CN106929594A - 梨果皮全红芽变性状位点的分子标记及其引物和应用 - Google Patents

梨果皮全红芽变性状位点的分子标记及其引物和应用 Download PDF

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CN106929594A CN201710294106.0A CN201710294106A CN106929594A CN 106929594 A CN106929594 A CN 106929594A CN 201710294106 A CN201710294106 A CN 201710294106A CN 106929594 A CN106929594 A CN 106929594A
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Abstract

本发明公开了梨果皮全红芽变性状位点Red的InDel分子标记及其应用。对非全红芽变材料‘T109’与‘红早酥’梨全红型芽变品种‘红早酥’的杂交F1代群体基因型与各单株的性状表型进行遗传连锁分析，获得与该芽变性状位点连锁的分子标记。所述的梨果皮全红芽变性状位点Red位于梨第4号染色体上面。所述的与梨果皮全红芽变性状位点Red连锁的InDel分子标记分别为In1579‑1和In1400‑1，与梨果皮全红芽变性状位点Red的遗传距离分别为1.4cM和2.1cM。利用这些标记对梨果皮全红芽变品种的杂交后代进行检测，可提前预测果皮颜色，大大提高了红皮梨育种的选择效率，节约成本，具有较好的社会经济效益。

Description

梨果皮全红芽变性状位点的分子标记及其引物和应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及梨遗传育种技术领域，具体涉及梨果皮全红芽变性状位点的分子标记及其引物和应用。
技术背景
梨是国际性的大宗水果，也是我国的主要水果之一，其果实营养丰富，味美多汁，香甜可口，深受人民的喜爱。果皮颜色是最能吸引人们注意的果实性状之一，是果实品质和商品性的重要组成部分。近年来，健康消费的观念日益深入人心，红色梨被认为具有更高的健康价值而受到市场的青睐，红色梨品种的选育也日益受到各国梨育种研究机构的重视。在我国，红皮梨种植面积较小，现有红皮梨资源多为幼果期不着色、在果实发育中后期着色，着色状况受环境条件影响较大的阳面红晕类型；而西洋梨品种‘巴梨’的全红型芽变品种‘红巴梨’以及我国‘早酥’梨的全红型芽变品种‘红早酥’的果实在幼果期即全面着红色，且能一直保持，受环境条件影响较小，利用这些全红型芽变品种做亲本，可望选育出在我国北方和南方均能着色良好的红皮梨新品种。
目前，在梨育种工作中主要采用的是传统的杂交育种手段，杂交种子培育成苗，并度过数年的童龄期结果之后，再对所有杂种单株生长结果性状进行后期评价，根据评价结果决定留下和淘汰的杂种单株。该方法的育种周期长、占地面积大、耗时耗力，育种效率低。近年来，分子生物学迅速发展并与作物遗传育种相结合，产生了分子标记辅助选择育种技术，使得对传统杂交育种获得的杂交单株进行提早选择和高效选择成为可能。梨全红型芽变品种的红皮性状分子标记用于分子标记辅助选择育种，则可以大大提高以该类型品种为亲本的红皮梨育种选择效率，节约杂交单株种植养护和调查考种的成本，促进我国梨育种由常规育种向分子育种手段转变。
发明内容
为了实现上述目的，本发明提供了一种梨果皮全红芽变性状位点及与该位点紧密连锁的分子标记，设计了其引物，并在以该类型品种为亲本的红皮梨育种选择中进行了应用，为红皮梨的鉴定提供了新方法，提高了红皮梨育种的准确性和选择效率。
本发明是通过以下技术方法实现的
一种梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记，该InDel分子标记为In1579-1，所述的分子标记In1579-1的InDel位点位于梨基因组登录号为NW_008988579.1的组装scaffold上的23081bp处，插入缺失序列为ATTATTTTTTTA或ATTATTTTTTTATTTTTTTA(插入缺失的两个序列可能只出现一个也可能两个同时出现)。
上述梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记，所述分子标记In1579-1的扩增产物序列为：CATGTTACAGGTCCAACCTTCTTTCCTTTTATTATTTTTTTAAATGTTTTTGGATTCTGGATTTCAGATTGCAATAGG(78)以及CATGTTACAGGTCCAACCTTCTTTCCTTTTATTATTTTTTTATTTTTTTAAATGTTTTTGGATTCTGGATTTCAGATTGCAATAGG(86)中的一个或两个。杂种后代在In1579-1标记位点的标记基因型为78/86(扩增出78bp和86bp两条带)即为红皮后代，标记基因型为78/78(只扩增出一条78bp的条带)即为绿皮后代。
一种上述梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记的引物，所述InDel分子标记In1579-1的引物序列为：
上游引物序列为(SEQ ID NO.11)：5'-CATGTTACAGGTCCAACCTT-3'，
下游引物序列为(SEQ ID NO 12)：5'-CCTATTGCAATCTGAAATCC-3'。
一种梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记，该InDel分子标记为In1400-1，所述的分子标记In1400-1的InDel位点位于梨基因组登录号为NW_008988400.1的scaffold上的161533bp处，插入缺失序列为G或GTTA(插入缺失的两个序列可能只出现一个也可能两个同时出现)。
上述梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记，所述分子标记In1400-1的扩增产物序列为：CAAGGACCAAAGTCACGTATTAGTTATTATCTAAACGGTAAGACTTTTTCTTTTTACATTTTGATCCATCAAGATTTCAAATTCCTCCAAATAGTACTCTTTTCCTAAAGTCGAAGA(117)以及CAAGGACCAAAGTCACGTATTAGTTATTATCTAAACGGTAAGACTTTTTCTTTTTACATTTTGATCCATCAAGATTTCAAATTCCTCCAAATAGTTATACTCTTTTCCTAAAGTCGAAGA(120)中的一个或两个。杂种后代在In1400-1标记位点的标记基因型为117/117(只扩增出一条117bp的条带)即为红皮后代，标记基因型为117/120(扩增出117bp和120bp两条带)即为绿皮后代。
一种上述梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记的引物，所述InDel分子标记In1400-1的引物序列为：
上游引物序列为(SEQ ID NO.21)：5'-CAAGGACCAAAGTCACGTAT-3'，
下游引物序列为(SEQ ID NO.22)：5'-TCTTCGACTTTAGGAAAAGAGT-3'。
上述的梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记，所述梨果皮全红型芽变性状位点命名为Red，位于梨的第四号染色体上，具体位于登录号为NW_008988579.1的组装scaffold和登录号为NW_008988400.1的组装scaffold上面及其之间的基因组范围内。
上述梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记的筛选方法，包括以下步骤：
(1)选择以果皮全红型芽变品种‘T109’为母本、‘红早酥’为父本杂交得到的144棵F1单株及2份亲本材料作为分子标记筛选的研究群体；
(2)利用常规的CTAB法提取步骤(1)所述杂交得到的8份F1红皮单株幼嫩叶片的DNA和8份F1绿皮单株幼嫩叶片的DNA；
(3)采用InDel标记引物对步骤(2)得到的8份F1红皮单株幼嫩叶片的DNA和8份F1绿皮单株幼嫩叶片的DNA进行聚合酶链式反应(PCR扩增反应)；并将扩增产物在8％非变性聚丙烯酰氨凝胶上进行电泳分离分析，然后筛选出在红皮样品和绿皮样品间有多态的引物；如图1所示；
该步骤所述PCR扩增反应的扩增体系为20μL的反应体系：Ex Taq 0.1μL；10×Buffer2μL；dNTPs(2.5mM each)1.6μL；Forward Primer(10μM)0.6μL；Reward Primer(10μM)0.6μL；DNA(10ng/μL)1μL，加入双蒸馏水补足至20μL；
该步骤所述PCR扩增反应的反应程序为：98℃预变性20s，30个循环的98℃10s，55℃30s，72℃45s，72℃10min，扩增完成后在10℃条件下保存；
(4)采用常规的CTAB法提取步骤(1)所述144棵F1单株及2份亲本材料的幼嫩叶片的DNA，并以步骤(3)所述筛选出的在红皮样品和绿皮样品间有多态的引物对该步骤提取的144棵F1单株及2份亲本材料的幼嫩叶片DNA进行PCR扩增反应及电泳分离分析，方法同步骤(2)、(3)；
(5)按照Joinmap4.0软件中的“CP”群体作图模式(lm×ll、nn×np、hk×hk、ef×eg、ab×cd等5种分离类型)进行电泳条带统计，无扩增或扩增不清晰的标记记为“--”；
(6)在Joinmap4.0软件中设置LOD最小值为4.0，利用Kosambi作图函数计算梨全红型芽变性状位点与InDel标记间的遗传距离，再利用MapChart绘制梨全红型芽变性状位点与InDel标记间的连锁图；
(7)分子标记In1400-1与‘红早酥’梨果皮全红芽变性状位点Red的重组率为0.0210，LOD值为36.79，连锁距离为2.1CM；分子标记In1579-1与‘红早酥’梨果皮全红芽变性状位点Red的重组率为0.0139，LOD值为38.77，连锁距离为1.4CM。分子标记In1400-1和In1579-1与‘红早酥’梨果皮全红芽变性状位点Red均存在紧密连锁关系，可以作为该性状位点的分子标记。
上述梨果皮全红型芽变性状位点Red的InDel分子标记In1579-1或梨果皮全红型芽变性状位点Red的InDel分子标记In1400-1在红皮梨辅助选择育种中的应用。
上述InDel分子标记的筛选方法在红皮梨辅助选择育种中的应用。
上述梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记In1579-1或In1400-1在红皮梨辅助选择育种中的应用，包括以下步骤：
(1)以果皮全红型芽变品种‘T109’为母本、‘红早酥’为父本进行杂交得到F1单株；
(2)采用常规的CTAB法提取步骤(1)杂交组合群体F1单株幼嫩叶片的DNA；
(3)以分子标记In1579-1或In1400-1的引物对为引物对步骤(2)得到的F1单株幼嫩叶片的DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
所述的PCR扩增体系为20μL的反应体系：Ex Taq 0.1μL；10×Buffer 2μL；dNTPs(2.5mMeach)1.6μL；Forward Primer(10μM)0.6μL；Reward Primer(10μM)0.6μL；DNA(10ng/μL)1μL，加入双蒸馏水补足至20μL；
所述的PCR扩增反应程序为：98℃预变性20s；30个循环的98℃10s，55℃30s，72℃45s；72℃10min，之后在10℃条件下保温；
(4)将步骤(3)得到的扩增产物在8％非变性聚丙烯酰氨凝胶上进行电泳分离分析；
(5)根据步骤(4)得到的电泳条带的标记基因型(如图1)判断单株的红皮表型和绿皮表型，并根据育种目标选择杂种后代。杂种后代在In1400-1标记位点的标记基因型为117/117(只扩增出一条117bp的条带)即为红皮后代，标记基因型为117/120(扩增出117bp和120bp两条带)即为绿皮后代。杂种后代在In1579-1标记位点的标记基因型为78/86(扩增出78bp和86bp两条带)即为红皮后代，标记基因型为78/78(只扩增出一条78bp的条带)即为绿皮后代。
与现有技术相比，本发明具有以下积极有益效果
(1)本发明采用分子标记的方法对红皮梨进行辅助选择育种，在苗期即可进行提前选择，而不必等到结果以后再进行人工选择，大大提高了红皮梨育种的选择效率，节约了杂种树养护管理、科研投入和地租等成本投入，具有较好的社会经济效益；
(2)‘红早酥’和‘红巴梨’分别是东方梨品种‘早酥’和西洋梨品种‘巴梨’的全红型芽变品种，其果皮红色不易受到环境条件的影响，表现稳定。本发明对‘T109’ב红早酥’杂交组合群体用In1579-1和In1400-1分子标记进行分析，这些标记能够对供试群体中的红皮梨单株进行选择，选择效率均达到97.2％以上。
附图说明
图1为In1579-1和In1400-1分子标记的引物对为引物，对‘T109’为母本、‘红早酥’为父本的F1代8个红皮单株和8个绿皮单株幼嫩叶片DNA进行扩增所得扩增产物的电泳条带图；
图2为梨全红型芽变性状位点与InDel分子标记间的连锁图；
图3为以分子标记1579-1的引物对为引物，对‘T109’为母本、‘红早酥’为父本杂交得到的F1代144个单株的幼嫩叶片DNA进行PCR扩增所得扩增产物的电泳条带图；
图4为以分子标记In1400-1的引物对为引物，对‘T109’为母本、‘红早酥’为父本杂交得到的F1代144个单株的幼嫩叶片DNA进行PCR扩增所得扩增产物的电泳条带图。
具体实施例
下面对本发明进行更加详细的说明，但是此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的保护范围。以下实施例中所涉及到的原料，如无特别说明均为市售。
实施例1
材料来源：供试材料为中国农业科学院郑州果树研究所杂种圃定植的‘T109’ב红早酥’杂交组合群体共144个单株及2份亲本材料。
梨果皮全红型芽变性状位点Red的InDel分子标记In1579-1及InDel分子标记In1400-1的筛选方法，包括以下步骤：
(1)利用常规的CTAB法提取杂交组合群体144个F1单株及2份亲本材料幼嫩叶片的DNA；
(2)以InDel标记引物对步骤(1)所述提取的杂交组合群体F1单株中的8个红皮单株及8个绿皮单株幼嫩叶片的DNA进行PCR扩增反应，得到扩增产物；该PCR扩增反应采用20μL的反应体系，反应体系的组成及反应程序如下所示：
所述的PCR扩增体系为20μL的反应体系：Ex Taq 0.1μL；10×Buffer 2μL；dNTPs(2.5mMeach)1.6μL；Forward Primer(10μM)0.6μL；Reward Primer(10μM)0.6μL；DNA(10ng/μL)1μL，加入双蒸馏水补足至20μL；
所述的PCR扩增反应程序为：98℃预变性20s；30个循环的98℃10s，55℃30s，72℃45s，72℃10min，之后在10℃条件下进行保温；
(3)对步骤(2)得到的PCR扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳、显影、染色和带型判读，然后筛选出在红皮样品和绿皮样品间有多态的引物，如图1所示；
(4)采用步骤(3)所述筛选出的在红皮样品和绿皮样品间有多态的引物对步骤(1)提取的杂交组合群体144个F1单株及2份亲本材料幼嫩叶片的DNA进行PCR扩增反应及电泳分离分析，方法同步骤(2)、(3)；
(5)按照Joinmap4.0软件中的“CP”群体作图模式(lm×ll、nn×np、hk×hk、ef×eg、ab×cd等5种分离类型)进行电泳条带统计，无扩增或扩增不清晰的标记记为“--”；
(6)在Joinmap4.0软件中设置LOD最小值为4.0，利用Kosambi作图函数计算梨全红型芽变性状位点与InDel标记间的遗传距离，再利用MapChart绘制梨全红型芽变性状位点与InDel标记间的连锁图；
(7)分子标记In1400-1与‘红早酥’梨果皮全红芽变性状位点Red的重组率为0.0210，LOD值为36.79，连锁距离为2.1CM；分子标记In1579-1与‘红早酥’梨果皮全红芽变性状位点Red的重组率为0.0139，LOD值为38.77，连锁距离为1.4CM。分子标记In1400-1和In1579-1与‘红早酥’梨果皮全红芽变性状位点Red均存在紧密连锁关系，可以作为该性状位点的分子标记。因此这2个标记均可作为与梨果皮全红芽变性状位点紧密连锁的分子标记用于分子标记辅助选择育种。
实施例2
材料来源：供试材料为中国农业科学院郑州果树研究所杂种圃定植的‘T109’ב红早酥’杂交组合得到F1单株群体共144个单株。
梨果皮全红型芽变性状位点Red的InDel分子标记In1579-1在红皮梨辅助选择育种中的应用，包括以下步骤：
(1)利用常规的CTAB法提取杂交组合群体F1单株幼嫩叶片的DNA；
(2)以In1579-1分子标记的引物对为引物对步骤(1)得到的杂交单株的DNA进行扩增，得到扩增产物，PCR反应体系和反应程序如下所示：
所述的PCR扩增体系为20μL的反应体系：Ex Taq 0.1μL；10×Buffer 2μL；dNTPs(2.5mM each)1.6μL；Forward Primer(10μM)0.6μL；Reward Primer(10μM)0.6μL；DNA(10ng/μL)1μL，加入双蒸馏水补足至20μL；
所述的PCR扩增反应程序为：98℃预变性20s；30个循环的98℃10s，55℃30s，72℃45s；72℃10min，之后在10℃条件下进行保温；
(3)对步骤(2)得到的PCR扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳、显影、染色和带型判读，如图3所示；
(4)根据杂交单株对步骤(3)所得电泳条带的标记基因型来判断单株的红皮和绿皮表型，并进行育种选择。杂种后代在In1579-1标记位点的标记基因型为78/86(扩增出78bp和86bp两条带)即为红皮后代，标记基因型为78/78(只扩增出一条78bp的条带)即为绿皮后代。
梨果皮全红型芽变性状位点Red的InDel分子标记In1400-1在红皮梨辅助选择育种中的应用，包括以下步骤：
(1)利用常规的CTAB法提取杂交组合群体F1单株幼嫩叶片的DNA；
(2)以In1400-1分子标记的引物对为引物对步骤(1)得到的杂交单株的DNA进行扩增，得到扩增产物，PCR反应体系和反应程序如下所示：
所述的PCR扩增体系为20μL的反应体系：Ex Taq 0.1μL；10×Buffer 2μL；dNTPs(2.5mM each)1.6μL；Forward Primer(10μM)0.6μL；Reward Primer(10μM)0.6μL；DNA(10ng/μL)1μL，加入双蒸馏水补足至20μL；
所述的PCR扩增反应程序为：98℃预变性20s；30个循环的98℃10s，55℃30s，72℃45s；72℃10min，之后在10℃条件下进行保温；
(3)对步骤(2)得到的PCR扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳、显影、染色和带型判读，如图4所示；
(4)根据杂交单株对步骤(3)所得电泳条带的标记基因型来判断单株的红皮和绿皮表型，并进行育种选择。杂种后代在In1400-1标记位点的标记基因型为117/117(只扩增出一条117bp的条带)即为红皮后代，标记基因型为117/120(扩增出117bp和120bp两条带)即为绿皮后代。
统计2个分子标记在144个单株中的基因型与单株红皮绿皮性状表型匹配的情况，如图3、图4所示，2个分子标记均能准确鉴定出其中至少140个单株的果皮色泽表型，即准确率均在97.2％以上。结果表明：分子标记In1579-1或In1400-1均能够作为梨果皮全红芽变性状位点紧密连锁的分子标记，用于‘红早酥’梨后代果皮颜色性状的筛选。
通过上述实施例可得：通过分子标记辅助选育可简单快速的通过分子标记预测单株表型，成功的将分子标记辅助选育技术应用于梨全红芽变性状位点的选择，显著降低了育种的工作量和杂种苗养护成本，极大地提高了育种效率。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
中国农业科学院果树研究所
<120> 梨果皮全红芽变性状位点的分子标记及其引物和应用
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分子标记In1400-1扩增产物序列
<400> 6
caaggaccaa agtcacgtat tagttattat ctaaacggta agactttttc tttttacatt 60
ttgatccatc aagatttcaa attcctccaa atagttatac tcttttccta aagtcgaaga 120
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分子标记In1400-1上游引物序列
<400> 7
caaggaccaa agtcacgtat 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 分子标记In1400-1下游引物序列
<400> 8
tcttcgactt taggaaaaga gt 22

Claims (10)

1.一种梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记，其特征在于，该InDel分子标记为In1579-1，所述的分子标记In1579-1的InDel位点位于梨基因组登录号为NW_008988579.1的scaffold上的23081bp处，插入缺失序列为ATTATTTTTTTA或ATTATTTTTTTATTTTTTTA。
2.根据权利要求1所述的梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记，其特征在于，所述分子标记In1579-1的扩增产物序列为：CATGTTACAGGTCCAACCTTCTTTCCTTTTATTATTTTTTTAAATGTTTTTGGATTCTGGATTTCAGATTGCAATAGG以及CATGTTACAGGTCCAACCTTCTTTCCTTTTATTATTTTTTTATTTTTTTAAATGTTTTTGGATTCTGGATTTCAGATTGCAATAGG中的一个或两个。
3.一种权利要求1或2所述梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记的引物，其特征在于，所述InDel分子标记In1579-1的引物序列为：
上游引物序列为：5'-CATGTTACAGGTCCAACCTT-3'，
下游引物序列为：5'-CCTATTGCAATCTGAAATCC-3'。
4.一种梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记，其特征在于，该InDel分子标记为In1400-1，分子标记In1400-1的InDel位点位于梨基因组登录号为NW_008988400.1的scaffold上161533bp处，插入缺失序列为G或GTTA。
5.根据权利要求4所述的梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记，其特征在于，所述分子标记In1400-1的扩增产物序列为：CAAGGACCAAAGTCACGTATTAGTTATTATCTAAACGGTAAGACTTTTTCTTTTTACATTTTGATCCATCAAGATTTCAAATTCCTCCAAATAGTACTCTTTTCCTAAAGTCGAAGA以及CAAGGACCAAAGTCACGTATTAGTTATTATCTAAACGGTAAGACTTTTTCTTTTTACATTTTGATCCATCAAGATTTCAAATTCCTCCAAATAGTTATACTCTTTTCCTAAAGTCGAAGA中的一个或两个。
6.一种权利要求4或5所述梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记的引物，其特征在于，所述InDel分子标记In1400-1的引物序列为：
上游引物序列为：5'-CAAGGACCAAAGTCACGTAT-3'，
下游引物序列为：5'-TCTTCGACTTTAGGAAAAGAGT-3'。
7.根据权利要求1或4所述的梨果皮全红型芽变性状位点的InDel分子标记，其特征在于，所述的梨果皮全红型芽变性状位点命名为Red，位于梨的第四号染色体上，位于登录号为NW_008988579.1的组装scaffold和登录号为NW_008988400.1的组装scaffold及其之间的基因组范围内。
8.权利要求1所述的梨果皮全红型芽变性状位点Red的InDel分子标记In1579-1、权利要求4所述梨果皮全红型芽变性状位点Red的InDel分子标记In1400-1在红皮梨辅助选择育种中的应用。
9.权利要求1或权利要求4所述的InDel分子标记在红皮梨辅助选择育种中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以果皮全红型芽变品种‘T109’为母本、‘红早酥’为父本进行杂交得到F1单株；
(2)采用常规的CTAB法提取步骤(1)所得杂交组合群体F1单株幼嫩叶片的DNA；
(3)以InDel分子标记In1579-1或InDel分子标记In1400-1的引物对为引物对步骤(2)所述的DNA进行聚合酶链式反应，得到扩增产物；
(4)将步骤(3)得到的扩增产物在8％非变性聚丙烯酰氨凝胶上进行电泳分离分析；然后根据电泳条带的标记基因型判断杂交组合群体F1单株的红皮表型和绿皮表型，并根据育种目标选择杂种后代。
10.根据权利要求9所述的InDel分子标记在红皮梨辅助选择育种中的应用，其特征在于，步骤(3)所述的聚合酶链式反应的反应体系和反应程序如下：
所述聚合酶链式反应的扩增体系为20μL的反应体系：Ex Taq 0.1μL；10×Buffer 2μL；dNTPs(2.5mM each)1.6μL；Forward Primer(10μM)0.6μL；Reward Primer(10μM)0.6μL；DNA(10ng/μL)1μL，加入双蒸馏水补足至20μL；
所述聚合酶链式反应的反应程序为：98℃预变性20s；30个循环的98℃10s，55℃30s，72℃45s；72℃10min，之后在10℃条件下保温。
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