CN101773067B - 利用隐性核不育材料进行籼稻轮回选择育种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用隐性核不育材料进行籼稻轮回选择育种的方法，主要是以带有隐性核不育基因ms_-np的不育株为母本，以20～30种水稻材料作父本杂交，并回交一代；然后在后代中选留优良不育株上的种子，等量混合组成第一轮轮回选择群体；重复前述轮回选择过程，随时可选择优良可育株进入系谱法，并结合分子标记辅助选择，育成新的品种。本发明方法利用隐性核不育可做大量杂交，丰富了育种材料的遗传基础；其次，本发明方法可以随时添加新的水稻材料，从而可对群体进行不断地改良；此外，本发明方法不用人工去雄和授粉，节省了大量人力；本发明方法还利用DNA分子标记进行辅助选择，缩短了育种进程和时间，降低了育种成本。

Description

利用隐性核不育材料进行籼稻轮回选择育种的方法

技术领域

本发明属于作物育种方法，具体涉及利用隐性核不育材料进行籼稻轮回选择育种的方法。 

背景技术

水稻是自花授粉作物，长期以来水稻品种的改良主要依赖杂交育种方法，但是由于人工去雄和杂交技术的限制，通常只能利用少数亲本进行杂交，亲本来源范围窄，导致品种遗传基础日渐狭窄，难以育成突破性的品种。水稻的主要农艺性状多为微效多基因控制的数量性状，轮回选择育种方法可以打破不利基因的连锁，增加优良基因的积累，因而是扩大遗传基础，育成突破性品种的重要手段，但是由于人工去雄困难等限制，使轮回选择育种方法在自花授粉作物上的应用受到限制。而核不育基因的发现为自花授粉作物应用轮回选择育种方法提供了可能。Gilmore(Gilmore，E.C，Jr.Crop Sci，1964，4：323-325)提出将核不育材料应用于自花授粉作物的轮回选择。Fujimaki(Fujimaki.H，S等.Japan.J.Breed.1977.27：70-77)提出将核不育材料用于水稻的轮回选择。Lkehashi(Lkehashi H，Japan J Breed，1980，31：205-209)详细描述了如何将核不育用于水稻于轮回选择的方法。 

水稻光(温)敏核不育已经成功用于水稻群体改良，如利用光(温)敏核不育育成的“准S”(武小金等.作物学报，2004，30(6)：589～592)，在北方粳稻中也进行了相应的研究(吴长明等.吉林农业科学，1994(3)：14-17)。在利用不受光温影响的普通隐性雄性核不育进行轮回选择育种方面，国际水稻所的Khush(1979)(吴长明等.吉林农业科学.1996(1)：36-39)、赵正洪等(赵正洪等.作物研究，1994，8(1)：16-17)先后利用单基因控制的隐性核不育材料IR36ms，采用轮回选择法对水稻的品种改良进行了初步研究，但是到目前为止，还没有成功应用的报道。 

利用现有的普通隐性雄性核不育进行水稻轮回选择育种存在的主要问题是：(1)群体的总体性状受隐性核不育基因供体材料遗传背景的影响大，容 易导致群体的遗传类型和性状表现单一，难以育成优良品系；(2)带有隐性核不育基因株系的选择或剔除是依据后代的自然分离进行，费时且工作量大，效率低。因此，需要寻找新的用于水稻轮回选择的隐性核不育类型进行水稻的轮回选择，并结合分子生物学技术对隐性核不育基因进行早期鉴定，减少工作量。 

发明内容

本发明目的在于克服目前水稻育种材料中存在的遗传基础狭窄的问题，提供一种利用隐性核不育材料进行籼稻轮回选择育种的方法，该方法借助单隐性核不育材料，不用人工去雄，可同时进行大量杂交，从而扩大育种材料的遗传基础；同时结合分子标记辅助选择进行不育基因的鉴定和淘汰，提高育种效率，从而培育出高产、优质、抗病性强和适应性好的品种。 

本发明另一目的是提供隐性核不育基因材料的分子标记和检测方法。 

为实现上述目的，本发明的技术方案为： 

利用隐性核不育材料进行籼稻轮回选择育种的方法，按照如下步骤进行： 

(1)、以带有隐性核不育基因ms_-np的材料的不育株为母本，以符合育种目标的10～30个水稻材料为父本，分别进行人工杂交，分别收取不育株上的种子，得杂交F₁代； 

(2)按照组合种植F₁代，然后以F₁代植株作母本，以步骤(1)中的父本材料为父本分别进行回交，获得BC₁F₁代种子； 

(3)、按照组合种植BC₁F₁群体，自交结实；同时在抽穗期剪取叶片，提取总DNA，并以总DNA为模板、分别以下述DNA序列为引物进行PCR扩增，选取同时具有W11和W19分子不育标记的单株，收获所选单株的种子，然后等量混合，建立基础群体RS₀； 

其中扩增W11分子标记的引物为： 

引物1：5′-CTTCAACATCCTCACACACCAGC-3′(SEQ ID No：1) 

引物2：5′-GCGAATCGGATGTGATCTATGC-3′(SEQ ID No：2)； 

扩增W19分子标记的引物为： 

引物3：5′-AATCATCCCTAGAGCATCGG-3′(SEQ ID No：3)， 

引物4：5′-GTCCAGCATGGGTGCAGATG-3′(SEQ ID No：4)； 

(4)、在隔离条件下种植RS₀群体10000～20000株，群体内自由授粉，收取农艺性状优良，抗病性好的不育株上的种子，等量混合，形成第一轮群 体RS₁； 

(5)、重复步骤(4)2～5次，可得到群体RS₃～RS₆； 

(6)、在步骤(5)所得群体中选择符合育种目标的可育单株，并利用步骤(3)所述方法进行PCR扩增，选择没有W11和W19分子不育标记的可育单株；所选可育单株进入系谱法育种程序，按照育种目标进行选择，培育出新的品种。 

上述轮回选择育种的方法步骤(5)中所得不育株，可以继续按照步骤(4)所述的方法继续进行轮回选择程序；或以群体里所得不育株为基础材料，随时添加新的材料，再继续进行轮回选择。 

对于符合育种目标的优良可育单株可利用DNA分子辅助标记W11和W19剔除含有核不育基因ms_-np的株系，利用可育单株育成杂交稻新品系；同时可再继续新的轮回选择。 

上述轮回选择育种的方法步骤(1)中所述的带有隐性核不育基因ms_-np的材料是H2S或以H2S为亲本产生的后代，H2S(水稻籼亚种)已于2009年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏编号为：P200905。 

上述轮回选择育种的方法步骤(1)中所述的水稻材料可以是恢复系、保持系、常规品种或杂交种。 

上述轮回选择育种的方法步骤(4)中所述的种植的群体大小可以为10000～15000株。 

上述轮回选择育种的方法步骤(6)中所述的新的品种可以是恢复系、保持系、常规品种等。 

利用上述轮回选择育种的方法培育的保持系，可按照常规方法回交转育成不育系。 

利用上述轮回选择育种的方法培育的恢复系，可以和不育系组配成水稻杂交种。 

上述轮回选择育种的方法中所述的育种目标是本领域技术人员熟知的概念，主要是指农艺性状、品质、抗性性状或适应性等性状优良，具体侧重哪些性状，要根据群体的具体情况而定。 

上述轮回选择育种的方法中所述的在隔离条件下是指群体的种植需要采取适当的隔离措施，以避免来自非本群体的花粉串粉。 

上述轮回选择育种的方法步骤(6)中所述的系谱法育种程序属于本领域 技术人员公知的常识。 

隐性核不育基因ms_-np的分子辅助选择标记，是指同时具有不育基因带型的W11和W19分子标记；其中W11是以引物1(SEQ ID No：1)和引物2(SEQID No：2)为引物进行PCR扩增产生的分子标记；W19是以引物3(SEQ IDNo：3)和引物4(SEQ ID No：4)为引物进行PCR扩增产生的分子标记；W11和W19是和隐性核不育基因ms_-np紧密连锁的分子标记，分别位于隐性核不育基因ms_-np的两侧；其中W11标记与隐性核不育基因ms_-np的遗传距离为0.2cM；W19标记与隐性核不育基因ms_-np的遗传距离为0.5cM。W11的不育基因带型见图1的“P2”；W19的不育基因带型见图2的“P2”。 

隐性核不育基因ms_-np的检测方法，以水稻材料总DNA为模板，以SEQ IDNo：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列为引物，以及以SEQ ID No：3和SEQID No：4所示的核苷酸序列为引物分别进行PCR扩增，选择同时具有W11或W19分子标记的不育基因标记的，即为含有核不育基因ms_-np的水稻材料。 

隐性核不育基因ms_-np分子检测试剂盒，其特征在于含有SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，及SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。 

本发明是基于四川农业大学发现的隐性核不育材料H₂S。1988年春，四川农业大学水稻研究所在海南省陵水县种植的保持系育种材料(亲本组合为：HA-7×297B)F₃代的C469株系的60个单株中发现16个不育株，其花药畸型、白色，无花粉，柱头外露好，异交率高。即选4个不育株分别与2个姊妹可育株、2个保持系、6个保持系材料和5个恢复系杂交。1988年夏，在四川雅安种植，结果与2个姊妹交组合分离出1∶1的可育株和不育株，其余13个组合全部结实正常。据此，初步确认C469株系中的不育株为隐性核不育，且不育基因的表达不受环境条件的影响，初步定名为四川隐性核不育水稻H₂S。 

2001年从H₂S作隐性核不育基因供体的选保持系的轮回群体中，收取隐性核不育株的种子种植，选农艺性状相似的不育株和可育株杂交，在杂交后代中又选农艺性状与可育株相似的不育株作母本进行回交，连续回交7代以上，得到本发明所用的隐性核不育材料，并命名为H2S。 

用H2S与珍汕97B、花B、明恢63、测64、9311、绿黄粘、江南香糯等籼稻材料杂交，F₁的育性都为正常可育，在F₂群体中可育与不育表现为3∶1的分 离比例。表明H2S中的不育性状为单隐性核不育基因所控制。 

用H2S×珍汕97B构建F₂群体，利用SSR标记将ms_-np初步定位于水稻第6染色体上，位于SSR标记RM3、RM454与RM528之间，遗传图距分别为16.09cM，7.47cM，9.19cM。用测序亲本9311的组合H2S×9311构建的定位群体，把隐性核不育基因ms_-np进一步定位到分子标记W19和W11之间，遗传图距分别为0.5cM和0.2cM，实现了基因的精细定位，W19和W11这两个和ms_-np紧密连锁的分子标记可用于该隐性核不育基因ms_-np的分子标记辅助选择。 

本发明的优点和积极效果：(1)、本发明方法克服了人工去雄和授粉的困难，使进行大规模的杂交成为可能，从而大大丰富了育种材料的遗传基础，有利于选出突破性的品种。水稻作为自花授粉作物，人工去雄和授粉都受到很大的限制，而用隐性核不育材料作为桥梁亲本，可以使群体内材料充分异交，打破不利基因的连锁，增加优良基因的重组和积累，从而培育出农艺性状优良、配合力高的自交系，进而组配出优良的杂交种；(2)、利用本发明方法可以对水稻材料不断地进行改良，即可以在不同时期灵活的加入所需要的资源，从而充分利用各种优异的水稻种质资源，不断地改良群体性状，并可不断选育出新的品种；(3)、本发明利用隐性核不育材料，不必进行人工去雄和授粉工作，节省大量人力和物力；(4)本发明所用隐性核不育材料，不受光温条件影响，因而不受时间和地点的限制，也不受材料的限制，易于进行选择和淘汰；(5)、本发明利用DNA分子标记辅助选择，选择或剔除含不育基因的株系，提高了轮回选择的育种效率，大大缩短了育种进程和时间，显著降低了育种成本。 

附图说明

图1为分子标记W11的PCR扩增检测图谱；其中“P1”表示纯合显性正常可育材料，“P2”表示隐性核不育材料，标注“*”条带表示携带有不育基因的杂合可育株，其他条带表示纯合显性正常可育单株。 

图2为分子标记W19的PCR扩增检测图谱；其中“P1”表示纯合显性正常可育材料，“P2”表示隐性核不育材料，标注“*”条带表示携带有不育基因的杂合可育株，其他条带表示纯合显性正常可育单株。 

具体实施方式

实施例1：利用隐性核不育材料H2S选育三系恢复系 

按照如下方法进行： 

(1)、1996年在四川温江，以无花粉的隐性核不育材料H2S(保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：P200905)为母本，以恢复系蜀恢527、明恢63、密阳46、蜀恢881、蜀恢885、明恢86、明恢78、绵恢725、CDR22、成恢047、宜恢1577、多系1号、辐恢802、辐恢838、6078、9308、IRBB60、江恢151、绵恢501、圭630等20多个亲本分别做父本进行人工杂交，分别收获不育株上的籽粒，得F₁代种子； 

(2)、1996年冬季在海南陵水按照组合种植F₁代，以F₁植株为母本，用(1)中所述的恢复系材料作父本分别进行回交，收获回交的种子，得BC₁F₁代种子。 

(3)、1997年夏季在四川温江按照组合种植BC₁F₁群体，在抽穗期取叶片提取总DNA，以总DNA为模板，以下述DNA序列为引物分别进行PCR扩增，选择具有分子标记W11和W19不育带型的且农艺性状优良的单株(杂合带型)，分单株收取种子，等量混合均匀，得恢复系轮回选择的基础群体RS₀； 

其中所述的W11分子标记的引物为： 

引物1：5′-CTTCAACATCCTCACACACCAGC-3′(SEQ ID No：1) 

引物2：5′-GCGAATCGGATGTGATCTATGC-3′(SEQ ID No：2)： 

所述的W19分子标记的引物为： 

引物3：5′-AATCATCCCTAGAGCATCGG-3′(SEQ ID No：3)， 

引物4：5′-GTCCAGCATGGGTGCAGATG-3′(SEQ ID No：4)； 

上述PCR反应体系为：DNA模板3.0μl，10×PCR buffer 2.5μl，20×dNTPs1.0μl，引物1.0μl，Taq酶1U，超纯水加至总体积25μl。反应条件为：94℃5min；94℃45s，55～58℃45s，72℃45s，共35个循环；72℃10min。 

(4)、1997年冬在海南陵水，在隔离条件下种植基础群体RS₀10000～20000株，群体内自由授粉，选择群体中农艺性状优良、稻米外观品质好、抗稻瘟病、生育期适当等符合育种目标的不育株，收取不育株上的种子；等量混合均匀，得轮回群体RS₁； 

(5)、1998年夏在四川温江，在隔离条件下种植第一轮轮回群体RS₁10000～20000株，自然异交(可人工辅助授粉)，按照育种目标，选择群体 中农艺性状优良、稻米外观品质好、抗稻瘟病、生育期适当的符合育种目标的不育株上的种子，等量混合均匀，得轮回选择群体RS₂； 

(6)、1998年冬在海南陵水，在隔离条件下种植第二轮的轮回群体RS₂；重复上季的操作，得RS₃群体。 

(7)、1999年夏在四川温江，种植第三轮的轮回群体RS₃，重复上季的操作；在群体中农艺性状优良、稻米外观品质好、抗稻瘟病、生育期适当的可育株，收取种子； 

(8)、系谱选择，进入三系杂交稻亲本恢复系的选育程序(F₂)；同时按照(3)所述PCR方法鉴定不育基因的分子标记W11和W19，检测入选单株的不育基因的基因型，淘汰含有该隐性核不育基因分子标记W11和W19的单株(W11的不育、可育和杂合植株的带型见图1；W19的不育、可育和杂合植株的带型见图2)。 

1999年冬在海南陵水种植选取的优良单株，若已检测到是含有不育基因植株的株系，则继续用不育基因的W11和W19分子标记检测该株系种植小区中的单株，留选农艺性状优良，符合育种目标且没有不育基因的单株，系谱选择，加代自交纯合稳定。然后在四川温江和海南陵水两地连续进行选择，至2002年，经加代和测交的杂种优势鉴定，编号498的株系表现出茎杆粗壮、恢复力强、配合力高等特点，定名为蜀恢498(F8代)。并且与通常的育种程序相比，本发明利用分子标记辅助选择将育种周期缩短了3-5代，加快了育种进程，减少了人力物力的投入，降低了育种成本。 

利用蜀恢498和不育系II-32A所配杂交组合II优498(II-32A/蜀恢498)。 

II优498参加2005～2006年四川省水稻中籼迟熟组区试，两年平均产量8130千克/公顷，比对照汕优63增产8.30％，平均增产点次95.8％；生产试验中单产8350千克/公顷，比对照增产9.29％；适宜四川平坝和丘陵地区作一季中稻种植。于2007年通过四川省品种审定。 

实施例2：利用隐性核不育材料H2S选育三系保持系 

(1)、1996年在四川温江，以无花粉的四川隐性核不育材料H2S(2009年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：P200905)为母本，分别以保持系G46B、II-32B、金23B、D62B、中9B、珍汕97B、K17B、地谷B、D702B、香改B、优1B、红突31、新露B、龙特浦B、IRBB23、 D90B、D43B、D44B、D207B或D738B为父本进行人工杂交，按照组合收获不育株上的种子，得杂交F₁代； 

(2)、1996年冬季，在海南陵水按照组合种植F₁代，以F₁代植株作母本，以(1)中保持系作父本分别进行人工回交，收获回交种子，得BC₁F₁代种子。 

(3)、1997年夏季，在四川温江种植BC₁F₁群体，在抽穗期提取叶片总DNA，以下述DNA序列为引物进行PCR扩增，选择具有W11和W19分子不育标记(见图1和图2)且农艺性状优良的单株(杂合型)，分单株收取种子，等量混合均匀，构建恢复系轮回选择的基础群体RS₀。 

其中所述的W11标记的引物为： 

引物1：5′-CTTCAACATCCTCACACACCAGC-3′(SEQ ID No：1) 

引物2：5′-GCGAATCGGATGTGATCTATGC-3′(SEQ ID No：2)； 

所述的W19标记的引物为： 

引物3：5′-AATCATCCCTAGAGCATCGG-3′(SEQ ID No：3)， 

引物4：5′-GTCCAGCATGGGTGCAGATG-3′(SEQ ID No：4)； 

PCR反应体系：DNA模板3.0ul，10×PCR buffer 2.5ul，20×dNTPs 1.0ul，引物1.0ul，Taq酶1U，超纯水加至总体积25ul。反应条件：94℃5min；94℃45s，55～58℃45s，72℃45s，共35个循环；72℃10min。 

(4)、1997年冬，在海南陵水在隔离条件下种植基础群体RS₀10000～20000株，群体内自由授粉，收取群体中农艺性状优良、外观品质好、抗稻瘟病、生育期适当等符合育种目标的不育株上的种子，等量混合，得第一轮轮回群体RS₁； 

(5)、1998年夏，在四川温江在隔离条件下种植第一轮轮回群体RS₁10000～20000株，自然异交(可人工辅助赶粉)，选留群体中农艺性状优良、外观品质好、没有稻瘟病发生、生育期适当等符合育种目标的不育株上的种子，等量混合，得第二轮轮回群体RS₂。 

(6)、1998年冬，在海南陵水种植第二轮的轮回群体RS₂；重复上季的操作，得第三轮轮回群体RS₃。 

(6)、1999年夏，在四川温江第三轮的轮回群体RS₃，重复上季的操作；在选育群体中农艺性状优良、外观品质好、抗稻瘟病、生育期适当的可育株， 按株单收种子； 

(7)、系谱选择，所收获的可育株种子进入三系杂交稻亲本不育系的选育程序；同时用该不育基因的W11和W19分子标记检测入选单株的不育基因的基因型，淘汰含有该隐性核不育基因的单株。1999年冬，在海南陵水种植(6)选取的优良单株，若已检测到是含有不育基因植株的株系，则继续用不育基因的分子标记W11检测该株系种植小区中的单株，选择农艺性状优良，符合育种目标且没有不育基因的单株，系谱选择，加代自交纯合稳定。 

(8)、2002年，经秋繁、冬繁加代和用D62A做母本进行回交转育、测交的杂种优势鉴定，编号4183的株系表现出千粒重高、抗稻瘟病、米质优、产量配合力高等特点，定名为川农1A(BC6F4)。其中利用分子标记辅助选择缩短育种周期3-5代。 

利用川农1A组配的水稻杂交种 

川农优527：组合为川农1A/蜀恢527。 

川农优527参加四川省2006～2007年中籼迟熟区试，两年区试平均产量8096千克/公顷，比对照品种冈优725增产4.15％，平均增产点次74％。2007年生产试验平均产量7951千克/公顷，比对照品种冈优725增产0.99％。 

川农优527参加国家稻2007～2008年长江上游区试，两年区试平均产量9224千克/公顷，比II优838(CK)增产5.54％，平均增产点比例80.4％。2008年参加长江上游中籼迟熟D组生产试验，平均亩产8652千克/公顷，比对照II优838增产3.58％。 

川农优527已分别于2008和2009年通过四川省和国家区试，编号分别为川审稻2008003和国审稻2009007。 

川农优498：组合为川农1A/蜀恢498。 

川农优498于2006～2007年参加四川省水稻中籼迟熟区试，两年平均产量7933千克/公顷，比对照冈优725增产4.36％。2007年生产试验平均产量8608千克/公顷，比对照冈优725增产2.91％。两年区试平均增产点次90.91％。川农优498已于2008年通过四川省区试，编号川审稻2008002。 

序列表 

<110>四川农业大学 

<120>利用隐性核不育材料进行籼稻轮回选择育种的方法 

<160>4 

<170>PatentIn version 3.5 

<210>1 

<211>23 

<212>DNA 

<213>Artificial Sequence 

<220> 

<223>引物1 

<400>1 

cttcaacatc ctcacacacc agc                   23 

<210>2 

<211>22 

<212>DNA 

<213>Artificial Sequence 

<220> 

<223>引物2 

<400>2 

gcgaatcgga tgtgatctat gc                    22 

<210>3 

<211>20 

<212>DNA 

<213>Artificial Sequence 

<220> 

<223>引物3 

<400>3 

aatcatccct agagcatcgg                        20 

<210>4 

<211>20 

<212>DNA 

<213>Artificial Sequence 

<220> 

<223>引物4 

<400>4 

gtccagcatg ggtgcagatg                        20 

Claims (10)

1.利用隐性核不育材料进行籼稻轮回选择育种的方法，按照如下步骤进行：

(1)、以带有隐性核不育基因ms_-np的材料的不育株为母本，以符合育种目标的10～30个水稻材料为父本，分别进行人工杂交，分别收取不育株上的种子，得杂交F₁代；

(2)按照组合种植F₁代，然后以F₁代植株作母本，以步骤(1)中的父本材料为父本分别进行回交，获得BC₁F₁代种子；

(3)、按照组合种植BC₁F₁群体，自交结实；同时在抽穗期剪取叶片，提取总DNA，并以总DNA为模板、分别以下述DNA序列为引物进行PCR扩增，选取同时具有W11和W19分子不育标记的单株，收获所选单株的种子，然后等量混合，建立基础群体RS₀；

其中W11分子标记的引物为：

引物1：5′-CTTCAACATCCTCACACACCAGC-3′

引物2：5′-GCGAATCGGATGTGATCTATGC-3′；

W19分子标记的引物为：

引物3：5′-AATCATCCCTAGAGCATCGG-3′，

引物4：5′-GTCCAGCATGGGTGCAGATG-3′；

(4)、在隔离条件下种植RS₀群体10000～20000株，群体内自由授粉，收取农艺性状优良，抗病性好的不育株上的种子，等量混合，形成第一轮群体RS₁；

(5)、重复步骤(4)2～5次，可得到群体RS₃～RS₆；

(6)、在步骤(5)所得群体中选择符合育种目标的可育单株，并利用步骤(3)所述方法进行PCR扩增，选择没有W11和W19分子不育标记的可育单株；所选可育单株进入系谱法育种程序，按照育种目标进行选择，培育出新的品种。

2.按照权利要求1所述的轮回选择育种的方法，其特征在于轮回选择群体的不育株为基础材料，随时添加新的材料，再继续进行轮回选择。

3.按照权利要求1所述的轮回选择育种的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的带有隐性核不育基因ms_-np的材料是H2S或以H2S为亲本杂交产生的后代，H2S已于2009年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏编号为：P200905。

4.按照权利要求1、2或3所述的轮回选择育种的方法，其特征在于其步 骤(1)中所述的水稻材料是恢复系、保持系、常规品种或杂交种。

5.按照权利要求4所述的轮回选择育种的方法，其特征在于其步骤(4)中所述的种植的群体大小为10000～15000株。

6.按照权利要求4所述的轮回选择育种的方法，其特征在于其所培育的保持系，可按照常规方法回交转育成不育系。

7.利用权利要求1所述的轮回选择育种的方法培育的恢复系，其特征在于所述的恢复系和不育系组配成水稻杂交种。

8.隐性核不育基因ms_-np的分子辅助选择标记，是指同时具有不育基因标记的W11和W19分子标记。

9.隐性核不育基因ms_-np的检测方法，其特征在于以水稻材料总DNA为模板，以SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列为引物，以及以SEQ IDNo：3和SEQ ID No：4所示的核苷酸序列为引物分别进行PCR扩增，选择同时具有W11和W19分子的不育基因标记的植株，即为含有核不育基因ms_-np的水稻材料。

10.隐性核不育基因ms_-np分子检测试剂盒，其特征在于含有SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，及SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。 

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