CN113136452B - 用于鉴别普通小麦-簇毛麦6vs.6al易位系的引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别普通小麦‑簇毛麦6VS.6AL易位系的引物对及其应用，该引物对核苷酸序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；以T6VS.6AL易位系衍生小麦材料的DNA为模板，该引物对为引物进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，若待测材料PCR扩增产物中有403bp、328bp大小的2个条带，则为6VS.6AL纯合易位材料；若待测材料PCR扩增产物中有403bp、328bp、297bp大小的3个条带，则不是6VS.6AL纯合易位材料；利用该分子标记可以提高育种分离世代中普通小麦‑簇毛麦6VS.6AL纯合易位系的选择效率，用于大规模分子标记辅助选择育种，加快育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及小麦遗传育种领域，特别是一种用于鉴别普通小麦-簇毛麦6VS.6AL易位系的分子标记引物对及其应用。
背景技术
簇毛麦是小麦的近缘属种，具有许多重要的农艺性状，其对几乎全部的白粉病生理小种表现高抗或免疫，高抗叶锈和秆锈病，对眼斑病、梭条花叶病及其病毒传媒瘿螨等多种病虫害都具有抗性，并且还具有抗寒、耐旱、密穗多花等优良性状，已经成为小麦改良的优良基因资源。以硬粒小麦-簇毛麦双二倍体为桥梁，Chen和Liu(Identification ofHaynaldiavillosachromosomes in alien wheat additions，Proc.of 1st InterChromosome Engineering of Plant,1986.279-300)获得了涉及簇毛麦各别染色体的异染色体系(添加或代换系)，并将抗白粉病基因定位到簇毛麦6V染色体上。
Chen等利用电离辐射方法获得了首个小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL，白粉病抗性基因Pm21被定位到6V染色体短臂上(Chen PD et al.,Development and molecularcytogenetic analysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation linesspecifying resistance to powdery mildew,Theor.Appl.Genet.,1995,91:1125-1128；齐莉莉等，小麦白粉病新抗源-基因Pm21，作物学报,1995,21(3)：257-262)。利用该易位系及衍生材料，相继育成许多小麦品种，其中在中国南方麦区育成27个6VS.6AL易位系品种(系)，中间试验中35.8％的品系为6VS.6AL易位系(Wu N,et al.,Predominant wheat-alien chromosome translocations in newly developed wheat of China,MolecularBreeding,2021,41:30)。由于6VS.6AL易位系在育种中被广泛应用，开发易于鉴别6VS.6AL纯合易位的分子标记，可以提高选择效率，加速育种进程。
曹爱忠等利用NAU/xibao15标记引物进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以从普通小麦的6AS、6BS、6DS和簇毛麦的6VS上扩增出大小不同的PCR条带(Cao AZet al.,A sequene-specific PCR marker linked with Pm21 distinguisheschromosomes 6AS,6BS,6DS of Triticum aestivum and 6VS of Haynaldiavillosa,Plant Breeding,2006,125:201-205)。由于NAU/xibao15标记引物PCR扩增产物中，6DS、6AS分别对应987bp、984bp的条带，两者相差仅3bp，电泳时不易检测，操作相对困难，且无法用琼脂糖凝胶电泳检测。因此，在以普通小麦-簇毛麦6VS.6AL易位系作为供体亲本的杂交育种中，迫切需要检测简便的分子标记，来快速准确鉴别6VS.6AL纯合易位材料，提高选择效率。
发明内容
为了便于利用分子标记鉴别携带抗白粉病基因Pm21的普通小麦-簇毛麦6VS.6AL易位系，提高目标材料的选择效率，本发明开发了分子标记6S-InDel 926，以6S-InDel 926标记引物对目标材料进行PCR扩增，其检测结果来筛选抗白粉病T6VS.6AL纯合易位，可以用于以T6VS.6AL易位系为供体亲本的杂交分离世代材料、育成品种的简便、快速筛选，提高品种选育和鉴别效率。
具体而言，本申请是通过如下技术方案实现的：一种用于鉴别普通小麦-簇毛麦6VS.6AL易位系分子标记6S-InDel 297的引物对，该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(GCCATCAAACACATCCTGATCC)和SEQ ID NO.2(CCATCTTTGTAGTGCGGTTGTC)所示。
本发明首先利用mInDel软件，开发小麦第6同源群短臂的InDel分子标记，即利用普通小麦中国春基因组重测序数据，分别进行从头组装(De novo assembly)，获得高质量的Contig序列；其次，通过利用滑动窗算法(sliding windows)设计覆盖全Contig序列的大规模探针池；进而针对第6同源群短臂，高通量的预测染色体臂间的InDel变异；最后，为了便于电泳检测，采用邻近InDel的聚合策略，设计开发出高效、易检测的InDel分子标记351个。然后，通过对351对第6同源群短臂的mInDel标记引物预测扩增条带片断大小的分析，筛选出不同片断大小之间差异较大、易于琼脂糖凝胶电泳检测的32个标记。
其中，以中国春、92R137(普通小麦-簇毛麦6VS.6AL易位系)、Pm97033(普通小麦-簇毛麦6VS.6DL易位系)等小麦材料的DNA模板，以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的序列为引物进行PCR扩增，扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳后检测，中国春扩增出403bp、328bp、297bp大小的3个条带，分别为小麦染色体臂6BS、6DS、6AS。在92R137中扩增出403bp、328bp大小的2条带，分别为6BS、6DS，缺失6AS条带。在Pm97033中扩增出403bp、297bp大小的2条带，分别为6BS、6AS，缺失6DS条带。申请人将该分子标记自命名为6S-InDel 297。并进一步开发该分子标记引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
其次，本发明还提供上述检测分子标记6S-InDel 297的引物对在鉴别抗白粉病T6VS.6AL纯合易位小麦中的应用，其具体步骤为：以待测小麦的DNA为模板，核苷酸序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对为引物进行PCR扩增，然后用质量百分数为的1.0％琼脂糖凝胶电泳，若扩增出大小为403bp、328bp的2个DNA片段，则证明待测小麦材料6AS缺失，则判定该小麦材料为普通小麦-簇毛麦6VS.6AL纯合易位小麦；若待测材料PCR扩增产物中有403bp、328bp、297bp大小的3个条带，则证明不是6VS纯合易位系(可能为6VS杂合易位系或无6VS材料)。
进一步而言，上述待测小麦优选T6VS.6AL易位系衍生小麦；术语“T6VS.6AL易位系衍生小麦”是指，遗传系谱中至少有一个亲本为T6VS.6AL易位系小麦，其他亲本为普通小麦的小麦品种或中间材料。术语“T6VS.6AL易位系小麦”是指普通小麦中6AS染色体臂与簇毛麦中6VS染色体臂发生易位，形成6VS.6AL易位染色体的纯合个体。(普通小麦中6A染色体(6AS.6AL)包括染色体长臂6AL、染色体短臂6AS、着丝粒，在一些外界因素的影响下，6VS与6AS发生交换，形成6VS.6AL易位染色体)。
进一步而言，上述PCR反应体系为20μL：DNA模板1μL(浓度40ng/μL)，核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物各1μL(浓度10μM)，2×Taq Plus Master MixⅡ(Vazyme)10.0μL，ddH2O 7μL；
PCR反应循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火40s，72℃延伸70s，34个循环；72℃延伸10min；
所述电泳检测检测是指：1％琼脂糖凝胶电泳后检测，电泳电压100V，电泳时间1.5h。
由于普通小麦第6同源群染色体6AS、6BS、6DS与簇毛麦染色体6VS难以发生交换，故本申请开发小麦第6同源群染色体短臂的分子标记，通过检测不同染色体短臂存在与缺失，来判定是否为6VS纯合易位。本发明中，基于中国春基因组重测序数据，利用mInDel软件开发了共线性InDel分子标记。mInDel软件采用不依赖基因组的开发策略，首先利用基因组重测序数据，分别进行从头组装(De novoassembly)，获得高质量的Contig序列；其次，通过利用滑动窗算法(sliding windows)设计覆盖全Contig序列的大规模探针池；进而针对第6同源群染色体短臂，高通量的预测染色体短臂之间的InDel变异；最后，为了便于电泳检测，采用邻近InDel的聚合策略，设计开发出高效、易检测的InDel分子标记。相比前人开发的NAU/xibao15标记，新开发的标记基于基因组水平，等位变异更为准确，且采用mInDel软件聚合了邻近的InDel，多态性更易于检测，琼脂糖凝胶电泳即可鉴定，有助于实现目标材料的高效筛选。
本申请引物对适用于普通小麦-簇毛麦6VS易位系衍生材料中6VS纯合易位的检测，特别是以普通小麦-簇毛麦6VS.6AL易位系为供体亲本的抗白粉病小麦品种改良中，在杂交F2及其后续世代，通过本分子标记的检测结果对6VS.6AL纯合易位进行选择：如果6BS、6DS、6AS均被检测到，则被测材料不是6VS纯合易位系(可能为6VS杂合易位系或无6VS材料)；如果6AS缺失，则为6VS.6AL纯合易位系(如实施例1中检测的一些小麦品种中，即存在6VS.6AL纯合易位系品种)。该检测方法可以提高选择效率、加速育种进程。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：(1)标记6S-InDel 297是基于基因组水平开发，等位变异更为准确，且采用mInDel软件聚合了邻近的InDel，多态性更易于检测，有助于实现目标材料的高效筛选；(2)6S-InDel 297为小麦第6同源群短臂的分子标记，可同时检测6AS、6BS和6DS，PCR产物电泳条带易于区分，根据6AS条带是否缺失，判定被测材料是否为6VS.6AL纯合易位；(3)扩增产物易被检测：本标记PCR扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测，相对于扩增产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶)电泳检测的标记引物，操作简单、易重复，可以提高选择效率。
附图说明
图1为实施例1中6S-InDel 297标记引物在中国春、92R137、Pm97033及江苏淮南小麦品种中PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱；
图中，M：100bp DNA Ladder；1：中国春(CS)；2：92R137(T5VS.5AL纯合易位系)；3：Pm97033(T5VS.5DL纯合易位系)；4：宁麦9号；5：宁麦13；6：宁麦26；7：宁紫麦1号；8：扬麦13；9：扬麦15；10：扬麦16；11：扬麦20；12：扬麦25；13：扬麦29；14：扬辐麦4号；15：镇麦168；16：镇麦9号；17：镇麦10号；18：镇麦12；19：泰麦901；20：华麦1092；21：泰麦902；22：扬麦21；23：瑞华麦596。
图2为实施例2中6S-InDel 297标记引物在92R137/宁麦9号F2植株中PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱及部分单株的白粉病抗性图片；
图2a中，M：100bp DNA Ladder；1-24：92R137/宁麦9号F2单株；1、7、11、17、18：T6VS.6AL纯合易位单株；
图2b为92R137/宁麦9号F2部分单株的白粉病抗性图片。
图3为实施例3中6S-InDel 297标记引物在宁麦13/镇麦9号F2植株中PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱及部分单株的白粉病抗性表现图片；
图3a中，M：100bp DNA Ladder；1-24：宁麦13/镇麦9号F2单株；1、7、10、14、15、16、20：T6VS.6AL纯合易位单株。
图4为实施例4中6S-InDel 297标记引物在T6VS.6AL易位系衍生品系或品种中PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱；
图中，M：100bp DNA Ladder；1：中国春(CS)；2：92R137；3：扬麦18；4：盐麦1号；5：扬12-145；6：扬14-88；7：扬14-179；8：扬14-214；9：扬辐麦5056；10：镇14034；11：镇麦18；12：资14-464；13：安农1124；14：瑞华590；15：盐麦0727。
具体实施方式
实施例涉及的材料来源，以下实施例涉及的小麦品种均为常规品种，其中：
92R137、Pm97033由江苏省农业科学院粮食作物研究所分别从南京农业大学和中国农业科学院作物科学研究所引进和保藏；
中国春、宁麦9号等小麦品种由江苏省农业科学院粮食作物研究所保藏。92R137(Chen PD,et al.,Development and molecular cytogenetic analysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AV translocation lines specifying resistance topowdery mildew,Theor.Appl.Genet.,1995,91:1125-1128)；
92R137衍生品系(品种)(Wu N,et al.,Predominant wheat-alien chromosometranslocations in newly developed wheat of China,Molecular Breeding,2021,41:30)；
Pm97033(李辉等，普通小麦-簇毛麦6DL/6VS抗白粉病易位系的选育及鉴定，中国农业科学，1999，32(5)：9-15)；
其他小麦品种均为常规小麦品种，由江苏省农业科学院粮食作物研究所保藏。
实施例涉及的白粉病鉴定方式：
白粉病抗性鉴定在江苏省农业科学院试验基地进行，用白粉病混合菌种，感染白粉病感病品种幼苗，在小麦返青期，将白粉病菌感染的幼苗移栽于感白粉病品种(如：苏麦3号)的诱发行(育种试验田四周或中间种植的感白粉病小麦材料)，诱发行白粉病发病后，感染分离世代育种材料。乳熟期采用0～9级标准调查病害的严重度,其中0级为免疫,1～2级为高抗,3～4级为中抗,5～6级为中感,7～9级为高感。上述表型鉴定方法为本领域常规简单方法(吴全安，粮食作物种质资源抗病虫鉴定方法，中国农业出版社，1991；《大麦品种抗病性鉴定技术规程第2部分：抗白粉病》(NY/T 3060.2-2016))。
实施例涉及的引物：
SEQ ID NO.1:GCCATCAAACACATCCTGATCC；
SEQ ID NO.2:CCATCTTTGTAGTGCGGTTGTC。
实施例1不同小麦遗传材料的标记引物6S-InDel 297分析
以普通小麦中国春，T6VS.6AL易位系92R137，T6VS.6DL易位系Pm97033，小麦品种宁麦9号、宁麦13、宁麦26、宁紫麦1号、扬麦13、扬麦15、扬麦16、扬麦20、扬麦25、扬麦29、扬辐麦4号、镇麦168、镇麦9号、镇麦10号、镇麦12、泰麦901、华麦1092、泰麦902、扬麦21、瑞华麦596的DNA(K2304Karroten植物基因组DNA提取试剂盒提取)为模板，以6S-InDel 297为引物进行PCR扩增。
PCR反应体系为20μL：DNA模板1μL(浓度40ng/μL)，标记引物SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2各1μL(浓度10μM)，2×Taq Plus Master MixⅡ(Vazyme)10.0μL，ddH2O 7μL；
PCR反应循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火40s，72℃延伸70s，34个循环；72℃延伸10min；
电泳检测检测：1.0％(质量百分数)琼脂糖凝胶电泳后检测，电泳电压100V，电泳时间1.5h。
检测结果如图1所示，中国春(泳道1)中扩增出6BS(403bp)、6DS(328bp)、6AS(297bp)条带；92R137(泳道2)扩增出6BS(403bp)、6DS(328bp)条带，6AS条带缺失，为T6VS.6AL易位系，与Chen PD等报道的一致(Theor.Appl.Genet.,1995,91:1125-1128)；Pm97033(泳道3)扩增出6BS(403bp)、6AS(297bp)条带，6DS条带缺失，为T6VS.6DL易位系，与李辉等报道的一致(中国农业科学，1999，32(5)：9-15)。泳道13、16、17、22均有6BS(403bp)、6DS(328bp)条带，分别为扬麦29、镇麦9号、镇麦10号、扬麦21，均为T6VS.6AL易位系衍生品种(Wu N,et al.,Predominant wheat-alien chromosome translocations in newlydeveloped wheat of China,Molecular Breeding,2021,41:30)；其余泳道有6BS(403bp)、6DS(328bp)、6AS(297bp)条带，为非6VS易位系品种。
实施例2 92R137/宁麦9号F2代植株的标记引物6S-InDel 297分析和白粉病抗性表现
参照小麦品种审定公告，本实施例中使用的宁麦9号为感白粉病小麦品种，以92R137/宁麦9号杂交种子种成F1代植株，将F1收获的种子点播种成F2代；以获得的F2代24个单株的DNA(K2304 Karroten植物基因组DNA提取试剂盒提取)为模板，以6S-InDel 297标记引物为引物进行PCR扩增。
6S-InDel 297标记引物的PCR反应体系及扩增产物电泳检测同实施例1，电泳结果如图2a所示，样品1、7、11、17、18扩增出6BS(403bp)、6DS(328bp)条带，为6VS.6AL纯合易位单株；其余样品扩增出6BS(403bp)、6DS(328bp)、6AS(297bp)条带，为6VS.6AL杂合易位单株或无6VS单株。
同时，对本实施例获得的92R137/宁麦9号F2代植株进行白粉病田间抗性鉴定，检测方式为在2月初用感白粉病(用白粉病混合菌种感染)的宁麦9号幼苗种于苏麦3号诱发行(诱发行种植于92R137/宁麦9号F2代植株四周)，使92R137/宁麦9号F2代植株发生白粉病；部分单株的检测结果如图2b所示，图中，R：抗病，S：感病；样品(单株)1、7、11、17、18均抗白粉病，且这些单株在F3代白粉病抗性不发生分离，这与6S-InDel 297标记引物检测结果一致。
实施例3宁麦13/镇麦9号F2代植株的标记引物6S-InDel 297分析和白粉病抗性表现
参照小麦品种审定公告，本实施例中使用的宁麦13是感白粉病品种，镇麦9号为T6VS.6AL易位系衍生品种(Wu N,et al.,Predominant wheat-alien chromosometranslocations in newly developed wheat of China,Molecular Breeding,2021,41:30)，抗白粉病。以宁麦13/镇麦9号杂交种子种成F1代植株，将F1收获的种子点播种成F2代；以获得的F2代24个单株的DNA为模板，以6S-InDel 297标记引物为引物进行PCR扩增。
6S-InDel 297标记引物的PCR反应体系及扩增产物检测同实施例1，结果如图3a所示，样品1、7、10、14、15、16、20扩增出6BS(403bp)、6DS(328bp)条带，为6VS.6AL纯合易位单株；其余样品扩增出6BS(403bp)、6DS(328bp)、6AS(297bp)条带，为6VS.6AL杂合易位单株或无6VS单株。
白粉病田间抗性鉴定(鉴定方法同实施例2)如图3b所示，图中，R：抗病，S：感病，样品(单株)1、7、10、14、15、16、20均抗白粉病，且这些单株在F3代白粉病抗性不发生分离,这与电泳检测结果一致。
实施例4 T6VS.6AL易位系为供体亲本的衍生品系或品种的标记引物6S-InDel297分析
以中国春(泳道1)、92R137(泳道2)，以及92R137衍生材料为供体亲本育成的13个高代品系或品种(泳道3-15)的DNA为模板，以6S-InDel 297标记引物为引物分别进行PCR扩增。
6S-InDel 297标记引物的PCR反应体系及扩增产物检测同实施例1，结果如图4所示，中国春(泳道1)中扩增出6BS(403bp)、6DS(328bp)、6AS(297bp)条带。92R137(泳道2)、T6VS.6AL易位系衍生品系或品种(泳道3-15)扩增出6BS(403bp)、6DS(328bp)条带，6AS条带缺失，均为6VS.6AL纯合易位系。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 用于鉴别普通小麦-簇毛麦6VS.6AL易位系的引物对及其应用
<141> 2021-06-09
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccatcaaac acatcctgat cc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccatctttgt agtgcggttg tc 22
Claims (4)
1.用于鉴别普通小麦-簇毛麦6VS.6AL易位系的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的引物对在鉴别T6VS.6AL纯合易位小麦中的应用，其特征在于，具体步骤如下：
以待测小麦DNA为模板，核苷酸序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对为引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若出现大小分别为403bp、328bp的2个条带，则判定该小麦材料为6VS.6AL纯合易位小麦。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增体系为：
浓度为40ng/µL的DNA模板1µL，浓度为10µM的引物I 1µL，浓度为10µM的引物II 1µL，2× Taq Plus Master Mix Ⅱ10 µL，ddH2O 补足至20µL；
所述引物I核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物II 核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
PCR反应循环程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，62℃退火40s，72℃延伸70s，34个循环；72℃延伸10min。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述待测小麦是指遗传系谱中至少有一个亲本为T6VS.6AL易位系的小麦。
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2021
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