CN116121442B - 一种水稻粒型QTL的InDel分子标记SG2-InDel、试剂、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻育种领域，特别是涉及一种水稻粒型QTL的InDel分子标记SG2‑InDel、试剂、试剂盒及其应用。本发明首次发现了位于水稻第2号染色体上控制粒长的SG2的新等位变异，并获得了可用于区分野生型和突变型的插入/缺失(InDel)分子标记SG2‑InDel。该分子标记不仅可以满足在苗期就能区别水稻品种/系/单株的基因型，而且能够方便、快捷、直接地实现目标基因在水稻种质资源以及育种后代中的鉴定，极大地降低了劳动成本、节约时间且不受环境及人为因素的影响，可为进一步阐明水稻粒型遗传机制及调控网络和高产、广适性水稻品种改良提供理论和实践支持。

Description

一种水稻粒型QTL的InDel分子标记SG2-InDel、试剂、试剂盒 及其应用

技术领域

本发明涉及水稻育种领域，特别是涉及一种水稻粒型QTL的InDel分子标记SG2-InDel、试剂、试剂盒及其应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的谷类作物之一，也是世界上约一半人口的主要粮食来源，水稻产量的稳步提高对于我国乃至全球的粮食生产和稳定具有重要意义。水稻的粒型是与产量直接相关的重要性状，同时与水稻的品质有密切的关系。粒型包括粒长、粒宽和千粒重这三个主要的性状，它们对水稻高产、优质育种具有重要意义。因此，发掘利用新的粒长基因等位变异可为水稻育种改良和生产实践提供基因资源。

截至目前，已被报道的粒型相关基因和QTL已达400多个。然而，大多数QTLs仅在特定的遗传背景中被发现和定位，存在于其他品种中的等位变异却并未被全部发现，也鲜有相关研究，导致对这些QTL的基因分布和功能研究尚不够完善。

目前，各研究小组主要通过对自育品种进行分子测序的手段，对这些QTL在一些特异种质中检测分析。通过基因序列分析的方式，对已克隆的QTL的新型等位变异进行挖掘，以期对这些QTL在不同材料中的分布和功能进行完善。

随着水稻粒型基因功能研究的深入，基因之间相互关系更加清晰明朗，将为水稻的遗传改良提供更多的科学依据。粒型基因作为影响水稻产量的重要性状之一，与更多其他优势基因聚合育种，已经成为育种研究的重要课题。因此，发掘新的水稻粒型QTL位点的等位变异，可为进一步阐明水稻粒型遗传机制及调控网络和高产、广适性水稻品种改良提供理论和实践支持。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种水稻粒型QTL的InDel分子标记SG2-InDel、试剂、试剂盒及其应用。本发明所述InDel分子标记SG2-InDel是一种新的水稻粒型QTL位点的等位变异，可为进一步阐明水稻粒型遗传机制及调控网络和高产、广适性水稻品种改良提供理论和实践支持。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种水稻粒型QTL的InDel分子标记SG2-InDel，所述InDel分子标记SG2-InDel的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；在所述SEQ ID NO.1中存在连续的3或4个重复序列；所述重复序列为GGCAGG。

本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述InDel分子标记SG2-InDel的试剂，其特征在于，所述试剂包括引物对；所述引物对包括SG2-InDel-F和SG2-InDel-R；

所述SG2-InDel-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述SG2-InDel-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种检测水稻粒型的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的试剂。

优选的，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶和含镁离子的10×Taqbuffer。

本发明还提供了上述技术方案所述的InDel分子标记SG2-InDel或上述技术方案所述的试剂或上述技术方案所述的试剂盒在检测和/或辅助检测水稻粒型中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的InDel分子标记SG2-InDel或上述技术方案所述的试剂或上述技术方案所述的试剂盒在水稻粒型改良中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的InDel分子标记SG2-InDel或上述技术方案所述的试剂或上述技术方案所述的试剂盒在选育和/或辅助选育细长粒型水稻品种中的应用。

本发明还提供了一种检测水稻粒型的方法，包括以下步骤：

以待检测水稻的DNA为模板，利用上述技术方案所述的试剂进行PCR扩增，得到扩增产物；

根据扩增产物的长度判断待检测水稻的粒型情况：

当所述扩增产物长度为89bp，则待测水稻的基因型为SG2，粒型为短粒；

当所述扩增产物的长度为95bp，则所述待测水稻的基因型为SG2-Nip，粒型表现为细长粒；

当所述扩增产物为95bp和89bp，则待测水稻的基因型为杂合型，粒型介于短粒和细长粒之间。

优选的，所述PCR扩增的反应体系以10μL计，包括1μL待检测水稻的DNA、0.5μLSG2-InDel-F、0.5μLSG2-InDel-R、1μL 10×Taqbuffer、0.2μL dNTPs、0.2μLTaq DNA聚合酶和余量ddH₂O。

优选的，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性3min；95℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸30s，共32个循环；72℃延伸10min。

有益效果：

本发明提供了一种水稻粒型QTL的InDel分子标记SG2-InDel，所述InDel分子标记SG2-InDel的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；在所述SEQ ID NO.1中存在连续的3或4个重复序列；所述重复序列为GGCAGG。本发明以日本晴基因组为对照，以籼稻BG1和优质恢复系籼稻华占作为实验材料，对粒长基因SG2的启动子区、基因组序列和编码序列进行测序分析，首次发现了位于水稻第2号染色体上控制粒长的SG2的新等位变异，并获得了可用于区分野生型和突变型的插入/缺失(InDel)分子标记SG2-InDel。只需要检测分子标记SG2-InDel的扩增条带特性，即可判断目标材料中的SG2位点是否是新的等位变异SG2-Nip，用于指导水稻育种工作中的粒型遗传改良。该分子标记不仅可以满足在苗期就能区别水稻品种/系/单株的基因型，而且能够方便面、快捷、直接地实现目标基因在水稻种质资源以及育种后代中的鉴定，极大地降低了劳动成本、节约时间且不受环境及人为因素的影响，可为进一步阐明水稻粒型遗传机制及调控网络和高产、广适性水稻品种改良提供理论和实践支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为采用本发明提供的分子标记SG2-Indel对不同水稻品种粒型的鉴定结果；其中1～15分别代表：1，巴斯马蒂；2，IR24；3，黄华占4，中恢9308；5，IR26；6，玉针香；7，19香；8，IR56；9，02428；10，长粒粳384；11，中恢8015；12，华占；13，BG1；14，9311；15，日本晴。

具体实施方式

本发明提供了一种水稻粒型QTL的InDel分子标记SG2-InDel，所述InDel分子标记SG2-InDel的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：TTTTTC CAATTTTGTTTTTGGGCAAGTGTAGTGCACTCACTCACACACTA(GGCAG G)_nGCGGCCTATAAATAAAAAGAA；其中n＝3或4；在所述SEQID NO.1中存在连续的3或4个重复序列；所述重复序列为GGCAGG。

本发明针对SG2基因功能区域，通过二代测序技术，以日本晴基因组为对照，以籼稻BG1和优质恢复系籼稻华占作为实验材料，对粒长基因SG2的启动子区、基因组序列和编码序列进行测序分析，其中日本晴SG2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：

BG1和华占SG2基因的核苷酸序列均如SEQ ID NO.5所示，具体如下：

序列4和5加粗的碱基为新发现的等位变异；

对比日本晴SG2基因与BG1和华占SG2基因的核苷酸序列可知，BG1和华占SG2基因相对于日本晴，在启动子区插入了一段GGCAGG的重复序列，并根据发现的等位变异开发SG2基因专一性功能标记SG2-InDel，利用PCR技术对该标记位点进行扩增，通过电泳检测PCR产物的片段数量和大小，判断被检水稻样品是否含有SG2基因，以及含有的SG2基因的基因型，具体为：当所述扩增产物长度为89bp，则待测水稻的基因型为SG2，粒型为短粒；当所述扩增产物的长度为95bp，则所述待测水稻的基因型为SG2-Nip，粒型表现为细长粒；当所述扩增产物为95bp和89bp，则待测水稻的基因型为杂合型，粒型介于短粒和细长粒之间，进而实现对SG2基因的辅助选育、SG2基因纯合体和杂合体的快速判断以及用于指导水稻育种工作中的粒型遗传改良，能够大大提高水稻粒型基因SG2的鉴定选育效率、加快育种进展。

本发明还提供了一种用于检测上述技术方案所述InDel分子标记SG2-InDel的试剂，所述试剂包括引物对；所述引物对包括SG2-InDel-F和SG2-InDel-R；

所述SG2-InDel-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：TTTTTCCAATTTTGTTTTTGGG；

所述SG2-InDel-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：TTCTTTTTATTTATAGGCCGCC。

本发明提供的引物对可以特异性扩增述技术方案所述InDel分子标记SG2-InDel。

本发明还提供了一种检测水稻粒型的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的试剂。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶和含镁离子的10×Taqbuffer。

本发明还提供了上述技术方案所述的InDel分子标记SG2-InDel或上述技术方案所述的试剂或上述技术方案所述的试剂盒在检测和/或辅助检测水稻粒型中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的InDel分子标记SG2-InDel或上述技术方案所述的试剂或上述技术方案所述的试剂盒在水稻粒型改良中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的InDel分子标记SG2-InDel或上述技术方案所述的试剂或上述技术方案所述的试剂盒在选育和/或辅助选育细长粒型水稻品种中的应用。

本发明还提供了一种检测水稻粒型的方法，包括以下步骤：

以待检测水稻的DNA为模板，利用上述技术方案所述的试剂进行PCR扩增，得到扩增产物；

根据扩增产物的长度判断待检测水稻的粒型情况：

当所述扩增产物长度为89bp，则待测水稻的基因型为SG2，粒型为短粒；

当所述扩增产物的长度为95bp，则所述待测水稻的基因型为SG2-Nip，粒型表现为细长粒；

当所述扩增产物为95bp和89bp，则待测水稻的基因型为杂合型，粒型介于短粒和细长粒之间。

在本发明中，所述PCR扩增的反应体系优选以10μL计，优选包括1μL待检测水稻的DNA、0.5μL SG2-InDel-F、0.5μLSG2-InDel-R、1μL 10×Taqbuffer、0.2μL dNTPs、0.2μLTaq DNA聚合酶和余量ddH₂O；所述SG2-InDel-F和SG2-InDel-R的浓度均优选为10mM；所述10×Taqbuffer优选含有20mM的Mg²⁺；所述Taq DNA聚合酶的酶活优选为2U/μL；所述PCR扩增的反应程序优选包括：95℃预变性3min；95℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸30s，共32个循环；72℃延伸10min。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种水稻粒型QTL的InDel分子标记SG2-InDel、试剂、试剂盒及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本发明对特异种质BG1和优质恢复系华占中的SG2基因组进行二代测序，与对照品种日本晴的SG2基因组序列进行比对，发现差异后，设计分子标记；所述特异种质BG1保藏于中国水稻研究所，公开于【龚柯,薛炮,温小霞等.水稻特大粒种质BG1和优质恢复系华占的粒形基因研究及相关功能标记开发[J].中国水稻科学,2021,35(6):543-553.DOI:10.16819/j.1001-7216.2021.201211.】。

测序结果：发现了SG2的第一内含子在BG1和华占中存在一个未被前人发现并研究的等位变异，与日本晴的SG2基因相比，华占和BG1的SG2基因在启动子区插入了一段GGCAGG的重复序列，根据该等位变异设计InDel分子标记引物对；所述引物对由SG2-InDel-F和SG2-InDel-R组成；所述SG2-InDel-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述SG2-InDel-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

实施例2

利用实施例1设计得到的引物对对巴斯马蒂、IR24、黄华占、中恢9308、IR26、玉针香、19香、IR56、02428、长粒粳384、中恢8015、华占、BG1、9311和日本晴15个亲本材料进行标记鉴定，具体方法如下：

单株取幼嫩叶片，采用CTAB法提取亲本材料的DNA；

以待检测水稻的DNA为模板，利用实施例1设计得到的引物对在PCR仪上进行PCR扩增，得到扩增产物；

所述PCR扩增的反应体系为：1μL DNA(100ng)、0.5μLSG2-InDel-F、0.5μLSG2-InDel-R、1μL 10×Taqbuffer、0.2μL dNTPs、0.2μLTaq DNA聚合酶和6.6μLddH₂O；所述SG2-InDel-F和SG2-InDel-R的浓度均为10mM；所述10×Taqbuffer含有20mM的Mg²⁺；所述Taq DNA聚合酶的酶活为2U/μL；

所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸30s，共32个循环；最后72℃延伸10min；

扩增产物在8％聚丙烯酰氨凝胶上进行电泳分离后，用1wt.％AgNO₃溶液染色，甲醛和NaOH显色后拍照并统计带型，结果见图1；

根据扩增产物的长度判断待检测水稻的基因型：如果目标品种能扩增出89bp片段，则说明目标品种不存在GGCAGG的重复序列的插入，其基因型为SG2，如果目标品种能扩增出95bp片段则说明目标品种中存在GGCAGG的插入，其基因型为SG2-Nip，如果目标品种能扩增出杂合带型，说明目标品种的基因型为SG2/SG2-HZ，基因型结果见表1。

利用考种仪测量每种亲本材料的千粒重(TGW)、粒长(GL)和粒宽(GW)，并计算长宽比＝粒长/粒宽(GL/GW)，每个品种进行3次平行重复实验，测量和计算结果见表1。

表1 15个常规水稻亲本的粒型考察和基因型

由图1和表1可知，条带为89bp的品种不存在GGCAGG的重复序列的插入；条带为95bp的品种存在GGCAGG重复序列插入；在粳稻和籼稻品种中，SG2的新型等位变异SG2-HZ的材料的长宽比大部分都大于3，仅有1个品种小于3，这个品种可能存在其他的粒型基因的影响属于典型的细长粒(GL/GW≥3.0)【黄海祥,钱前.(2017).水稻粒形遗传与长粒型优质粳稻育种进展.中国水稻科学(06),665-672.doi:10.16819/j.1001-7216.2017.7115】；说明具有该种新型等位变异的水稻品种/材料，具有细长籽粒的特征。

实施例3

利用实施例1设计得到的引物对对25个水稻品种进行粒型鉴定，具体方法同实施例1，测量和计算结果见表2。

表2 25个水稻品种的粒型考察和SG2基因型

由表2可知，SG2的新型等位变异SG2-Nip的材料的长宽比都大于3，属于典型的细长粒，而SG2基因型的材料长宽比大部分都小于3(仅有2个品种大于3，两个品种中可能存在其他的粒型基因的影响)，属于典型的短粒。

本发明提供的分子标记及方法，主要用于水稻粒长基因SG2启动子区是否存在GGCAGG的重复序列插入的鉴定。通过检测鉴定，可以确定目标品种中是否存在新型等位变异SG2-Nip，丰富了了水稻粒长基因SG2的多样性，提高了选择效率、加快了育种进度。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (3)

1.一种检测水稻粒型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以待检测水稻的DNA为模板，利用试剂进行PCR扩增，得到扩增产物；所述试剂包括引物对；所述引物对为SG2-InDel-F和SG2-InDel-R；所述SG2-InDel-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述SG2-InDel-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

根据扩增产物的长度判断待检测水稻的粒型情况：

当所述扩增产物长度为89bp，则待测水稻的基因型为SG2，粒型为短粒；

当所述扩增产物的长度为95bp，则所述待测水稻的基因型为SG2-Nip，粒型表现为细长粒；

当所述扩增产物为95bp和89bp，则待测水稻的基因型为杂合型，粒型介于短粒和细长粒之间。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系以10μL计，包括1μL待检测水稻的DNA、0.5μL SG2-InDel-F、0.5μL SG2-InDel-R、1μL 10×Taq buffer、0.2μLdNTPs、0.2μL Taq DNA聚合酶和余量ddH₂O。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性3min；95℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸30s，共32个循环；72℃延伸10min。