CN112795693B - 与玉米叶片叶绿素含量相关的分子标记及其应用 - Google Patents

与玉米叶片叶绿素含量相关的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与玉米叶片叶绿素含量相关的分子标记及其应用。本发明公开的与玉米叶片叶绿素含量相关的分子标记，为SEQ ID No.3所示的DNA片段或SEQ ID No.4所示的DNA片段，可利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行检测。实验证明，本发明额与玉米叶片叶绿素含量相关的分子标记与玉米叶片叶绿素含量相关，利用该分子标记可以成功鉴定玉米的叶片叶绿素含量情况，并具有简便、快速、高效、准确的优点，且重复性好，特异性高，可以用于玉米分子标记辅助育种，选育综合性状优良的玉米新品种，大大节约了育种成本，提高了育种效率。

Description

与玉米叶片叶绿素含量相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，与玉米叶片叶绿素含量相关的分子标记及其应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是粮食、饲料和经济兼用作物，是我国唯一一个在播种面积及产量上稳步增加的农作物。近年来，全球经济有了快速的发展，预计在未来工业生产和生活上对玉米的需求量将不断增加。2018年我国玉米种植面积为4213万公顷，产量高达2.57亿吨，约占我国粮食总产量的39％。因此，玉米生产在保障我国粮食安全中具有十分重要的战略地位。
叶绿素是绿色植物叶绿体中参与光合作用的重要色素，通常与蛋白结合形成稳定的复合物，在光合作用中通过吸收、传递和转化光能合成有机物质，是作物产量形成的基础。叶绿素含量是评价光合作用速率的有效指标，在一定范围内，光合作用速率随叶绿素含量的升高而增强，但过量的叶绿素在光照下极易催化产生氧自由基，进而影响植物正常的生理代谢过程。叶绿素含量也是作物高光效育种的重要目标性状之一，较高的叶绿素含量能有效提高光合作用速率，合成更多的光合产物，最终实现作物的产量潜力。
分子标记具有数量大，检测不受环境条件、发育时期和表达调控等因素影响以及能提供完整丰富的遗传信息等优点，已被广泛应用于种质资源鉴定、QTL定位和分子标记辅助选择等方面。插入缺失(InDel)标记是常用的基于DNA水平差异的分子标记之一，具体指的是两个亲本中的差异，相对一个亲本而言，另一个亲本的基因组某些位点中有一定数量的核苷酸插入或缺失，根据其插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR引物。利用与目的基因紧密连锁的InDel标记，通过辅助回交选择，辅助系谱选择乃至全基因组选择，从而减轻连锁累赘，聚合有利基因，加快育种进程，可以有效提高选择效率和效果。
目前，尽管在玉米10条染色体上均有报道控制叶绿素含量的QTL，但开发与目标QTL紧密连锁的分子标记并申请专利应用的报道很少，且在qChl1-1区段内没有与叶绿素含量相关的专利报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测玉米叶片叶绿素含量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测玉米叶片叶绿素含量分子标记的物质在检测或辅助检测玉米叶片叶绿素含量中的应用，所述玉米叶片叶绿素含量分子标记为以玉米基因组DNA为模板，利用与序列1的第30位上游特异结合的单链DNA和与序列1的第186位下游特异结合的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段。
上述应用中，所述玉米叶片叶绿素含量分子标记可为SEQ ID No.3所示的DNA片段或SEQ ID No.4所示的DNA片段。
上述应用中，所述检测玉米叶片叶绿素含量分子标记的物质可为由序列表中SEQID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对。
本发明还提供了一种检测玉米叶片叶绿素含量的方法，所述方法包括：以待测玉米的基因组DNA为模板，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，所得PCR产物序列为SEQ ID No.3的纯合玉米的叶片叶绿素含量低于或候选低于所得PCR产物序列为SEQ ID No.4的纯合玉米的叶片叶绿素含量，所得PCR产物序列为SEQ ID No.3的纯合玉米的叶片叶绿素含量低于或候选低于所得PCR产物序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的杂合玉米的叶片叶绿素含量，所得PCR产物序列为SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4的杂合玉米的叶片叶绿素含量低于或候选低于所得PCR产物序列为SEQID No.4的纯合玉米的叶片叶绿素含量。
本发明还提供了另一种检测玉米叶片叶绿素含量的方法，所述方法包括：以待测玉米的基因组DNA为模板，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，所得PCR产物大小为246bp的纯合玉米的叶片叶绿素含量低于或候选低于所得PCR产物大小为166bp的纯合玉米的叶片叶绿素含量，所得PCR产物大小为246bp的纯合玉米的叶片叶绿素含量低于或候选低于所得PCR产物大小为246bp和166bp的杂合玉米的叶片叶绿素含量，所得PCR产物大小为246bp和166bp的杂合玉米的叶片叶绿素含量低于或候选低于所得PCR产物大小为166bp的纯合玉米的叶片叶绿素含量。
本发明还提供了一种玉米育种方法，所述方法包括：以待测玉米的基因组DNA为模板，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，选择PCR产物为SEQ ID No.4的待测玉米作为亲本完成育种。
上文中，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增的反应体系可为：1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.1所示的单链DNA；1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.2所示的单链DNA；1μL浓度为100ng/μL的基因组DNA；5μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye(北京康润诚业生物科技有限公司，货号：A012-01)；2μL ddH2O。
利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增的反应条件可为：95℃预变性10min；95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
所述检测玉米叶片叶绿素含量分子标记的物质在制备检测玉米叶片叶绿素含量产品中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述玉米叶片叶绿素含量分子标记在检测或辅助检测玉米叶片叶绿素含量中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述玉米叶片叶绿素含量分子标记在玉米育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述检测玉米叶片叶绿素含量分子标记的物质，也属于本发明的保护范围。
在本发明的一个实施例中，所述叶片为穗位叶。
所述玉米叶片叶绿素含量可体现在SPAD值上。
本发明的玉米叶绿素含量分子标记CHL1与玉米叶片叶绿素含量相关，利用该分子标记可以成功鉴定玉米的叶片叶绿素含量情况，并具有简便、快速、高效、准确的优点，且重复性好，特异性高，可以用于玉米分子标记辅助育种，选育综合性状优良的玉米新品种，大大节约了育种成本，提高了育种效率。
附图说明
图1是本发明的分子标记CHL1在双亲中扩增序列的比对结果。
图2是本发明的分子标记CHL1在双亲中PCR扩增产物的电泳图谱。其中，W为纯合W22基因型的扩增带型，C为纯合CIMMYT 8759基因型的扩增带型，Marker从下往上条带大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp。
图3是本发明的分子标记CHL1在F2群体中PCR扩增产物的电泳图谱。其中，W为纯合W22基因型的扩增带型，C为纯合CIMMYT 8759基因型的扩增带型，H为杂合基因型的扩增带型，Marker从下往上条带大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp。
图4是本发明的分子标记CHL1在F2群体中叶绿素含量的单标记分析结果。NIL_W22表示纯合的W22基因型，Het表示杂合的基因型，NIL_CIMMYT 8759表示纯合的CIMMYT8759基因型，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的玉米自交系W22与玉米野生近缘种CIMMYT 8759均记载在文献(Identification and fine mapping of quantitative trait loci for the number ofvascular bundle in maize stem，J Integr Plant Biol.2016Jan；58(1):81-90.doi:10.1111/jipb.12358.Epub 2015Jul 16.)中，玉米野生近缘种CIMMYT 8759为该文献中的CIMMYT accession 8759，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的MR0131为美国玉米种质资源中心(Maize Genetics CooperationStock Center)产品，网址为：www.maizecoop.cropsci.uiuc.edu，公众也可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。MR0131为由玉米自交系W22与玉米野生近缘种CIMMYT 8759通过杂交、回交和自交衍生得到的渗入系材料。公众可从申请人处获得玉米自交系W22，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、与玉米叶绿素含量相关的分子标记
本发明提供了用于鉴定或辅助鉴定玉米叶绿素含量的分子标记CHL1(记为玉米叶绿素含量分子标记)，该分子标记为以玉米基因组DNA为模板，利用引物对A1进行PCR扩增得到的DNA片段，所得DNA片段的序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4。引物对A1序列如下：
正向扩增引物Chl1-F：5’-TGCATCCCACTTCTCTTCACT-3’，如SEQ ID No.1所示；
反向扩增引物Chl1-R：5’-TCCCTTGAAGCTTAAAGTGACA-3’，如SEQ ID No.2所示。
以叶绿素含量较低的玉米自交系W22和叶绿素含量较高的玉米野生近缘种CIMMYT8759的基因组DNA为模板，用引物对A1进行PCR扩增，检测所得PCR产物的序列。
其中，PCR扩增的反应体系为10μL，包括：
(1)1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.1所示的正向扩增引物；
(2)1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.2所示的反向扩增引物；
(3)1μL浓度为100ng/μL的DNA模板；
(4)5μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye(北京康润诚业生物科技有限公司，货号：A012-01)；
(5)2μL ddH2O。
PCR扩增的程序如下：
(1)95℃预变性10min；
(2)95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环；
(3)72℃延伸10min；
(4)4℃保存。
PCR仪型号：Eppendorf Mastercycler nexus。
将PCR扩增产物在3.0％的琼脂糖凝胶(每100mL凝胶溶液中含有3.0g琼脂糖)中进行电泳分离并进行测序分析，结果显示，以玉米自交系W22的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物的分子量大小为246bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；以玉米野生近缘种CIMMYT 8759的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物的分子量大小为166bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
其中，玉米野生近缘种CIMMYT 8759的扩增带型为增加叶绿素含量的优异等位基因。所以，如果待测玉米样品PCR扩增产物的分子量大小为166bp，则该待测玉米样品含有提高玉米叶绿素含量的等位基因；如果待测玉米样品PCR扩增产物的分子量大小为246bp，则该待测玉米样品含有降低玉米叶绿素含量的等位基因。
将SEQ ID No.3和SEQ ID No.4序列比对后发现，与高叶绿素含量的玉米样品相比，低叶绿素含量的玉米样品在107bp的位置有80bp的核苷酸插入(图1)。玉米自交系W22和玉米野生近缘种CIMMYT 8759的PCR扩增产物的电泳结果如图2所示。
实施例2、分子标记CHL1的获得方法
分子标记CHL1的获得方法具体包括以下步骤：
步骤1：构建包含866个家系的BC2S3渗入系群体
以玉米自交系W22作为受体亲本，以玉米野生近缘种CIMMYT 8759作为供体亲本，通过杂交1代，回交2代，自交3代得到包含866个家系的BC2S3渗入系群体。
步骤2：渗入系群体的田间种植与表型测定
2019年春季在湖南省浏阳市(28.2°N,113.6°E)国家农作物品种区域试验站种植该渗入系群体。田间试验采用扩增式不完全随机区组设计，每个小区种植2行，每行种植15株，株距25cm。每垄种植2个家系，垄高15cm，垄宽70cm，沟宽30cm。
在玉米开花期使用便携式叶绿素测定仪(SPAD-502Plus,Konica Minolta,Japan)测定植株穗位叶的SPAD值。每个家系选择长势一致的5个单株，测定每个单株穗位叶1/2位置的SPAD值，每个单株重复测定3次，3次测定的均值作为该植株穗位叶的叶绿素含量，5个单株SPAD值的均值作为该家系穗位叶的叶绿素含量。
步骤3：进行QTL定位分析
利用R/qtl的多QTL模型进行QTL定位分析。首先应用Haley-Knott回归进行QTL简单区间定位分析，并采用置换检验10000次的方法确定叶绿素含量QTL的LOD阈值(α＝0.05)。将简单区间定位得到的QTL模型进行多QTL模型拟合，并利用R/qtl的refineqtl命令优化每个QTL的位置。进一步利用addqtl命令检测基因组是否存在其他显著改善模型的QTL，如果检测到新的QTL，则重新拟合多QTL模型和优化QTL位置，重复此过程，直到检测不到新的QTL。最后利用fitqtl命令计算所有QTL解释的总表型变异及单个QTL的加性效应和表型贡献率。
QTL定位结果分析：共检测到10个控制玉米叶绿素含量的QTL，其中在第1染色体上检测到一个表型效应最大的QTL qChl1-1。qChl1-1的LOD值为10.78，加性效应大小为2.14，显性效应大小为-0.81，表型贡献率为4.04％，位于玉米第1染色体25411083bp至27638632bp区间内。
步骤4：分子标记CHL1的开发与合成
利用在线引物设计软件primer3(https://primer3.ut.ee/)对qChl1-1在第1染色体25411083bp至27638632bp的物理区间进行搜索，设计正向扩增引物Chl1-F和反向扩增引物Chl1-R，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，核苷酸序列如下：
正向扩增引物Chl1-F：5’-TGCATCCCACTTCTCTTCACT-3’，如SEQ ID No.1所示；
反向扩增引物Chl1-R：5’-TCCCTTGAAGCTTAAAGTGACA-3’，如SEQ ID No.2所示。
实施例3、分子标记CHL1的应用
以仅在qChl1-1区段杂合，而在基因组其他位点纯合的渗入系MR0131为起始材料并进行自交授粉，产生一个仅在qChl1-1区段分离的F2群体。以包含192个单株的F2群体为材料对本发明获得的分子标记CHL1进行验证，以确定该分子标记应用于分子标记辅助选择育种的准确性。具体包括以下步骤：
步骤1：F2群体叶绿素含量的测定
按照实施例2的方法测定F2群体植株的叶绿素含量。
步骤2：采用CTAB法提取玉米叶片DNA。
步骤3：PCR扩增
PCR扩增的反应体系为10μL，包括：
(1)1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.1所示的正向扩增引物；
(2)1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.2所示的反向扩增引物；
(3)1μL浓度为100ng/μL的DNA模板；
(4)5μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye(北京康润诚业生物科技有限公司，货号：A012-01)；
(5)2μL ddH2O。
PCR扩增的程序如下：
(1)95℃预变性10min；
(2)95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环；
(3)72℃延伸10min；
(4)4℃保存。
PCR仪型号：Eppendorf Mastercycler nexus。
步骤4：电泳
分子标记CHL1在部分F2单株中PCR扩增产物的电泳图谱如图3所示。
步骤5：结果分析
根据PCR扩增产物的分子量大小确定待测玉米样品的基因型：如果待测玉米样品PCR扩增产物仅有一条246bp的条带，则该待测玉米含有纯合的W22基因型(即与玉米自交系W22相同的基因型)；如果待测玉米样品PCR扩增产物仅有一条166bp的条带，则该待测玉米含有纯合的CIMMYT 8759基因型(即与玉米野生近缘种CIMMYT 8759相同的基因型)；如果待测玉米样品PCR扩增产物不仅有一条246bp的条带，而且还有一条166bp的条带，则该待测玉米为杂合基因型。
F2单株中共有38株为纯合的W22基因型，对PCR产物测序显示，其序列均为SEQ IDNo.3，38株纯合的W22基因型F2单株穗位叶的SPAD的测定值为41.34±6.01；共有40株为纯合的CIMMYT 8759基因型，对PCR产物测序显示，其序列均为SEQ ID No.4，40株纯合的CIMMYT 8759基因型F2单株穗位叶的SPAD的测定值为46.65±6.08；共有114株为杂合基因型，对PCR产物测序显示，其序列均为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，114株杂合基因型F2单株穗位叶的SPAD的测定值为43.64±5.03。
进一步对各组的叶绿素含量表型值进行方差分析(图4)。结果表明：纯合的W22基因型F2单株穗位叶SPAD值显著低于纯合的CIMMYT 8759基因型F2单株，纯合的W22基因型F2单株穗位叶SPAD值显著低于杂合基因型F2单株，杂合基因型F2单株穗位叶SPAD值显著低于纯合的CIMMYT 8759基因型F2单株，说明分子标记CHL1与玉米叶片的叶绿素含量相关，具有重要的育种应用价值。
综上所述，本发明提供的分子标记CHL1与qChl1-1紧密连锁，可以快速准确地鉴定出玉米叶绿素含量，能够促进该位点在玉米新品种选育中的应用，也有利于该位点与其它优良性状位点的分子聚合育种。通过本发明提供的方法，在玉米任何阶段均可鉴定和筛选玉米种质资源的叶绿素含量，具有简便、快速、高效、准确的优点，适于大规模推广应用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 与玉米叶片叶绿素含量相关的分子标记及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
tgcatcccac ttctcttcac t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
tcccttgaag cttaaagtga ca 22
<210> 3
<211> 246
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays L.）
<400> 3
tgcatcccac ttctcttcac ttgttgcact gtacctttat cttgtcaaac aatgctatta 60
gtcttgtgat gattccctga aactgaaatt ccacttgaaa attgatactc cctccgtttc 120
tttttagttg tcgctggata gttcaattga actatccagc gacaactaaa aacaaacgga 180
aggagtatta gttttggact tttgagttct catcgtgtct tatatgtcac tttaagcttc 240
aaggga 246
<210> 4
<211> 166
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays L.）
<400> 4
tgcatcccac ttctcttcac ttgttgcact ctacctttat cttgtcaaac aatgctatta 60
gtcttgtgat gattccctga aactgaaatt ccacttgata attgatatta gttttggact 120
tttgagttct catcgtgtct tatatgtcac tttaagcttc aaggga 166

Claims (8)

1.检测玉米叶片叶绿素含量分子标记的物质在检测或辅助检测玉米叶片叶绿素含量中的应用，所述玉米叶片叶绿素含量分子标记为SEQ ID No.3所示的DNA片段和SEQ IDNo.4所示的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测玉米叶片叶绿素含量分子标记的物质为由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对。
3.检测玉米叶片叶绿素含量的方法，包括：以待测玉米的基因组DNA为模板，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，所得PCR产物序列为SEQ ID No.3的纯合玉米的叶片叶绿素含量低于或候选低于所得PCR产物序列为SEQ ID No.4的纯合玉米的叶片叶绿素含量，所得PCR产物序列为SEQ ID No.3的纯合玉米的叶片叶绿素含量低于或候选低于所得PCR产物序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的杂合玉米的叶片叶绿素含量，所得PCR产物序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的杂合玉米的叶片叶绿素含量低于或候选低于所得PCR产物序列为SEQ ID No.4的纯合玉米的叶片叶绿素含量。
4.检测玉米叶片叶绿素含量的方法，包括：以待测玉米的基因组DNA为模板，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，所得PCR产物大小为246bp的纯合玉米的叶片叶绿素含量低于或候选低于所得PCR产物大小为166bp的纯合玉米的叶片叶绿素含量，所得PCR产物大小为246bp的纯合玉米的叶片叶绿素含量低于或候选低于所得PCR产物大小为246bp和166bp的杂合玉米的叶片叶绿素含量，所得PCR产物大小为246bp和166bp的杂合玉米的叶片叶绿素含量低于或候选低于所得PCR产物大小为166bp的纯合玉米的叶片叶绿素含量。
5.玉米育种方法，包括：以待测玉米的基因组DNA为模板，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，选择PCR产物为SEQ IDNo.4的待测玉米作为亲本完成育种。
6.权利要求1或2中所述检测玉米叶片叶绿素含量分子标记的物质在制备检测玉米叶片叶绿素含量产品中的应用。
7.权利要求1或2中所述玉米叶片叶绿素含量分子标记在检测或辅助检测玉米叶片叶绿素含量中的应用。
8.权利要求1或2中所述玉米叶片叶绿素含量分子标记在玉米育种中的应用。
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