CN106048012B - 用于辅助Rf基因选择的分子标记及特异性引物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子标记领域，具体涉及用于辅助Rf基因选择的分子标记及特异性引物和应用。所述分子标记与Rf基因遗传距离为0.7cM与该基因紧密连锁，其特异性上下游引物为：MI16的上游引物序列为：CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCC，MI16的下游引物序列为:GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT。M16标记能够很快鉴别出甜椒中的Rf基因，更好的补充了甜椒在雄性不育方向的研究。

Description

用于辅助Rf基因选择的分子标记及特异性引物和应用
技术领域
本发明涉及分子标记领域，具体涉及用于辅助Rf基因选择的分子标记及特异性引物和应用。
背景技术
利用细胞质雄性不育(CMS，Cytoplasmic male sterility)三系配套杂交制种是省去辣椒制种人工去雄成本的有效方法。由于辣椒生产以果实为收获对象，若父本雄性不育恢复系其育性恢复力不强，则会导致果实种子量不足，从而严重影响杂交F1代商品辣椒果实的外观和产量。因此细胞质雄性不育强恢复性优良父本(恢复系)的选育是辣椒CMS利用中关键问题之一。
辣椒雄性不育恢复性主要受位于辣椒6号染色体上的主效基因Rf(Fertilityrestorer)控制，但是辣椒中Rf分布不够广泛，在无辣味的辣椒(甜椒)中更不多见，而且传统的辣椒CMS恢复系转育过程中需要测交评价，转育周期长，限制了辣椒CMS的应用。辣椒强恢复系的选育和与Rf紧密连锁分子标记的开发和应用，是解决辣椒CMS育种应用瓶颈的有效方法。
辣椒中已报道了多个与Rf紧密连锁的不同类型的分子标记，发现与辣椒Rf遗传距离更近的共显性分子标记，对更好利用辣椒CMS进行育种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与辣椒Rf基因紧密连锁的分子标记。
本发明的另一目的是提供一种利用分子标记鉴定辣椒的育性的方法，以提高辣椒的育种进程和育种效果。
根据本发明的可用于辅助Rf基因选择的分子标记通过以下步骤获得：
以辣椒可育亲本0601M和不育亲本77013A及其构建的:BC5F2群体为试验材料，研究辅助辣椒恢复基因的分子标记。利用辣椒基因组重测序结果比对到辣椒CM334基因组信息6号染色体上(http://passport.pepper.snu.ac.kr/？t＝PGENOME/)；获取已发表的有关Rf基因标记之间的DNA序列并利用其开发标记，共开发233对SSR引物和76对Indel引物，经过初筛，其中8对在双亲及群体中表现多态性。通过与BC5F2群体育性表型对应，将目标基因定位在Indel标记MI16旁，遗传距离为0.7cM。利用此分子标记在新群体中进行辣椒育性的鉴定，可以有效地用来辅助育种工作。
MI16上游引物序列为：CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCC。MI16的下游引物序列为:GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT
随着分子生物学的发展，分子辅助育种技术在辣椒的品种选育和育性的鉴定中得到越来越广泛的应用。利用MI16引物可以在辣椒的苗期通过分子的手段确定辣椒的育性，为辣椒的育种节约了人力物力。0601M属于甜椒品系，M16标记能够很快鉴别出甜椒中的Rf基因，更好的补充了甜椒在雄性不育方向的研究。通过利用本发明提供的特异性引物采用PCR和凝胶电泳技术检测待测辣椒基因组DNA：扩增Indel标记MI16，在辣椒不育亲本中克隆得到约130bp的片段，可育亲本中得到100bp的片段。由于片段长度较短并且差异较大，通过凝胶电泳技术能够很快分辨辣椒植株的育性。MI16引物与Rf基因遗传距离为0.7cM与该基因紧密连锁，能较准确判断辣椒育性。本发明提供了分子标记在辣椒分子标记辅助育种中的应用。
附图说明
图1显示MI16标记在亲本和F1中扩增结果。
图2显示MI16标记在BC5F2群体部分单株扩增结果。注：M：50bp marker；a：与不育亲本77013条带相同；b：与可育亲本0601M条带相同；h：为杂合样品与F1相同。
图3显示MI16标记与Rf基因连锁关系。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
以辣椒不育亲本77013A和可育亲本0601M及其F1同77013回交多次构建的BC5F2群体((77013A×0601M)×77013)为试验材料。
辣椒Rf基因遗传群体构建
以辣椒不育亲本77013A(Capsicum annuum L.)及辣椒恢复系材料0601M(Capsicum annuum L.)为双亲，杂交后获得F1，F1与77013回交多次获得的BC5F2群体((77013A×0601M)×77013)为作图群体，共741个单株。
1、基因组DNA的提取
用CTAB法提取BC5F2所有单株、亲本及F1的基因组DNA，用Biospec-nano微量分光光度计测定浓度和质量，将浓度稀释至100ng/μl。
2、Indel标记开发
利用已知辣椒的标记对应的比对到辣椒CM334和Zunla基因组信息6号染色体上(http://passport.pepper.snu.ac.kr/？t＝PGENOME/；http://peppersequence.genomics.cn/page/species/index.jsp)，获取两标记之间的DNA序列并利用其开发标记，设计Indel引物，以亲本DNA为模板，对Indel引物进行多态性筛选，共筛选到8对具有多态性的标记，再以筛选到的多态性的标记对BC5F2群体进行分析，这8对引物均与Rf基因连锁。其中Indel标记MI16是与辣椒Rf基因连锁最紧密的分子标记。
PCR扩增体系(10μL)：DNA(100ng/μL)0.5μL，10x Green Mix 5μL，上游引物(10μM/μL)0.5μL，下游引物(10μM/μL)0.5μL，ddH2O 3.5μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共34个循环；72℃延伸8min；16℃保存。
Indel产物检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

Claims (3)

1.用于辅助辣椒Rf 基因选择的分子标记，其特征在于，所述分子标记与辣椒Rf基因紧密连锁，与辣椒Rf基因的遗传距离为0.7cM，所述分子标记的特异性上下游引物为：
MI16的上游引物序列为：CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCC，
MI16的下游引物序列为: GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT。
2.用于检测辣椒育性的特异性引物，其特征在于，
上游引物序列为：CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCC，
下游引物序列为: GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT。
3.检测辣椒育性的方法，其特征在于，所述方法包括使用以下特异性引物PCR检测待测辣椒品种的基因组DNA的步骤，
上游引物序列为：CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCC，
下游引物序列为: GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT；
如PCR产物的电泳结果显示仅扩增得到130bp片段，则判断所述待测辣椒品种的育性为不育，如PCR产物的电泳结果显示仅扩增得到100bp的片段，则判断所述待测辣椒品种的育性为可育。
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