CN108690883B - 一种辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性的分子标记rmd7 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性的分子标记RMD7。分子标记RMD7是以待测大豆的基因组DNA为模板，采用引物F和引物R进行PCR扩增,得到的DNA片段。引物F为序列表的序列3所示的单链DNA分子。引物R为序列表的序列4所示的单链DNA分子。实验证明，分子标记RMD7具有较高的多态性，可以辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性，具有快速、低成本以及限制少等特点，可大大提高育种效率。本发明具有重大的应用价值。

Description

一种辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性的分子标记RMD7

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性的分子标记RMD7。

背景技术

大豆是重要的经济作物，在世界范围内普遍种植，是人类食用油和植物蛋白的主要来源。大豆白粉病(soybean powdery mildew)是由大豆白粉病菌(MicrosphaeradiffusaCooke&Peck)侵染引起的一种区域性和季节性较强的真菌性病害，可导致大豆减产30-40％。大豆白粉病为多循环病害，病害潜育期短，一个生长季可多代繁殖且繁育率高，产生的孢子可借助空气大范围传播，并多次重复侵染寄主作物，一旦遇到合适的气候和环境条件，该病可能大范围发生且流行性快。因此，选育抗大豆白粉病的大豆品种是防治大豆白粉病最有效、最经济环保的手段。

筛选并利用优异抗源是培育抗大豆白粉病的大豆品种的前提，而大豆白粉病菌是严格寄生菌，只能通过活体进行培养繁殖，并且大豆白粉病的发生与否以及严重程度取决于环境条件。若要对大豆品种进行抗源筛选，只能在特定的地区和时间进行。分子标记辅助选择(market-assisted selection，MAS)可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种；其不受环境条件影响且选择准确性高，因此开发与大豆白粉病抗性相关的分子标记具有较大意义。

发明内容

本发明的目的是辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性。

本发明首先保护一种特异引物对，其可由用于扩增特异DNA片段的两条引物组成；所述特异DNA片段中具有大豆基因组中引物F和引物R组成的引物对的靶序列；

所述引物F可为如下a1)或a2)：

a1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物R可为如下a3)或a4)：

a3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

a4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。

所述特异引物对具体可由所述引物F和所述引物R组成。

所述特异引物对的应用也属于本发明的保护范围。所述特异引物对的应用可为如下b1)-b4)中的任一种：

b1)辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性；

b2)辅助筛选具有或疑似具有大豆白粉病抗性的大豆品种；

b3)辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种；

b4)大豆育种。

本发明还保护一种试剂盒，其含有上述任一所述特异引物对。

所述试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的应用可为如下b1)-b4)中的任一种：

b1)辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性；

b2)辅助筛选具有或疑似具有大豆白粉病抗性的大豆品种；

b3)辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种；

b4)大豆育种。

本发明还保护以待测大豆的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对扩增得到的DNA片段。

所述DNA片段即为本发明要保护的分子标记RMD7。

所述DNA片段的核苷酸序列具体可如序列表中的序列1所示。

所述DNA片段的核苷酸序列具体可如序列表中的序列2所示。

所述DNA片段的应用也属于本发明的保护范围。所述DNA片段的应用可为如下b1)-b8)中的任一种：

b1)辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性；

b2)辅助筛选具有或疑似具有大豆白粉病抗性的大豆品种；

b3)辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种；

b4)大豆育种；

b5)制备辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性的产品；

b6)制备辅助筛选具有或疑似具有大豆白粉病抗性的大豆品种的产品；

b7)制备辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种的产品；

b8)作为分子标记。

本发明还保护一种辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性的方法，可包括如下步骤：

(1)以待测大豆的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(2)完成步骤(1)后，进行如下判断：如果所述PCR扩增产物中具有约365bp的DNA片段、待测大豆具有或疑似具有大豆白粉病抗性，如果所述PCR扩增产物中不具有约365bp的DNA片段、待测大豆不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性。

本发明还保护一种辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性的方法，可包括如下步骤：

(1)检测待测大豆的基因组DNA中是否含有DNA区段甲或DNA区段乙；

所述DNA区段甲的核苷酸序列如序列表中的序列1所示；

所述DNA区段乙的核苷酸序列如序列表中的序列2所示；

(2)完成步骤(1)后，进行如下判断：如果待测大豆的基因组DNA中含有DNA区段甲、待测大豆不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性，如果待测大豆的基因组DNA中含有DNA区段乙、待测大豆具有或疑似具有大豆白粉病抗性。

本发明还保护一种辅助筛选不同大豆白粉病抗性的大豆的方法，可包括如下步骤：以待测大豆的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；“PCR扩增产物中具有约365bp的DNA片段”的大豆的白粉病抗性高于“PCR扩增产物中不具有约365bp的DNA片段”的大豆。

本发明还保护一种辅助筛选不同大豆白粉病抗性的大豆的方法，可包括如下步骤：检测待测大豆的基因组DNA中是否含有DNA区段甲或DNA区段乙；

所述DNA区段甲的核苷酸序列如序列表中的序列1所示；

所述DNA区段乙的核苷酸序列如序列表中的序列2所示；

“待测大豆的基因组DNA中含有DNA区段乙”的大豆的白粉病抗性高于“待测大豆的基因组DNA中含有DNA区段甲”的大豆。

需要说明的是，由于大豆种质资源经过多代自交后存在杂合类型的数量极少，因此通常被默认为是高度纯合的大豆材料，所以大豆材料分子标记RMD7的核苷酸序列通常为序列表中的序列1(456bp)或序列表中的序列2(365bp)所示。

实验证明，采用本发明提供的分子标记RMD7具有较高的特异性，可以辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性，具有快速、低成本以及限制少等特点，可大大提高育种效率。本发明具有重大的应用价值。

附图说明

图1为大豆白粉病菌侵染大豆品种BRSMG68(抗白粉病)和大豆品种桂早1号(感白粉病)后的表型。

图2为部分大豆种质资源的分子鉴定。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

高效植物基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的产品。

下述实施例中的100份大豆种质资源的名称详见表1，100份大豆种质资源的详细信息记载于如下文献中：吉林农业科学院.中国大豆品种志[M].北京，农业出版社.1985和盖钧镒，熊冬金，赵团结.中国大豆育成品种系谱与种质基础(1923-2005)[M].北京，中国农业出版社.2015。

表1. 100份大豆种质资源大豆白粉病抗性鉴定表

实施例1、分子标记RMD7的开发和多态性检测

一、分子标记RMD7的开发

本发明的发明人经过大量实验，开发了与大豆白粉病抗性相关的分子标记RMD7。

扩增分子标记RMD7的核苷酸序列如下所示：

引物F：5’-CATCTCTGTGTCAGATTCAC-3’(序列表中的序列3)；

引物R：5’-CTGAACGAGTTGATAGGAGT-3’(序列表中的序列4)。

二、多态性检测

A、多态性检测一

1、100份大豆种质资源大豆白粉病抗性的表型鉴定

2016年12月至2018年3月，将100份大豆种质资源分别种植于广州市华南农业大学校内试验基地(以下简称“广州试验基地”)、广州市华南农业大学增城试验基地(以下简称“增城试验基地”)和广州试验基地温室，待生长至苗期，采用喷雾接种法人工辅助接种大豆白粉病菌(目的为让感病材料完全发病)，待充分发病(处于白粉病高发期)后，分别于苗期和初花期进行植株白粉病抗性调查，如果某大豆种质资源的植株在上述两个时期均没有白粉病症状，则该大豆种质资源为抗白粉病大豆品种；否则为感白粉病大豆品种。

采用喷雾接种法人工辅助接种大豆白粉病菌的步骤如下：

(1)从广州试验基地采集感染大豆白粉病菌的大豆植株叶片若干，用笔刷刷取病叶上的孢子并收集于盛有无菌水的烧杯中，混匀，得到孢子悬浮液。

(2)完成步骤(1)后，将孢子悬浮液进行喷雾接种。

大豆白粉病菌侵染大豆品种BRSMG68和大豆品种桂早1号，充分发病后植株症状见图1。结果表明，大豆品种BRSMG68为抗白粉病大豆品种，大豆品种桂早1号为感白粉病大豆品种。

各个大豆种质资源白粉病抗性的表型鉴定结果见表1中第3列。

2、100份大豆种质资源的分子鉴定

(1)采用高效植物基因组DNA提取试剂盒分别提取100份大豆种质资源幼嫩叶片的基因组DNA，得到大豆的基因组DNA。

(2)分别以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，用步骤一中引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR反应体系为10μL，由10-15ng大豆的基因组DNA、10ng引物F、10ng引物R、5μLGenStar 2×Taq PCR StarMix(北京康润诚业生物科技有限公司的产品)和ddH₂O组成。

PCR反应条件：94℃2min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min。

(3)取部分步骤(2)得到的PCR扩增产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳(100V电压下电泳40min)，然后用Nucleic Acid Stain(北京鼎国昌盛生物技术有限公司的产品)进行核酸染色，凝胶成像系统下拍照。

部分结果见图2(泳道1-23分别为23个大豆种质资源)。结果显示，100份大豆种质资源的PCR扩增产物的带型为两种：带型A(显示一条带，为456bp)和带型B(显示一条带，约为365bp)。

各个大豆种质资源的分子鉴定结果见表1中第4列。

根据100份大豆种质资源的分子鉴定和大豆白粉病抗性的表型鉴定结果，发现分子鉴定为带型A的79份大豆种质资源中，表型鉴定为感白粉病大豆品种的73份，表型鉴定为抗白粉病大豆品种6份，标记的正确率为92.4％；分子鉴定为带型B的21份大豆种质资源中，表型鉴定为感白粉病大豆品种的2份，表型鉴定为抗白粉病大豆品种19份，标记的正确率为90.4％。100份大豆种质资源的标记的正确率为92％。

B、多态性检测二

1、100份大豆种质资源大豆白粉病抗性的表型鉴定

同步骤A中1。

2、100份大豆种质资源的分子鉴定

(1)同步骤A 2中(1)。

(2)同步骤A 2中(2)。

(3)取部分步骤(2)得到的PCR扩增产物，测序；测序结果显示，100份大豆种质资源的PCR扩增产物的核苷酸序列有两种：DNA序列甲(序列表中的序列1所示，约456bp)和DNA序列乙(序列表中的序列2所示，约365bp)。

各个大豆种质资源的分子鉴定结果见表1中第5列。

根据100份大豆种质资源的分子鉴定和大豆白粉病抗性的表型鉴定结果，发现分子鉴定为DNA序列甲的79份大豆种质资源中，表型鉴定为感白粉病大豆品种的73份，表型鉴定为抗白粉病大豆品种6份，标记的正确率为92.4％；分子鉴定为DNA序列乙的21份大豆种质资源中，表型鉴定为感白粉病大豆品种的2份，表型鉴定为抗白粉病大豆品种19份，标记的正确率为90.4％。100份大豆种质资源的标记的正确率为92％。这一结果与多态性检测一中的实验结果完全一致。

上述结果表明，步骤一开发的分子标记RMD7具有较高的多态性。需要说明的是，由于大豆种质资源经过多代自交后存在杂合类型的数量极少，因此通常被默认为是高度纯合的大豆材料，所以大豆材料分子标记RMD7的核苷酸序列通常为序列表中的序列1(456bp)或序列表中的序列2(365bp)所示。

实施例2、分子标记RMD7的应用

一、重组自交系群体F_2：10的获得

以大豆品种桂早1号为母本，大豆品种BRSMG68为父本进行杂交，得到杂交F₁，后采用单粒传法构建重组自交系群体，得到319个F_2：10子代，即319个株系。

二、319个株系的分子鉴定

按照实施例1二中多态性检测一的方法对319个株系进行分子鉴定。

结果表明，180个株系的PCR扩增产物的带型为带型A，这180个株系鉴定为感白粉病大豆品种；139个株系的PCR扩增产物的带型为带型B，这139个株系鉴定为抗白粉病大豆品种。

三、319个株系大豆白粉病抗性的表型鉴定

2017年12月，将319个株系种植于广州市华南农业大学增城试验基地待生长至苗期，采用喷雾接种法人工辅助接种大豆白粉病菌(目的为让感病材料完全发病)，待充分发病(处于白粉病高发期)后，分别于苗期和初花期进行植株白粉病抗性调查，如果某株系的植株在上述两个时期均没有白粉病症状，则该株系为抗白粉病大豆品种；否则为感白粉病大豆品种。

采用喷雾接种法人工辅助接种大豆白粉病菌的步骤如下：

(1)从广州市华南农业大学增城试验基地采集感染大豆白粉病菌的大豆植株叶片若干，用笔刷刷取病叶上的孢子并收集于盛有无菌水的烧杯中，混匀，得到孢子悬浮液。

(2)完成步骤(1)后，将孢子悬浮液进行喷雾接种。

结果表明，步骤二中鉴定为感白粉病大豆品种的180个株系中，176个株系通过表型鉴定为感白粉病大豆品种，4个株系通过表型鉴定为抗白粉病大豆品种，检测的准确率为97.8％；步骤二中鉴定为抗白粉病大豆品种的139个株系中，133个株系通过表型鉴定为抗白粉病大豆品种，6个株系通过表型鉴定为感白粉病大豆品种，检测的准确率为95.7％。319个株系的平均检测准确率为96.9％。

由此可见，应用分子标记RMD7可以辅助鉴定大豆品种是否具有大豆白粉病抗性。

<110> 华南农业大学

<120> 一种辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性的分子标记RMD7

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

catctctgtg tcagattcac agcaaaagaa tgttgacttg tggctggacc ccaacaatta 60

ggtctcagct ctcatgtttt ctctcacttg attgggctca actttctcac aaaacagagt 120

ccaccttctg ccgtgttgaa gttgcccctc cctcactttt tctctcacat gtctcttctc 180

ctgtgttgaa tttgtgtctc tcccttggct gtgtcgaagt cacctcttct gtcacacttc 240

acaccttcct ctgccatttg caacaggtta aagctccttc ctctgtcaca gcgacccatt 300

cagctcatcc actcatgtga gtctaatttt ggtccattat tttcactttg gcttattagt 360

gataagctca ttattcactt tttgatccat tcagcactaa tgtaactata aatctgatac 420

ctttcggtcc atttacactc ctatcaactc gttcag 456

<210> 2

<211> 365

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

catctctgtg tcagattcac agcaaaagaa tgttgacttg tggctggacc ccaacaatta 60

ggtctcagct ctcatttttc tctcacttga ttagggctca actttctcac aaaacagagt 120

ccaccttctg ctgtgttgaa gttgcccctc cctcactttt tctctcacat gtctcttctc 180

ctgtgttgaa tttgtgtctc tcccttggct gtgtcgaagt cacctcttct gtctcacttc 240

acaccttcct ctgccatttg caacaggtta aagctccttc ctctgtcaca gcgacccatt 300

cagcactaat gtaactataa atctgatacc tttcggtcca tttacactcc tatcaactcg 360

ttcag 365

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

catctctgtg tcagattcac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ctgaacgagt tgataggagt 20

Claims (9)

1.特异引物对，所述特异引物对由引物F和引物R组成；

所述引物F为序列表的序列3所示的单链DNA分子；

所述引物R为序列表的序列4所示的单链DNA分子。

2.一种试剂盒，含有权利要求1所述特异引物对。

3.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述试剂盒的应用，为如下b1)-b3)中的任一种：

b1)辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性；

b2)辅助筛选具有或疑似具有大豆白粉病抗性的大豆品种；

b3)辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种。

4.以待测大豆的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述特异引物对扩增得到的DNA片段。

5.权利要求4所述DNA片段的应用，为如下b1)-b6)中的任一种：

b1)辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性；

b2)辅助筛选具有或疑似具有大豆白粉病抗性的大豆品种；

b3)辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种；

b4)制备辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性的产品；

b5)制备辅助筛选具有或疑似具有大豆白粉病抗性的大豆品种的产品；

b6)制备辅助筛选不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性的大豆品种的产品。

6.一种辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性的方法，包括如下步骤：

(1)以待测大豆的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(2)完成步骤(1)后，进行如下判断：如果所述PCR扩增产物中具有约365bp的DNA片段、待测大豆具有或疑似具有大豆白粉病抗性，如果所述PCR扩增产物中不具有约365bp的DNA片段、待测大豆不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性。

7.一种辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性的方法，包括如下步骤：

(1)检测待测大豆的基因组DNA中是否含有DNA区段甲或DNA区段乙；所述DNA区段甲的核苷酸序列如序列表中的序列1所示；所述DNA区段乙的核苷酸序列如序列表中的序列2所示；

(2)完成步骤(1)后，进行如下判断：如果待测大豆的基因组DNA中含有DNA区段甲、待测大豆不具有或疑似不具有大豆白粉病抗性，如果待测大豆的基因组DNA中含有DNA区段乙、待测大豆具有或疑似具有大豆白粉病抗性。

8.一种辅助筛选不同大豆白粉病抗性的大豆的方法，包括如下步骤：以待测大豆的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；“PCR扩增产物中具有约365bp的DNA片段”的大豆的白粉病抗性高于“PCR扩增产物中不具有约365bp的DNA片段”的大豆。

9.一种辅助筛选不同大豆白粉病抗性的大豆的方法，包括如下步骤：检测待测大豆的基因组DNA中是否含有DNA区段甲或DNA区段乙；所述DNA区段甲的核苷酸序列如序列表中的序列1所示；所述DNA区段乙的核苷酸序列如序列表中的序列2所示；

“待测大豆的基因组DNA中含有DNA区段乙”的大豆的白粉病抗性高于“待测大豆的基因组DNA中含有DNA区段甲”的大豆。

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