JP3836451B2 - トウガラシ属植物の辛味遺伝子座近傍に位置するｄｎａマーカーを用いた遺伝子型判別方法、ｄｎａマーカー検出に用いられるプライマー、およびこれを用いた遺伝子型判別方法 - Google Patents
トウガラシ属植物の辛味遺伝子座近傍に位置するｄｎａマーカーを用いた遺伝子型判別方法、ｄｎａマーカー検出に用いられるプライマー、およびこれを用いた遺伝子型判別方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【本発明の属する技術分野】
本発明の対象は、トウガラシ属の植物、特にカプシクム・アヌウム（Capsicum annuum ）の辛味成分の生産に関する遺伝子型を判定するための、簡便かつ効率的な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トウガラシ属植物の一種であるカプシクム・アヌウム（Capsicum annuum ）には、いわゆるトウガラシのように辛味成分（カプサイシノイド）を生産するものと、ピーマンのように辛味成分を生産しないものが存在する。辛味成分の生産能力の有無は、辛味遺伝子座の遺伝子型により決定され、この遺伝子型が優性ホモ型のPunPunあるいはヘテロ型のPunpunであれば辛味の生産能力を有し、劣性ホモ型のpunpunであれば辛味の生産能力がないことが知られている（非特許文献１）。従来より、ピーマン等の育種では辛味成分の生産能力を有する野生種等から病害抵抗性遺伝子等の導入が行われることが多く、その際辛味遺伝子座についても劣性ホモ型のものを選抜する必要があった。
【非特許文献１】
Daskalov, S. and J.M. Poulos. 1994. Capsicum Newsletter 13:15-26、Deshpande, R.B. 1935. Indian Jour. Agr. Sci. 5:513-516
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、辛味成分の生産能力を有する品種の中には、‘ししとう’や京都府の在来品種である‘万願寺’トウガラシのように通常辛味成分を生産していなくても栽培環境の変化によって突然辛味を発現するものがあるため、辛味遺伝子座が劣性ホモ型のものを選抜することが非常に困難となっている。したがって、本発明は、栽培環境に関わらず安定的に辛味成分を生産しないものの選抜を目的とした、より簡易に辛味遺伝子座の遺伝子型の判定を可能ならしめる方法を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、辛味遺伝子と連鎖するＤＮＡ断片を見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置し、配列番号１で表される塩基配列よりなるＤＮＡ、または配列番号１で表される塩基配列よりなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡマーカーを用いて以下ａ）〜ｃ）の少なくとも一の基準：
ａ）該ＤＮＡマーカーの増幅断片の有無、
ｂ）該ＤＮＡマーカーの増幅断片の長さ、および
ｃ）該ＤＮＡマーカーの増幅断片の制限酵素による切断パターン、
によりPun 座の遺伝子型を判別することを特徴とする方法である。
【０００５】
また、本発明は、トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置するＤＮＡマーカーを検出するための１組のプライマーであって、配列番号１の塩基配列より任意に選んだ連続した１５〜４０塩基の長さの塩基配列（ｘ）で規定されるプライマーと、配列番号１の塩基配列より任意に選んだ連続した１５〜４０塩基の長さの塩基配列（ｙ）と相補的な塩基配列で規定されるプライマーとからなることを特徴とするものである。
【０００６】
さらに、本発明は、前記プライマーの配列が、配列番号２と配列番号３であることを特徴とするものである。配列番号２は、上記の「配列番号１の塩基配列より任意に選んだ連続した１５〜４０塩基の長さの塩基配列（ｘ）で規定されるプライマー」に相当し、配列番号３は、「配列番号１の塩基配列より任意に選んだ連続した１５〜４０塩基の長さの塩基配列（ｙ）と相補的な塩基配列で規定されるプライマー」に相当する。
【０００７】
また、本発明は、Pun 座の遺伝子型を判定する方法において、トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置するＤＮＡマーカーを検出するため、前記１組のプライマーを用いて、トウガラシ属植物から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、トウガラシの辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置するＤＮＡマーカーを増幅し、増幅されたＤＮＡマーカーを制限酵素Mbo Ｉで処理した場合、切断パターンが異なることにより、Pun 座の遺伝子型を判定することをも特徴とする。なお、この場合、前記１組のプライマーの配列が、配列番号２と配列番号３であるのがよい。
【０００８】
更に、本発明では、辛味遺伝子と連鎖した新たなマーカーの開発により、これを使用して、誤判定の可能性を極限まで減らすことを可能とした。例えば、前記ａ）〜ｃ）の少なくとも１の基準によりPun 座の遺伝子型を判別する方法において、配列番号４（１０塩基のＲＡＰＤ用プライマー）の記載の塩基配列で規定されるプライマーを用いてＰＣＲによるＤＮＡマーカーの増幅を行い、 トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置する約１kbp のＤＮＡマーカーを用いて、より効率のよい判別を可能とする。なお、本発明において約１kbp とは０．９〜１．１kbp を意味する。
【０００９】
なお、この場合、配列番号５および６で挟まれた約１kbp のＤＮＡマーカーを使用するのが好ましい。
【００１０】
また、トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置するＤＮＡマーカーを検出するための１組のプライマーとしては、配列番号５の塩基配列より任意に選んだ連続した１５〜４０塩基の長さの塩基配列で規定されるプライマーと、このプライマーと向かい合う配列番号６の塩基配列より任意に選んだ連続した１５〜４０塩基の長さの塩基配列で規定されるプライマーとからなるものであってもよい。
【００１１】
かかる１組のプライマーは、プライマーの配列が、配列番号７および９とこれと向かい合う配列番号８および１０であってもよい。
【００１２】
なお、本発明では、前述の配列番号５と配列番号６で規定されるプライマーや、配列が配列番号７および９とこれに向かい合う配列番号８および１０であるような１組のプライマーを用いてトウガラシから抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置するＤＮＡマーカーを増幅し、増幅されたＤＮＡマーカーを制限酵素Hsp 92IIで処理した場合、切断パターンが異なることにより、Pun 座の遺伝子型を判別する方法も可能とする。
【００１３】
更に、本発明では、前述のPun 座の遺伝子型を判別する方法において、Pun 座をはさむ位置に座乗する２つのＤＮＡマーカーを用いることも効果的である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、上記課題を解決するため、ＲＡＰＤ法を用いて多数の増幅断片の中から辛味遺伝子座と連鎖したＤＮＡ断片を見いだし、これの塩基配列を明らかにし、この塩基配列に基づいてプライマーを作成し、ＰＣＲ法を用いて安定して増幅できるＤＮＡマーカーの特定を行った。さらに、このＤＮＡマーカーを適当な制限酵素により切断することにより、辛味遺伝子座の遺伝子型を識別できるようにした。すなわち、本発明は辛味遺伝子座の近傍に位置し、配列番号１で表される塩基配列よりなるＤＮＡマーカー、または配列番号１で表される塩基配列よりなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡマーカーを利用して、これを制限酵素Mbo Ｉで処理した場合、切断パターンが異なることにより、辛味遺伝子座の遺伝子型を判定できるようにした。
【００１５】
ここでいう、トウガラシの辛味遺伝子座であるPun 座の「ＤＮＡマーカー」とは、トウガラシの辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置するＤＮＡで、トウガラシのＤＮＡを調べることにより、間接的に辛味遺伝子座の遺伝子型を判別できるものを指す。「近傍」とは、本発明に係るＤＮＡマーカーがトウガラシの育種において実用的に利用可能な距離を指す。遺伝子間の距離は、分析に用いる集団の個体数や種類により変動するが、具体的には約１５cM（センチモルガン）以下が好ましく、さらに好ましくは１０cM以下で、５cM以下が特に好ましい。本発明のトウガラシの辛味遺伝子座の近傍に位置するＤＮＡマーカーとしては、具体的には例えば、配列番号１で表される塩基配列によるＤＮＡまたは配列番号１で表される塩基配列によるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡを挙げることができる。ここで、「配列番号１で表される塩基配列によるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡ」とは、配列番号１で表されるＤＮＡと同様に辛味遺伝子座の近傍に位置し、配列番号１で表される塩基配列の一部を含有するＤＮＡ、または配列番号１で表される塩基配列の一部を含有し、かつ配列番号１で表される塩基配列に隣接する塩基配列を含有するＤＮＡを意味する。本発明のトウガラシの辛味遺伝子座の近傍に位置するＤＮＡマーカーである、配列番号１に示されるＤＮＡまたは配列番号１で表されるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡを有するかどうかの確認は、サザンハイブリダイゼーション法を用いて分析可能であるが、ＰＣＲ法を利用して分析することが望ましい。
【００１６】
次に、ＰＣＲ法によって簡便かつ安定して増幅可能なＤＮＡマーカーを用いたPun 座の遺伝子型の判別方法について説明する。まず、供試しようとするトウガラシから鋳型となるＤＮＡを抽出するが、ＤＮＡを抽出するための組織としては植物体のどの部位を用いてもよく、また、生育段階も問わない。また、抽出方法はどのような方法も用いることができ、粗精製のＤＮＡを用いることもできる。抽出したＤＮＡを鋳型にＤＮＡマーカーをＰＣＲ法により増幅させる。
【００１７】
ＰＣＲ法を用いて遺伝子型を判別する方法としては、（１）ある遺伝子型においてのみ特異的断片を増幅し、増幅の有無により遺伝子型を判別する方法、（２）増幅断片の長さが遺伝子型間で異なることに基づき、この増幅断片の長さを比較することにより遺伝子型を判別する方法、（３）全ての遺伝子型で増幅する同じ長さの断片をある制限酵素で処理した場合、遺伝子型により切断パターンが異なることに基づき、切断パターンを比較することにより遺伝子型を判別する方法などがある。（２）および（３）では遺伝子型がホモであるかヘテロであるかも同時に判別することが可能である。例えば、配列番号２と３に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅した断片を制限酵素Mbo Ｉで処理した場合、３つの断片に切断される品種と４つの断片に切断される品種がある。この切断パターンが異なることに基づき、辛味遺伝子座の遺伝子型の判定を行うことが可能となる。
【００１８】
なお、本発明では、トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置する強く連鎖した２つのマーカーで目的の遺伝子を挟み込むことにより、誤判定の可能性を極限まで減らすことを可能とした。すなわち、配列番号５と６で挟まれた約１kbp のＤＮＡマーカーを用いて、より効率のよい判別を可能とする。
【００１９】
このマーカーと先に開発されたマーカー（配列番号１で表わされる塩基配列よりなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡマーカー）の間の遺伝距離は約８cM以下であり、この距離での二重組み換えの可能性は極めて低いため、これらの使用により、辛味遺伝子座の遺伝子型をより正確に判別することが可能となった。
【００２０】
以下に実施例をあげて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例にのみ限定されるものではない。
【００２１】
【実施例】
実施例１：（植物材料）
辛味成分を生産しない‘とんがり’（ナント種苗より入手）と辛味成分を生産する‘万願寺’（京都府農業資源研究センター育成系統）を交配したＦ1 個体の自殖Ｆ2 集団を８７個体育成し、この全ての個体について辛味成分の生産能力について調査した。その結果、辛味成分を生産する個体と生産しない個体が、６０個体と２７個体に分離した。この結果により、辛味成分の生産能力の有無は単一の遺伝子により支配されていることが確認された。以降、この８７個体のＦ2 集団を用いて辛味遺伝子の連鎖マーカーの検索を行った。
【００２２】
（トウガラシの辛味遺伝子に連鎖した多型断片の探索）
トウガラシからのＤＮＡの抽出は、ＤＮＡ extraction kits （Nucleon PhytoPure ，Amersham社）を用いて行った。得られたＤＮＡを鋳型とし、約５００種類の市販の１０mer オリゴヌクレオチド（オペロン社）をプライマーとしてＲＡＰＤ法の反応を行った。ＲＡＰＤ法の反応液組成および反応条件は以下の通りである。反応液は10mM Tris-HCl （pH8.3 ）、50mM KCl、1.5mM MgCl2 、0.05％ TritonX-100、200 μM dNTP mixture、0.5units Taq ＤＮＡ polymerase（Takara社）、0.42μM プライマー、12ng鋳型ＤＮＡを含み12μｌとなるように水で調節した。反応サイクルは９４℃にて３分間保持した後、９４℃にて１分間、４０℃にて２分間、７２℃にて２分間の繰り返しを４０回行った後、７２℃で５分間反応させ、その後４℃で維持した。なお、反応にはPROGRAM TEMP CONTROL SYSTEM （PC-800，ASTEC 社）を用いた。次にＰＣＲ反応液８μｌを、1.7 ％アガロースゲル、TBE バッファーを用いた電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅断片を検出した。その結果、親品種である‘とんがり’と’万願寺’の間で約１９２種類のプライマーを用いた際に多型断片が検出できた。
【００２３】
次にＦ2 個体のうち辛味成分を生産する個体と生産しない個体の各７個体から抽出したＤＮＡを鋳型として、親品種間で多型断片の認められた１９２種類のプライマーを用いてＲＡＰＤ法を行った。しかし、辛味成分を生産する個体のみに特異的な多型断片は認められなかった。したがって、組換え型の比較的少なかった１０種類のプライマーを用いて全８７個体の多型断片の分離を調査した。その結果、プライマー 5 '-agcagcgcac-3' （オペロン社の品名「OPY-09」）を用いた場合に得られた約０．８kbp の多型断片で組換え型が少なく、辛味遺伝子と連鎖していることがわかった。
【００２４】
図１は親品種である‘とんがり’、‘万願寺’およびＦ2 個体の３個体のＤＮＡを鋳型にし、「OPY-09」をプライマーに用いてＲＡＰＤ法により反応を行った際の増幅産物の電気泳動像を示す。鋳型にしたＤＮＡは左のレーンから‘万願寺’、‘とんがり’およびＦ2 個体の３個体であり、Ｆ2 個体の辛味成分の生産能力は左から「なし」、「あり」および「あり」である。泳動像からもわかるように、辛味遺伝子と連鎖した約０．８kbp の多型断片（矢印）のＲＡＰＤ法による増幅は極めて不安定であった。
【００２５】
（辛味遺伝子連鎖マーカーの塩基配列の決定）
辛味遺伝子に連鎖した約０．８kbp のＤＮＡ断片の塩基配列を決定するため、以下の操作を行った。‘万願寺’のＤＮＡを鋳型にして増幅した約０．８kbp のＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収し、TAクローニングキット（pGEM-T Easy Vector System 、プロメガ社）により、プラスミドpGEM-T Easy Vectorにサブクローニングし、大腸菌（DH5 α）に形質転換した。塩基配列の決定はABI PRISM BIG DYE Terminator Sequence Kit （ABI 社）を用いて、サブクローニングしたプラスミドを鋳型にシークエンス反応液を調整し、ABI PRISM 310 （ABI 社）装置で解析した。以上の操作の結果、辛味遺伝子に連鎖した約０．８kbp のＤＮＡ断片の塩基配列は、配列番号１に示すとおりであった。
【００２６】
実施例２：（辛味遺伝子連鎖マーカーの遺伝子型の識別）
配列番号１記載の塩基配列情報から、辛味遺伝子に連鎖したＤＮＡ断片を特異的に増幅するためのプライマーペアを設計した。設計したプライマーの塩基配列は配列番号２および３に示した。このプライマーペアを用いて以下の反応液組成および反応条件で親品種である‘とんがり’と‘万願寺’のＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。反応液は 10mM Tris-HCl（pH8.3 ）、50mM KCl、1.5mM MgCl2 、0.05％ Triton X -100、200 μM dNTP mixture、0.5units Taq ＤＮＡ polymerase（Takara社）、各0.21μM プライマー、12ng鋳型ＤＮＡを含み12μｌとなるように水で調節した。反応サイクルは９４℃で３分間保持した後、９４℃にて１分間、６５℃にて２分間、７２℃にて２分間の繰り返しを３０回行った後、７２℃で５分間反応させ、その後４℃で維持した。その結果、親品種間で同じサイズと思われるＤＮＡ断片の増幅が認められた。図２に、このＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。左のレーンが‘万願寺’、右のレーンが‘とんがり’を鋳型にした増幅産物である。
【００２７】
次に配列番号２および３のプライマーペアを用いて上記の方法でＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。得られた増幅産物を制限酵素Mbo Ｉで処理し、８％アクリルアミドゲルで電気泳動し分画した。その結果、‘万願寺’では３つの断片（約１７０bp、約２２０bp、および約３４０bp）に切断されたのに対し、‘とんがり’では４つの断片（約１４０bp、約１６０bp、約２００bp、および約２２０bp）に切断された。すなわち、‘とんがり’の増幅産物では‘万願寺’のそれよりも制限酵素Mbo Ｉの認識部位が１箇所多いことがわかった。また、Ｆ2 個体では‘万願寺’のホモ型、‘とんがり’のホモ型およびこれらの２つのパターンを併せ持ったヘテロ型を確認できた。この方法により、辛味遺伝子連鎖マーカーの遺伝子型の識別が可能となった。図３にこの結果を示した。左のレーンから順に‘万願寺’、‘とんがり’、Ｆ2 個体の４個体であり、Ｆ2 個体は左からヘテロ型、ヘテロ型、‘とんがり’ホモ型および‘万願寺’ホモ型である。
【００２８】
（辛味遺伝子と辛味遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーの距離）
‘とんがり’と‘万願寺’の交配Ｆ2 集団の８７個体について、上記の方法により辛味遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーの遺伝子型の判定を行った。その結果と辛味成分の生産能力の有無を表１に示した。Ｆ2 集団では辛味遺伝子座の遺伝子型の判定は不可能であるため、表現型での比較を行ったところ、９個体で組換えが起こっており、これらの遺伝子間の距離は約１０cMと計算された。したがって、配列番号１に示すＤＮＡマーカーが辛味遺伝子座の連鎖マーカーとして実用的に利用できる距離であることがわかった。
【００２９】
【表１】
【００３０】
実施例３：（他の品種での辛味遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーの利用）
さらに、辛味成分を生産する‘伏見甘長’（タキイ種苗より入手）と‘とんがり’との交配Ｆ2 集団の１０３個体を用いて、辛味遺伝子と連鎖マーカーの遺伝子分析を行ったところ、表２に示すように、４個体で組換えが起こっており、遺伝子間の距離は約４cMであった。また、同一の種（カプシクム・アヌウム）に含まれる１５品種から抽出した粗精製のＤＮＡを鋳型に配列番号２および３のプライマーペアを用いてＰＣＲを行ったところ、全ての品種でほぼ同一サイズのＤＮＡ断片が増幅されることが確認され、これらの１５品種についての辛味成分の生産性有無の判定に応用可能であることが示唆された。用いた１５品種のうちの８品種を以下に列挙する。
ベルマサリ（長野県原種センター）、新さきがけ２号（高知前川種苗）、カリフォルニアワンダー、鷹の爪、八つ房、ししとう（いずれも大和農園）、南禅寺トウガラシ（丸種種苗）、ニューエース（タキイ種苗）。
【００３１】
【表２】
【００３２】
実施例４：（植物材料）
辛味成分を生産しない‘とんがり’（ナント種苗より入手）と辛味成分を生産する‘万願寺’（京都府農業資源研究センター育成系統）を交配したＦ1 個体から葯培養により作出した倍加半数体（ＤＨ）集団を１２３個体育成し、この全ての個体について辛味成分の生産能力について調査した。その結果、辛味成分を生産する個体と生産しない個体が、６９個体と５４個体に分離した。ＤＨ集団の個体はヘテロ接合体がなく、全ての固体がホモ結合体で固定している特徴を持つ。以降、この１２３個体のＤＨ集団を用いて辛味遺伝子の連鎖マーカーの検索を行った。
【００３３】
「トウガラシの辛味遺伝子に連鎖した多型断片の探索」を実施例１と同様の方法で実施しその結果、親品種である‘とんがり’と’万願寺’の間で約１９２種類のプライマーを用いた際に多型断片が検出できた。
【００３４】
次にＤＨ集団のうち辛味成分を生産する個体と生産しない個体の各７個体から抽出したＤＮＡを鋳型として、親品種間で多型断片の認められた１９２種類のプライマーを用いてＲＡＰＤ法を行った。しかし、辛味成分を生産する個体あるいは生産しない個体のみに特異的な多型断片は認められなかった。したがって、組換え型の比較的少なかったプライマーを用いて全１２３個体の多型断片の分離を調査した。その結果、配列番号４に記載されるプライマー 5'-acaggtgcgt-3'（オペロン社の品名「OPR-12」）を用いた場合に得られた約１kbp の多型断片で組換え型が少なく、辛味遺伝座の劣性遺伝子と連鎖していることがわかった。
【００３５】
図４は親品種である‘とんがり’、‘万願寺’およびＤＨ集団の３個体のＤＮＡを鋳型にし、「OPR-12」をプライマーに用いてＲＡＰＤ法により反応を行った際の増幅産物の電気泳動像を示す。鋳型にしたＤＮＡは左のレーンから‘万願寺’、‘とんがり’およびＤＨ集団の３個体であり、ＤＨ個体の辛味成分の生産能力は全て「なし」である。
【００３６】
（辛味遺伝子座連鎖マーカーの塩基配列の決定）
辛味遺伝子座に連鎖した約１．０kbp のＤＮＡ断片の塩基配列を決定するため、以下の操作を行った。‘とんがり’のＤＮＡを鋳型にして増幅した約１．０kbp のＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収し、TAクローニングキット（pGEM-T Easy Vector System 、プロメガ社）により、プラスミドpGEM-T Easy Vectorにサブクローニングし、大腸菌（DH5 α）に形質転換した。塩基配列の決定は、サブクローニングしたプラスミドを鋳型にシークエンス反応液を調整し、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システム（ベックマン・コールター社）で解析した。以上の操作の結果、辛味遺伝子座に連鎖した約１．０kbp のＤＮＡ断片の中央部を除く両端の塩基配列を配列番号５と配列番号６に示した。
【００３７】
実施例５：（辛味遺伝子座連鎖マーカーの遺伝子型の識別）
配列番号５と６記載の塩基配列情報から、辛味遺伝子に連鎖したＤＮＡ断片を特異的に増幅するためのプライマーペアを設計した。設計したプライマーの塩基配列は配列番号７および８と配列番号９および１０に示した。配列番号７および８のプライマーペアを用いて以下の反応液組成および反応条件で親品種である‘とんがり’と‘万願寺’のＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。反応液は 10mM Tris-HCl（pH8.3 ）、50mM KCl、1.5mM MgCl2 、0.05％ TritonX-100、200 μM dNTP mixture、0.5units Taq ＤＮＡ polymerase（Takara社）、各0.21μM プライマー、12ng鋳型ＤＮＡを含み12μｌとなるように水で調節した。反応サイクルは９４℃で３分間保持した後、９４℃にて１分間、６０℃にて２分間、７２℃にて２分間の繰り返しを３０回行った後、７２℃で５分間反応させ、その後４℃で維持した。その結果、非特異的なＤＮＡ断片の増幅が認められるため１回目のＰＣＲ産物を１００倍に希釈した後、配列番号９および１０のプライマーペアを用いて、 同じ条件でＰＣＲ反応を行った。その結果、 親品種間で同じサイズと思われるＤＮＡ断片の増幅が認められた。図２に、このＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。左のレーンが‘万願寺’、右のレーンが‘とんがり’を鋳型にした増幅産物である。
【００３８】
次に配列番号７および８と配列番号９および１０のプライマーペアを用いて上記の方法でＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。得られた増幅産物を制限酵素Hsp 92IIで処理し、電気泳動し分画した。その結果、サイズマーカーの１１８bp付近に、切断断片長の違いによる、多型が確認できた。また、ＤＨ集団では‘万願寺’のホモ型‘とんがり’のホモ型の２つのパターンを確認できた。この方法により、辛味遺伝子連鎖マーカーの遺伝子型の識別が可能となった。図６は上記方法によりＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を６種類の制限酵素で処理した際の泳動像であり、偶数番号が‘万願寺’、奇数番号が‘とんがり’を示し、多型の得られたHsp 92IIで切断したものは１２と１３レーンに示した。
【００３９】
（辛味遺伝子と辛味遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーの距離）
‘とんがり’と‘万願寺’のＤＨ集団の１２３個体について、辛味遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーの遺伝子型と辛味成分の生産能力の有無を表３に示した。その結果、６個体で組換えが起こっており、これらの遺伝子間の距離は約５cMと計算された。したがって、配列番号５および６を両端にもつ約１．０kbp のＤＮＡマーカーが辛味遺伝子座の連鎖マーカーとして実用的に利用できる距離であることがわかった。
【００４０】
【表３】
【００４１】
なお、ＤＨ集団で実施例１に示した辛味遺伝子連鎖マーカーを適用したところ、辛味遺伝子と３個体で組換えが確認され、２．４cMの遺伝距離であった。さらに、この２つの連鎖マーカーは辛味遺伝子座を挟む形で連鎖していることも確認できた。従って、上記２つの辛味遺伝子連鎖マーカーを用いることにより、より正確に辛味遺伝子座の遺伝子型の判定が可能であり、辛味の有無に関する形質を間違いなく選抜できることが明らかとなった。
【００４２】
なお、本発明は上述した実施例には限られない。例えば、ＤＮＡをマーカーとして、配列番号１や５および６に表された塩基配列の一部を少なくとも含むＤＮＡ断片を用いて、辛味遺伝子座の遺伝子型の判定を行っても構わない。さらに、このようなＤＮＡマーカーを用いる際に、例えば制限酵素Mbo ＩやHsp 92IIとは異なる他の一般的な制限酵素を、単独もしくは組み合わせて用いて処理することで、遺伝子型の判定を行うことも可能である。
【００４３】
【発明の効果】
本発明による配列番号１に表される辛味遺伝子座近傍のＤＮＡマーカーと、これをＰＣＲ法および制限酵素処理を用いて行う辛味遺伝子座の遺伝子型の判定方法は、トウガラシ属の植物、特にカプシクム・アヌウムの品種に適応可能であり、これにより、例えば辛味成分を生産するトウガラシ品種と生産しないトウガラシ品種を交配して育種を行う際に、辛味成分の生産能力の有無を効率的かつ簡便に判定できるという効果を奏する。
【００４４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、OPY-09をプライマーに用いてＲＡＰＤ法により反応を行った際の増幅産物の電気泳動像である。
【図２】 図２は、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片の電気泳動像である。
【図３】 図３は、ＰＣＲによる増幅産物を制限酵素Mbo Ｉで処理して得られた断片の電気泳動像である。
【図４】 図４は、OPR-12をプライマーに用いてＲＡＰＤ法により反応を行った際の増幅産物の電気泳動像である。
【図５】 図５は、特異的にＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片の電気泳動像である。
【図６】 図６は、特異的にＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を様々な制限酵素処理して得られた断片の電気泳動像である。
【本発明の属する技術分野】
本発明の対象は、トウガラシ属の植物、特にカプシクム・アヌウム（Capsicum annuum ）の辛味成分の生産に関する遺伝子型を判定するための、簡便かつ効率的な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トウガラシ属植物の一種であるカプシクム・アヌウム（Capsicum annuum ）には、いわゆるトウガラシのように辛味成分（カプサイシノイド）を生産するものと、ピーマンのように辛味成分を生産しないものが存在する。辛味成分の生産能力の有無は、辛味遺伝子座の遺伝子型により決定され、この遺伝子型が優性ホモ型のPunPunあるいはヘテロ型のPunpunであれば辛味の生産能力を有し、劣性ホモ型のpunpunであれば辛味の生産能力がないことが知られている（非特許文献１）。従来より、ピーマン等の育種では辛味成分の生産能力を有する野生種等から病害抵抗性遺伝子等の導入が行われることが多く、その際辛味遺伝子座についても劣性ホモ型のものを選抜する必要があった。
【非特許文献１】
Daskalov, S. and J.M. Poulos. 1994. Capsicum Newsletter 13:15-26、Deshpande, R.B. 1935. Indian Jour. Agr. Sci. 5:513-516
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、辛味成分の生産能力を有する品種の中には、‘ししとう’や京都府の在来品種である‘万願寺’トウガラシのように通常辛味成分を生産していなくても栽培環境の変化によって突然辛味を発現するものがあるため、辛味遺伝子座が劣性ホモ型のものを選抜することが非常に困難となっている。したがって、本発明は、栽培環境に関わらず安定的に辛味成分を生産しないものの選抜を目的とした、より簡易に辛味遺伝子座の遺伝子型の判定を可能ならしめる方法を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、辛味遺伝子と連鎖するＤＮＡ断片を見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置し、配列番号１で表される塩基配列よりなるＤＮＡ、または配列番号１で表される塩基配列よりなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡマーカーを用いて以下ａ）〜ｃ）の少なくとも一の基準：
ａ）該ＤＮＡマーカーの増幅断片の有無、
ｂ）該ＤＮＡマーカーの増幅断片の長さ、および
ｃ）該ＤＮＡマーカーの増幅断片の制限酵素による切断パターン、
によりPun 座の遺伝子型を判別することを特徴とする方法である。
【０００５】
また、本発明は、トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置するＤＮＡマーカーを検出するための１組のプライマーであって、配列番号１の塩基配列より任意に選んだ連続した１５〜４０塩基の長さの塩基配列（ｘ）で規定されるプライマーと、配列番号１の塩基配列より任意に選んだ連続した１５〜４０塩基の長さの塩基配列（ｙ）と相補的な塩基配列で規定されるプライマーとからなることを特徴とするものである。
【０００６】
さらに、本発明は、前記プライマーの配列が、配列番号２と配列番号３であることを特徴とするものである。配列番号２は、上記の「配列番号１の塩基配列より任意に選んだ連続した１５〜４０塩基の長さの塩基配列（ｘ）で規定されるプライマー」に相当し、配列番号３は、「配列番号１の塩基配列より任意に選んだ連続した１５〜４０塩基の長さの塩基配列（ｙ）と相補的な塩基配列で規定されるプライマー」に相当する。
【０００７】
また、本発明は、Pun 座の遺伝子型を判定する方法において、トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置するＤＮＡマーカーを検出するため、前記１組のプライマーを用いて、トウガラシ属植物から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、トウガラシの辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置するＤＮＡマーカーを増幅し、増幅されたＤＮＡマーカーを制限酵素Mbo Ｉで処理した場合、切断パターンが異なることにより、Pun 座の遺伝子型を判定することをも特徴とする。なお、この場合、前記１組のプライマーの配列が、配列番号２と配列番号３であるのがよい。
【０００８】
更に、本発明では、辛味遺伝子と連鎖した新たなマーカーの開発により、これを使用して、誤判定の可能性を極限まで減らすことを可能とした。例えば、前記ａ）〜ｃ）の少なくとも１の基準によりPun 座の遺伝子型を判別する方法において、配列番号４（１０塩基のＲＡＰＤ用プライマー）の記載の塩基配列で規定されるプライマーを用いてＰＣＲによるＤＮＡマーカーの増幅を行い、 トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置する約１kbp のＤＮＡマーカーを用いて、より効率のよい判別を可能とする。なお、本発明において約１kbp とは０．９〜１．１kbp を意味する。
【０００９】
なお、この場合、配列番号５および６で挟まれた約１kbp のＤＮＡマーカーを使用するのが好ましい。
【００１０】
また、トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置するＤＮＡマーカーを検出するための１組のプライマーとしては、配列番号５の塩基配列より任意に選んだ連続した１５〜４０塩基の長さの塩基配列で規定されるプライマーと、このプライマーと向かい合う配列番号６の塩基配列より任意に選んだ連続した１５〜４０塩基の長さの塩基配列で規定されるプライマーとからなるものであってもよい。
【００１１】
かかる１組のプライマーは、プライマーの配列が、配列番号７および９とこれと向かい合う配列番号８および１０であってもよい。
【００１２】
なお、本発明では、前述の配列番号５と配列番号６で規定されるプライマーや、配列が配列番号７および９とこれに向かい合う配列番号８および１０であるような１組のプライマーを用いてトウガラシから抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置するＤＮＡマーカーを増幅し、増幅されたＤＮＡマーカーを制限酵素Hsp 92IIで処理した場合、切断パターンが異なることにより、Pun 座の遺伝子型を判別する方法も可能とする。
【００１３】
更に、本発明では、前述のPun 座の遺伝子型を判別する方法において、Pun 座をはさむ位置に座乗する２つのＤＮＡマーカーを用いることも効果的である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、上記課題を解決するため、ＲＡＰＤ法を用いて多数の増幅断片の中から辛味遺伝子座と連鎖したＤＮＡ断片を見いだし、これの塩基配列を明らかにし、この塩基配列に基づいてプライマーを作成し、ＰＣＲ法を用いて安定して増幅できるＤＮＡマーカーの特定を行った。さらに、このＤＮＡマーカーを適当な制限酵素により切断することにより、辛味遺伝子座の遺伝子型を識別できるようにした。すなわち、本発明は辛味遺伝子座の近傍に位置し、配列番号１で表される塩基配列よりなるＤＮＡマーカー、または配列番号１で表される塩基配列よりなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡマーカーを利用して、これを制限酵素Mbo Ｉで処理した場合、切断パターンが異なることにより、辛味遺伝子座の遺伝子型を判定できるようにした。
【００１５】
ここでいう、トウガラシの辛味遺伝子座であるPun 座の「ＤＮＡマーカー」とは、トウガラシの辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置するＤＮＡで、トウガラシのＤＮＡを調べることにより、間接的に辛味遺伝子座の遺伝子型を判別できるものを指す。「近傍」とは、本発明に係るＤＮＡマーカーがトウガラシの育種において実用的に利用可能な距離を指す。遺伝子間の距離は、分析に用いる集団の個体数や種類により変動するが、具体的には約１５cM（センチモルガン）以下が好ましく、さらに好ましくは１０cM以下で、５cM以下が特に好ましい。本発明のトウガラシの辛味遺伝子座の近傍に位置するＤＮＡマーカーとしては、具体的には例えば、配列番号１で表される塩基配列によるＤＮＡまたは配列番号１で表される塩基配列によるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡを挙げることができる。ここで、「配列番号１で表される塩基配列によるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡ」とは、配列番号１で表されるＤＮＡと同様に辛味遺伝子座の近傍に位置し、配列番号１で表される塩基配列の一部を含有するＤＮＡ、または配列番号１で表される塩基配列の一部を含有し、かつ配列番号１で表される塩基配列に隣接する塩基配列を含有するＤＮＡを意味する。本発明のトウガラシの辛味遺伝子座の近傍に位置するＤＮＡマーカーである、配列番号１に示されるＤＮＡまたは配列番号１で表されるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡを有するかどうかの確認は、サザンハイブリダイゼーション法を用いて分析可能であるが、ＰＣＲ法を利用して分析することが望ましい。
【００１６】
次に、ＰＣＲ法によって簡便かつ安定して増幅可能なＤＮＡマーカーを用いたPun 座の遺伝子型の判別方法について説明する。まず、供試しようとするトウガラシから鋳型となるＤＮＡを抽出するが、ＤＮＡを抽出するための組織としては植物体のどの部位を用いてもよく、また、生育段階も問わない。また、抽出方法はどのような方法も用いることができ、粗精製のＤＮＡを用いることもできる。抽出したＤＮＡを鋳型にＤＮＡマーカーをＰＣＲ法により増幅させる。
【００１７】
ＰＣＲ法を用いて遺伝子型を判別する方法としては、（１）ある遺伝子型においてのみ特異的断片を増幅し、増幅の有無により遺伝子型を判別する方法、（２）増幅断片の長さが遺伝子型間で異なることに基づき、この増幅断片の長さを比較することにより遺伝子型を判別する方法、（３）全ての遺伝子型で増幅する同じ長さの断片をある制限酵素で処理した場合、遺伝子型により切断パターンが異なることに基づき、切断パターンを比較することにより遺伝子型を判別する方法などがある。（２）および（３）では遺伝子型がホモであるかヘテロであるかも同時に判別することが可能である。例えば、配列番号２と３に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅した断片を制限酵素Mbo Ｉで処理した場合、３つの断片に切断される品種と４つの断片に切断される品種がある。この切断パターンが異なることに基づき、辛味遺伝子座の遺伝子型の判定を行うことが可能となる。
【００１８】
なお、本発明では、トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置する強く連鎖した２つのマーカーで目的の遺伝子を挟み込むことにより、誤判定の可能性を極限まで減らすことを可能とした。すなわち、配列番号５と６で挟まれた約１kbp のＤＮＡマーカーを用いて、より効率のよい判別を可能とする。
【００１９】
このマーカーと先に開発されたマーカー（配列番号１で表わされる塩基配列よりなるＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡマーカー）の間の遺伝距離は約８cM以下であり、この距離での二重組み換えの可能性は極めて低いため、これらの使用により、辛味遺伝子座の遺伝子型をより正確に判別することが可能となった。
【００２０】
以下に実施例をあげて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例にのみ限定されるものではない。
【００２１】
【実施例】
実施例１：（植物材料）
辛味成分を生産しない‘とんがり’（ナント種苗より入手）と辛味成分を生産する‘万願寺’（京都府農業資源研究センター育成系統）を交配したＦ1 個体の自殖Ｆ2 集団を８７個体育成し、この全ての個体について辛味成分の生産能力について調査した。その結果、辛味成分を生産する個体と生産しない個体が、６０個体と２７個体に分離した。この結果により、辛味成分の生産能力の有無は単一の遺伝子により支配されていることが確認された。以降、この８７個体のＦ2 集団を用いて辛味遺伝子の連鎖マーカーの検索を行った。
【００２２】
（トウガラシの辛味遺伝子に連鎖した多型断片の探索）
トウガラシからのＤＮＡの抽出は、ＤＮＡ extraction kits （Nucleon PhytoPure ，Amersham社）を用いて行った。得られたＤＮＡを鋳型とし、約５００種類の市販の１０mer オリゴヌクレオチド（オペロン社）をプライマーとしてＲＡＰＤ法の反応を行った。ＲＡＰＤ法の反応液組成および反応条件は以下の通りである。反応液は10mM Tris-HCl （pH8.3 ）、50mM KCl、1.5mM MgCl2 、0.05％ TritonX-100、200 μM dNTP mixture、0.5units Taq ＤＮＡ polymerase（Takara社）、0.42μM プライマー、12ng鋳型ＤＮＡを含み12μｌとなるように水で調節した。反応サイクルは９４℃にて３分間保持した後、９４℃にて１分間、４０℃にて２分間、７２℃にて２分間の繰り返しを４０回行った後、７２℃で５分間反応させ、その後４℃で維持した。なお、反応にはPROGRAM TEMP CONTROL SYSTEM （PC-800，ASTEC 社）を用いた。次にＰＣＲ反応液８μｌを、1.7 ％アガロースゲル、TBE バッファーを用いた電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅断片を検出した。その結果、親品種である‘とんがり’と’万願寺’の間で約１９２種類のプライマーを用いた際に多型断片が検出できた。
【００２３】
次にＦ2 個体のうち辛味成分を生産する個体と生産しない個体の各７個体から抽出したＤＮＡを鋳型として、親品種間で多型断片の認められた１９２種類のプライマーを用いてＲＡＰＤ法を行った。しかし、辛味成分を生産する個体のみに特異的な多型断片は認められなかった。したがって、組換え型の比較的少なかった１０種類のプライマーを用いて全８７個体の多型断片の分離を調査した。その結果、プライマー 5 '-agcagcgcac-3' （オペロン社の品名「OPY-09」）を用いた場合に得られた約０．８kbp の多型断片で組換え型が少なく、辛味遺伝子と連鎖していることがわかった。
【００２４】
図１は親品種である‘とんがり’、‘万願寺’およびＦ2 個体の３個体のＤＮＡを鋳型にし、「OPY-09」をプライマーに用いてＲＡＰＤ法により反応を行った際の増幅産物の電気泳動像を示す。鋳型にしたＤＮＡは左のレーンから‘万願寺’、‘とんがり’およびＦ2 個体の３個体であり、Ｆ2 個体の辛味成分の生産能力は左から「なし」、「あり」および「あり」である。泳動像からもわかるように、辛味遺伝子と連鎖した約０．８kbp の多型断片（矢印）のＲＡＰＤ法による増幅は極めて不安定であった。
【００２５】
（辛味遺伝子連鎖マーカーの塩基配列の決定）
辛味遺伝子に連鎖した約０．８kbp のＤＮＡ断片の塩基配列を決定するため、以下の操作を行った。‘万願寺’のＤＮＡを鋳型にして増幅した約０．８kbp のＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収し、TAクローニングキット（pGEM-T Easy Vector System 、プロメガ社）により、プラスミドpGEM-T Easy Vectorにサブクローニングし、大腸菌（DH5 α）に形質転換した。塩基配列の決定はABI PRISM BIG DYE Terminator Sequence Kit （ABI 社）を用いて、サブクローニングしたプラスミドを鋳型にシークエンス反応液を調整し、ABI PRISM 310 （ABI 社）装置で解析した。以上の操作の結果、辛味遺伝子に連鎖した約０．８kbp のＤＮＡ断片の塩基配列は、配列番号１に示すとおりであった。
【００２６】
実施例２：（辛味遺伝子連鎖マーカーの遺伝子型の識別）
配列番号１記載の塩基配列情報から、辛味遺伝子に連鎖したＤＮＡ断片を特異的に増幅するためのプライマーペアを設計した。設計したプライマーの塩基配列は配列番号２および３に示した。このプライマーペアを用いて以下の反応液組成および反応条件で親品種である‘とんがり’と‘万願寺’のＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。反応液は 10mM Tris-HCl（pH8.3 ）、50mM KCl、1.5mM MgCl2 、0.05％ Triton X -100、200 μM dNTP mixture、0.5units Taq ＤＮＡ polymerase（Takara社）、各0.21μM プライマー、12ng鋳型ＤＮＡを含み12μｌとなるように水で調節した。反応サイクルは９４℃で３分間保持した後、９４℃にて１分間、６５℃にて２分間、７２℃にて２分間の繰り返しを３０回行った後、７２℃で５分間反応させ、その後４℃で維持した。その結果、親品種間で同じサイズと思われるＤＮＡ断片の増幅が認められた。図２に、このＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。左のレーンが‘万願寺’、右のレーンが‘とんがり’を鋳型にした増幅産物である。
【００２７】
次に配列番号２および３のプライマーペアを用いて上記の方法でＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。得られた増幅産物を制限酵素Mbo Ｉで処理し、８％アクリルアミドゲルで電気泳動し分画した。その結果、‘万願寺’では３つの断片（約１７０bp、約２２０bp、および約３４０bp）に切断されたのに対し、‘とんがり’では４つの断片（約１４０bp、約１６０bp、約２００bp、および約２２０bp）に切断された。すなわち、‘とんがり’の増幅産物では‘万願寺’のそれよりも制限酵素Mbo Ｉの認識部位が１箇所多いことがわかった。また、Ｆ2 個体では‘万願寺’のホモ型、‘とんがり’のホモ型およびこれらの２つのパターンを併せ持ったヘテロ型を確認できた。この方法により、辛味遺伝子連鎖マーカーの遺伝子型の識別が可能となった。図３にこの結果を示した。左のレーンから順に‘万願寺’、‘とんがり’、Ｆ2 個体の４個体であり、Ｆ2 個体は左からヘテロ型、ヘテロ型、‘とんがり’ホモ型および‘万願寺’ホモ型である。
【００２８】
（辛味遺伝子と辛味遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーの距離）
‘とんがり’と‘万願寺’の交配Ｆ2 集団の８７個体について、上記の方法により辛味遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーの遺伝子型の判定を行った。その結果と辛味成分の生産能力の有無を表１に示した。Ｆ2 集団では辛味遺伝子座の遺伝子型の判定は不可能であるため、表現型での比較を行ったところ、９個体で組換えが起こっており、これらの遺伝子間の距離は約１０cMと計算された。したがって、配列番号１に示すＤＮＡマーカーが辛味遺伝子座の連鎖マーカーとして実用的に利用できる距離であることがわかった。
【００２９】
【表１】
実施例３：（他の品種での辛味遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーの利用）
さらに、辛味成分を生産する‘伏見甘長’（タキイ種苗より入手）と‘とんがり’との交配Ｆ2 集団の１０３個体を用いて、辛味遺伝子と連鎖マーカーの遺伝子分析を行ったところ、表２に示すように、４個体で組換えが起こっており、遺伝子間の距離は約４cMであった。また、同一の種（カプシクム・アヌウム）に含まれる１５品種から抽出した粗精製のＤＮＡを鋳型に配列番号２および３のプライマーペアを用いてＰＣＲを行ったところ、全ての品種でほぼ同一サイズのＤＮＡ断片が増幅されることが確認され、これらの１５品種についての辛味成分の生産性有無の判定に応用可能であることが示唆された。用いた１５品種のうちの８品種を以下に列挙する。
ベルマサリ（長野県原種センター）、新さきがけ２号（高知前川種苗）、カリフォルニアワンダー、鷹の爪、八つ房、ししとう（いずれも大和農園）、南禅寺トウガラシ（丸種種苗）、ニューエース（タキイ種苗）。
【００３１】
【表２】
実施例４：（植物材料）
辛味成分を生産しない‘とんがり’（ナント種苗より入手）と辛味成分を生産する‘万願寺’（京都府農業資源研究センター育成系統）を交配したＦ1 個体から葯培養により作出した倍加半数体（ＤＨ）集団を１２３個体育成し、この全ての個体について辛味成分の生産能力について調査した。その結果、辛味成分を生産する個体と生産しない個体が、６９個体と５４個体に分離した。ＤＨ集団の個体はヘテロ接合体がなく、全ての固体がホモ結合体で固定している特徴を持つ。以降、この１２３個体のＤＨ集団を用いて辛味遺伝子の連鎖マーカーの検索を行った。
【００３３】
「トウガラシの辛味遺伝子に連鎖した多型断片の探索」を実施例１と同様の方法で実施しその結果、親品種である‘とんがり’と’万願寺’の間で約１９２種類のプライマーを用いた際に多型断片が検出できた。
【００３４】
次にＤＨ集団のうち辛味成分を生産する個体と生産しない個体の各７個体から抽出したＤＮＡを鋳型として、親品種間で多型断片の認められた１９２種類のプライマーを用いてＲＡＰＤ法を行った。しかし、辛味成分を生産する個体あるいは生産しない個体のみに特異的な多型断片は認められなかった。したがって、組換え型の比較的少なかったプライマーを用いて全１２３個体の多型断片の分離を調査した。その結果、配列番号４に記載されるプライマー 5'-acaggtgcgt-3'（オペロン社の品名「OPR-12」）を用いた場合に得られた約１kbp の多型断片で組換え型が少なく、辛味遺伝座の劣性遺伝子と連鎖していることがわかった。
【００３５】
図４は親品種である‘とんがり’、‘万願寺’およびＤＨ集団の３個体のＤＮＡを鋳型にし、「OPR-12」をプライマーに用いてＲＡＰＤ法により反応を行った際の増幅産物の電気泳動像を示す。鋳型にしたＤＮＡは左のレーンから‘万願寺’、‘とんがり’およびＤＨ集団の３個体であり、ＤＨ個体の辛味成分の生産能力は全て「なし」である。
【００３６】
（辛味遺伝子座連鎖マーカーの塩基配列の決定）
辛味遺伝子座に連鎖した約１．０kbp のＤＮＡ断片の塩基配列を決定するため、以下の操作を行った。‘とんがり’のＤＮＡを鋳型にして増幅した約１．０kbp のＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収し、TAクローニングキット（pGEM-T Easy Vector System 、プロメガ社）により、プラスミドpGEM-T Easy Vectorにサブクローニングし、大腸菌（DH5 α）に形質転換した。塩基配列の決定は、サブクローニングしたプラスミドを鋳型にシークエンス反応液を調整し、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システム（ベックマン・コールター社）で解析した。以上の操作の結果、辛味遺伝子座に連鎖した約１．０kbp のＤＮＡ断片の中央部を除く両端の塩基配列を配列番号５と配列番号６に示した。
【００３７】
実施例５：（辛味遺伝子座連鎖マーカーの遺伝子型の識別）
配列番号５と６記載の塩基配列情報から、辛味遺伝子に連鎖したＤＮＡ断片を特異的に増幅するためのプライマーペアを設計した。設計したプライマーの塩基配列は配列番号７および８と配列番号９および１０に示した。配列番号７および８のプライマーペアを用いて以下の反応液組成および反応条件で親品種である‘とんがり’と‘万願寺’のＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。反応液は 10mM Tris-HCl（pH8.3 ）、50mM KCl、1.5mM MgCl2 、0.05％ TritonX-100、200 μM dNTP mixture、0.5units Taq ＤＮＡ polymerase（Takara社）、各0.21μM プライマー、12ng鋳型ＤＮＡを含み12μｌとなるように水で調節した。反応サイクルは９４℃で３分間保持した後、９４℃にて１分間、６０℃にて２分間、７２℃にて２分間の繰り返しを３０回行った後、７２℃で５分間反応させ、その後４℃で維持した。その結果、非特異的なＤＮＡ断片の増幅が認められるため１回目のＰＣＲ産物を１００倍に希釈した後、配列番号９および１０のプライマーペアを用いて、 同じ条件でＰＣＲ反応を行った。その結果、 親品種間で同じサイズと思われるＤＮＡ断片の増幅が認められた。図２に、このＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。左のレーンが‘万願寺’、右のレーンが‘とんがり’を鋳型にした増幅産物である。
【００３８】
次に配列番号７および８と配列番号９および１０のプライマーペアを用いて上記の方法でＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。得られた増幅産物を制限酵素Hsp 92IIで処理し、電気泳動し分画した。その結果、サイズマーカーの１１８bp付近に、切断断片長の違いによる、多型が確認できた。また、ＤＨ集団では‘万願寺’のホモ型‘とんがり’のホモ型の２つのパターンを確認できた。この方法により、辛味遺伝子連鎖マーカーの遺伝子型の識別が可能となった。図６は上記方法によりＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を６種類の制限酵素で処理した際の泳動像であり、偶数番号が‘万願寺’、奇数番号が‘とんがり’を示し、多型の得られたHsp 92IIで切断したものは１２と１３レーンに示した。
【００３９】
（辛味遺伝子と辛味遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーの距離）
‘とんがり’と‘万願寺’のＤＨ集団の１２３個体について、辛味遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーの遺伝子型と辛味成分の生産能力の有無を表３に示した。その結果、６個体で組換えが起こっており、これらの遺伝子間の距離は約５cMと計算された。したがって、配列番号５および６を両端にもつ約１．０kbp のＤＮＡマーカーが辛味遺伝子座の連鎖マーカーとして実用的に利用できる距離であることがわかった。
【００４０】
【表３】
なお、ＤＨ集団で実施例１に示した辛味遺伝子連鎖マーカーを適用したところ、辛味遺伝子と３個体で組換えが確認され、２．４cMの遺伝距離であった。さらに、この２つの連鎖マーカーは辛味遺伝子座を挟む形で連鎖していることも確認できた。従って、上記２つの辛味遺伝子連鎖マーカーを用いることにより、より正確に辛味遺伝子座の遺伝子型の判定が可能であり、辛味の有無に関する形質を間違いなく選抜できることが明らかとなった。
【００４２】
なお、本発明は上述した実施例には限られない。例えば、ＤＮＡをマーカーとして、配列番号１や５および６に表された塩基配列の一部を少なくとも含むＤＮＡ断片を用いて、辛味遺伝子座の遺伝子型の判定を行っても構わない。さらに、このようなＤＮＡマーカーを用いる際に、例えば制限酵素Mbo ＩやHsp 92IIとは異なる他の一般的な制限酵素を、単独もしくは組み合わせて用いて処理することで、遺伝子型の判定を行うことも可能である。
【００４３】
【発明の効果】
本発明による配列番号１に表される辛味遺伝子座近傍のＤＮＡマーカーと、これをＰＣＲ法および制限酵素処理を用いて行う辛味遺伝子座の遺伝子型の判定方法は、トウガラシ属の植物、特にカプシクム・アヌウムの品種に適応可能であり、これにより、例えば辛味成分を生産するトウガラシ品種と生産しないトウガラシ品種を交配して育種を行う際に、辛味成分の生産能力の有無を効率的かつ簡便に判定できるという効果を奏する。
【００４４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、OPY-09をプライマーに用いてＲＡＰＤ法により反応を行った際の増幅産物の電気泳動像である。
【図２】 図２は、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片の電気泳動像である。
【図３】 図３は、ＰＣＲによる増幅産物を制限酵素Mbo Ｉで処理して得られた断片の電気泳動像である。
【図４】 図４は、OPR-12をプライマーに用いてＲＡＰＤ法により反応を行った際の増幅産物の電気泳動像である。
【図５】 図５は、特異的にＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片の電気泳動像である。
【図６】 図６は、特異的にＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を様々な制限酵素処理して得られた断片の電気泳動像である。
Claims (9)
- トウガラシ属植物の辛味遺伝子座であるPun 座の近傍に位置し、配列番号１で表される塩基配列よりなるＤＮＡマーカーを用いて以下ａ）〜ｃ）の少なくとも一の基準：
ａ）該ＤＮＡマーカーの増幅断片の有無、
ｂ）該ＤＮＡマーカーの増幅断片の長さ、および
ｃ）該ＤＮＡマーカーの増幅断片の制限酵素による切断パターン、
により前記 Pun 座が、辛味成分の生産能力に関して優性ホモ型か、劣性ホモ型か、またはヘテロ型かを判別する方法であって、
前記ＤＮＡマーカーの増幅断片が、配列番号２で規定されるプライマーと配列番号３で規定されるプライマーとからなる１組のプライマーを用いて、トウガラシ属植物から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って得られることを特徴とする、判別方法。 - 配列番号２で規定されるプライマーと配列番号３で規定されるプライマーとからなる１組のプライマーを用いて、トウガラシ属植物から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って得られることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡマーカーの増幅断片。
- 配列番号２で規定されるプライマーと配列番号３で規定されるプライマーとからなる１組のプライマー。
- 請求項２に記載のＤＮＡマーカーの増幅断片を制限酵素Mbo Ｉで処理し、該増幅断片の切断パターンが異なることにより、前記 Pun 座が、辛味成分の生産能力に関して優性ホモ型か、劣性ホモ型か、またはヘテロ型かを判別する方法。
- トウガラシ属植物の辛味遺伝子座である Pun 座の近傍に位置し、配列番号５で表される塩基配列と配列番号６で表される塩基配列を両端に有する塩基配列よりなるＤＮＡマーカーを用いて、以下ａ）〜ｃ）の少なくとも一の基準：
ａ）該ＤＮＡマーカーの増幅断片の有無、
ｂ）該ＤＮＡマーカーの増幅断片の長さ、および
ｃ）該ＤＮＡマーカーの増幅断片の制限酵素による切断パターン、
により前記 Pun 座が、辛味成分の生産能力に関して優性ホモ型か、劣性ホモ型か、またはヘテロ型かを判別する方法であって、
前記ＤＮＡマーカの増幅断片が、配列番号７で規定されるプライマーおよび配列番号９で規定されるプライマーと配列番号８で規定されるプライマーおよび配列番号１０で規定されるプライマーとからなる１組のプライマーを用いて、トウガラシ属植物から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って得られることを特徴とする、判別方法。 - 配列番号７で規定されるプライマーおよび配列番号９で規定されるプライマーと配列番号８で規定されるプライマーおよび配列番号１０で規定されるプライマーとからなる１組のプライマーを用いて、トウガラシ属植物から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って得られることを特徴とする、請求項５に記載のＤＮＡマーカーの増幅断片。
- 配列番号７で規定されるプライマーおよび配列番号９で規定されるプライマーと配列番号８で規定されるプライマーおよび配列番号１０で規定されるプライマーとからなる１組のプライマー。
- 請求項６に記載のＤＮＡマーカーの増幅断片を制限酵素Hsp 92IIで処理し、該増幅断片の切断パターンが異なることにより、前記 Pun 座が、辛味成分の生産能力に関して優性ホモ型か、劣性ホモ型か、またはヘテロ型かを判別する方法。
- 請求項１に記載のＤＮＡマーカーおよび請求項５に記載のＤＮＡマーカーの、 Pun 座をはさむ位置に座乗する２つのＤＮＡマーカーを用いて、以下ａ）〜ｃ）の少なくとも一の基準：
ａ）配列番号２で規定されるプライマーと配列番号３で規定されるプライマーとからなる１組のプライマーを用いて得られることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡマーカーの増幅断片および配列番号７で規定されるプライマーおよび配列番号９で規定されるプライマーと配列番号８で規定されるプライマーおよび配列番号１０で規定されるプライマーと からなる１組のプライマーを用いて得られることを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡマーカの増幅断片の有無、
ｂ）前記２つのＤＮＡマーカーの前記増幅断片の長さ、および
ｃ）前記２つのＤＮＡマーカーの前記増幅断片の制限酵素による切断パターン、
により前記 Pun 座が、辛味成分の生産能力に関して優性ホモ型か、劣性ホモ型か、またはヘテロ型かを判別する方法。
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