CN111996275B - 一种辅助鉴定待测大豆的白粉病抗性的分子标记rmd16 - Google Patents

一种辅助鉴定待测大豆的白粉病抗性的分子标记rmd16 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辅助鉴定待测大豆的白粉病抗性的分子标记RMD16。该方法为以待测大豆的基因组DNA为模板，用分子标记RMD16的引物F和引物R进行PCR扩增，得到DNA片段；其中，引物F的序列为SEQ ID NO.1所示，或其经过一个或几个核苷酸的取代/缺失/添加且与SEQ ID NO.1具有相同功能的DNA分子；引物R的序列为SEQ ID NO.2所示，或其经过一个或几个核苷酸的取代/缺失/添加且与SEQ ID NO.1具有相同功能的DNA分子。本发明中的DNA片段大小与白粉病抗性紧密连锁，该方法具有快速、低成本、限制少等特点，可以辅助鉴定待测大豆白粉病抗性，提高育种效率。

Description

一种辅助鉴定待测大豆的白粉病抗性的分子标记RMD16
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种辅助鉴定待测大豆的白粉病抗性的分子标记RMD16。
背景技术
大豆[Glycine max(L.)Merrill]作为重要的粮食和经济作物，在人类的生产生活中有十分重要的地位。大豆白粉病由真菌Erysiphe diffusa和Erysiphe glycines引起，是一种影响大豆产量的病害。白粉病对大豆的危害主要集中在叶片，叶柄和茎秆也会发病，但豆荚很少发病。发病先从下部叶片开始，后向中上部蔓延；感病叶片正面，初期产生白色圆形粉末状小斑，扩大后呈边缘不明显的片状白粉斑，严重时发病叶片表面似撒一层白粉(病菌的菌丝体及分生孢子)；后期病斑上白粉逐渐由白色转为灰白色，可造成大豆减产30％～40％。实践证明，通过分子育种手段选育抗白粉病品种是防治大豆白粉病最经济有效的方法。
利用大豆种质资源筛选大豆白粉病抗性，结合大豆种质资源基因组测序对白粉病抗性进行全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)，发现一些紧密连锁位点。筛选紧密连锁位点，得到可以辅助鉴定大豆材料白粉病抗性的分子标记，可以从分子水平上快速准确地分析个体的基因型，大大加快了选育抗白粉病品种的进程。
说明内容
本发明的首要目的在于克服现有白粉病抗性鉴定技术的缺点与不足，提供一种特异引物对。
本发明的另一目的在于提供所述特异引物对的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种特异引物对，其可由用于扩增特异DNA片段的两条引物组成；所述的特异DNA片段中具有大豆基因组中引物F和引物R组成的引物对的靶序列；
所述的引物F为如下a1)或a2)：
a1)如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子；
a2)将SEQ ID NO.1经过一个或几个核苷酸的取代/缺失/添加且与SEQ ID NO.1具有相同功能的DNA分子；
所述的引物R为如下a3)或a4)：
a3)如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子；
a4)将SEQ ID NO.2经过一个或几个核苷酸的取代/缺失/添加且与SEQ ID NO.2具有相同功能的DNA分子。
所述的特异引物对具体可由所述引物F和所述引物R组成。
一种试剂盒，含有上述特异引物对。
所述的特异引物和/或试剂盒的应用，为如下b1)-b4)中的任意一种：
b1)辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性；
b2)辅助筛选具有或疑似具有大豆白粉病抗性的大豆品种；
b3)辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种；
b4)大豆育种。
一种DNA片段，为以大豆基因组DNA为模板，利用上述特异引物和/或试剂盒扩增得到。
所说的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
所述DNA片段的应用，为如下c1)-c8)中的任意一种：
c1)辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性；
c2)辅助筛选具有或疑似具有大豆白粉病抗性的大豆品种；
c3)辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种；
c4)大豆育种；
c5)制备辅助鉴定待测大豆的白粉病抗性的产品；
c6)制备辅助筛选具有或疑似具有大豆白粉病抗性的大豆品种的产品；
c7)制备辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种的产品；
c8)作为分子标记。
一种辅助鉴定待测大豆白粉病抗性的方法，为通过如下任一种或两种方法实现：
S1、根据PCR扩增产物进行辅助鉴定：
d1)提取待测大豆的基因组DNA，然后以待测大豆的基因组DNA为模板，采用所述的特异引物对和/或试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
d2)根据PCR扩增产物的大小判断大豆白粉病抗性：若PCR扩增产物中具有约103bp的DNA片段，说明待测大豆具有或疑似具有大豆白粉病抗性；若PCR扩增产物中具有约100bp的DNA片段，说明待测大豆不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性；
S2、根据待测大豆的基因组DNA进行辅助鉴定：
e1)提取待测大豆的基因组DNA，然后检测待测大豆的基因组DNA中是否含有如SEQID NO.3或SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
e2)根据DNA序列判断大豆白粉病抗性：如果待测大豆基因组中含有SEQ ID NO.3，则待测大豆具有或疑似具有大豆白粉病抗性；如果待测大豆基因组中含有SEQ ID NO.4，则待测大豆不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性。
步骤d1)中所述的PCR扩增的体系为10ul反应体系：10～15ng大豆基因组DNA、10ng引物F、10ng引物R、5ul GenStar 2×Taq PCR StarMix，余量为ddH2O。
步骤d1)中所述的PCR扩增的条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
一种辅助筛选不同大豆白粉病抗性的方法，为通过如下任一种或两种方法实现：
S3、根据PCR扩增产物进行辅助筛选；
f1)提取待测大豆的基因组DNA，然后以待测大豆的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对和/或试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
f2)根据PCR扩增产物的大小进行辅助筛选：“PCR扩增产物中含有约103bpDNA片段”的大豆白粉病抗性高于“PCR扩增产物中不含有约103bpDNA片段”的大豆；
S4、根据待测大豆的基因组DNA进行辅助筛选：
g1)提取待测大豆的基因组DNA，然后检测待测大豆基因组DNA中是否含有如SEQID NO.3或SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
g2)根据DNA序列进行辅助筛选：“待测大豆基因组DNA中含有SEQ ID NO.3”的大豆白粉病抗性高于“待测大豆基因组DNA中含有SEQ ID NO.4”的大豆。
步骤f1)中所述的PCR扩增的体系为10ul反应体系：10～15ng大豆基因组DNA、10ng引物F、10ng引物R、5ul GenStar 2×Taq PCR StarMix，余量为ddH2O。
步骤f1)中所述的PCR扩增的条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
需要说明的是，由于大豆种质资源经过多代自交后存在的杂合类型数量极少，因此通常认为大豆材料为纯合类型，因此本发明所述的特异引物对扩增的序列通常为SEQ IDNO.3(103bp)和SEQ ID NO.4(100bp)所示。
实验证明，采用本发明提供的分子标记具有较高的特异性，可以辅助鉴定待测大豆白粉病抗性。对常规育种来说，本发明对大豆白粉病抗性鉴定具有快速、低成本和限制小等特点，具有重大的应用价值。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明开发了一种辅助鉴定待测大豆白粉病抗性的分子标记RMD16，使用方法为以待测大豆的基因组DNA为模板，用分子标记RMD16的引物F和引物R进行PCR扩增，得到DNA片段。实验证明，DNA片段大小与白粉病抗性紧密连锁，该方法具有快速、低成本、限制少等特点，并且利用该方法可大大提高育种效率。
附图说明
图1是RMD16在396份种质资源证明实验结果图(泳道M为Marker100bp；泳道1～396对应表1中的396份种质资源)。
图2是RMD16在194份马山仁峰黑豆*华夏3号的F2株系中的验证实验结果图(泳道Marker为Marker 100bp；泳道M为马山仁峰黑豆；泳道H为华夏3号；其余泳道对应表2中的194份材料)。
图3是Satt431引物在396份种质资源鉴定对比实验结果图(泳道M为Marker200bp；泳道1～396对应表1中的396份种质资源)。
图4是Satt431引物在194份马山仁峰黑豆*华夏3号F2株系中的鉴定对比实验结果图(泳道Marker为Marker 200bp；泳道M为马山仁峰黑豆；泳道H为华夏3号；其余泳道对应表2中的194份材料)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1分子标记的开发和多态性检测
一、大豆种质资源大豆白粉病抗性鉴定
本实施例中的396份大豆种质资源的名称详见表1(该396份大豆育种材料中含有育种品种(详细信息记载于如下文献中：吉林农业科学院.中国大豆品种志[M].北京，农业出版社.1985和盖钧镒，熊东金，赵团结.中国大豆育成品种系谱与种质基础(1923-2005)[M].北京，中国农业出版社.2015)，国外品种和南方大豆地方品种由国家大豆改良中心广东分中心收集保存。
2017年12月至2020年3月，分别在海南陵水、广州华南农业大学试验农场、海南陵水的试验田种植396份大豆种质资源，待其生长至苗期，为让大豆材料均匀接受白粉病菌。采用喷雾法人工辅助接种大豆白粉病菌，步骤如下：
(1)采集新鲜的感染大豆白粉病菌的大豆叶片若干；
(2)用1％(v/v)的Tween 20洗采集的新鲜白粉病叶片，获得孢子悬浮液；
(3)检测孢子悬浮液的浓度达到1*105个/ml；
(4)采用喷雾的方式将孢子悬浮液均匀地喷洒在植株叶片的上表面。
待充分发病后，田间肉眼观察叶片白粉病发病情况进行抗/感调查。病情分级采用0～5级分级标准：0级为抗病(R)，1级、2级、3级、4级和5级为感病(S)；0级叶片表面无白色粉末状病斑，无病害；1级叶面有少量病斑，占病斑面积少于1/3；2级病斑占叶面积1/3～2/3；3级病斑占叶面积2/3以上；4级病斑几乎布满整个叶片；5级病斑遍布整个叶片。具体参考：李穆，刘念析，岳岩磊，等.抗大豆白粉病南方栽培大豆种质资源的初步筛选[J].大豆科学.2016,35(02):209-212.
396份大豆育种材料白粉病抗性的表型鉴定结果见表1。
二、分子标记RMD16的开发
本发明的发明人根据396份大豆种质资源测序与大豆白粉病抗性调查结果关联分析，开发了与大豆白粉病抗性相关的分子标记RMD16。具体开发步骤如下：
首先于2016-2020年分别在广州和三亚种植396份大豆育种材料后接种白粉病菌种，田间调查了大豆育种材料的抗/感白粉病表型，并将种质资源库中材料进行重测序；然后通过全基因组关联分析(GWAS)得到一批与表型可能连锁的位点；最后通过基因注释等筛选，发现其中一个关联位点。研究发现该位点位于NBS-LRR抗病基因家族。通过设计特异引物对在大豆育种材料和育种群体中实验验证确定该位点与大豆白粉病抗性表型紧密连锁，将该引物命名为RMD16。
引物F：5’-TTCAACAGTACCATAGC-3’(SEQ ID NO.1)；
引物R：5’-TGATATACTCCGTGCTC-3’(SEQ ID NO.2)。
三、396份大豆种质资源的分子鉴定
1、基因组DNA提取：采用SDS法提取大豆种质资源幼嫩叶片的基因组DNA。
2、PCR扩增：分别以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，用本发明标记的引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增。
PCR反应体系为10ul，由10～15ng大豆基因组DNA、10ng引物F、10ng引物R、5ulGenStar2×Taq PCR StarMix(北京康润诚业生物科技有限公司的产品)和ddH2O组成。
PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳：将上一步得到的PCR扩增产物进行6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压300V，电流100mA，电泳2.5h)，然后用0.1％的AgNO3染色，显色液(0.025％(w/v)四硼酸钠、1.5％(w/v)NaOH、0.4％(v/v)甲醛)显色，记录条带，拍照。
4、结果显示，396份大豆种质资源的PCR扩增产物的大小有103bp的条带(SEQ IDNO.3)和100bp的条带(SEQ ID NO.4)两种。具体PCR扩增产物序列如下所示：
SEQ ID NO.3：
TTCAACAGTACCATAGCAGTTGTTAAGCTTTATGAGAGATTTTTCAACCAACACCCCAATATGATGCTTCTTGCAGTTACCATAAAGAGCACGGAGTATATCA；
SEQ ID NO.4：
TTCAACAGTACCATAGCaGTTAAGCTTTATGAGAGATTTTTCAACCAACACCCCAATATGATGCTTCTTGCAGTTACCATAAAGAGCACGGAGTATATCA。
四、结果分析
各个大豆种质资源的分子鉴定结果见表1，原始胶图结果见图1(泳道M为Marker100bp位置)。
根据396份大豆种质资源的分子鉴定和大豆白粉病抗性的表型鉴定结果，发现PCR产物为103bp的271份大豆种质资源中，表型鉴定为抗白粉病大豆品种265份，表型鉴定为感白粉病大豆品种6份，标记的正确率为97.79％；PCR产物为100bp的125份大豆种质资源中，表型鉴定为感白粉病大豆品种124份，表型鉴定为抗白粉病大豆品种1份，标记的正确率为99.2％。396份大豆的平均检测准确度为98.23％。
表1两种标记在396份大豆种质资源中分子鉴定和白粉病抗感比较
Figure BDA0002633787190000061
Figure BDA0002633787190000071
Figure BDA0002633787190000081
Figure BDA0002633787190000091
Figure BDA0002633787190000101
Figure BDA0002633787190000111
Figure BDA0002633787190000121
实施例2、分子标记RMD16的应用
一、育种群体F2：3的获得
以大豆品种马山仁峰黑豆(马山仁峰黑豆为在广西壮族自治区南宁市马山县采集所得)为母本，大豆品种华夏3号为父本进行杂交，得到杂交种子为F1，播种后得到217粒F2种子。F2中的部分植株在种植过程中因病害等原因死亡，得到194个单株系F3的材料(详见表2)。
二、194个株系大豆白粉病抗性的表型鉴定
按照实施例1步骤一(大豆种质资源大豆白粉病抗性鉴定)的方法对194个F3单株系进行表型鉴定，记录大豆白粉病抗性情况。详见表2，结果如表2所示(R表示抗病；S表示感病，R/S表示该单株系存在抗白粉病单株和感白粉病单株)。
三、194个株系的分子鉴定
1、基因组DNA提取：采用SDS法提取F2植株的幼嫩叶片的基因组DNA。
2、PCR扩增：分别以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，用本发明标记的引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增。
PCR反应体系为10ul，由10～15ng大豆基因组DNA、10ng引物F、10ng引物R、5ulGenStar2×Taq PCR StarMix(北京康润诚业生物科技有限公司的产品)和ddH2O组成。
PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳：将上一步得到的PCR扩增产物进行6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压300V，电流100mA，电泳2.5h)，然后用0.1％的AgNO3染色，显色液(0.025％(w/v)四硼酸钠、1.5％(w/v)NaOH、0.4％(v/v)甲醛)显色，记录条带，拍照。
4、结果显示，194个株系的PCR扩增产物有带型103bp的条带(SEQ ID NO.3)，带型100bp的条带(SEQ ID NO.4)，以及带型100bp+103bp(同时含有100bp和103bp的条带；即同时含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的序列)三种，结果如表2所示。
表2马山仁峰黑豆*华夏3号F3表型及RMD16带型
Figure BDA0002633787190000131
Figure BDA0002633787190000141
Figure BDA0002633787190000151
四、结果分析
比较标记RMD16对194个株系的分子鉴定和大豆白粉病抗性的表型鉴定结果(图2)，发现分子鉴定为103bp带型的41个株系中，表型鉴定为抗白粉病株系40个，表型鉴定为感白粉病株系0个，表型鉴定为抗/感分离株系1个，标记的正确率为97.56％；分子鉴定为100bp带型的50个株系中，表型鉴定为抗白粉病株系0个，表型鉴定为感白粉病株系47个，表型鉴定为抗/感分离株系3个，标记的正确率为94.00％；分子鉴定为带型100bp+103bp带型的103个株系中，表型鉴定为抗/感分离株系101个，表型鉴定为抗白粉病株系1个，表型鉴定为感白粉病株系1个，标记的正确率为98.06％。194个株系的平均检测准确度为96.91％。
对比例1引物的来源和多态性检测
一、对比试验引物的来源
为了验证本标记的选择效率，选取参考文献(Jiang B,Li M,Cheng Y,etal.Genetic mapping of powdery mildew resistance genes in soybean by high-throughput genome-wide sequencing.Theor Appl Genet.2019；132(6):1833-1845.)中的与大豆白粉病抗病基因Rmd-B3连锁的分子标记Satt431在396份大豆材料中进行分析。其中，Satt431的引物序列如下：
引物F2：5’-GCGTGGCACCCTTGATAAATAA-3’(SEQ ID NO.5)；
引物R2：5’-GCGCACGAAAGTTTTTCTGTAACA-3’(SEQ ID NO.6)。
二、Satt431在396份大豆种质资源中的多态性鉴定
1、基因组DNA提取：采用SDS法提取大豆种质资源幼嫩叶片的基因组DNA。
2、PCR扩增：分别以提取的基因组DNA为模板，用本发明标记的引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增。PCR反应体系为10ul，由10～15ng大豆基因组DNA、10ng引物F、10ng引物R、5ul GenStar 2×Taq PCR StarMix(北京康润诚业生物科技有限公司的产品)和ddH2O组成。
PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳：将上一步得到的PCR扩增产物进行6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压300V，电流100mA，电泳3.25h)，然后用0.1％的AgNO3染色，显色液(0.025％(w/v)四硼酸钠、1.5％(w/v)NaOH、0.4％(v/v)甲醛)显色，记录条带，拍照。
4结果展示：396份大豆种质资源的PCR扩增产物的大小共有9种条带。用带型定量分析软件Quantity One 4.6.2分析图片，以100bp DNA ladder(擎科生物技术有限公司的产品)为Marker，获得各样品扩增片段的大小。
三、结果分析
各个大豆种质资源的对比试验分子鉴定结果见表1。原始胶图结果见图3(泳道M为Marker 200bp位置)。对不同带型分别统计发现(见表1和表3)，在396份大豆种质资源中出现10种带型，一种带型只在部分育种材料中出现，出现最多的240bp带型，也只在85个育种材料中出现；呈现240bp带型的材料中抗白粉病品种占该带型的比例达到了90％，但并不能用于大豆育种材料的分子鉴定。因此Satt431引物不能用于大豆种质资源白粉病抗/感的分子鉴定。
表3标记Satt431在大豆种质资源中分子鉴定结果与白粉病抗感比较
Figure BDA0002633787190000171
对比例2 Satt431的应用对比分析
一、对比试验引物的来源
为了验证本标记的选择效率，选取前人发表的与大豆白粉病抗病基因Rmd-B3连锁的分子标记Satt431(参考文献为：Jiang B,Li M,Cheng Y,et al.Genetic mapping ofpowdery mildew resistance genes in soybean by high-throughput genome-widesequencing.Theor Appl Genet.2019；132(6):1833-1845.)，同时在该育种群体中进行对比分析。
二、Satt431在194个株系中的多态性鉴定
按照对比例1步骤二(Satt431在396份大豆种质资源中的多态性鉴定)的方法对194个株系(具体见实施例2)进行分子鉴定。用带型定量分析软件Quantity One 4.6.2分析图片，以100bp DNA ladder(擎科生物技术有限公司的产品)为Marker，获得各样品扩增片段的大小。马山仁峰黑豆的带型为200bp，华夏3号的带型为213bp。
三、结果分析
结果如图4所示：根据194个株系的分子鉴定和大豆白粉病抗性的表型鉴定结果，发现分子鉴定为带型200bp的41个株系中，抗白粉病株系37个，感白粉病株系0个，抗/感分离株系4个，标记的正确率为90.24％；分子鉴定为带型213bp的52个株系中，抗白粉病株系0个，感白粉病株系46个，抗/感分离株系6个，标记的正确率为88.46％；分子鉴定为带型200+213bp的101个株系中，抗/感分离株系95个，抗白粉病株系4个，感白粉病株系2个，标记的正确率为94.06％。Satt431在194个株系的平均检测准确度为91.75％。
虽然Satt431在育种群体中确实与抗病基因连锁，但其辅助鉴定种质资源库大豆白粉病抗性的效率低于RMD16(见对比例1)。因此，Satt431不能作为鉴定种质资源库大豆的白粉病抗性的分子标记。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种辅助鉴定待测大豆的白粉病抗性的分子标记RMD16
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物F
<400> 1
ttcaacagta ccatagc 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物R
<400> 2
tgatatactc cgtgctc 17
<210> 3
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCR扩增产物1
<400> 3
ttcaacagta ccatagcagt tgttaagctt tatgagagat ttttcaacca acaccccaat 60
atgatgcttc ttgcagttac cataaagagc acggagtata tca 103
<210> 4
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCR扩增产物2
<400> 4
ttcaacagta ccatagcagt taagctttat gagagatttt tcaaccaaca ccccaatatg 60
atgcttcttg cagttaccat aaagagcacg gagtatatca 100
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物F2
<400> 5
gcgtggcacc cttgataaat aa 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物R2
<400> 6
gcgcacgaaa gtttttctgt aaca 24

Claims (10)

1.一种特异引物对，其特征在于：由用于扩增特异DNA片段的两条引物组成；所述的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
2.一种试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的特异引物对。
3.权利要求1所述的特异引物对和/或权利要求2所述的试剂盒的应用，其特征在于，为如下b1)-b3)中的任意一种：
b1)辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性；
b2)辅助筛选具有或疑似具有大豆白粉病抗性的大豆品种；
b3)辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种。
4.一种DNA片段，其特征在于：为以大豆基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的特异引物对和/或权利要求2所述的试剂盒扩增得到。
5.根据权利要求4所述的DNA片段，其特征在于：所说的DNA片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示。
6.权利要求4或5所述的DNA片段的应用，其特征在于，为如下c1)-c7)中的任意一种：
c1)辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性；
c2)辅助筛选具有或疑似具有大豆白粉病抗性的大豆品种；
c3)辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种；
c4)制备辅助鉴定待测大豆的白粉病抗性的产品；
c5)制备辅助筛选具有或疑似具有大豆白粉病抗性的大豆品种的产品；
c6)制备辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种的产品；
c7)作为辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种的分子标记。
7.一种辅助鉴定待测大豆白粉病抗性的方法，其特征在于，为通过如下任一种或两种方法实现：
S1、根据PCR扩增产物进行辅助鉴定：
d1)提取待测大豆的基因组DNA，然后以待测大豆的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的特异引物对和/或权利要求2所述的试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
d2)根据PCR扩增产物的大小判断大豆白粉病抗性：若PCR扩增产物为103bp的DNA片段，说明待测大豆具有或疑似具有大豆白粉病抗性；若PCR扩增产物为100bp的DNA片段，说明待测大豆不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性；
S2、根据待测大豆的基因组DNA进行辅助鉴定：
e1)提取待测大豆的基因组DNA，然后检测待测大豆的基因组DNA中是否含有如SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
e2)根据DNA序列判断大豆白粉病抗性：如果待测大豆基因组中含有SEQ ID NO.3，则待测大豆具有或疑似具有大豆白粉病抗性；如果待测大豆基因组中含有SEQ ID NO.4，则待测大豆不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性。
8.根据权利要求7所述的辅助鉴定待测大豆白粉病抗性的方法，其特征在于：
步骤d1)中所述的PCR扩增的体系为10ul反应体系：10～15ng大豆基因组DNA、10ng引物F、10ng引物R、5ul GenStar 2×Taq PCR StarMix，余量为ddH2O；
步骤d1)中所述的PCR扩增的条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
9.一种辅助筛选不同大豆白粉病抗性的方法，其特征在于，为通过如下任一种或两种方法实现：
S3、根据PCR扩增产物进行辅助筛选；
f1)提取待测大豆的基因组DNA，然后以待测大豆的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的特异引物对和/或权利要求2所述的试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
f2)根据PCR扩增产物的大小进行辅助筛选：“PCR扩增产物为103bp的DNA片段”的大豆白粉病抗性高于“PCR扩增产物不是103bp的DNA片段”的大豆；
S4、根据待测大豆的基因组DNA进行辅助筛选：
g1)提取待测大豆的基因组DNA，然后检测待测大豆基因组DNA中是否含有如SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
g2)根据DNA序列进行辅助筛选：“待测大豆基因组DNA中含有SEQ ID NO.3”的大豆白粉病抗性高于“待测大豆基因组DNA中含有SEQ ID NO.4”的大豆。
10.根据权利要求9所述的辅助筛选不同大豆白粉病抗性的方法，其特征在于：
步骤f1)中所述的PCR扩增的体系为10ul反应体系：10～15ng大豆基因组DNA、10ng引物F、10ng引物R、5ul GenStar 2×Taq PCR StarMix，余量为ddH2O；
步骤f1)中所述的PCR扩增的条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
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US7473823B1 (en) * 2006-08-24 2009-01-06 Syngenta Participations Ag Soybean cultivar S06-SJ144056
CA2868216A1 (en) * 2012-04-11 2013-10-17 Basf Plant Science Company Gmbh Fungal resistant plants expressing ocp3
CN104593481A (zh) * 2013-10-30 2015-05-06 江苏省常熟现代农业产业园区发展有限公司 应用候选基因策略快速鉴定大豆抗白粉病基因
AR108695A1 (es) * 2016-06-09 2018-09-19 Syngenta Participations Ag Loci genéticos asociados con resistencia a enfermedades en soja
CN106434689B (zh) * 2016-08-02 2019-10-29 周口师范学院 一种植物抗病必需基因ShORR-1及其应用
CN108690883B (zh) * 2018-08-17 2020-09-15 华南农业大学 一种辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性的分子标记rmd7

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