CN110684858B

CN110684858B - 一种水稻细长粒型基因的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110684858B
Application number: CN201911063514.0A
Authority: CN
Inventors: 刘迪林; 柳武革; 王丰; 李金华; 付崇允; 廖亦龙; 朱满山; 马晓智; 曾学勤
Original assignee: Rice Research Institute Guangdong Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Rice Research Institute Guangdong Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2039-11-04
Also published as: CN110684858A

Abstract

本发明公开了一种水稻细长粒型基因的分子标记及其应用，包括水稻细长粒型基因的分子标记的获取，以细长粒品种泰丰B为母本，短粒品种特三矮2号为父本进行杂交，获得F1，F1植株套袋自交得到F2种子，种植F2群体，并采用单粒传法得到170个家系组成的重组自交系群体，对分离群体的粒长、粒宽和长宽比表型进行考察和统计，从重组自交系群体中选取含有SG7的特征单株，根据细长粒型品种泰丰B和短粒型品种特三矮2号之间LOC_Os07g41200基因存在的18bp插入/缺失的序列差异，开发了基于SG7候选基因的分子标记SG7‑18，从而获取水稻细长粒型基因的分子标记SG7‑18，并利用水稻细长粒型基因的分子标记检测水稻品种SG7基因型，和利用水稻细长粒型基因的分子标记培育细长粒型水稻品种。

Description

一种水稻细长粒型基因的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及农作物分子标记辅助选择技术领域，具体为一种水稻细长粒型基因的分子标记及其应用。

背景技术

全球超过50％的人口以稻米为主食。在许多国家和地区，人们对细长粒型的水稻品种有所偏爱。稻米粒型不仅影响千粒重进而间接影响产量，而且是稻米外观品质的重要影响因素。根据《中华人民共和国国家标准：优质稻谷GB/T17891-1999》的规定，优质稻谷的稻米长宽比不得低于2.8。在生产实践中，细长粒形的稻米，往往在垩白性状方面具有优势，表现为米粒晶莹透亮，心腹白少，广受消费者喜爱。因此，培育细长粒形水稻品种对提高稻米品质具有重要意义。

普遍认为，稻谷粒型在遗传上受多基因控制，遗传基础比较复杂，属于典型的数量遗传性状。利用分子标记可以将控制数量性状的QTL进行定位和分解，将复杂的数量性状分解为简单的孟德尔遗传因子来进行研究。利用这种方法，已经发现和克隆了部分控制稻谷粒型的QTLs。例如，控制稻谷粒宽的基因GW2(Song et al.Nat Genet 39:623–630)、GW5(Wan et al.Genetics179:2239–2252)、GS5(Li et al.Nat Genet 43:1266–1269)和qGW8(Wang et al.Nat Genet 44:950–954)；控制粒长的基因GS3(Fan et al.Theor ApplGenet 112:1164–1171)和qGL3.1等(Zhang et al.Proc Natl Acad Sci USA109:21534–21539；Qi et al.Cell Res 22:1666–1680)。其中，位于水稻第3染色体的GS3是一个粒长主效基因和粒宽微效基因，由于其长粒增效等位基因gs3表现为隐性遗传，大大限制了其在杂交稻中的应用(Fan et al.,Theor Appl Genet 112:1164–1171)。qGL3.1同样位于水稻第3染色体上，对粒长的贡献较大，是近年发现的稀有位点，在生产中应用较少(Zhang etal.Proc Natl Acad Sci USA 109:21534–21539；Qi et al.Cell Res 22:1666–1680)。

传统的水稻粒型改良中，一般在成熟期通过表型观察进行选择。存在以下缺点：无法进行早期选择；肉眼对表型的观察存在偏差；无法知道所选材料的粒型是否稳定，必须根据下一代的粒型分离情况来判断。DNA分子标记技术因其具有快速检测、准确鉴定和早期选择等优点，在水稻遗传育种中发挥了重要作用。通过对粒型基因分子标记的开发和应用，可以准确地对育种材料的长粒和短粒等位基因型进行鉴定，尤其是能够有效鉴定出杂合基因型，并且能够把多个粒长基因累加到同一品种中，从而实现基因聚合，有效提高水稻粒型改良的效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻细长粒型基因的分子标记及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种水稻细长粒型基因的分子标记，命名为SG7-18，包括如下获取步骤：

S1、以细长粒品种泰丰B为母本，短粒品种特三矮2号为父本进行杂交，获得F1，F1植株套袋自交得到F2种子。种植F2群体，并采用单粒传法得到170个家系组成的重组自交系群体；

S2、用CTAB法提取两个亲本和重组自交系170个家系的基因组DNA。筛选两个亲本之间具有多态性的水稻SSR标记，用这些多态性SSR标记对重组自交系群体进行基因型分析，获得群体的基因型数据，采用MapMaker 3.0构建分子遗传图谱；

S3、对分离群体的粒长、粒宽和长宽比表型进行考察和统计，结合基因型数据采用WinQTL Cartographer 2.5进行QTL扫描，鉴定粒型QTL位点。其中，qSG7位点同时增加粒长、减少粒宽、增加长宽比，使稻米变得细长；

S4、从重组自交系群体中选取含有SG7的特征单株，和特三矮2号回交，构建衍生的F₂次级群体。利用该次级群体，进一步对qSG7位点进行精细定位和候选基因筛选，确定候选基因为LOC_Os07g41200。对泰丰B和特三矮2号进行30X深度的基因组重测序。根据细长粒型品种泰丰B和短粒型品种特三矮2号之间LOC_Os07g41200基因存在的18bp插入/缺失的序列差异，开发了基于SG7候选基因的分子标记SG7-18，从而获取水稻细长粒型基因的分子标记SG7-18。

优选的一种实施案例，所述SG7-18由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成，其中，SEQ ID NO.1序列为：

GACATGGACCATCGACACGCCTTGACCCACACACCCCCCACCCCACCAATCCCCCATCCCTCCCGCTTATTTCAACCCCCCCTCTCCCTCTCCTCACGACACCCTGCATGGCATTCGCACGCCATTGACACATATCTCATCATACCATCACCATACCACATCTCATCTCACGCGTC

SEQ ID NO.2序列为：

GACATGGACCATCGACACGCCTTGACCCACACACCCCCCACCCCACCAATCCCCCATCCCTCCCGCTTATTTCAACCCCCCCTCTCCCTCTCCTCACGACACCCTGCATGGCATTCGCACGCCATTGACA------------------CACCATACCACATCTCATCTCACGCGTC。

一种水稻细长粒型基因的分子标记的应用，包括利用水稻细长粒型基因的分子标记检测水稻品种SG7基因型，包括如下步骤：选取生产和研究中广泛应用的代表性水稻品种，并插秧2周后，分别取水稻品种的幼苗叶片半片，采用简易CTAB法提取水稻基因组DNA，然后采用引物对SG7-18F和SG7-18R，对DNA模板进行PCR扩增，并在3％琼脂糖胶中电泳分离(凝胶中加入EB替代染料)，150V恒定电压电泳90分钟后，采用BioRad凝胶成像仪拍照，进行带型比对从而检测水稻品种中的SG7基因型。

优选的一种实施案例，所述SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的具体核苷酸序列为：

SG7-18F：5’-GACATGGACCATCGACACG-3’(SEQ ID No.3)，

SG7-18R：5’-GACGCGTGAGATGAGATGTG-3’(SEQ ID No.4)。

一种水稻细长粒型基因的分子标记的应用，包括水稻细长粒型基因的分子标记在培育细长粒型水稻品种，包括如下步骤：选取短粒品种早S为母本，细长粒品种泰丰B为父本，进行杂交，得到F1代种子；种植F₁植株，以F₁植株为父本，早S为母本，进行回交，得到BC₁F₁；种植BC₁F₁植株，插秧后2周，摘取半片水稻幼苗叶片，采用简易CTAB法提取基因组DNA，溶解于200μL ddH₂O中；采用引物对SG7-18F和SG7-18R对BC₁F₁植株的DNA进行PCR扩增，并进行分子标记的检测，采用BioRad凝胶成像仪拍照。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)利用本发明首次发现的分子标记引物(即分子标记引物对SG7-18)，可方便地采用聚合酶链反应扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，准确追踪水稻品种泰丰B及其衍生品种中的细长粒型基因SG7，为在分子水平上对水稻细长粒型性状进行辅助选择提供了有效手段。(2)在水稻育种过程中，利用本发明公开的分子标记，可在水稻苗期对水稻育种材料中的粒型基因SG7进行分子检测和标记辅助选择，不必像传统方法那样等到成熟期通过表型去选择目标单株。(3)本发明为共显性标记，仅需PCR扩增和电泳检测，即可准确知道目标材料或育种后代中细长粒型基因SG7的纯合或杂合状态，而传统方法靠表型观察很难判断细长粒基因是纯合还是杂合状态，必须通过下一代的粒型分离情况进行分析，因而本发明可以提高育种效率，节约时间成本，加速育种进程。

附图说明

图1为泰丰B和特三矮的粒型表型及粒型主效QTL位点的检测结果。上图的a为泰丰B谷粒；c为泰丰B糙米；,b为特三矮2号谷粒；d为特三矮2号糙米。比例尺代表1cm。下图中显示的是粒长、粒宽和长宽比3个性状的QTL检测情况，上半部分的峰代表QTL的LOD值，下半部分的峰代表QTL的加性效应。

图2为引物对SG7-18在代表性水稻品种中进行扩增的电泳图谱。其中泳道信息1：泰丰B；2：特三矮2号；3，日本晴；4,93-11；5，华占；6，广恢122；7，博B；8，五丰B；9,玉针香；10，黄华占；11，粤丰B；12，广恢1002；13，安丰B；14,广8B；15，秋B

图3为引物对SG7-18在泰丰B和早S回交的BC₁F₁群体中扩增的电泳图谱。1为泰丰B,2为特三矮2号，3为早S，4-18为泰丰B和早S的BC₁F₁植株。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

本发明提供一种技术方案：一种水稻细长粒型基因的分子标记，命名为SG7-18，包括如下获取步骤：

(1)以细长粒品种泰丰B为母本，短粒品种特三矮2号为父本进行杂交，获得F₁，F₁植株套袋自交得到F₂种子。种植F₂群体，并采用单粒传法得到170个家系组成的重组自交系群体；

(2)用CTAB法提取两个亲本和重组自交系170个家系的基因组DNA。筛选两个亲本之间具有多态性的水稻SSR标记，用这些多态性SSR标记对重组自交系群体进行基因型分析，获得群体的基因型数据，采用MapMaker 3.0构建分子遗传图谱；

(3)对分离群体的粒长、粒宽和长宽比表型进行考察和统计，结合基因型数据采用WinQTL Cartographer 2.5进行QTL扫描，鉴定粒型QTL位点。其中，qSG7位点同时增加粒长、减少粒宽、增加长宽比，使稻米变得细长。

(4)从重组自交系群体中选取含有SG7的特征单株，和特三矮2号回交，构建衍生的F₂次级群体。利用该次级群体，进一步对qSG7位点进行精细定位和候选基因筛选，确定候选基因为LOC_Os07g41200。对泰丰B和特三矮2号进行30X深度的基因组重测序。根据细长粒型品种泰丰B和短粒型品种特三矮2号之间LOC_Os07g41200基因存在的18bp插入/缺失的序列差异，开发了基于SG7候选基因的分子标记SG7-18。

(5)由QTL分析可知，利用重组自交系定位到的主效QTL位点qSG7效应值最大，位于第7染色体长臂，同时影响稻米粒长、粒宽和长宽比。如图1所示：

在检测到的QTL位点中，它们对表型变异的总贡献率在53.6％-75.2％之间。主效QTL qSG7对粒型的贡献最大，表现为半显性遗传，具有增加粒长、减小粒宽和增加长宽比的功效，不影响粒重。

对qSG7进行精细定位的结果表明，qSG7区间内的候选基因有5个，分别为LOC_Os07g41180、LOC_Os07g41190、LOC_Os07g41200、LOC_Os07g41210、LOC_Os07g41220。其中，LOC_Os07g41200的拟南芥同源基因LNG1控制细胞伸长，正向调控种子长度，因此将它确定为SG7的候选基因。

利用Illumina HiSeq2000平台对亲本泰丰B和特三矮2号分别进行30倍覆盖度的基因组重测序。结果表明，LOC_Os07g41200基因在泰丰B和特三矮2号之间存在7处变异，其中有一个18碱基的插入/缺失序列差异(CATATCTCATCATACCAT)，据此开发设计了分子标记SG7。SG7在细长粒品种泰丰B中的扩增产物大小为176bp，而在短粒品种特三矮2号中的扩增产物大小为158bp。

(6)根据QTL定位、精细定位以及候选基因分析的结果，开发了基于细长粒型基因候选基因的InDel标记SG7，该标记可以方便地采用3％琼脂糖凝胶电泳检测，对SG7和sg7等位基因进行鉴定分型。

实施例二

本发明提供一种技术方案：一种水稻细长粒型基因的分子标记的应用，具体为SG7-18分子标记在检测水稻品种SG7基因型中的应用，步骤如下：

(1)选取生产和研究中广泛应用的代表性水稻品种，包括三系恢复系(华占、广恢122、广恢1002)、三系保持系(泰丰B、博B、五丰B、粤丰B、安丰B、广8B、秋B)、常规稻品种(特三矮2号、玉针香、黄华占)以及用于水稻模式品种日本晴和93-11。其中泰丰B为细长粒对照品种，特三矮为短粒对照品种；

(2)插秧2周后，分别取上述水稻品种的幼苗叶片半片。采用简易CTAB法提取水稻基因组DNA，溶解于200μL ddH₂O中；

(3)采用引物对SG7-18F和SG7-18R，对DNA模板进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系为20μL，其中：10×buffer(含Mg²⁺)2μL、2.5mM dNTPs 2μL(10mmolL^-1)、2μM正向引物(SG7-F)1μL、2μM反向引物(SG7-R)1μL、模板DNA(50ngμL^-1)2μL、5U/μL Taq聚合酶0.2μL、ddH₂O11.8μL。PCR扩增反应条件分别为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸8min，4℃保存；

(4)在3％琼脂糖胶中电泳分离(凝胶中加入EB替代染料)，150V恒定电压电泳90分钟后，采用BioRad凝胶成像仪拍照；

(5)对检测结果进行分析，和泰丰B带型一致的，SG7基因型为SG7SG7，说明检测材料含有细长粒型基因SG7；和特三矮2号带型一致的，SG7基因型为sg7sg7，说明检测材料不含细长粒型基因SG7；

(6)如图2所示，在7、9、12泳道的材料中，用标记SG7均可检测到和泰丰B一致的带型；而在编号3、4、5、6、8、10、11、13、14和15泳道中，用标记SG7均可检测到和特三矮2号一致的带型。说明，7、9、12泳道中的材料含有细长粒基因SG7，而3、4、5、6、8、10、11、13、14和15泳道中的材料不含有细长粒型基因SG7

从以上结果可以得出，本发明涉及的基因SG7与细长粒粒型紧密相关，本发明以SG7-18引物扩增产生的分子标记与细长粒型基因共分离，可用于鉴定筛选新的含有细长粒基因SG7的育种材料，筛选准确、高效。

实施例三

本发明提供一种技术方案：一种水稻细长粒型基因的分子标记的应用，具体为SG7-18分子标记在培育细长粒型水稻品种上的应用，步骤如下：

(1)选取短粒品种早S为母本，细长粒品种泰丰B为父本，进行杂交，得到F₁代种子；

(2)种植F₁植株，以F₁植株为父本，早S为母本，进行回交，得到BC₁F₁；

(3)种植BC₁F₁植株，插秧后2周，摘取半片水稻幼苗叶片，采用简易CTAB法提取基因组DNA，溶解于200μL ddH₂O中；

(4)采用引物对SG7-18F和SG7-18R对BC₁F₁植株的DNA进行PCR扩增。扩增条件如下：PCR扩增的反应体系为20μL，其中：10×buffer(含Mg²⁺)2μL、2.5mM dNTPs 2μL(10mmolL^-1)、2μM正向引物1μL、2μM反向引物1μL、模板DNA(50ngμL^-1)2μL、5U/μL Taq聚合酶0.2μL、ddH₂O11.8μL。PCR扩增反应条件分别为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸8min，4℃保存；

(5)分子标记的检测：在3％琼脂糖胶中电泳分离(凝胶中加入EB替代染料)，150V恒定电压电泳90分钟后，采用BioRad凝胶成像仪拍照；

(6)结果表明(图3)，F₁植株的粒型比早S显著变得细长。在BC₁F₁植株中得到两种带型，一种带型为泰丰B和早S的杂合带型(单株4、5、7、8、9、12、14)，一种带型为早S纯合带型(6、10、11、13、15、16、17、18)。其中，携带杂合带型的单株，其后代BC₁F₂的粒型发生分离；而携带早S纯合带型的单株，BC₁F₂后代粒型不发生分离。表明粒型表型调查结果和分子标记辅助选择的结果一致。说明标记SG7可用于水稻细长粒型的分子标记辅助选择；

(7)由此可知，利用标记SG7-18进行分子标记辅助选择，可有效筛选具有细长粒型基因的品种或品系材料，大大提高了水稻粒型遗传改良中细长粒型品种的选择效率和准确性，能够有效促进粒型的定向改良。在育种实践中，利用本发明的SG7-18标记和已知的gs3功能标记，对SG7基因和gs3等位基因进行聚合，在增加粒长和长宽比方面效果更佳。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 广东省农业科学院水稻研究所

<120> 一种水稻细长粒型基因的分子标记及其应用

<140> 201911063514.0

<141> 2019-11-04

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 176

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacatggacc atcgacacgc cttgacccac acacccccca ccccaccaat cccccatccc 60

tcccgcttat ttcaaccccc cctctccctc tcctcacgac accctgcatg gcattcgcac 120

gccattgaca catatctcat cataccatca ccataccaca tctcatctca cgcgtc 176

<210> 2

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacatggacc atcgacacgc cttgacccac acacccccca ccccaccaat cccccatccc 60

tcccgcttat ttcaaccccc cctctccctc tcctcacgac accctgcatg gcattcgcac 120

gccattgaca caccatacca catctcatct cacgcgtc 158

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgtgtcgcc gtttaacaag g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgggttcg gaggccattt g 21

Claims

1.一种水稻细长粒型基因的分子标记，其特征在于：所述分子标记为SG7-18，SG7-18由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列组成，其中，SEQ ID NO.1序列为：

SEQ ID NO.2序列为：

2.检测权利要求1所述的一种水稻细长粒型基因的分子标记的试剂在检测水稻品种SG7基因型的应用，其特征在于，包括如下步骤：选取生产和研究中广泛应用的代表性水稻品种，并插秧2周后，分别取水稻品种的幼苗叶片半片，采用简易CTAB法提取水稻基因组DNA，然后采用引物对SG7-18F和SG7-18R，对DNA模板进行PCR扩增，并在3%琼脂糖胶中电泳分离，150V恒定电压电泳90分钟后，采用BioRad凝胶成像仪拍照，进行带型比对从而检测水稻品种中的SG7基因型，所述SG7-18F和SG7-18R的具体核苷酸序列为：

SG7-18F：5’-GACATGGACCATCGACACG-3’，

SG7-18R： 5’-GACGCGTGAGATGAGATGTG-3’。

3.检测权利要求1所述的一种水稻细长粒型基因的分子标记的试剂在培育细长粒型水稻品种中的应用，其特征在于，包括如下步骤：选取短粒品种长早S为母本，细长粒品种泰丰B为父本，进行杂交，得到F1代种子；种植F₁植株，以F₁植株为父本，长早S为母本，进行回交，得到BC₁F₁；种植BC₁F₁植株，插秧后2周，摘取半片水稻幼苗叶片，采用简易CTAB法提取基因组DNA，溶解于200μL ddH₂O中；采用引物对SG7-18F和SG7-18R对BC₁F₁植株的DNA进行PCR扩增，并进行分子标记的检测，采用BioRad凝胶成像仪拍照，SG7在细长粒品种泰丰B中的扩增产物大小为176 bp，而在短粒品种特三矮2号中的扩增产物大小为158 bp，所述SG7-18F和SG7-18R的具体核苷酸序列为：

SG7-18F：5’-GACATGGACCATCGACACG-3’，

SG7-18R： 5’-GACGCGTGAGATGAGATGTG-3’。