CN105684889A - 一种利用分子标记快速转育获得橙红色颖壳水稻育种材料及其转育方法 - Google Patents

一种利用分子标记快速转育获得橙红色颖壳水稻育种材料及其转育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用分子标记快速获得橙红色颖壳水稻育种材料，其转育方法，包括以下步骤：（1）材料准备；（2）杂交处理；（3）分子标记选择：选择综合性状优良的杂交后代，提取DNA，分子标记筛选，确定含有目标基因植株，进行回交，对回交后代进行分子标记筛选，重复回交，分子标记筛选4-5代；（4）选择含有目的基因的植株进行自交；（5）在自交后代中选择获得含有橙红色颖壳性状的水稻育种材料，进行水稻杂交制种，通过后代种子是否含有橙红色颖壳性状来判断杂交种的真实性和纯度。本发明可操作性高，实用性强，可显著缩短育种材料育成时间，简单高效区别真实杂交种及其杂交种纯度，大大节省育种和制种的人力、财力投入。

Description

一种利用分子标记快速转育获得橙红色颖壳水稻育种材料及其转育方法
技术领域
本发明涉及农作物杂交育种培育方法技术领域，具体涉及一种利用分子标记快速转育获得橙红色颖壳水稻育种材料及其转育方法。
背景技术
选育水稻育种新材料是选育水稻突破性品种的基础，目前水稻育种材料的选育主要通过物理诱变、化学诱变、人工杂交、基因转化等方法获得突变体，育种家根据不同的选育目标从突变体中选择材料，并结合单倍体技术、分子标记辅助选择等技术和田间性状表现，最终选育获得遗传稳定的水稻育种新材料。
现有技术有常规选育技术（隐性性状）、转基因选育技术。常规选育技术：将颖壳为橙红色的水稻材料A与需要获得该性状的材料B杂交，获得的F1自交后代，F1代自交获得的种子种植于大田中得到F2代材料，待F2代材料结实后从大田中选择颖壳为橙红色，其它性状接近B的材料与B回交后，再次自交，从自交后代材料BC1F2中选择颖壳为橙红色但其它性状接近B的材料，将从BC1F2代中选取的材料与B回后自交，又从自交后代材料BC2F2中选择颖壳为橙红色但其它性状接近B的材料，依次进行多次回交BCn、自交BCnF2、筛选，最终获得具有橙红色颖壳的B材料。这种技术存在以下缺点：①需要大量的人力物力；②即使每年完成两次杂交，筛选获得目标材料也需要长达6年以上的时间；③目的性状选择必须以回交后代的F2分离后代为基础，费时费力。
转基因选育技术：从水稻材料A中克隆出橙红色颖壳基因，利用转基因技术将橙红色颖壳基因转入水稻材料B中，从而获得转基因材料M1，将M1自交后从后代中筛选颖壳为橙红色的水稻材料，通过稳定性验证后，最终获得具有橙红色颖壳的B材料。这种技术存在以下缺点：①克隆基因和转基因技术都需要好的实验条件和高的实验技术；②通过转基因获得的水稻材料具有局限性，在国内目前还不能应用于大田生产中。
发明内容
针对于现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种利用分子标记快速获得橙红色颖壳水稻育种材料及其转育方法，该方法将现有颖壳为橙红色的水稻材料A与需要获得性状的材料B杂交，获得的F1代与原始材料B回交获得BC1代，利用橙红色颖壳基因的分子标记检测BC1代种子，仅保留目的基因，基因型为杂合（Rr，可先期淘汰一半的种子量）的种子种植于田间，然后再与B材料回交后，对种子进行橙红色颖壳基因分子标记选择，按此方法进行多次回交、分子标记选择获得BCn代，BCn代材料自交后，获得BCnF2后代，选择橙红色颖壳材料，且其它农艺性状与B材料相似，再次利用橙红色颖壳基因分子标记检测其种子，仅留下橙红色颖壳基因，基因型为纯合隐性（rr，可先期淘汰四分之三的种子）的种子种植于田间，持续观察颖壳变化，并与原始母本材料对比，选择具有橙红色颖壳性状的植株，最终获得具有橙红色颖壳水稻材料B。在用水稻材料B进行制种时，以橙红色颖壳性状作为标记性状，通过直接观察杂交种是否具有橙红色颖壳性状来判断杂交种子的真实性，提高杂交种的纯度。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种利用分子标记快速获得橙红色颖壳水稻育种材料的方法，包括以下步骤：
（1）材料准备：选取待转育成橙红色颖壳性状的水稻材料为母本，具有橙红色颖壳性状的水稻材料为父本，分别播种育苗；
（2）杂交处理：选取即将开花的母本，去雄套袋，待雌蕊成熟之后，取父本花粉，授予已去雄的母本雌蕊柱头上后套袋；
（3）分子标记选择：选取饱满的杂交种子，消毒后用无菌水冲洗干净，催芽培养，然后取其叶片提取DNA，以橙红色颖壳性状基因分子标记进行PCR扩增和凝胶电泳检测，选择含有橙红色颖壳性状基因，且标记呈杂合状态的植株进行培育，在后代中选择性状偏向母本的材料重复（1）、（2）、（3）步骤4-5次；
其中所述分子标记筛选的具体步骤为：
1）PCR扩增体系：反应总体系为20ul，分别含有100ng水稻基因组DNA，1×buffer，1.5mMMgCl2，200μMdNTP，0.25μM引物，0.5UTaq酶；
引物为：
S1：F(5'-3')CCCTCCGTCTCAACACTCTG；具体见SEQIDNO：1；
R(5'-3')GCAATCTGCTTGTACTTCTC；具体见SEQIDNO：2；
引物产物长度为117bp；
S2：F(5'-3')TATACCAAAACTAGGTTAAAAC；具体见SEQIDNO：3；
R(5'-3')GCACTCCGAACTCTGAAA；具体见SEQIDNO：4；
引物产物长度为100bp；
2）PCR扩增程序；
3）电泳检测：2.5%琼脂糖凝胶电泳或6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
（4）幼苗培养：将步骤（3）中选择的种子催芽、育苗后，移栽大田，套袋自交，自交后的种子再在室内催芽育苗后，分单株取叶片提取DNA，以橙红色颖壳性状基因分子标记进行筛选，选择含有纯合橙红色颖壳性状基因，且标记呈纯合状态的植株，催芽育苗后移栽大田；
（5）选择橙红色颖壳水稻育种材料：待步骤（4）的幼苗抽穗后，持续观察颖壳变化，并与原始母本材料对比，选择具有橙红色颖壳性状的植株。
进一步地，步骤（3）中的消毒过程是先使用70%酒精消毒后再用浓度为5%~15%的次氯酸钠溶液消毒。
进一步地，步骤（3）中PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃终延伸10min，冷却至12℃保存。
进一步地，步骤（3）中2.5%琼脂糖凝胶电泳过程为：2.5%琼脂糖凝胶，加入5μL/100mL的溴化乙锭，于1/2×TBE缓冲液中，120V电泳2h。
进一步地，步骤（3）中6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳过程为：向PCR产物中加入5μL上样缓冲液、6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，然后向电泳槽上加入1×TBE缓冲液，100W恒定功率预电泳25分钟之后停止，点样5μL，90W恒定功率电泳1.2小时后在固定液中固定20分钟，然后用双蒸水清洗2次，最后至于银染液中染色30分钟，接着用双蒸水清洗后放入显影液中至条带完全显现出来；其中上样缓冲液由质量分数40%蔗糖和0.025%溴酚蓝组成。
通过上述方法培育出的橙红色颖壳水稻育种材料。
本发明提供的一种利用分子标记快速获得橙红色颖壳水稻育种材料及其转育方法，具有以下几种有益效果：
（1）本发明提供的选育目的材料的方法与现有技术相比，可节省一半人工劳动，节约一半时间，同时还可以提高杂交制种的纯度。
（2）本发明提供的发明选育的橙红色颖壳水稻育种材料纯度高，稳定性好，对人体没有危害。
（3）本发明提供的橙红色颖壳水稻育种材料可进行杂交制种，通过观察后代种子是否含有橙红色颖壳性状及所占比例就可判断其育种材料的真实性和纯度，其过程简单有效。
具体实施方式
实施例1
一种利用分子标记快速获得橙红色颖壳水稻育种材料的方法，包括以下步骤：
（1）材料准备：母本选取水稻品种锦优A原始材料于夏季5-6月份在四川省农业科学院新都农场进行种植，父本为花香B，将其种子育苗后，移栽到水田中，使其自然开花，父本花香B的开花期为7-8月，母本锦优A原始材料的开花期也在在7-8月；
（2）杂交：待母本品种锦优A原始材料进入开花盛期，选取即将开花的小花，按常规水稻去雄方法去雄、套袋，于次日早上8~10点，取花香B的花粉，将其授予已去雄的锦优A原始材料雌蕊柱头上，套袋，标记，待杂交种子成熟后，收获；
（3）分子标记选择：在收获的杂交种子中选取饱满的杂交种子，使用70%酒精消毒后，接着用浓度为5%~15%的次氯酸钠溶液消毒，再用无菌水冲洗干净，催芽后移栽大棚培养，然后取其叶片提取DNA，以橙红色颖壳性状基因作为分子标记进行PCR扩增和凝胶电泳检测，根据PCR产物在凝胶电泳中的结果，选择含有橙红色颖壳性状基因，且标记呈杂合状态的植株，移栽大田，在后代中选择性状偏向母本的材料重复（1）、（2）、（3）步骤4-5次；
其中所述分子标记筛选的具体步骤为：
1）PCR扩增体系：反应总体系为20ul，分别含有100ng水稻基因组DNA，1×buffer，1.5mMMgCl2，200μMdNTP，0.25μM引物，0.5UTaq酶；
引物为：
S1：F(5'-3')CCCTCCGTCTCAACACTCTG；具体见SEQIDNO：1；
R(5'-3')GCAATCTGCTTGTACTTCTC；具体见SEQIDNO：2；
引物产物长度为117bp；
S2：F(5'-3')TATACCAAAACTAGGTTAAAAC；具体见SEQIDNO：3；
R(5'-3')GCACTCCGAACTCTGAAA；具体见SEQIDNO：4；
引物产物长度为100bp；
2）PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃终延伸10min，冷却至12℃保存；
3）电泳检测：
琼脂糖凝胶电泳：2.5%琼脂糖凝胶，加入5μL/100mL的溴化乙锭，于1/2×TBE缓冲液中，120V电泳2h，用凝胶成像系统拍照；
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：向PCR产物中加入5μL上样缓冲液，上样缓冲液由质量分数40%蔗糖和质量分数0.025%溴酚蓝，然后用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，将胶板安置于电泳槽上，上、下槽分别加入1×TBE缓冲液，100W恒定功率预电泳25分钟之后停止，用移液枪清除胶口的碎胶，点样5μL，90W恒定功率电泳约1.2小时，电泳结束后，将玻璃板从电泳槽中取出，分开两块玻璃板，将带胶的玻璃板胶面朝上置于固定液中，摇动固定20分钟；将玻璃板从固定液中取出，用双蒸水水洗两次，第一次3分钟，第二次5分钟，然后将玻璃板取出放入银染液中，摇动染色30分钟，将玻璃板从染色液中取出，用双蒸水清洗10秒钟后，放入预冷的显影液中，轻轻摇动至条带完全显现出来，取出玻璃板，用双蒸水清洗2分钟，取出胶板，室温干燥，读取数据；
（4）幼苗培养：将步骤（3）中选择的种子催芽、育苗后，移栽大田，套袋自交，在自交后的种子中选择颖壳为橙红色，其他农艺性状与锦优A相似的水稻材料，再在室内催芽育苗后，分单株取叶片提取DNA，以橙红色颖壳性状基因作为分子标记进行筛选，选择含有纯合橙红色颖壳性状基因，且标记呈纯合状态的植株，催芽育苗后移栽大田；
（5）选择橙红色颖壳水稻育种材料：待步骤（4）的幼苗抽穗后，持续观察颖壳变化，并与原始母本材料对比，选择具有橙红色颖壳性状的植株，最终获得橙红色颖壳水稻育种材料。
将获得的橙红色颖壳水稻育种材料与非橙红色颖壳水稻（已知性状）进行杂交制种，通过观察后代种子是否含有橙红色颖壳性状及所占比例就可判断其育种材料的真实性和纯度，其过程简单有效，可操作性高，实用性强，可显著缩短育种材料育成时间，简单高效区别真实杂交种及其杂交种纯度，大大节省育种和制种的人力、财力投入。
序列表
<110>四川省农业科学院生物技术核技术研究所
<120>一种利用分子标记快速转育获得橙红色颖壳水稻育种材料及其转育方法
<130>2016
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ccctccgtctcaacactctg20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gcaatctgcttgtacttctc20
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tataccaaaactaggttaaaac22
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gcactccgaactctgaaa18

Claims (6)

1.一种利用分子标记快速获得橙红色颖壳水稻育种材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）材料准备：选取待转育成橙红色颖壳性状的水稻材料为母本，具有橙红色颖壳性状的水稻材料为父本，分别播种育苗；
（2）杂交处理：选取即将开花的母本，去雄套袋，待雌蕊成熟之后，取父本花粉，授予已去雄的母本雌蕊柱头上后套袋；
（3）分子标记选择：选取饱满的杂交种子，消毒后用无菌水冲洗干净，催芽培养，然后取其叶片提取DNA，以橙红色颖壳性状基因分子标记进行PCR扩增和凝胶电泳检测，选择含有橙红色颖壳性状基因，且标记呈杂合状态的植株进行培育，在后代中选择性状偏向母本的材料重复（1）、（2）、（3）步骤4-5次；
其中所述分子标记筛选的具体步骤为：
1）PCR扩增体系：反应总体系为20μL，分别含有100ng水稻基因组DNA，1×buffer，1.5mMMgCl2，200μMdNTP，0.25μM引物，0.5UTaq酶；
引物为：
S1：F(5'-3')CCCTCCGTCTCAACACTCTG；
R(5'-3')GCAATCTGCTTGTACTTCTC；
S2：F(5'-3')TATACCAAAACTAGGTTAAAAC；
R(5'-3')GCACTCCGAACTCTGAAA；
2）PCR扩增；
3）电泳检测：2.5%琼脂糖凝胶电泳或6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
（4）幼苗培养：将步骤（3）中选择的种子催芽、育苗然后套袋自交，自交后的种子继续催芽育苗后，取叶片提取DNA，以橙红色颖壳性状基因分子标记进行筛选，选择含有纯合橙红色颖壳性状基因，且标记呈纯合状态的植株，催芽、育苗培育；
（5）选择橙红色颖壳水稻育种材料：待步骤（4）的幼苗抽穗后，持续观察颖壳变化，并与原始母本材料对比，选择具有橙红色颖壳性状的植株。
2.根据权利要求1所述的一种利用分子标记快速获得橙红色颖壳水稻育种材料的方法，其特征在于，步骤（3）中的消毒过程是先使用70%酒精消毒后再用浓度为5%~15%的次氯酸钠溶液消毒。
3.根据权利要求1所述的一种利用分子标记快速获得橙红色颖壳水稻育种材料的方法，其特征在于，步骤（3）中PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃终延伸10min，冷却至12℃保存。
4.根据权利要求1所述的一种利用分子标记快速获得橙红色颖壳水稻育种材料的方法，其特征在于，步骤（3）中2.5%琼脂糖凝胶电泳过程为：2.5%琼脂糖凝胶，加入5μL/100mL的溴化乙锭，于1/2×TBE缓冲液中，120V电泳2h。
5.根据权利要求1所述的一种利用分子标记快速获得橙红色颖壳水稻育种材料的方法，其特征在于，步骤（3）中6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳过程为：向PCR产物中加入5μL上样缓冲液、6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，然后向电泳槽上加入1×TBE缓冲液，100W恒定功率预电泳25分钟之后停止，点样5μL，90W恒定功率电泳1.2小时后在固定液中固定20分钟，然后用双蒸水清洗2次，最后至于银染液中染色30分钟，接着用双蒸水清洗后放入显影液中至条带完全显现出来；其中上样缓冲液由质量分数40%蔗糖和0.025%溴酚蓝组成。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法培育出的橙红色颖壳水稻育种材料。
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