CN104120126B - 与番茄雄性不育基因紧密连锁的srap分子标记及其获得方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与番茄雄性不育基因紧密连锁的SRAP分子标记及其获得方法，以番茄紫茎可育87‑5为父本，苗期绿茎雄性不育型番茄为母本，杂交产生F1代，自交构建F2分离群体。用集群分离分析法对雄性不育基因ms进行了SRAP标记分析，通过SRAP前、后引物的随机组合，选取了544对引物组合在雄性不育、可育池间筛选，标记为C10B9_1、C10B9_4在两DNA池间表现为多态性。利用这两个标记对F2分离群体进行SRAP标记验证，通过连锁分析发现，C10B9_1、C10B9_4与不育基因ms的连锁距离分别为3.3cM和‑3.3cM。利用此分子标记可以进行番茄雄性不育辅助选育，缩短转育周期，提高转育效率，可省去转育过程中每代需自交鉴定其不育性的繁琐程序，将传统的表现型选择转化为基因型选择，提高选择的准确性和科学性。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，特别是涉及一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的SRAP分子标记及其获得方法。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum L.)是一种在全世界栽培极为广泛的蔬菜，也是我国的主要栽培蔬菜之一，其既可鲜食，也可加工成不同类型的番茄制品。杂种优势是生物界的普遍现象，是改良作物、大幅度提高产量的重要途径。番茄是自花授粉作物，杂种优势十分明显，杂交种比普通品种增产20-30％以上，且整齐度高，抗逆性强，当前番茄生产上大面积推广的杂交种全部使用杂交制种，仍然以人工去雄为主，制种成本过高已成为番茄杂种优势利用的主要限制因素之一。
雄性不育系在蔬菜杂交制种上的应用为番茄杂交种子生产提供了新思路，由于目前番茄雄性不育系在利用上尚存在一定困难，在利用雄性不育系进行育种时，其后代可育株与不育株发生分离。利用早期的标记性状，在幼苗时期根据标记性状来鉴别不育株和可育株，解决了原来两用系只有在开花时，才能鉴别可育株的问题。而一般的不育系其商品性状较差，所以在实际应用中需将雄性不育基因进行转育。但是普通的不育系转育周期很长，要通过杂交、自交各重复多代才可能转育成一个优良的雄性不育系。如何在早期有效地鉴定可育株与不育株，将直接影响其应用价值。
随着分子生物学理论和技术的发展，番茄雄性不育的研究已经从细胞学、形态学、生物化学逐渐转向了分子生物学。目前利用形态学标记或分子学标记，已经基本将各种不同类型的番茄雄性不育基因定位到了各条染色体上。目前较为成功的方法是利用基因工程，将雄性不育基因与抗除草剂基因紧密连锁，使不育株具有抗除草剂的能力，进而可通过在苗期喷施除草剂杀死可育株，而不育株不受影响，从而使不育株保持下来。
发明内容
本发明的目在于：用集群分离分析法(BSA)对雄性不育基因ms进行SRAP标记分析，以期找到与雄性不育基因ms紧密连锁的SRAP标记，应用于分子标记辅助选择育种实践，省去转育过程中每代需自交鉴定其不育性的繁琐程序，缩短转育周期，提高转育效率。同时将传统的表现型选择转化为基因型选择，提高选择的准确性和科学性。简单讲就是通过番茄紫茎可育、绿茎雄性不育番茄品系，用集群分离分析法(BSA)对雄性不育基因ms进行了SRAP标记分析，找到与番茄雄性不育基因ms紧密连锁的分子标记，实现利用此分子标记有效的进行番茄雄性不育辅助选育。
本发明通过以下技术方案实现的：与番茄雄性不育基因紧密连锁的SRAP分子标记，所述SRAP分子标记为C10B9_1和C10B9_4，其引物组合相同，均为C10B9，引物序列如下：C10B9组合上游引物C10：为5'–TGAGTCCAAACCGGCAT-'3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物B9：5'-GACTGCGTACGAATTCAG-'3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的SRAP分子标记C10B9_1和C10B9_4与番茄雄性不育基因ms的连锁距离分别为3.3cM、-3.3cM。
与番茄雄性不育基因紧密连锁的SRAP分子标记的获得方法，所述的获得方法包括以下步骤：
(1)确定以紫茎可育自交品系87-5番茄为父本，以绿茎雄性不育型番茄为母本，所述的绿茎雄性不育型番茄中雄性不育基因与一个苗期绿茎基因紧密连锁；将苗期绿茎雄性不育型番茄与苗期紫茎可育自交系87-5番茄杂交产生F1代，F1代自交产生F2分离群体，然后提取每个F2单株的基因组DNA，备用；
(2)从步骤(1)F2分离群体中通过集群分析分离法选取10株绿茎不育株，提取每株的基因组DNA，将每株基因组DNA等量混合，建成不育基因池；再取10株紫茎可育株，提取每株的基因组DNA，将每株基因组DNA等量混合，建成可育基因池；然后，利用SRAP分子标记引物组合，通过PCR扩增后的产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，筛选出在可育与不育池之间具有扩增多态性的SRAP分子标记引物组合1对，即C10B9；且C10B9引物组合在可育与不育池之间产生的扩增多态性标记为2个，分别编号为C10B9_1和C10B9_4；
(3)利用步骤(2)中已获得的2个具有多态性位点标记，通过PCR扩增及凝胶电泳，对60株F2分离群体进行遗传分析，获得遗传鉴定结果；
(4)对60株F2分离群体的遗传鉴定结果进行连锁分析，以3.0为LOD阀值，确定与不育基因ms连锁的SRAP分子标记为C10B9_1、C10B9_4，其连锁距离分别为3.3cM、-3.3cM。
所述的SRAP分子标记引物为市售的引物。
详细说明：(1)上述方法中所选择的不育母本是由栽培种突变而来的，所以其遗传背景与栽培种父本十分相似，对研究单位点的功能基因非常有效，可非常有效地避免假阳性位点的出现。一旦筛选出多态性标记位点，均可用于位点基因的连锁作图，且其遗传距离也比较理想。另外，由于母本的不育基因与苗期绿茎基因紧密连锁，大大简化了此雄性不育基因在实际生产中的有效利用(李会远，吉林蔬菜，2005，(6):36)。(2)集群分析分离法：是指根据Michelmortal(Michelmore R W，Proc Natl Acad Sci，1991，88:9829-9832)提出的，简称BSA(Bulk Segregate Anallysis)法。(3)SRAP分子标记的引物序列采用(Li G，Theor Appl Genet，2003，107:168-180：Li G，Theor Appl Genet,2001,103:455-461：雷剑，中国马铃薯，2006，20(3):150-153：Budak，Theor Appl Genet，2004，108:328-334：王刚，中国科学逻辑生命科学，2004，34(6):510-516：Riaz，Plant Breeding，2001，120:411-415)等已发表的引物，并且在市面上可以购买到的，将SRAP上游引物和下游引物的随机组合，共选取了544对引物组合，其中有1对引物组合C10B9在两DNA池间扩增效果良好，并产生了2个多态性标记，分别编号为C10B9_1和C10B9_4。利用多态性标记C10B9_1和C10B9_4，通过PCR扩增及凝胶电泳，对60株F2分离群体进行遗传分析，获得遗传鉴定结果。(4)应用JoinMap4.0软件将其对60株F2群体的遗传鉴定结果进行连锁分析，以3.0为LOD阀值，确定与不育基因ms连锁的分子标记为C10B9_1及C10B9_4；已获得的与不育基因ms连锁具有多态性的2个特异性标记C10B9_1和C10B9_4，其引物组合相同，均为C10B9，所述的多态性SRAP分子标记，其引物序列为：SRAP引物C10B9组合上游引物C10为5'TGAGTCCAAACCGGCAT'3，下游引物为B9为5'GACTGCGTACGAATTCAG'3。雄性不育基因ms连锁的分子标记C10B9_1、C10B9_4。其与不育基因ms的连锁距离分别为3.3cM、-3.3cM。
发明的有益效果：利用一个与苗期绿茎基因紧密连锁的花粉败育型材料，通过与紫茎可育系杂交产生F2代分离群体。采用BSA选择雄性不育单株和雄性可育单株构建不育、可育DNA池。筛选SRAP引物，找到与雄性不育基因紧密连锁的分子标记。利用此分子标记进行辅助选育，可省去转育过程中每代需自交鉴定其不育性的繁琐程序，缩短转育周期，提高转育效率。将传统的表现型选择转化为基因型选择，提高选择的准确性和科学性。同时利用苗期有绿茎标记性状的番茄雄性不育系不仅可以保证番茄种子生产的纯度，而且节省劳动力，降低成本，提高工作效率。另外在育苗前期拔除可育株的工作由育种单位自己完成，把完全拔除可育株的绿茎不育植株发给制种单位，由制种单位来完成接下来的工作能有效的防止亲本的流失，有利于杂交新品种的保护，应用与推广意义重大。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1.部分SRAP引物在不育、可育池的筛选；
图2.SRAP引物组合C10B9_1、C10B9_4在F2分离群体中扩增的部分结果；
图3.不育基因的分子连锁图。
具体实施方式
下面举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
实施例1、与番茄雄性不育基因紧密连锁的SRAP分子标记，所述SRAP分子标记为C10B9_1和C10B9_4，其引物组合相同，均为C10B9，引物序列如下：
C10B9组合上游引物C10：为5'–TGAGTCCAAACCGGCAT-'3，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；下游引物B9：5'-GACTGCGTACGAATTCAG-'3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的SRAP分子标记C10B9_1和C10B9_4与番茄雄性不育基因ms的连锁距离分别为3.3cM、-3.3cM。
实施例2、与番茄雄性不育基因紧密连锁的SRAP分子标记的获得方法，所述的获得方法包括以下步骤：
(1)确定以紫茎可育自交品系87-5番茄为父本，以绿茎雄性不育型番茄为母本，所述的绿茎雄性不育型番茄中雄性不育基因与一个苗期绿茎基因紧密连锁；将苗期绿茎雄性不育型番茄与苗期紫茎可育自交系87-5番茄杂交产生F1代，F1代自交产生F2分离群体，然后提取每个F2单株的基因组DNA，备用；
(2)从步骤(1)F2分离群体中通过集群分析分离法选取10株绿茎不育株，提取每株的基因组DNA，将每株基因组DNA等量混合，建成不育基因池；再取10株紫茎可育株，提取每株的基因组DNA，将每株基因组DNA等量混合，建成可育基因池；然后，利用SRAP分子标记引物组合，通过PCR扩增后的产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，筛选出在可育与不育池之间具有扩增多态性的SRAP分子标记引物组合1对，即C10B9；且C10B9引物组合在可育与不育池之间产生的扩增多态性标记为2个，分别编号为C10B9_1和C10B9_4；
(3)利用步骤(2)中已获得的2个具有多态性位点标记，通过PCR扩增及凝胶电泳，对60株F2分离群体进行遗传分析，获得遗传鉴定结果；
(4)对60株F2分离群体的遗传鉴定结果进行连锁分析，以3.0为LOD阀值，确定与不育基因ms连锁的SRAP分子标记为C10B9_1、C10B9_4，其连锁距离分别为3.3cM、-3.3cM。
所述的SRAP分子标记引物为市售的引物。
实践操作中，具体实验的设备和材料有：PCR仪选用英国TECHNE TC-512热循环仪；引物由上海生物工程责任有限公司提供；Taq酶采用上海生工Promega进口分装；缓冲液采用上海生工Promega进口分装；dNTPs中dATP，dCTP，dGTP，dTTP各取10mM组成混合液均购于大连宝生物责任有限公司和Promega进口原装；其他试剂购于上海生工生物工程股份有限公司。
PCR产物用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶溶液的配制见表1。凝胶大小为185×105×1mm，电泳缓冲液采用0.5×TBE，点样量通常为3.5μL(10μL PCR产物中加入6μL上样Buffer)。通常以160V电压电泳2.5h(个别引物适当延长电泳时间)。电泳仪和电泳槽分别使用北京君意东方电泳设备有限公司的JY600C电泳仪和北京市六一仪器厂的DYCZ-30电泳槽。
表1.8％聚丙烯酰胺凝胶配方
| 试剂 | 每板用量 |
| 聚丙烯酰胺胶母液 | 8mL |
| 10×TBE | 2mL |
| 超纯水 | 10mL |
| 10％过硫酸胺 | 200μL |
| TEMED | 20μL |
番茄核雄性不育型基因材料，该雄性不育基因与一个苗期绿茎基因紧密连锁。利用这种标记性状，在早期就可有效地鉴定不育株与可育株，具有很高的应用价值，此材料2010年由新疆农业科学院园艺作物研究所从日本帝门公司(Del Montel)引进。用于杂交建立分离群体的父本为一个紫茎可育的加工番茄自交系87-5，此材料由新疆农业科学院园艺作物研究所加工番茄课题组选育。
上述选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其它本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明的实施。
具体操作方法：首先(1)通过苗期绿茎雄性不育系(母本)与苗期紫茎可育的自交系(父本)杂交产生F1杂种，F1代自交产生F2分离群体，分别随机选择30株绿茎不育株和30株紫茎可育株作为连锁作图群体。
(2)F1自交产生F2分离群体，分别随机选择30株绿茎不育株和30株紫茎可育株作为连锁作图群体。分离作图群体F2单株的基因组DNA，根据Michelmortal(Michelmore R W，Proc Natl Acad Sci，1991，88:9829-9832)提出的集群分析分离法，简称BSA(BulkSegregate Anallysis)法，从F2分离群体中选取10株绿茎不育株，将其单株DNA等量混合，建成不育基因池；再取10株紫茎可育株，将其单株DNA等量混合，建立可育基因池。用在两个亲本间表现多态性的引物扫描不育池和可育池，寻找在不育池和可育池间表现多态性的引物标记。
(3)根据(Li G，Theor Appl Genet，2003，107:168-180：Li G，Theor Appl Genet，2001，103:455-461：雷剑，中国马铃薯，2006，20(3):150-153：Budak，Theor Appl Genet，2004，108:328-334：王刚，中国科学逻辑生命科学，2004，34(6):510-516：Riaz，PlantBreeding，2001，120:411-415)等已发表的引物，将SRAP前引物和后引物的随机组合，共选取了544对引物组合，利用SRAP标记参照(赵娟，内蒙古农业大学，2009)等方法，并进行了一定程度的优化，最终采用扩增反应体系和扩增程序如下：
表2.番茄SRAP扩增反应体系
| 试剂 | 用量 |
| 20ng/μL DNA | 2.0μL |
| 10×Buffer(含Mg2+) | 1.0μL |
| dNTPs(2.5mM each) | 0.8μL |
| 10pM Forward primer | 0.5μL |
| 10pM Reverse primer | 0.5μL |
| 5U/μL Taq polymerase | 0.2μL |
| ddH20 | 5.0μL |
PCR反应在MJ PTC-200热循环仪上进行，扩增程序为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，35℃退火30s，72℃延伸1min 30s，循环4次，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min 30s，共37个循环，最后72℃延伸10min。
(4)根据SRAP标记在两DNA池PCR扩增，扩增产物在8％变性聚丙烯酞胺凝胶上电泳分离。结果有498对引物组合在中可以扩增出产物，其中有1对引物组合在DNA池间表现为多态性且扩增效果较好的SRAP分子标记，即C10B9。且C10B9引物组合在可育与不育池之间产生的扩增多态性标记为2个，分别编号为C10B9_1和C10B9_4；参见附图1。利用这对在可育池、不育池之间具有扩增多态性的引物，对60个F2分离单株进行分析，获得分子标记多态性数据。附图2.为SRAP引物组合C10B9_1、C10B9_4在F2分离群体中扩增的部分结果。
然后，对与番茄雄性不育基因紧密连锁的分子标记在F2分离群体中进行验证。(1)将获得的与番茄雄性不育基因相关的分子标记，对60个F2分离单株进行分析，先从它们的叶片中分离DNA，然后利用标记C10B9_1、C10B9_4的引物对这些DNA进行PCR扩增，根据电泳谱带结果，记录标记的类型：与亲本绿茎不育系相同纯合带型记为a，与紫茎可育相同纯合带型记为b，两亲本的杂合带型记为h，由于各种原因造成的模糊或缺失数据记为u，扩增结果用于图谱的构建。
表3.与番茄雄性不育基因紧密连锁的SRAP分子标记预测与F2分离群体田间育性表型
注：“a”表示与不育单株一致的基因型，“b”表示与可育单株一致的基因型；“m”表示不育单株，“f”表示可育单株。
由表3得出结论：在30株苗期绿茎雄性不育株型中，标记验证显示C10B9_1有2株与紫茎可育纯合表型一致，C10B9_4标记与绿茎雄性不育田间表型相符合；在30株苗期紫茎可育株田间表型与C10B9_1标记验证结果相吻合，C10B9_4有2株与不育株型一致。可见苗期绿茎与雄性不育基因的连锁为紧密连锁，其交换率分别为3.3％、-3.3％，即±[2/60]*100＝±3.3％。
(2)应用JoinMap4.0软件构建连锁图谱。将其对F2群体的遗传鉴定结果进行连锁分析，取LOD值为3.0，得到1张不育基因的连锁图，如附图3所示，其中与不育基因连锁的位点标记有2个，分别是C10B9_1和C10B9_4，其与不育基因ms的连锁距离分别为3.3cM、-3.3cM。
序列表
<110> 新疆农业科学院园艺作物研究所
<120> 与番茄雄性不育基因紧密连锁的SRAP分子标记及其获得方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>多态性SRAP分子标记上游引物。
<400> 1
tgagtccaaa ccggcat 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>多态性SRAP分子标记下游引物。
<400> 1
gactgcgtac gaattcag 18
Claims (2)
1.与番茄雄性不育基因紧密连锁的SRAP分子标记，其特征在于：所述SRAP分子标记为C10B9_1和C10B9_4，其是采用C10B9引物组合从绿茎雄性不育番茄基因组中扩增得到的，C10B9组合上游引物C10：为5' –TGAGTCCAAACCGGCAT- '3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物B9：5' -GACTGCGTACGAATTCAG -'3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的SRAP分子标记C10B9_1和C10B9_4与番茄雄性不育基因ms的连锁距离分别为3.3cM、-3.3cM。
2.与番茄雄性不育基因紧密连锁的SRAP分子标记的获得方法，其特征在于：所述的获得方法包括以下步骤：
（1）确定以紫茎可育自交品系87-5番茄为父本，以绿茎雄性不育型番茄为母本，所述的绿茎雄性不育型番茄中雄性不育基因与一个苗期绿茎基因紧密连锁；将苗期绿茎雄性不育型番茄与苗期紫茎可育自交系87-5番茄杂交产生F1代，F1代自交产生F2分离群体，然后提取每个F2 单株的基因组DNA，备用；
（2）从步骤（1）F2分离群体中通过集群分析分离法选取10株绿茎不育株，提取每株的基因组DNA，将每株基因组DNA等量混合，建成不育基因池；再取10株紫茎可育株，提取每株的基因组DNA，将每株基因组DNA等量混合，建成可育基因池；然后，利用SRAP分子标记引物组合，通过PCR扩增后的产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，筛选出在可育与不育池之间具有扩增多态性的SRAP分子标记引物组合1对，即C10B9；且C10B9引物组合在可育与不育池之间产生的扩增多态性标记为2个，分别编号为C10B9_1和C10B9_4；所述的C10B9，引物序列如下：C10B9组合上游引物C10：为5' –TGAGTCCAAACCGGCAT- '3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物B9：5' -GACTGCGTACGAATTCAG -'3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
（3）利用步骤（2）中已获得的2个具有多态性位点标记，通过PCR扩增及凝胶电泳，对60株F2分离群体进行遗传分析，获得遗传鉴定结果；
（4）对60株F2分离群体的遗传鉴定结果进行连锁分析，以 3.0 为 LOD 阀值，确定与不育基因ms连锁的SRAP分子标记为C10B9_1、C10B9_4，其连锁距离分别为3.3cM、-3.3cM。
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