(两个世代、两个环境及3个发病时期)分别解释表型变异的12.31％、9.76％、11.74％％和13.59％，加性效应分别为7.5、3.0、6.0和10.7；qDI-5-3在BC₂F₁群体的9月17日大田、7月19日病圃、8月15日病圃及BC₁S₁群体9月17日大田(两个世代、两个环境及3个发病时期)分别解释表型变异的13.46％、9.80％、13.52％和13.13％，加性效应分别为7.9、3.0、6.5和10.6；qDI-5-4在BC₂F₁群体的9月17日大田、7月19日病圃和8月15日病圃及BC₁S₁群体9月17日大田(两个世代、两个环境及3个发病时期)分别解释表型变异的10.13％、12.01％、16.66％和10.83％，加性效应分别为6.8、3.2、7.3和9.5；qDI-5-5在BC₂F₁群体9月17日大田和8月15日病圃这两个环境2个发病时期分别解释表型变异的7.72％和11.63％，加性效应分别为5.8和6.1。定位的QTL在多环境、多个发病时期及不同世代表现稳定、可靠，可用于进行棉花黄萎病抗性DNA水平上的早期辅助选择，提高育种效率。

附图说明

图1为本发明与黄萎病抗性有关的QTL在BC₁F₁分子标记连锁图谱的位置。

其中，qDI-5-1位于染色体C5的标记区间DPL0247₁₁₀–CIR224₁₆₀内，与之相连锁的标记为DPL0247₁₁₀和CIR224₁₆₀，具体位置为25.6cM和30.5cM；qDI-5-2位于染色体C5的标记区间PGML03048₂₇₀–BNL1042₁₅₀内，与之相连锁的标记为PGML03048₂₇₀、NAU4034₂₂₀和BNL1042₁₅₀，具体位置为31.3cM、32.4cM和32.6cM；qDI-5-3位于染色体C5的标记区间DPL0063₁₃₀–DPL0724₂₁₀内，与之相连锁的标记为DPL0063₁₃₀、HAU0746₂₁₀、TMB1296₁₈₀、CGR6708₁₁₀和DPL0724₂₁₀，具体位置为35.4cM、38.2cM、38.2cM、38.6cM和39.0cM；qDI-5-4位于染色体C5的标记区间TMB1120₃₉₀–HAU1712₂₂₀内，与之相连锁的标记为TMB1120₃₉₀、CGR5590₁₆₀、PGML02063₂₁₀、CGR5025₁₆₀和HAU1712₂₂₀，具体位置为39.1cM、39.4cM、39.8cM、40.2cM和43.1cM；qDI-5-5位于染色体C5的标记区间MGHES6₁₉₀–DPL0241₁₃₀内，与之相连锁的标记为MGHES6₁₉₀、DPL0838₁₆₀、NAU2494₂₁₀、DPL0138₂₄₀和DPL0241₁₃₀，具体位置为43.9cM、44.6cM、44.8cM、45.0cM和47.4cM。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1：筛选分子标记

本发明与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因连锁的分子标记，是通过以下方法筛选出的:

(1)以陆地棉中棉所36为轮回亲本，海岛棉海1为供体亲本，配制杂交回交组合。中棉所36(中36)是早熟的优异的陆地棉推广品种(国审棉990007)，海1(Hai1)是高抗黄萎病的海岛棉栽培种(靖深蓉等，1990，中国农业科学)。

2003年夏季双亲杂交，获得中棉所36×海₁F₁种子，2003年冬在海南中棉所野生棉种植园试验基地加代回交，以轮回亲本中棉所36为母本，获得BC₁F₁种子。2004年4月在安阳试验田种植双亲、F₁和BC₁F₁世代，并在苗期拔出有腺体植株。以轮回亲本中棉所36为母本和BC₁F₁单株(135个)为父本回交，杂交时按照父本株号为每个杂交铃挂牌，同时BC₁F₁单株自交。按父本来源混收杂交铃，并分收父本单株自交铃。2005年4月在安阳试验田种植双亲、F₁、BC₂F₁(133个系)和BC₁S₁(120个系)，双亲及F₁各种2行，两个世代的每个株系各1行，行长5m，株距25cm，同样在苗期拔出有腺体植株。在2005年9月17日对种植在试验田的中棉所36组合的两个世代BC₂F₁和BC₁S₁全部单株，进行棉花黄萎病分级调查。同时，在安阳棉花所病圃鉴定中棉所36组合BC₂F₁世代133个家系的黄萎病抗性，以冀11和豫2067为感病和抗病对照材料，鉴定病圃每个为长20米，宽2.5米的人工感染的水泥池，病原菌为安阳菌系，具有中等致病力。单行种植，行长2.5米，共设三个随机重复，在四个不同时期(6月23日、7月19日、8月15日和8月25日)分别进行黄萎病分级调查。

黄萎病调查均采用标准的5级制，并计算发病指数(DI)(参考中国农业科学院棉花研究所主编的2003年出版的《中国棉花遗传育种学》)。

病指计算公式如下：

病指的统计描述和正态性分布检验见表2。偏度绝对值都小于1，符合正态分布。

(2)用CTAB法(Paterson，1993)，提取亲本、F₁及BC₁F₁群体135个棉花单株叶片DNA。

(3)共选用不同来源的23569对SSR引物对双亲本进行多态性筛选，这些引物包括24个系列的SSR引物。其中，14个系列的12504对基因组SSRs(NAU6124-NAU6701，578对；BNL113-BNL4108，689对；CIR001-CIR418，392对；CM003-209，49对；COT001-COT165，70对；DC20001-DC40441，465对；CGR5001-CGR7005，1244对；C20001-C20139，93对；DPL0009-DPL0922，849对；GH001-GH700，700对；JESPR1-JESPR311，309对；MUSB0001-MUSB1316，1316对；TMB0010-TMB2963，750对；PGML00001-PGML05000，5000对)，和10个系列的11065对EST-SSRs(CICR0001-CICR1000，1000对；CER0001-CER0170，121对；HAU0001-3407，3407对；MGHES1-MGHES78，82对；MUCS001-MUCS624，624对；MUSS001-MUSS607，554对；NAU0747-NAU5513，3198对；SHIN0011-SHIN1640，295对；STV001-STV192，192对；SWU0001-SWU1592，1592对)。其中，CICR系列是中国农业科学院棉花研究所王为博士自主开发的SSR引物，PGML和SWU系列的引物是由西南大学张正圣教授开发的SSR引物。引物序列在CMD(Cotton MarkerDatabase)数据库(http://www.cotton-marker.org/)免费下载或有关文献中公布。引物合成由上海英俊生物技术有限公司完成。SSR扩增反应体系为10μ1，其中超纯水6.40μ1，10×Buffer 1.0μ1，10mM dNTPs 0.50μ1，正向引物(10μM)0.50μ1，反向引物(10μM)0.50μ1，模板DNA(30ng/μ1)1.0μ1，Taq DNA聚合酶(5U/μ1)0.10μ1。SSR扩增反应程序：94℃预变性45s；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环。94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸2min。扩增反应在BIOMETRA公司TGRADIENT及BIO-RAD公司PTC-200上进行，扩增产物在8％的聚丙烯凝胶中进行电泳，按照Zhang et al.(2002)的方法进行凝胶银染，记录结果。分子标记筛选结果表明，有2173对SSR引物在亲本间表现多态性，并进一步分析BC₁F₁群体135个单株DNA的多态性，共获得2365个多态性位点。

(4)利用JoinMap 4.0软件(Van Ooijen 2006)构建BC₁F₁群体遗传连锁图谱，作图采用Kosambi函数，设定LOD值≥4.0，构建连锁群。根据网上公布数据的几张含有SSR标记的分子连锁图谱间的共有标记(Guo et al.2007；Yu et al.2011；Yu et al.2012；Lacape et al.2005)和其它连锁群定位研究结果(David Fang，2007，http://www.cottonmarker.org/projects/dpl/)，采用传统的染色体或连锁群的命名方法，将构建的连锁群定位到具体的染色体上(Guo et al.2007)。构建了含有2292个位点，26个连锁群(分别对应26个染色体)，覆盖基因组5115.16cM的分子连锁图谱(其中5号染色体见图1)。

(5)上述遗传连锁图谱结合BC₂F₁病圃的四个不同发病高峰期及BC₁S₁和BC₂F₁大田各自黄萎病平均病指数据，利用Windows QTL Cartographer2.5的复合区间作图法进行QTL作图定位，设定LOD值为2.5，进行1000次排序测验，筛选多环境多世代多个不同发病时期表现稳定的黄萎病抗性QTL，共筛选到5个表现稳定的黄萎病抗性QTL，分别为qDI-5-1、qDI-5-2、qDI-5-3、qDI-5-4和qDI-5-5，都位于染色体C5上。这5个QTL都来源于海岛棉海1，能降低陆地棉黄萎病病指，提高黄萎病抗性。qDI-5-1位于染色体C5的标记区间DPL0247₁₁₀–CIR224₁₆₀内，与之相连锁的新标记为DPL0247₁₁₀和CIR224₁₆₀，具体位置为25.6cM和30.5cM；qDI-5-2位于染色体C5的标记区间PGML03048₂₇₀–BNL1042₁₅₀内，与之相连锁的新标记为PGML03048₂₇₀、NAU4034₂₂₀和BNL1042₁₅₀，具体位置为31.3cM、32.4cM和32.6cM，附近的其它标记CIR102₂₃₀和DC20067₁₂₀分别在张保才(2006)和Ning et al.(2013)研究中已报道；qDI-5-3位于染色体C5的标记区间DPL0063₁₃₀–DPL0724₂₁₀内，与之相连锁的新标记为DPL0063₁₃₀、HAU0746₂₁₀、TMB1296₁₈₀、CGR6708₁₁₀和DPL0724₂₁₀，具体位置为35.4cM、38.2cM、38.2cM、38.6cM和39.0cM；qDI-5-4位于染色体C5的标记区间TMB1120₃₉₀–HAU1712₂₂₀内，与之相连锁的新标记为TMB1120₃₉₀、CGR5590₁₆₀、PGML02063₂₁₀、CGR5025₁₆₀和HAU1712₂₂₀，具体位置为39.1cM、39.4cM、39.8cM、40.2cM和43.1cM，附近的标记DPL0022₂₅₀在Ning et al.(2013)研究中已报道；qDI-5-5位于染色体C5的标记区间MGHES6₁₉₀–DPL0241₁₃₀内，与之相连锁的新标记为MGHES6₁₉₀、DPL0838₁₆₀、NAU2494₂₁₀、DPL0138₂₄₀和DPL0241₁₃₀，具体位置为43.9cM、44.6cM、44.8cM、45.0cM和47.4cM(图1和表3)。这些引物的碱基序列见表1。

qDI-5-1在群体BC₂F₁群体9月17日大田和7月19日病圃两个环境的2个不同发病时期分别解释表型变异的10.91％和8.10％，加性效应分别为7.0和2.7；qDI-5-2在群体BC₂F₁群体的9月17日大田、7月19日病圃和8月15日病圃及群体BC₁S₁群体9月17日大田(两个世代、两个环境及3个发病时期)分别解释表型变异的12.31％、9.76％、11.74％％和13.59％，加性效应分别为7.5、3.0、6.0和10.7；qDI-5-3在群体BC₂F₁群体的9月17日大田、7月19日病圃、8月15日病圃及群体BC₁S₁9月17日大田(两个世代、两个环境及3个发病时期)分别解释表型变异的13.46％、9.80％、13.52％和13.13％，加性效应分别为7.9、3.0、6.5和10.6；qDI-5-4在群体BC₂F₁群体的9月17日大田、7月19日病圃和8月15日病圃及群体BC₁S₁群体9月17日大田(两个世代、两个环境及3个发病时期)分别解释表型变异的10.13％、12.01％、16.66％和10.83％，加性效应分别为6.8、3.2、7.3和9.5；qDI-5-5在BC₂F₁群体9月17日大田和8月15日病圃这两个环境2个发病时期分别解释表型变异的7.72％和11.63％，加性效应分别为5.8和6.1(表3)。与这些稳定的QTL连锁的分子标记可用于棉花黄萎病抗性的分子标记辅助选择，提高抗病育种效率。

实施例2：陆地棉黄萎病抗性提高的分子标记选择方法

使用实施例1获得的分子标记，与qDI-5-1连锁的标记为DPL0247₁₁₀和CIR224₁₆₀；与qDI-5-2连锁的标记为PGML03048₂₇₀、NAU4034₂₂₀和BNL1042₁₅₀；与qDI-5-3连锁的标记为DPL0063₁₃₀、HAU0746₂₁₀、TMB1296₁₈₀、CGR6708₁₁₀和DPL0724₂₁₀；与qDI-5-4连锁的标记为TMB1120₃₉₀、CGR5590₁₆₀、PGML02063₂₁₀、CGR5025₁₆₀和HAU1712₂₂₀；与qDI-5-5连锁的标记为MGHES6₁₉₀、DPL0838₁₆₀、NAU2494₂₁₀、DPL0138₂₄₀和DPL0241₁₃₀，在与海岛棉海1等有关的育种群体中进行分子标记选择，包括以下步骤：

(1)DNA提取：以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种或品系为受体亲本，进行杂交、回交，获得分离群体，或者以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种为受体亲本杂交高代回交获得的渐渗系及其衍生品系，或者其渐渗系与陆地棉品种杂交、回交的后代群体，在苗期采用CTAB法提取分离群体单株DNA；

(2)使用上述分子标记对上述(1)群体单株的基因型进行分子标记检测，并以陆地棉中棉所36和海岛棉海1为对照；

(3)对检测结果进行分析；

(4)选择带有海岛棉海1特征条带的植株，这些中选单株的黄萎病抗性可能得到不同程度的提高。

中棉所36与海1回交5代自交6代的408个株系群体分别设置2行区2重复试验于2014年种植在新疆石河子中棉所试验地和石河子市农业科学院棉花黄萎病重病试验地，9月8日分别对两个试验地进行黄萎病病指调查。用随机选用的分别与qDI-5-1和qDI-5-2连锁的SSR标记TMB1120₃₉₀和CIR224₁₆₀在408个株系群体中进行分子检测，获得抗性得到提高、黄萎病平均病指较低的株系。表4是获得的部分株系的黄萎病平均病指的表现。

表1 SSR分子标记的正向、反向引物序列

表2 三个世代分离群体黄萎病抗性性状数据的基本统计及正态检验

备注：FD表示大田试验

表3 利用复合区间鉴定的稳定的5个QTL

备注：7.19、8.15、8.25、9.17分别表示7月19日、8月15日、8月25日和9月17

表4 分子标记选择的中棉所36与海1回交5代自交6代的9个株系的黄萎病平均病指的表现

材料编号	TMB1120	CIR224	病指(试验地一)	病指(试验地二)
					MBC093	+		15.68	26.18
MBC153	+		14.81	27.17
					MBC162	+		16.36	26.46
MBC178	+		15.11	24.98
					MBC222	+		13.96	24.22
MBC238		+	16.93	31.72
					MBC528	+		14.96	25.58
MBC639	+		19.10	24.93
					MBC095	+	+	17.74	23.41
中棉所36			22.66	36.36

“+”表示能检测到标记的特征带；试验地一是新疆石河子中棉所试验地，试验地二，是石河子市农业科学院棉花黄萎病重病试验地。

Claims

1.一种与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因位点qDI-5-1、qDI-5-2、qDI-5-3、qDI-5-4或qDI-5-5相关的分子标记，其特征在于：qDI-5-1、qDI-5-2、qDI-5-3、qDI-5-4、qDI-5-5都位于染色体C5上，与qDI-5-1连锁的标记为DPL0247₁₁₀和CIR224₁₆₀；与qDI-5-2连锁的标记为PGML03048₂₇₀、NAU4034₂₂₀和BNL1042₁₅₀；与qDI-5-3连锁的标记为DPL0063₁₃₀、HAU0746₂₁₀、TMB1296₁₈₀、CGR6708₁₁₀和DPL0724₂₁₀；与qDI-5-4连锁的标记为TMB1120₃₉₀、CGR5590₁₆₀、PGML02063₂₁₀、CGR5025₁₆₀和HAU1712₂₂₀；与qDI-5-5连锁的标记为MGHES6₁₉₀、DPL0838₁₆₀、NAU2494₂₁₀、DPL0138₂₄₀和DPL0241₁₃₀。

2.根据权利要求1所述的一种与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因位点连锁的分子标记，其特征在于是通过以下方法获得的：

3)用CTAB法提取亲本、F₁及BC₁F₁群体135个棉花单株叶片DNA；

4)选用不同来源的23569对SSR引物对亲本进行多态性筛选，这些引物包括14个系列的12504对基因组SSRs：NAU6124-NAU6701，578对；BNL113-BNL4108，689对；CIR001-CIR418，392对；CM003-209，49对；COT001-COT165，70对；DC20001-DC40441，465对；CGR5001-CGR7005，1244对；C20001-C20139，93对；DPL0009-DPL0922，849对；GH001-GH700，700对；JESPR1-JESPR311，309对；MUSB0001-MUSB1316，1316对；TMB0010-TMB2963，750对；PGML00001-PGML05000，5000对)，和10个系列的11065对EST-SSRs(CICR0001-CICR1000，1000对；CER0001-CER0170，121对；HAU0001-3407，3407对；MGHES1-MGHES78，82对；MUCS001-MUCS624，624对；MUSS001-MUSS607，554对；NAU0747-NAU5513，3198对；SHIN0011-SHIN1640，295对；STV001-STV192，192对；SWU0001-SWU1592，1592对；

通过对双亲分子标记初步筛选，结果表明有2173对SSR引物在亲本间有差异，用多态性引物对135个BC₁F₁群体进行扩增，用JoinMap 4.0软件(Van Ooijen 2006)构建BC₁F₁群体的分子连锁图谱；

5)利用2个世代BC₂F₁和BC₁S₁群体在大田和病圃的不同发病时期下的黄萎病数据并结合BC₁F₁群体的遗传连锁图谱，利用Windows QTL Cartographer 2.5软件的复合区间作图法开展黄萎病抗性主效QTL筛选，其中5个能在2个世代BC₂F₁和BC₁S₁，或2个环境病圃和大田，或不同发病时期下稳定检测，而且黄萎病抗性增效基因均来自海岛棉海1，即：qDI-5-1、qDI-5-2、qDI-5-3、qDI-5-4、qDI-5-5，这5个主效基因位点都位于染色体C5上，与qDI-5-1连锁的标记为DPL0247₁₁₀和CIR224₁₆₀；与qDI-5-2连锁的标记为PGML03048₂₇₀、NAU4034₂₂₀和BNL1042₁₅₀；与qDI-5-3连锁的标记为DPL0063₁₃₀、HAU0746₂₁₀、TMB1296₁₈₀、CGR6708₁₁₀和DPL0724₂₁₀；与qDI-5-4连锁的标记为TMB1120₃₉₀、CGR5590₁₆₀、PGML02063₂₁₀、CGR5025₁₆₀和HAU1712₂₂₀；与qDI-5-5连锁的标记为MGHES6₁₉₀、DPL0838₁₆₀、NAU2494₂₁₀、DPL0138₂₄₀和DPL0241₁₃₀。

3.根据权利要求2所述的与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因位点连锁的分子标记，其特征在于：上述第4)步选用不同来源的23569对SSR引物对亲本进行多态性筛选，PCR反应体系为10μ1，其中超纯水6.40μ1，10×Buffer 1.0μ1，10mM dNTPs 0.50μ1，10μM正向引物0.50μ1，10μM反向引物0.50μ1，30ng/μ1模板DNA1.0μ1，5U/μ1Taq DNA聚合酶0.10μ1，PCR反应程序为：94℃预变性45s；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环；94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸2min，PCR反应在TGRADIENT及PTC-200上进行，扩增产物在8％的聚丙烯凝胶中进行电泳，记录结果。

4.一种检测棉花黄萎病抗性的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)DNA提取，使用与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因位点qDI-5-1、qDI-5-2、qDI-5-3、qDI-5-4或qDI-5-5连锁的分子标记，分别为DPL0247₁₁₀和CIR224₁₆₀；PGML03048₂₇₀、NAU4034₂₂₀和BNL1042₁₅₀；DPL0063₁₃₀、HAU0746₂₁₀、TMB1296₁₈₀、CGR6708₁₁₀和DPL0724₂₁₀；TMB1120₃₉₀、CGR5590₁₆₀、PGML02063₂₁₀、CGR5025₁₆₀和HAU1712₂₂₀；MGHES6₁₉₀、DPL0838₁₆₀、NAU2494₂₁₀、DPL0138₂₄₀和DPL0241₁₃₀，对群体单株的基因型进行分子检测，并以陆地棉中棉所36和海岛棉海1为对照；

(2)对检测结果进行分析，选择带有海岛棉海1特征条带的植株，获得黄萎病得到提高的单株，其中，所述与与棉花黄萎病抗性QTL/主效基因位点qDI-5-1、qDI-5-2、qDI-5-3、qDI-5-4或qDI-5-5连锁的分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：

5.如权利要求1-3任一项所述的分子标记在棉花辅助育种以提高棉花对棉花黄萎病抗性中的应用。