KR101573419B1 - 캡시노이드 고 함유 고추 품종의 구별을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

캡시노이드 고 함유 고추 품종의 구별을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 고추의 매운맛 연구 및 신품종 육종 분야에 유용하게 사용될 것이다.

Description

캡시노이드 고 함유 고추 품종의 구별을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set for discrimination of pepper cultivar having high content of capsinoid and uses thereof}
본 발명은 캡시노이드 고 함유 고추 품종의 구별을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 방법에 관한 것이다.
고추의 고유한 특징인 매운맛은 고추 과실의 캡사이시노이드(capsaicinoid)라는 물질의 분비로 인해 나타난다. 캡사이시노이드는 고추의 태좌에서 합성되고 분비되며 암 예방이나 체중감소, 심혈관 질환 등에 의학적 효능을 가지고 있다 (Thiele et al., 2008, J. Agric. Food Chem. 56:4219-4224; Xiu-Ju et al., 2011, Eur. J. Pharmacol. 650:1-7). 캡사이시노이드 중 대표적인 물질인 캡사이신(capsaicin)은 페닐프로파노이드(phenylpropanoid) 합성 경로 물질인 바닐릴아민(vanillylamine)과 발린 합성 경로 물질인 8-methyl-6-nonenoic acid의 응축반응으로 합성이 된다. 바닐린(vanillin)은 pAMT(putative aminotransferase) 유전자에 의해 바닐릴아민으로 만들어지며 캡사이신은 분지지방산(branched-fatty acids)과 바닐릴아민의 합성 반응으로 나온 최종산물이다. 캡사이신 합성효소(CS, capsaicin synthase) 유전자는 8-methyl-6-nonanoic acid와 바닐릴아민으로부터 캡사이신을 합성하도록 한다.
캡사이시노이드와 유사한 물질로 알려진 캡시노이드(capsinoid)는 1989년 일본의 Yazawa에 의해 처음으로 보고되었다. 캡시노이드 물질 중 하나인 캡시에이트 (capsiate)는 캡사이신과 비슷한 구조를 가지고 있으나 펩티드결합(NH)이 에스터결합(O)으로 치환되어 있다. 캡시노이드는 캡사이시노이드보다 의학적으로 더 용이한 장점을 가지고 있다. 매운맛을 내지 않는 물질인 캡시에이트는 캡사이신보다 섭취가 더 용이하고 독성이 덜 하다는 장점을 가지고 있다. 하지만 캡시노이드는 불안정하며 수용성 용매 상에서는 쉽게 분해된다는 단점이 있다.
캡시노이드 합성의 양적인 조절은 pAMT와 CS 뿐만 아니라 다른 유전적 요소에 의해서도 영향을 받을 것이라고 추측된다. 캡사이시노이드 축적은 환경적인 영향과 유전적 구조에 의해 영향을 받는다. 양적형질유전자좌(QTL, quantitative trait loci) 분석과 분자적 매핑을 이용하여 캡사이시노이드 함량에 대한 유전적 연구가 시도되었다. 캡사이시노이드 축적에 관하여 31%의 표현형 변이의 여섯 개의 QTL이 규명되었다. 그럼에도 불구하고 캡사이시노이드의 함량 조절에 영향을 미치는 유전적 요소를 찾기 위한 연구는 계속해서 진행되고 있다. 캡사이시노이드의 축적에 영향을 미치는 요인이 캡시노이드의 축적에도 관여할 것이라고 추측한다.
캡시노이드의 생합성에 대한 유전적 연구는 캡시에이트가 발견되었던 1980년대부터 이루어져왔다. 그러나 고추의 캡시노이드의 양적인 조절에 대해서는 명확하게 설명된 바가 없다. 본 발명은 캡시노이드 축적에 관한 유전적 원인을 규명하기 위하여 수행되었다. 이를 위하여 캡시쿰 키넨세 (Capsicum chinense) 종인 SNU11-001과 하바네로 (Habanero)로부터 진전된 F2 집단에서 캡사이시노이드와 캡시노이드의 함량을 측정하고 유전형 분석이 이루어졌다.
한편, 한국등록특허 제1242426호에는 'PMMoV 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0974821호에는 '시판 고추 F1 품종 식별을 위한 SNP 마커'가 개시되어 있지만, 본 발명의 캡시노이드 고 함유 고추 품종의 구별을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 효율적으로 육성하기 위하여, 캡시노이드 함량을 조절하는 것으로 알려진 pAMT(putative aminotransferase)와 CS(capsaicin synthase) 유전자형을 구분할 수 있는 프라이머를 제작하여, 고추 품종 SNU11-001과 하바네로를 양친으로 F2 집단을 구축하여 유전형을 분석한 결과, CS의 유전형은 캡시노이드의 양적인 형질에 영향을 미치지 않음을, 그리고 pAMT는 열성동형접합체의 유전형이 캡시노이드의 양적인 함량 증가에 영향을 미침을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 육성하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 분자마커를 고추 작물들에 적용하면 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 효율적으로 선별 및 육성할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 분자마커 및 본 발명에서 제공하는 고추 품종 선별 방법은 고추의 매운맛과 관련된 연구 분야 및 캡시노이드 함량이 증가된 신규 고추 품종 육종 분야에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 다섯 가지의 고추 품종에서 과실 발달 단계에 따른 캡사이시노이드(A)와 캡시노이드(B)의 함량을 비교한 결과이다. DAP: 착과 후 일수 (day after fruit).
도 2는 다섯 가지의 고추 품종에서 pAMT와 CS 유전자의 발현 경향을 역전사 PCR로 확인한 결과이다. DAP, 착과 후 일수 (day after fruit); S, SNU11-001; E, ECW; Y, 유월초(Yuwol-cho); T, Takanotsume; H, 하바네로(Habanero).
도 3은 SNU11-001 품종에서 확인된 기능상실 pAMT 유전자 대립형질의 두가지 형태를 나타내는 결과로, A는 pAMT 유전자 대립형질의 두가지 형태의 겔 사진을, B는 다른 고추 품종 CM334 (Capsicum annuum 품종)의 pAMT 유전자와 SNU11-001 품종에서 확인된 pAMT 유전자 대립형질의 두가지 형태의 염기서열을 비교하여 모식화한 그림이다.
도 4는 캡시쿰 키넨세 (Capsicum chinense) 종인 SNU11-001과 하바네로에서 CS 유전자의 아미노산 서열을 비교 분석한 결과이다. 붉은색 상자는 아미노산이 치환되는 비유사 돌연변이를 나타내며, 붉은색 화살표 머리는 아미노산이 치환되지 않은 동의 돌연변이를 나타낸다.
도 5는 pAMT 돌연변이를 선별하기 위한 분자 마커 제작을 나타내는 것으로, A는 하바네로와 SNU11-001의 유전형에서 pAMT 분자 마커의 증폭을 위한 프라이머(검은색 막대)의 위치를 나타낸 모식도이며, B는 A의 프라이머를 이용하여 수행한 PCR 결과이다.
도 6은 SNU11-001 및 하바네로의 CS 유전자형을 구별하기 위한 분자 마커 제작를 나타내는 것으로, (A)는 SNU11-001 및 하바네로의 CS 유전자의 게노믹 DNA 염기서열 및 아미노산 서열을 비교한 결과와 분자 마커를 증폭하기 위한 프라이머(검은색 막대)의 위치를 표시한 그림이며, B는 A의 프라이머를 이용하여 SNU11-001, 하바네로 및 SNU11-001 x 하바네로 교잡의 F1 세대 4 개체에서 수행한 PCR 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서, 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종은 고추 건조중량 g당 1,000㎍ 이상, 바람직하게는 1,000~7,000㎍의 캡시노이드를 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 에에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법에 있어서, 캡시노이드 함량이 높은 본 발명의 고추 품종을 선별하기 위한 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 육성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 캡시노이드의 합성에 필요한 것으로 알려진 pAMT(putative aminotransferase) 유전자 돌연변이의 유전형을 확인할 수 있는 것으로, pamt/pamt 동형접합체의 유전형에서 고추 식물체의 캡시노이드 합성을 확인할 수 있다. 본 발명의 상기 프라이머 세트를 이용하면 교배된 신규 고추 품종의 유전자형을 판별할 수 있으므로, 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 육성할 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
식물재료
캡사이신과 캡시에이트의 함량 정도가 각기 다른 다섯 가지의 고추 품종이 사용되었다. SNU11-001 (Capsicum chinense)은 캡시노이드를 가장 많이 함유하고 있으며 캡사이시노이드는 가장 적게 함유하는 품종이다. ECW (Capsicum annuum)은 캡사이시노이드와 캡시노이드 모두 함유하고 있지 않다. 유월초 (Yuwol-cho, Capsicum annuum)와 Takanotsume (Capsicum annuum)은 한국과 일본의 근원종으로 약간의 매운맛을 낸다. SNU11-001과 하바네로 (Habanero, Capsicum chinense)는 F1과 F2 집단을 만드는데 사용되었다. F1 9 개체와 F2 215 개체가 서울대학교 농업생명과학대학 농장에서 재배되었다.
pAMT 및 CS 유전형 분석
SNU11-001의 pAMT 유전형 분석을 위하여 두 가지 타입의 분자 마커를 작성하였다. SCAR(Sequence Characterised Amplified Region) 마커를 작성하기 위하여 고추 게놈 데이터베이스 (http://cab.pepper.snu.ac.kr)에서 pAMT 염기서열을 얻었다. 첫 번째 프라이머 세트인 SNU11-001-ECW-정방향: 5'-GTTTCGTAGATTTCCAATTCG-3'(서열번호 4)와 SNU11-001-ECW-역방향: 5'-ATTTGGCCGGTTTCACCCAT-3'(서열번호 5)은 Capsicum chinense 종인 pAMT 돌연변이 품종에 특이적인 pAMT 유전자의 세 번째 인트론에 삽입된 반복 염기서열을 검출하기 위하여 만들어졌다. 두 번째 마커인 third intron (F)(5'-CATCATACATACTATTCCCACGC-3'; 서열번호 1), Tcc-R3(5'-CCGGGTTTGACCGGATTTTAG-3'; 서열번호 3)과 third intron(R)(5'-GGGAGGATGCACAGCTTTACG-3'; 서열번호 2)은 SNU11-001에 특이적인 pAMT 유전자의 세 번째 인트론에 있는 전이인자 (transposable element)를 검출하기 위하여 만들어졌다.
SNU11-001과 하바네로의 CS 유전형을 구분하기 위하여 두 가지 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence) 마커가 개발되었다. 첫 번째 프라이머 세트는 CS 유전자의 첫 번째 엑손에 있는 Alu Ⅰ 위치를 이용하여 만들었으며 나머지 프라이머 세트는 두 번째 엑손의 Rsa Ⅰ 위치를 이용하여 만들었다. 후자는 전자의 마커보다 PCR 밴드 패턴이 명확하여 F2 집단의 CS 유전형 분석을 위하여 사용되었다.
SNU11-001의 pAMT 유전형 분석을 위한 PCR이 수행되었으며, 반응 총 볼륨은 25㎕이고, 50ng의 DNA 주형과 10pmol의 각 프라이머, dNTP, 10x Hipi 버퍼, 1 유닛의 Taq 중합효소가 포함된다. PCR은 다음과 같은 조건에서 수행되었다 : 94℃에서 5분 반응 뒤 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분을 35 반복으로 하였으며 72℃에서 10분 동안 최종 신장 반응을 하였다. CS 유전형 분석을 위한 PCR 조건은 pAMT 유전형 분석과 유사하나 PCR 결합 온도를 57℃로 조정하여 수행하였다.
DNA 추출
게노믹 DNA는 한 등(Mol. Breeding. 2013, 31:1-12)의 실험 방법을 참고하였으며 CTAB 방법으로 대상 식물체의 어린 잎에서 추출하였다. 게노믹 DNA의 농도를 측정하기 위하여 Nanodrop 기계 (Nanodrop Technology, Inc., 미국)를 사용하였다. 추출된 DNA는 TE 버퍼 용액 30㎕에 용해시켜 사용하였다.
RNA 추출 및 cDNA 합성
총 RNA 추출은 한 등(Mol. Breeding. 2013, 31:1-12)의 TRIzol 시약 (Invitrogen, 미국)을 사용한 방법을 사용하여 착과 20일 후의 과실의 태좌에서 추출하였다. RNA는 RNase-free water (GeneAll Biotechnology, 한국)에 녹였다. cDNA를 합성하기 위하여 역전사 PCR이 수행되었으며 총 20㎕ 볼륨에 M-MLV 5x 반응 버퍼, dNTP, M-MLV 역전사효소 200 유닛, mRNA 혼합물과 올리고 dT를 넣었으며 42℃에서 한 시간 동안 반응시켰다.
캡사이시노이드와 캡시노이드의 HPLC 분석
다섯 가지의 고추 계통과 SNU11-001 x 하바네로 교배의 F1과 F2 집단에서 개체 당 세 개의 과실을 수확하였다. 종자를 포함한 과실 전체를 잘게 썰어 -20℃에서 얼린 후 사용하였다. HPLC 분석은 한 등(Mol. Breeding. 2013, 31:1-12)의 방법을 참고하여 농업기술실용화재단에서 수행하였다.
실시예 1. 다섯 품종의 캡사이시노이드와 캡시노이드 함량
CS 유전자 전사 수준이 캡사이신 함량과 연관이 있다고 가정을 하고, SNU11-001, ECW, 유월초(Yuwol-cho), Takanotsume 및 하바네로(Habanero) 다섯 품종에서 캡사이시노이드와 캡시노이드 함량을 측정하기 위한 HPLC 분석을 실시하였다. 캡사이시노이드와 캡시노이드 함량은 과실이 성숙하는 동안 네 단계에서 측정이 되었다.
그 결과, 하바네로가 과실 성숙 2 단계에서 다섯 품종들 중 캡사이시노이드를 9195.3±591.29 ㎍/gDW로 가장 많이 함유하고 있었다(표 1). 유월초와 Takanotsume는 각각 3433.52±588.23 ㎍/gDW와 3153.73±518.04 ㎍/gDW으로 비등한 수치를 보였다. 그러나 과실 성숙 3 및 4 단계에서 Takanotsume는 유월초보다 높은 함량의 캡사이시노이드를 함유하였다. SNU11-001의 캡사이시노이드 함량은 16.13±7.15 ㎍/gDW으로 매운맛을 거의 내지 않았다. 맵지 않은 품종으로 알려진 품종 ECW는 캡사이시노이드의 함량이 확인되지 않았다. 그리고 캡시노이드의 경우, SNU11-001이 6855.98±1795.53 ㎍/gDW으로 확인되어 캡시노이드를 가장 많이 함유한 품종으로 확인되었으며 하바네로가 그 뒤를 이었다. ECW는 캡시노이드 역시 함유하고 있지 않았다(표 1 및 도 1).
표 1. 다섯 가지 고추 품종의 캡사이시노이드 및 캡시노이드 함량 분석
Figure 112014047894674-pat00001

실시예 2. 캡시노이드의 함량으로 분리되는 집단의 구축
캡시에이트 함량과 CS 유전자 발현 간의 상관관계를 규명하기 위하여 SNU11-001과 다양한 매운맛을 내는 네 품종 (ECW, 유월초, Takanotsume, 하바네로)으로 세가지 F1 집단을 구축하였다. 이종교배에서 교배불화합성을 줄이기 위해 Capsicum annuum 계통을 모계로, 다른 계통 Capsicum chinense를 부계로 사용하였다. pAMT 돌연변이 유전자를 이입시키기 위하여 SNU11-001을 다른 네 품종과 교배하였으며 그 중 SNU11-001과 하바네로를 교배하여 구축한 집단을 F2 세대까지 진전시켰다.
실시예 3. pAMT 와 CS 유전자의 발현 양상 확인
다섯 품종에서 pAMT와 CS 유전자의 발현 양상을 확인하였다. 고추 게놈 데이터베이스 (cab.pepper.snu.ac.kr)의 유전자 염기서열 정보를 토대로 pAMT와 CS 유전자에서, 한 대립유전자에만 특이적인 염기서열에서 각각 1,455bp와 1,206bp 크기의 cDNA를 증폭시킬 수 있도록 프라이머를 제작하였다. cDNA는 착과 후 20일과 45일의 태좌에서 추출한 mRNA를 합성하여 사용하였다.
그 결과 pAMT 전사체는 모든 품종의 미숙과(immature) 시기에서 발현이 확인되었고, SNU11-001에서는 두 가지 서로 다른 길이의 전사체를 확인할 수 있었다. 안 매운맛 품종인 ECW 또한 pAMT 유전자의 발현을 확인할 수 있었다. 숙과(mature) 시기에서는 하바네로를 제외한 다른 품종들에서는 pAMT가 발현하지 않았다. 또한, 미숙과 시기에서 ECW는 이미 알려진 바와 같이 CS 유전자가 발현되지 않았으며, 매운맛을 거의 내지 않는 SNU11-001을 포함한 다른 품종들에서는 CS의 발현을 확인할 수 있었다. 하바네로는 이 품종들 중 CS 유전자의 발현량이 가장 높게 확인되었다. 그러나 숙과 시기에서는 모든 품종들에서 CS의 발현을 확인할 수 없었다(도 2).
실시예 4. pAMT 와 CS 의 cDNA 염기서열 분석
SNU11-001에서는 서로 길이가 다른 두 가지의 pAMT 전사체를 확인할 수 있었는데(도 3A), 이들 염기서열에서 일부분을 분석하였다. SNU11-001에서 분석한 pAMT의 두 가지 전사체는 고추 게놈 데이터베이스에서 얻은 CM334 (Capsicum annuum 품종)의 염기서열과 달랐다. 둘 중 길이가 긴 전사체의 1,118bp 가운데 세 번째 엑손에 403bp 크기의 염기서열과 여섯 번째 엑손의 8bp 크기의 염기서열 삽입을 확인하였다. 이 전사체는 Aji Dulce strain 2 (Tanaka et al., 2010, J. Agric. Food Chem. 58:11762-11767)의 pAMT와 유사하였다. 짧은 전사체는 45bp 크기의 염기서열의 결실과 8bp 크기의 염기서열 삽입이 확인되었다(도 3B). 두 전사체 모두 조기 종결 코돈이 확인되어 SNU11-001에서는 pAMT 유전자가 발현되지 않는다고 사료된다.
SNU11-001과 하바네로의 CS 유전자에서 염기서열 상의 차이를 확인하기 위하여 두 품종의 유전자 암호 영역의 전체 염기서열을 분석하였으며, 그 결과 4개의 단일염기다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism)을 확인할 수 있었다(도 4). 이 중 3개는 아미노산이 치환되는 비유사 돌연변이이며, 나머지 하나는 아미노산이 치환되지 않은 동의 돌연변이였다. 4개의 SNP 중 2개는 첫 번째 엑손에서, 그리고 나머지는 두 번째 엑손에서 각각 확인되었다.
실시예 5. pAMT 와 CS 에서의 분자 마커 작성
pAMT와 CS 유전자에서 각각 두 개의 분자 마커 세트를 작성하였다. pAMT 유전자에서 작성된 마커(이하, SNU-pAMT669로 표기)는 pAMT 돌연변이 개체를 선발하기 위하여 만들어졌고, CS 유전자에서 개발된 마커는 SNU11-001과 하바네로의 CS 유전형을 구별하기 위하여 작성되었다. SNU11-001에 특이적인 전위인자(Tcc)는 pAMT 유전자의 세 번째 인트론에서 확인되었다. SNU-pAMT669는 SCAR 마커로 SNU11-001의 Tcc 염기서열을 기반으로 하여 개발되었다(도 5). 따라서 이 마커 세트는 Tcc를 포함하고 있는 pAMT 돌연변이 계통을 구분할 수 있다. 반면 CS 마커는 SNU11-001과 하바네로 두 품종의 정상 CS 유전자를 SNP를 이용하여 구분할 수 있도록 작성되었다(도 6). 이 마커 세트는 CS 유전자의 두 번째 엑손에 위치한 동의 돌연변이를 이용하여 만들었으며 이 SNP는 RsaⅠ에 의하여 인식된다. 이 CAPS 마커는 SNU11-001 x Habanero F2 집단에서 CS 유전형을 구분하기 위하여 작성되었다.
실시예 6. F 2 집단의 pAMT 와 CS 유전형에 따른 개체들의 분리
SNU11-001 x Habanero F2 집단에서 SCAR 마커와 CAPS 마커를 사용하여 pAMT와 CS 유전형 분석을 수행하였다. 이 중 49 개체가 pamt/pamt 동형접합체였다. 총 215 개체 중 pAMT/pamt 이형접합체 및 pAMT/pAMT 동형접합체는 160 개체였다. 이 분리비는 3:1로 예상 분리비에 부합하였다(x2=0.27; p=0.6033). 그러나 이형접합체의 수는 84 개체로 이는 예상 수치보다 적게 확인되어, 예상 빈도에 맞지 않는 결과를 보여주었다(표 2).
CS 유전형의 경우, CSS/CSS, CSH/CSH 및 CSS/CSH (CSS는 SNU11-001 타입의 CS 유전자, CSH는 하바네로 타입의 CS 유전자)의 유전형을 가진 개체의 수가 각각 50, 50 및 108으로 확인되었다. 이 분리비는 예상 분리비 1:2:1에 상응하였으며 (x2=0.308; p=0.8524), 또한 이는 pAMT와 CS 유전은 각각 독립적으로 이루어진다는 것을 보여준다(표 2 및 표 3).
표 2. pAMT와 CS의 유전형 분석
Figure 112014047894674-pat00002

표 3. SNU11-001 x Habanero F2 집단에서 pAMT와 CS의 유전 경향 분석
Figure 112014047894674-pat00003

실시예 7. F 2 집단의 캡시노이드와 캡사이시노이드 함량
pamt/pamt 동형접합체 49 개체에 대하여 HPLC 분석으로 캡사이시노이드와 캡시노이드 함량을 측정하였다. 49 개체 중 7 개체는 과실을 수확하는데 어려움이 있어 분석에 포함하지 않았다. 170번 개체의 캡시노이드 함량이 1485.61±115.58 ㎍/gDW으로 가장 낮았으며 76번 개체가 6050.75±698.74 ㎍/gDW으로 가장 높은 수치를 보였다. 76번 개체는 170번 개체보다 4.07배 높은 캡시노이드를 함유하고 있으며 이는 SNU11-001에 근접하는 값이다(표 4).
42 개체들의 캡시노이드 함량과 CS 유전형과의 연관관계를 조사해보았다. CSS/CSS 및 CSH/CSH의 동형접합체와 CSS/CSH의 이형접합체의 캡시노이드 평균값은 각각 3033.95±383.82 ㎍/gDW, 2664.02±198.43 ㎍/gDW, 2933.66±309.53 ㎍/gDW였다(표 4).
표 4. SNU11-001 x Habanero F2 집단의 캡사이시노이드 및 캡시노이드 함량
Figure 112014047894674-pat00004
Figure 112014047894674-pat00005
Figure 112014047894674-pat00006
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Primer set for discrimination of pepper cultivar having high content of capsinoid and uses thereof <130> PN14127 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 catcatacat actattccca cgc 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gggaggatgc acagctttac g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccgggtttga ccggatttta g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtttcgtaga tttccaattc g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atttggccgg tttcacccat 20

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 1 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  3. 제1항 또는 제2항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 캡시노이드 함량이 높은 고추 품종을 선별하기 위한 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
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