CN110331231B - 一种鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记、引物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记、引物和方法，杏仁苦甜性状的Indel标记位于杏仁的Chr5染色体13650674bp位置，杏仁苦甜性状的Indel的特征条带为15bp，核苷酸序列为CTTAACCATCGCTTC。本发明利用两对引物以及与杏仁苦甜性状相关的15bp的插入多态，可在幼苗初期即能预判杏仁的苦甜，用于甜仁杏资源的早期筛选，在杂交育种初期就能筛选后代的杏仁苦甜表型，达到科研、杏仁加工等要求，提高杏育种的筛选效率，缩短育种年限。

Description

一种鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记、引物和方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域。具体地说是一种鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记、引物和方法。
背景技术
苦杏仁在传统医学中是众所周知的，因为它可有效治疗镇咳，祛痰，解痉，泻药。杏仁中含氰二葡萄糖苷和苦杏仁苷的含量决定了其苦味和药理作用。早在1845年，苦杏仁苷首先在俄罗斯被用作抗癌化合物。许多实验结果表明，苦杏仁苷具有抗肿瘤活性；它已在美国、德国、意大利、日本、菲律宾和其他20个国家制造并用于治疗癌症。苦杏仁苷还可以改善癌症晚期患者的症状，延长其生存期。
由于杏仁的药用价值和食用价值，仁味是一种重要的品质特性。然而，杏仁苦甜形成的分子机制仍然未知，因此研究杏仁苦甜性状的形成对杏产业的发展至关重要。
但是杏因其遗传背景复杂、童期长和自交不亲和等特点严重制约了杏遗传育种及新品种的选育。因此通过开发与表型性状相关的标记，应用分子标记辅助育种，弥补常规杂交育种的缺陷，有利于定向选择育种，缩短育种年限，为杏育种的早期选择做铺垫。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种仅通过PCR扩增及一代测序鉴定杏仁苦甜性状的的Indel标记、引物和方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记，杏仁苦甜性状的Indel标记位于杏仁的Chr5染色体13650674bp位置，杏仁苦甜性状的Indel的特征条带为15bp，核苷酸序列为CTTAACCATCGCTTC。
一种鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记的引物，用于扩增Indel标记的引物的核苷酸序列如下：
引物对1:F1:5’-TCAACAAACCATGGACCAGG-3’；
R1:5’-TGTGATTGGATTTTGGCCTCC-3’；
引物对2:F1:5’-TCAACAAACCATGGACCAGG-3’；
R2:5’-TGGCCTCCAATTCTTCAAC-3’。
一种鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测杏仁样品的基因组DNA，获得基因组DNA溶液；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述的引物对1或引物对2对基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)制得的PCR扩增产物经凝胶电泳后，当PCR产物电泳图谱显示200bp处有条带；
(4)PCR产物回收：使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收步骤(3)中获得PCR产物中的目的片段，并进行一代测序；
(5)一代测序结果比对：将测序得到的序列与预测序列进行比对，得到在PCR扩增序列77bp的位置呈现CTTAACCATCGCTTC的序列，则为苦仁杏；若在PCR扩增序列77bp的位置CTTAACCATCGCTTC缺失，则为甜仁杏。
上述鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记的方法，在步骤(2)中，PCR扩增的反应体系为，总体系为50μL；包括：基因组DNA模板的体积1μL、引物对1或引物对2的体积1μL、PremixTaq酶的体积25μL、无菌水22μL，引物的浓度为10μmol/L。
上述鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记的方法，PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性45S，55℃退火45S，72℃延伸60S，共30个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。
上述鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记的方法，在步骤(3)中的凝胶电泳为1.0％的琼脂糖凝胶电泳。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
本发明通过重测序以及GWAS分析获得与杏仁苦甜性状相关的Indel的特征条带为15bp，核苷酸序列为CTTAACCATCGCTTC；并得到两对引物对。
本发明利用两对引物以及与杏仁苦甜性状相关的15bp的插入多态，可在幼苗初期即能预判杏仁的苦甜，用于甜仁杏资源的早期筛选，在杂交育种初期就能筛选后代的杏仁苦甜表型，达到科研、杏仁加工等要求，提高杏育种的筛选效率，缩短育种年限。
附图说明
图1本发明一种鉴定杏仁苦甜性状的Indel方法的苦杏仁和甜杏仁序列。
具体实施方式
一、鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记：
以‘龙王帽’为参考基因组，我们收集了160份甜仁杏和苦仁杏资源(表1)进行重测序和GWAS分析，在Chr5染色体上，发现与苦甜性状显著关联的1个主效位点，以-log10Pvalue＞20为筛选标准，以SNP两侧边界取25kb进行延伸，合并峰值区域，最终将苦甜位点定位于5号染色体上13620093和13823643之间,约为204kb。
表1 160份甜仁杏和苦仁杏资源概况
Figure GDA0003732461640000031
Figure GDA0003732461640000041
进一步分析发现，在该区域内有一个15bp的Indel(Chr5:13650674)与苦甜性状显著关联，即甜杏仁中表现为缺失该15bp纯合或杂合，而苦杏仁样品中则具有该15bp。将具有该15bp核酸的单倍体定义为‘S15’，将缺失该核酸的单倍体定义为S。杏为二倍体，基于该缺失多态，苦甜性状在该位点形成三种基因型为S15S15基因型、SS15基因型或SS基因型。
表2缺失多态性位点基本信息
Indel 单倍体基因型
Chr5:13650674 G/GCTTAACCATCGCTTC
二、鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记的引物
基于15bp缺失多态，以甜仁样品‘龙王帽’和苦仁样品‘F106’基因组序列为参考，利用Primer3(version4.1.0，http://bioinfo.ut.ee/primer3/)，在线软件设计引物设计两对PCR引物如下：
引物对1:
F1:5’-TCAACAAACCATGGACCAGG-3’
R1:5’-TGTGATTGGATTTTGGCCTCC-3’
引物对2：
F1:5’-TCAACAAACCATGGACCAGG-3’
R2:5’-TGGCCTCCAATTCTTCAAC-3’
引物对1鉴别引物的PCR产物长度为205bp；
引物对2鉴别引物的PCR产物长度为203bp。
三、验证
1.确定杏仁苦甜性状序列
(1)提取已知基因型的杏仁的基因组DNA，获得基因组DNA溶液；
本实施例以已知基因型的5份甜仁杏(阿克牙格勒克、毛拉肖、胡安娜、卡拉胡安娜、洛浦红特克)和5份苦仁杏材料(察尔森25-1、敖汉旗15-1、科左后旗01-1、科右中旗16-1、凉城14-1)为待测样品，提取其基因组DNA。
(2)以待测5份甜仁杏基因组和5份苦仁杏基因组为模板，利用引物对1或引物对2进行扩增，得到PCR扩增产物。
建立扩增的反应体系50μL(含有引物对的试剂)，包括:基因组DNA模板1μL、引物各1μL(10μmol/L)、Premix Taq 25μL、无菌水22μL。
上述反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性45S，55℃退火45S，72℃延伸60S，共30个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。
上述反应在PCR扩增热循环仪上进行扩增。
上述引物对1和引物对2分别对应10份待测杏材料的扩增产物取5μL，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增出目的片段。所有材料均获得了的与目标片段长度大小相近的产物。
(3)一代测序
选择引物扩增正常、扩增产物符合预测大小的扩增产物进行切胶回收并测序，甜仁杏扩增产物和苦仁杏扩增产物的测序序列比对结果如图1所示。
将测序得到的序列与预测序列进行比对，得到在PCR扩增序列77bp的位置出现CTTAACCATCGCTTC的缺失，则为甜仁杏；若在PCR扩增序列77bp的位置不缺失，则为苦仁杏，如图1。鉴定结果基因型与已知基因型一致，如表3。
表3
Figure GDA0003732461640000051
Figure GDA0003732461640000061
四.检测Indel分子标记与苦甜性状的相关性
为了验证Indel分子标记的可靠性，利用上述实施例中特异性引物对1或引物对2鉴别10份未知苦甜性状的杏的Chr5:13650674基因型。且在2019年对此10份材料杏仁成熟时期进行品尝测试，获得苦甜性状，与采用本申请特异性引物对1或引物对2鉴别的结果完全一致，如表4所示。
表4
实验编号 材料名称 基因型 苦/甜性状
11 小西沟野杏1 S<sup>15</sup>S<sup>15</sup> 苦
12 小西沟野杏2 S<sup>15</sup>S<sup>15</sup> 苦
13 小西沟野杏3 S<sup>15</sup>S<sup>15</sup> 苦
14 果子沟野杏1 S<sup>15</sup>S<sup>15</sup> 苦
15 果子沟野杏2 S<sup>15</sup>S<sup>15</sup> 苦
16 伊宁野杏1 S<sup>15</sup>S 甜
17 伊宁野杏2 S<sup>15</sup>S 甜
18 伊宁野杏3 S<sup>15</sup>S 甜
19 伊宁野杏4 S<sup>15</sup>S 甜
20 伊宁野杏5 SS 甜
显然，上述实施例仅仅是为清地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。
序列表
<110> 国家林业和草原局泡桐研究开发中心
<120> 一种鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记、引物和方法
<141> 2019-08-22
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Apricot
<400> 1
tcaacaaacc atggaccagg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Apricot
<400> 2
tgtgattgga ttttggcctc c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Apricot
<400> 3
tcaacaaacc atggaccagg 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Apricot
<400> 4
tggcctccaa ttcttcaac 19

Claims (5)

1.一种鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记的引物，其特征在于，用于扩增Indel标记的引物的核苷酸序列如下：
引物对1:F1:5’-TCAACAAACCATGGACCAGG-3’；
R1:5’-TGTGATTGGATTTTGGCCTCC-3’；
引物对2:F1:5’-TCAACAAACCATGGACCAGG-3’；
R2:5’-TGGCCTCCAATTCTTCAAC-3’。
2.一种鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测杏仁样品的基因组DNA，获得基因组DNA溶液；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对1或引物对2对基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)制得的PCR扩增产物经凝胶电泳后，当PCR产物电泳图谱显示200bp处有条带；
(4)PCR产物回收：使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收步骤(3)中获得PCR产物中的目的片段，并进行一代测序；
(5)一代测序结果比对：将测序得到的序列与预测序列进行比对，得到在PCR扩增序列77bp的位置呈现CTTAACCATCGCTTC的序列，则为苦仁杏；若在PCR扩增序列77bp的位置CTTAACCATCGCTTC缺失，则为甜仁杏。
3.根据权利要求2所述的鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记的方法，其特征在于，在步骤(2)中，PCR扩增的反应体系为，总体系为50μL；包括：基因组DNA模板的体积1μL、引物对1或引物对2的体积1μL、Premix Taq酶的体积25μL、无菌水22μL，引物的浓度为10μmol/L。
4.根据权利要求3所述的鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性45S，55℃退火45S，72℃延伸60S，共30个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。
5.根据权利要求4所述的鉴定杏仁苦甜性状的Indel标记的方法，其特征在于，在步骤(3)中的凝胶电泳为1.0％的琼脂糖凝胶电泳。
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