CN107881256A - 用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的单核苷酸多态性标记位点、引物对、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的单核苷酸多态性标记位点、引物对、试剂盒及应用，所述的单核苷酸多态性标记位点是桃基因组第5染色体的第12,622,852位核苷酸，该核苷酸为A或T。本发明通过对大量桃种质样品的测序比对，鉴定出4063377个SNPs，利用这些SNPs对129份种质的桃果实苦仁/甜仁性状进行全基因组关联分析，鉴定出与桃果实苦仁/甜仁有显著关联的SNP位于第5染色体的第12,622,852bp处。并设计了特定的AS‑PCR分子标记及用于扩增该标记的引物对，通过琼脂糖电泳结果可以获得该基因分型结果。本发明的检测方法具有简单、快速、成本低的优点，能够实现生产中大规模的应用，具有良好的社会和经济效益。

Description

用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的单核苷酸多态性标记位点、 引物对、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的单核苷酸多态性标记位点、引物对、试剂盒及应用，属于生物技术领域。

背景技术

选择是育种中最重要的环节之一，它是指在一个群体中选择符合要求的基因型，来进行后续的培育。但在传统育种中，由于很难获知后代的基因型，因此选择的依据通常是表现型而非基因型，这种选择方法对质量性状而言一般是有效的，但对数量性状来说，因为其表现型与基因型之间缺乏明确的对应关系，因而效率不高。此外，对于以果实性状为目标的果树来说，这些性状都有其特定的表现时期，通常需要度过3-5年甚至更长时间的童期，因而选择的时间较晚。这对于那些植株高大、占地多、生长季长的作物，特别是果树之类的园艺作物，显然是非常不利的。

近20年来迅速发展起来的基于DNA的分子标记技术，即“分子标记辅助选择”(marker-assisted selection，缩写为MAS)给育种提供了崭新的途径。它通过分析与目的基因紧密连锁的分子标记的基因型来进行育种，从而达到提高育种效率的目的。Yamamoto(2001)利用AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)、RAPD(random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、SSR(Simple SequenceRepeats，简单重复序列)和RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)标记，将果皮颜色定位第6连锁群，与之连锁距离最近(3.7cM)的SSR标记为UDP96-015。由于进行分子标记辅助选择有两个重要的前提，首先是必须得到与目标性状紧密连锁的标记，即建立目标基因与分子标记的连锁关系。其次是检测的自动化，由于分子标记辅助选择要求对育种群体进行大规模检测，因而要求检测的方法要简单、快速、成本低、比较准确，以实现检测过程(包括DNA的提取、分子标记的检测、数据分析等)的自动化。但是，可以发现在过去很长一段时间内采用的分子标记，如RFLP(RestrictionFragment Length Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)、RAPD(randomamplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP和SSR等通常需要酶切或PCR后用电泳检测分型结果，很难实现这一点。

SNPs标记(single nucleotide polymorphisms，单核苷酸多态性)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它在基因组上分布广泛，数量众多，因此很容易检测到相对于RFLP、RAPD、AFLP、SSR标记更连锁的标记，且在检测时具有高通量、简单、快速、高灵敏度的优点，是进行分子标记辅助育种中最具潜力的标记。

桃(学名：Amygdalus persica L.)：蔷薇科、桃属植物。桃果实有苦仁和甜仁两种。由于之前的桃果实苦仁/甜仁性状标记为SSR标记，在染色体上数目少，因此必然导致现有的SSR标记与桃果实苦/甜仁性状连锁距离远，在杂交后代的早期鉴定中准确率较低。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的单核苷酸多态性标记位点、引物对、试剂盒及应用，该标记位点在鉴定桃果实苦仁/甜仁性状时具有较高的准确率。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的单核苷酸多态性标记位点，所述的单核苷酸多态性标记位点是桃基因组第5染色体的第12,622,852位核苷酸，该核苷酸为A或T。

用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的PCR扩增引物对，所述引物对中的上游引物是根据桃基因组第5染色体的第12,622,852位核苷酸及其上游序列进行设计，所述引物对中的下游引物是根据桃基因组第5染色体的第12,622,852位核苷酸的下游序列进行设计。

所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的试剂盒，包括PCR扩增引物对。

一种单核苷酸多态性标记位点在鉴定或辅助鉴定桃果实苦仁/甜仁性状中的应用。

一种单核苷酸多态性标记位点在桃果实苦仁/甜仁性状分子标记辅助选择育种方面的应用。

一种试剂盒在辅助选择育种方面的应用。

一种利用单核苷酸多态性标记位点鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的方法，包括以下步骤：

(1)PCR扩增：以待测桃的基因组DNA为模板，用PCR扩增引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(2)琼脂糖电泳：将完成扩增反应的产物进行1％琼脂糖电泳，统计条带有无及大小；

(3)基因分型：根据条带有无及大小情况判定种质的基因分型，预测桃果实苦仁/甜仁性状。

本发明通过对大量桃种质样品的测序比对，鉴定出4063377个SNPs，利用这些SNPs对129份种质的桃果实苦仁/甜仁性状进行全基因组关联分析，鉴定出与桃果实苦仁/甜仁有显著关联的SNP位于第5染色体的第12,622,852bp处。

本发明针对桃基因组第2版的第5染色体的第12,622,852位核苷酸多态性的特性，设计了特定的AS-PCR分子标记及用于扩增该标记的引物对，通过琼脂糖电泳结果可以获得该基因分型结果。

本发明对129份自然群体种质进行分子标记预测表型的准确率的验证，结果表明，本发明对显性表型(苦仁)中准确率可达100％；针对隐性表型(甜仁)准确率为90.91％。这说明，利用本发明的单核苷酸标记位点进行检测具有简单、快速、成本低的优点，能够实现生产中大规模的应用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1 SNPs标记位点的获得

本发明以从中国农业科学院郑州果树研究所桃种质资源圃随机获得的129份桃种质为样品，采用常规CTAB法提取样品DNA，并通过Illumina HiSeq 2000测序仪对129份桃种质进行重测序，得到121Gb数据，平均覆盖桃基因组89.28％，平均测序深度为4.21×左右。根据测序得到的50-150bp的reads，与桃参考基因组第2版(http://www.rosaceae.org/node/355)进行比对，鉴定出4063377个SNPs，利用这些SNPs对129份种质的表型性状进行全基因组关联分析，鉴定出与桃果实苦/甜仁性状有显著关联的SNP位于第5染色体的第12,622,852bp处。

实施例2利用SNP标记鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的方法

1、DNA提取

采用常规CTAB法提取待测桃样品组织的DNA，去除RNA，DNA样品总体积不低于15μl。用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，计算DNA含量和OD_260/280的比值。DNA样品纯度OD_260/280值应在1.8-2.0之间，浓度稀释至50ng/μl。

2、设计引物

根据桃基因组第5染色体的第12,622,852位处上游400bp，下游100bp序列(具体的核苷酸序列见表1)，设计引物。

表1 SNP旁侧序列信息

其中，W表示A或T。

引物由生物技术公司合成后，稀释PCR扩增上下游引物至浓度均为10.0μM。AS-PCR标记引物序列见表2。

表2引物序列

3、PCR反应体系及电泳检测

(1)首先，配制PCR扩增体系，具体见表3。

表3扩增PCR反应体系

其中，Primer Mix为浓度10.0μM的上游引物和下游引物各加入0.2μl。

(2)将上述试剂转移到PCR管或板中，PCR扩增程序如下：94℃3min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃10min；4℃保存。

配置1％琼脂糖凝胶，对PCR反应后的产物进行电泳，并对电泳结果进行条带统计。统计中出现485bp条带的即种质分型为T/T或A/T，对应果实为苦仁；没有条带的则种质分型为A/A，对应果实为甜仁。

实施例3 129份自然群体利用桃果实苦/甜仁性状SNP开发的AS-PCR标记进行表型性状的盲测验证

1、实验材料的选择

以郑州果树研究所资源圃中保存的129份自然群体种质为实验材料，该群体中有118个苦仁，11份甜仁，甜仁种质包括丽格兰特、离核甜仁、甜仁桃、喀什1号、喀什2号、喀什3号、喀什4号、比南I、秀红、农泊儿扁桃和凯特杏。

2、利用桃果实苦仁/甜仁关联SNP开发的标记进行表型预测的鉴定方法

以本发明桃基因组第5染色体的第12,622,852位开发的一对AS-PCR引物，对129份自然群体试材的果实苦/甜仁性状进行盲测鉴定，具体的鉴定方法参照实施例2的方法。

3、自然群体中分型结果对表型的预测能力(表4)

表4显示了本发明与桃果实苦仁/甜仁关联的AS-PCR标记在129份自然群体的鉴定结果。

表4桃果实苦仁/甜仁关联AS-PCR标记在自然群体的分型结果及表型预测准确率

从表4可以看出，本发明针对显性表型(苦仁)准确率为100.00％，针对隐性表型(甜仁)准确率为90.91％。

综上所述，本发明的SNP位点能够帮助实现利用桃幼苗DNA早期预测桃成龄后果实的苦/甜仁性状的目的，该方法是利用重测序得到的400万以上SNPs中全基因组关联分析得到最关联的位点从而新开发的，由于原始SNPs数量庞大，从而保证了得到的关联标记关联性高，有效提高了利用SNPs预测的准确性。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的单核苷酸多态性标记位点、引物对、试剂盒及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 501

<212> DNA

<213> 桃(Amygdalus persica L.)

<220>

<223> m=a或t

<400> 1

tcaacaaact taccataacg agatgatgag tcattatttc aattagtcaa tttttgttgt 60

gtgcctattt taccctccta caatttcttt tatcaaccca ttattgtcgt agaatttaat 120

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aattactatc tattttttta tttttgtttg aataaaaaat tgttttttct aaataccgga 240

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aataaaaaaa caattaattt a 501

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

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<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

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Claims (8)

1.用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的单核苷酸多态性标记位点，其特征在于，所述的单核苷酸多态性标记位点是桃基因组第5染色体的第12,622,852位核苷酸，该核苷酸为A或T。

2.用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的PCR扩增引物对，其特征在于，所述引物对中的上游引物是根据桃基因组第5染色体的第12,622,852位核苷酸及其上游序列进行设计，所述引物对中的下游引物是根据桃基因组第5染色体的第12,622,852位核苷酸的下游序列进行设计。

3.根据权利要求2所述的用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的PCR扩增引物对，其特征在于，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

4.用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求2或3所述的PCR扩增引物对。

5.一种如权利要求1所述的单核苷酸多态性标记位点在鉴定或辅助鉴定桃果实苦仁/甜仁性状中的应用。

6.一种如权利要求1所述的单核苷酸多态性标记位点在桃果实苦仁/甜仁性状分子标记辅助选择育种方面的应用。

7.一种如权利要求4所述的试剂盒在辅助选择育种方面的应用。

8.一种利用权利要求1所述单核苷酸多态性标记位点鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)PCR扩增：以待测桃的基因组DNA为模板，用PCR扩增引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(2)琼脂糖电泳：将完成扩增反应的产物进行1％琼脂糖电泳，统计条带有无及大小；

(3)基因分型：根据条带有无及大小情况判定种质的基因分型，预测桃果实苦仁/甜仁性状。