CN104561297B - 一种检测辣椒雄性不育恢复基因的ssr分子标记方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术辅助育种领域，尤其涉及辣椒雄性不育恢复基因Rf连锁的SSR标记及其在辣椒雄性不育育种材料选择中的应用。辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记，该分子标记为pep43标记或pep20标记。SSR分子标记的开发可加速辣椒雄性不育的选育进程，提高育种效果，对辣椒CMS三系的分类和选育提供理论依据；采用自主开发的SSR引物和实验室常规的PCR 技术，通过对辣椒植株的检测，选出具有恢复基因的植株。该方法是对遗传物质的检测，方便、重复性好，且周年均可进行；本发明所提供的试剂盒，将检测用引物和相关试剂综合组装在一盒内，方便实施操作，检测结果稳定可靠。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术辅助育种领域，尤其涉及辣椒雄性不育恢复基因Rf连锁的SSR标记及其在辣椒雄性不育育种材料选择中的应用。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum L.)是一种世界性的蔬菜，在蔬菜生产中占有重要地位。雄性不育是作物育种的重要性状之一。辣椒属于杂种优势非常明显的常异花授粉作物，利用雄性不育性状可以解决杂种优势人工去雄这一难题，降低生产成本。辣椒雄性不育可分为核质互作雄性不育（Cytoplasmic male sterility, CMS）和细胞核雄性不育（Geneticmale sterility, GMS），其中CMS需要同时选育“三系”，包括可育型细胞质的保持系N（msms）；不育型细胞质的雄性不育系S（msms）；控制育性的恢复系S（MsMs）或N（MsMs）。辣椒CMS三系配套育种中恢复系是配制杂交种的前提（马勇等, 2008）。辣椒CMS的研究已应用于商业化杂交制种中。在生产上，恢复基因是辣椒杂种优势利用的基础，而目前辣椒CMS不育系应用的最大阻碍是育性恢复基因分布不广泛，恢复基因主要存在于线椒、牛角椒和羊角椒类型中（邹学校，1991；刘金兵，等，1999），大部分灯笼椒中不含恢复基因。三系的选育周期长，如果能找到与恢复基因或不育基因紧密连锁的分子标记，有助于缩短选育过程。
Peterson（1958）首次报道了辣椒雄性不育CMS，此后对辣椒CMS恢复基因的标记、定位、基因的遗传及其相互之间的关系等研究受到广泛重视。Peterson（1958）、Yu（1990）和Gulyas等（2006）研究表明辣椒育性恢复主要被一个显性核基因控制。Wang等（2004）利用QTL方法研究认为辣椒CMS育性恢复受1个主效基因和4个微效基因控制。魏兵强等（2013）研究认为辣椒CMS恢复性可能由2对加性—显性上位性主基因和加性—显性多基因控制。
随着分子生物学的发展，利用分子标记辅助育种技术已在辣椒恢复系选育种得到应用。辣椒雄性不育的恢复主要由一个核恢复基因Rf 控制，核恢复基因Rf 的存在能抑制不育基因的表达，从而使育性得到恢复。至今，辣椒的核恢复基因Rf尚未被克隆，Rf的分子标记与定位已取得了较好的进展，多个与Rf 基因连锁的标记被开发出来，如OPP13-CAPS（1.1 cM）、AFRF8CAPS（1.8 cM）、PR-CAPS（1.8 cM）及 CRF-SCAR（5.3 cM）等(Kim 2005 ;Kim et al. 2006 ; Lee et al. 2008 ; Gulyas et al. 2006 )。
Zhang 等（2000）筛选出2个与Rf连锁的RAPD标记OP131400（0.37 cM）和OW18800（8.12 cM）；唐冬英（2002）利用不育系9704A和恢复系800l构建F2群体，获得1个与Rf连锁的RAPD分子标记QPL09-763（4.18cM）；Lee 等（2004）和 Gulyas 等（2006）利用一个与Rf 连锁的RAPD标记OPT-02/570（5 cM）开发出一个STS标记CRF-SCAR；Kim 等（2006）运用AFLP技术获得了与Rf连锁的标记AFRF8CAPS（1.8cM），并利用2个RAPD 标记OP131400、OW18800和1个CAPS 标记AFRF8CAPS对Rf基因进行了定位；Lee 等（2008）研究发现辣椒雄性部分恢复现象的Pr/Pr 基因型的花粉表现为全可育，而pr/pr 基因型的花粉表现为部分可育，并开发出1个与 pr 紧密连锁的CAPS标记PR-CAPS（1.8 cM），pr 基因与Rf 连锁；杨娟等（2010）利用SSR 标记将Rf 基因定位于辣椒第6 号染色体上，AF208834与Rf 基因的遗传距离为20.8cM，相距较远，不能直接应用于分子标记辅助育种。
SSR分子标记的开发可加速辣椒雄性不育的选育进程，提高育种效果，对辣椒CMS三系的分类和选育提供理论依据。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记，本发明的二个目的是提供一种上述的分子标记的筛选方法，本发明的第三个目的是提供一种辣椒雄性不育恢复基因的SSR分子标记方法，该方法可以快速、准确检测辣椒雄性不育恢复基因。本发明的第三个目的是提供采用上述方法的一种辣椒雄性不育恢复基因的SSR分子标记的试剂盒。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记，该分子标记为pep43标记或pep20标记：
pep43标记：上游引物序列如SEQ ID NO：1 所示，下游引物如SEQ ID NO：2 所示；
pep20标记：上游引物序列如SEQ ID NO：3 所示，下游引物如SEQ ID NO：4 所示。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记的筛选方法，该方法包括以下的步骤：
1）SSR分子标记的引物设计：在网站数据库SGN和The Pepper Genome Database中找分布于辣椒6号染色体上的SSR标记，并进行筛选；SSR 标记主要是利用SSRHunter软件及gramene网站上SSRtool寻找重复序列，并用Primer5软件设计引物；
2）辣椒基因组DNA 的提取：取辣椒131BC5A、139D-21-3亲本和F1、F2 代各单株样品苗期幼嫩叶片0.02~0.05g 克，按常规CTAB 法提取DNA 后，分别保存，备用；
3）基因组DNA 的PCR 扩增：在各PCR 管中分别加入步骤2) 提取的各辣椒样品基因组DNA 1μL后，再依次加入2× Taq PCR MasterMix 5·μL，步骤1）设计的上下游引物各0. 25 μL，加无菌纯水至10 μL，PCR 反应程序：94℃ 3 min预变性后，接着94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个扩增循环，最后72℃延伸5 min，产物4℃保存；
4）PCR 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：各样品分别取扩增产物2.5 μL，并加入由10mM EDTA、0.25％溴酚兰、0.25%二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上样缓冲液2.5 μL，混匀；将混合物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的底端处停止电泳；最后银染显色，进行观察，用数码相机拍照保存；共显性标记统计方法，与母本131BC5A一致的带型记为b，与父本139D-21-3一致的带型记为a，杂合的带型记为h；
5）筛选出与辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记pep43和pep20：pep43标记的上游引物序列如SEQ ID NO：1 所示，下游引物如SEQ ID NO：2 所示，pep20标记的上游引物序列如SEQ ID NO：3 所示，下游引物如SEQ ID NO：4 所示。
为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种辣椒雄性不育恢复基因的SSR分子标记方法，该方法包括以下步骤：
1）根据目标基因筛选获得两个与辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记，pep43标记的上游引物序列如SEQ ID NO：1 所示，下游引物如SEQ ID NO：2 所示，pep20标记的上游引物序列如SEQ ID NO：3 所示，下游引物如SEQ ID NO：4 所示；
2）辣椒基因组DNA 的提取：将各待检测辣椒样品用CTAB 法提取基因组DNA 后，分别保存，备用；
3）PCR 扩增反应体系：扩增反应的总体积为10μL，1 μL DNA模板，2× Taq PCRMasterMix 5·μL，pep43标记或pep20标记的上、下游引物各0. 25 μL，无菌纯水3.5 μL；PCR反应程序为：94℃ 3 min预变性后，接着94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，35个扩增循环，最后72℃延伸5 min，产物4℃保存；
4）PCR 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：各样品分别取扩增产物2.5 μL，并加入由10mM EDTA、0.25％溴酚兰、0.25%二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上样缓冲液2.5 μL，混匀；将混合物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的底端处停止电泳；最后银染显色，进行观察、照相；
5）辣椒样品恢复基因的检测：按共显性标记统计方法，与母本131BC5A一致的带型记为b，与父本139D-21-3一致的带型记为a，杂合的带型记为h，以确定辣椒样品是否具有恢复基因。
为了实现上述的第四个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种辣椒雄性不育恢复基因的SSR分子标记的试剂盒，该试剂盒包括盒体和6 支PCR 管，在2 支PCR 管中分别装有2× Taq PCR MasterMix和聚丙烯酰胺凝胶上样缓冲液，在其他4支PCR 管中分别装辣椒雄性不育恢复基因的SSR分子标记方法用引物，所述的为pep43标记或pep20标记：pep43标记的上游引物序列如SEQ ID NO：1 所示，下游引物如SEQID NO：2 所示；pep20标记的上游引物序列如SEQ ID NO：3 所示，下游引物如SEQ ID NO：4所示。
本发明的有益效果是：
1、SSR分子标记的开发可加速辣椒雄性不育的选育进程，提高育种效果，对辣椒CMS三系的分类和选育提供理论依据；
2、采用自主开发的SSR引物和实验室常规的PCR 技术，通过对辣椒植株的检测，选出具有恢复基因的植株。该方法是对遗传物质的检测，方便、重复性好，且周年均可进行；
3、本发明所提供的试剂盒，将检测用引物和相关试剂综合组装在一盒内，方便实施操作，检测结果稳定可靠。
附图说明
图1 辣椒雄性不育恢复系选育各亲本、杂交世代单株苗期恢复基因检测图；
注：a为pep20引物扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，b为pep43引物扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；M为DL2000 Marker；1为不育系亲本134BC5A，2为134BC5A x139D-21-3 F1 代单株，3 为恢复系亲本139D-21-3，4-24 为134BC5A x139D-21-3 F2 代单株。
图2 对不同辣椒雄性不育材料恢复基因的检测图；
注：c为pep20引物扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，d为pep43引物扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；M为DL2000 Marker；1为不育系对照，2为恢复系对照，3、4、8和9为自选辣椒不育材料，5、6和7为自选辣椒恢复材料。
图3 用试剂盒检测不同辣椒雄性不育材料恢复基因；
注：e为pep20引物扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，f为pep43引物扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；M为DL2000 Marker；1为不育系对照，2为恢复系对照，3、5、8、9和11为自选辣椒恢复材料，4、6和7为自选辣椒不育材料，10为保持系N(msms) 08-131，12为地方辣椒材料08032。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。
实施例1、（辣椒雄性不育恢复基因Rf共分离分子标记的开发）
本例所述辣椒材料：辣椒不育系131BC5A；恢复系139D-21-3；131BC5A x 139D-21-3 F1代单株；131BC5A x 139D-21-3 F2分离群体；
亲本材料与杂交方法：
①亲本材料：
恢复系139D-21-3：2009年春季，从浙江省海宁市许村镇杨渡村的农家田头发现的优良单株，取得同意后采果留种，经多代自交提纯留种而成。恢复系139D-21-3在本专利申请日前公众可以从浙江省农业科学院购买获得，浙江省农业科学院已于2014年10月起向公众发放该生物材料，主要特征为：早熟，座果能力极强，叶色深绿；高抗病毒病，耐高低温能力强；果实纵径约18cm，横径约1.5cm，单果重约10g；果形为细羊角型，果条笔直美观，果表色泽鲜亮，绿熟果深绿色，老熟果火红色；经鉴定基因型为（N）MsMs。
辣椒不育系材料131BC5A： 2009年从浙江省杭州博邦种子有限公司引进的三系配套杂交一代品种‘艳阳’的分离后代中获得的不育株，经大量测交选出优良不育系131，经5代回交而成。不育系材料131BC5A为自育材料在本专利申请日前公众可以从浙江省农业科学院购买获得，浙江省农业科学院已于2014年10月起向公众发放该生物材料，主要特征为：生长势强，叶色深绿，高抗病毒病；花药萎缩不开裂或微裂，无花粉，不育性状稳定，经鉴定基因型为（S）msms。
②杂交方法：
以不育系131BC5A为为母本，恢复系139D-21-3为父本，获得F1杂交组合131BC5A x139D-21-3，F1自交获得131BC5A x 139D-21-3 F2分离群体。
本发明按以下步骤进行：
1、SSR分子标记的引物设计：在网站数据库SGN (http://sgn.cornell.edu/)和The Pepper Genome Database (http://peppersequence.genomics.cn) 中找分布于辣椒6号染色体上的SSR标记，并进行筛选。SSR 标记主要是利用SSRHunter软件及gramene网站上SSRtool （http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool）寻找重复序列，并用Primer5软件设计引物。
2、辣椒基因组DNA 的提取：取辣椒131BC5A、139D-21-3亲本和F1、F2 代各单株样品苗期幼嫩叶片0.02~0.05g 克，按常规CTAB 法提取DNA 后，分别保存，备用；
3、基因组DNA 的PCR 扩增：在各PCR 管中分别加入步骤(2) 提取的各辣椒样品基因组DNA 1μL后，再依次加入2× Taq PCR MasterMix 5·μL，步骤（1）设计的上下游引物各0. 25 μL，加无菌纯水至10 μL，PCR 反应程序：94℃ 3 min预变性后，接着94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个扩增循环，最后72℃延伸5 min，产物4℃保存；
4、PCR 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：各样品分别取扩增产物2.5 μL，并加入由10mM EDTA、0.25％溴酚兰、0.25%二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上样缓冲液2.5 μL，混匀；将混合物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的底端处停止电泳；最后银染显色，进行观察，用数码相机拍照保存；共显性标记统计方法，与母本131BC5A一致的带型记为b，与父本139D-21-3一致的带型记为a，杂合的带型记为h；
5、筛选出与辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记pep43和pep20：pep43标记的上游引物序列如SEQ ID NO：1 所示，下游引物如SEQ ID NO：2 所示，pep20标记的上游引物序列如SEQ ID NO：3 所示，下游引物如SEQ ID NO：4 所示；
6、辣椒样品恢复基因的检测：按步骤（4）所述的标记统计方法来确定辣椒样品是否具有恢复基因（见图1）。
实施例2、（用本发明的标记引物对辣椒雄性不育恢复基因进行检测）
本例所述辣椒材料：辣椒不育系对照材料：131BC5A，编号为1；恢复系对照材料：139D-21-3，编号为2；自选辣椒恢复材料：编号为5、6和7；自选辣椒不育材料：编号为3、4、8和9；
检测方法按以下步骤进行：
1、辣椒基因组DNA的提取：取待检测辣椒样品苗期幼嫩叶片各0.02~0.05克，按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用；
2、基因组DNA 的PCR 扩增：在各PCR 管中分别加入步骤(1) 提取的各辣椒样品基因组DNA 1μL后，再依次加入2× Taq PCR MasterMix 5·μL，pep43或pep20上下游引物各0.25 μL，加无菌纯水至10 μL；扩增条件、程序同实施例1；
3、PCR 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：各样品分别取扩增产物2.5 μL，并加入由10mM EDTA、0.25％溴酚兰、0.25%二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上样缓冲液2.5 μL，混匀；将混合物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，具体分析同实施例1；
4、辣椒样品恢复基因的检测：标记统计方法同实施例1（见图2）。
实施例3、（用本发明试剂盒对不同辣椒材料恢复基因的检测）
本例所述辣椒材料：辣椒不育系对照材料：131BC5A，编号为1；恢复系对照材料：139D-21-3，编号为2；自选辣椒恢复材料：编号为3、5、8、9和11；自选辣椒不育材料：编号为4、6和7；保持系N(msms) 08-131：编号为10；地方辣椒材料08032：编号为12；
检测方法按以下步骤进行：
1、辣椒基因组DNA的提取：取待检测辣椒样品苗期幼嫩叶片各0.02~0.05克，按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用；
2、基因组DNA 的PCR 扩增：用试剂盒提供的引物和试剂进行PCR 扩增，扩增体积为10 μL；加入DNA模板1μL，2× Taq PCR MasterMix 5·μL，上下游引物各0.25 μL，加无菌纯水至10 μL；扩增条件、程序同实施例1；
3、PCR 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：各样品分别取扩增产物2.5 μL，并加入由试剂盒提供的上样缓冲液2.5 μL，混匀；将混合物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，具体分析同实施例1；
4、辣椒样品恢复基因的检测：标记统计方法同实施例1（见图3）。
序列表
<110>浙江省农业科学院
<120>一种检测辣椒雄性不育恢复基因的SSR分子标记方法及其试剂盒
<160>4
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>自主开发的引物，由大连宝生物技术公司合成，用作检测辣椒雄性不育恢复基因的上游引物
<400>1
caacgtatttcacaaacactcaga 24
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>自主开发的引物，由大连宝生物技术公司合成，用作检测辣椒雄性不育恢复基因的的下游引物
<400>2
agtgcgcattcaagagttca 20
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>自主开发的引物，由大连宝生物技术公司合成，用作检测辣椒雄性不育恢复基因的上游引物
<400> 3
aacggttagtttatcttaggtca 23
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>自主开发的引物，由大连宝生物技术公司合成，用作检测辣椒雄性不育恢复基因的的下游引物
<400> 4
acaagcaccgtgtagcgtct 20
Claims (2)
1.辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记，该分子标记为pep43标记或pep20标记：
扩增pep43标记的上游引物序列如SEQ ID NO：1 所示，下游引物如SEQ ID NO：2 所示；扩增pep20标记的上游引物序列如SEQ ID NO：3 所示，下游引物如SEQ ID NO：4 所示。
2.一种辣椒雄性不育恢复基因的SSR分子标记的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括盒体和6 支PCR 管，在2 支PCR 管中分别装有2× Taq PCR MasterMix和聚丙烯酰胺凝胶上样缓冲液，在其他4支PCR 管中分别装辣椒雄性不育恢复基因的SSR分子标记方法用引物，所述的标记为pep43标记或pep20标记：扩增pep43标记的上游引物序列如SEQ ID NO：1 所示，下游引物如SEQ ID NO：2 所示；扩增pep20标记的上游引物序列如SEQ ID NO：3 所示，下游引物如SEQ ID NO：4 所示。
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