CN115896323A - 与玉米种子萌发能力紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与玉米种子萌发能力紧密连锁的分子标记及其应用。本发明公开的与玉米种子萌发能力紧密连锁的分子标记，为SEQ ID No.3所示的DNA片段或SEQ ID No.4所示的DNA片段，可利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行检测。实验证明，本发明的与玉米种子萌发能力紧密连锁的分子标记与玉米种子萌发能力相关，利用该分子标记可以成功鉴定玉米的种子萌发能力，并具有简便、快速、高效、准确的优点，且重复性好，特异性高，可以用于玉米分子标记辅助育种，选育综合性状优良的玉米新品种，大大节约了育种成本，提高了育种效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，与玉米种子萌发能力紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是粮食、饲料和经济兼用作物，是我国唯一一个在播种面积及产量上稳步增加的农作物。近年来，全球经济有了快速的发展，预计在未来工业生产和生活上对玉米的需求量将不断增加。2021年我国玉米种植面积为4332万公顷，比上年增加206万公顷，产量高达27255万吨，约占我国粮食总产量的39.91％。
随着我国经济的快速发展和人们生活水平的不断提高，预计未来在工业生产和生活中对玉米的需求量将不断增加，如何提高玉米产量始终是玉米育种的重要目标。玉米产量由单位面积有效穗数、穗粒数和粒重3个因素构成，而出苗率直接影响单位面积的收获株数，进而影响单位面积的有效穗数，最终影响玉米产量。出苗是种子植物生命周期中极为关键和重要的发育阶段，它决定了植物从暗形态建成到光形态建成的转变，进而影响幼苗形态建成。快速、旺盛和整齐的出苗不仅是不同环境条件下幼苗适合性的理想特征，也是实现作物产量潜力的前提条件。出苗率与作物产量之间存在显著的正相关关系，是玉米育种重要的目标性状之一。因此，进一步解析玉米种子萌发的遗传基础并开发与种子萌发数量性状位点(quantitative trait loci,QTL)紧密连锁的分子标记，对培育高萌发率的玉米新品种进而提高玉米产量具有积极的意义。
分子标记具有数量大，检测不受环境条件、发育时期和表达调控等因素影响以及能提供完整丰富的遗传信息等优点，已被广泛应用于种质资源鉴定、QTL定位和分子标记辅助选择等方面。插入缺失(Insertion-Deletion,InDel)标记是常用的基于DNA水平差异的分子标记之一，具体指的是两个材料中的差异，相对一个材料而言，另一个材料的基因组某些位点中有一定数量的核苷酸插入或缺失，根据其插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR引物。利用与目的基因紧密连锁的InDel标记，通过辅助回交选择，辅助系谱选择乃至全基因组选择，从而减轻连锁累赘，聚合有利基因，加快育种进程，可以有效提高选择效率和效果。
目前，尽管在玉米染色体上有报道控制玉米种子萌发的QTL，但开发与目标QTL紧密连锁的分子标记并申请专利应用的报道很少，且在qFGR5-1区段内没有与玉米种子萌发相关的专利报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测玉米种子萌发能力。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测玉米种子萌发分子标记的物质在检测或辅助检测玉米种子萌发能力中的应用，所述玉米种子萌发分子标记为SEQ ID No.3所示的DNA片段和SEQ ID No.4所示的DNA片段。
上述应用中，所述检测玉米种子萌发分子标记的物质可为由序列表中SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对。
本发明还提供了检测玉米种子萌发能力的方法，所述方法包括：以待测玉米的基因组DNA为模板，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，所得PCR产物序列为SEQ ID No.3的纯合玉米的种子萌发能力高于或候选高于所得PCR产物序列为SEQ ID No.4的纯合玉米的种子萌发能力，所得PCR产物序列为SEQ ID No.3的纯合玉米的种子萌发能力高于或候选高于所得PCR产物序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的杂合玉米的种子萌发能力，所得PCR产物序列为SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4的杂合玉米的种子萌发能力高于或候选高于所得PCR产物序列为SEQ ID No.4的纯合玉米的种子萌发能力。
本发明还提供了检测玉米种子萌发能力的方法，所述方法包括：以待测玉米的基因组DNA为模板，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，所得PCR产物大小为161bp的纯合玉米的种子萌发能力高于或候选高于所得PCR产物大小为125bp的纯合玉米的种子萌发能力，所得PCR产物大小为161bp的纯合玉米的种子萌发能力高于或候选高于所得PCR产物大小为161bp和125bp的杂合玉米的种子萌发能力，所得PCR产物大小为161bp和125bp的杂合玉米的种子萌发能力高于或候选高于所得PCR产物大小为125bp的纯合玉米的种子萌发能力。
上文中，所述纯合玉米的种子萌发能力与所述杂合玉米的种子萌发能力均可为相应玉米植株所结种子的萌发能力。
本发明还提供了一种玉米育种方法，所述方法包括：以待测玉米的基因组DNA为模板，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，选择PCR产物为SEQ ID No.3的待测玉米作为亲本完成育种。
上文中，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增的反应体系可为：1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.1所示的单链DNA；1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.2所示的单链DNA；1μL浓度为100ng/μL的基因组DNA；5μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye(北京康润诚业生物科技有限公司，货号：A012-01)；2μL ddH2O。
利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增的反应条件可为：95℃预变性10min；95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
所述检测玉米种子萌发分子标记的物质在制备检测玉米种子萌发能力产品中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述玉米种子萌发分子标记在检测或辅助检测玉米种子萌发能力中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述玉米种子萌发分子标记在玉米育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明中，所述种子萌发的标准为玉米第1片真叶完全伸展，叶环可见。
本发明的玉米种子萌发分子标记与玉米种子萌发能力相关，利用该分子标记可以成功鉴定玉米的种子萌发能力，并具有简便、快速、高效、准确的优点，且重复性好，特异性高，可以用于玉米分子标记辅助育种，选育综合性状优良的玉米新品种，大大节约了育种成本，提高了育种效率。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1是本发明的分子标记qFGR5-1在双亲中扩增序列的比对结果。
图2是本发明的分子标记qFGR5-1在双亲中PCR扩增产物的电泳图谱。其中，W为玉米自交系W22的扩增带型，C为玉米野生近缘种CIMMYT 8759的扩增带型，Marker从下往上条带大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp和2000bp。
图3是本发明的分子标记qFGR5-1在F2群体中PCR扩增产物的电泳图谱。其中，W为纯合W22基因型的扩增带型，C为纯合CIMMYT 8759基因型的扩增带型，H为杂合基因型的扩增带型，Marker从下往上条带大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp和2000bp。
图4是本发明的分子标记qFGR5-1在F2群体中种子萌发率的单标记分析结果。NIL_W22表示纯合的W22基因型，Het表示杂合的基因型，NIL_CIMMYT 8759表示纯合的CIMMYT8759基因型，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的玉米自交系W22与玉米野生近缘种CIMMYT 8759均记载在文献(Identification and fine mapping of quantitative trait loci for the number ofvascular bundle in maize stem,JIntegrPlant Biol.2016 Jan；58(1):81-90.doi:10.1111/jipb.12358.Epub 2015 Jul 16.)中，玉米野生近缘种CIMMYT 8759为该文献中的CIMMYT accession 8759，公众可从申请人处获得玉米自交系W22与玉米野生近缘种CIMMYT8759，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的MR0212为美国玉米种质资源中心(Maize Genetics CooperationStock Center)产品，网址为：www.maizecoop.cropsci.uiuc.edu，公众也可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。MR0212为由玉米自交系W22与玉米野生近缘种CIMMYT 8759通过杂交、回交和自交衍生得到的渗入系材料。
实施例1：与玉米种子萌发能力紧密连锁的分子标记
本发明提供了用于鉴定或辅助鉴定玉米种子萌发能力的分子标记qFGR5-1(记为玉米种子萌发分子标记)，该分子标记为以玉米基因组DNA为模板，利用引物对A1进行PCR扩增得到的DNA片段，所得DNA片段的序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4。引物对A1序列如下：
正向扩增引物FGR5-F：5’-GCATTCTAGTTTCTCCTTTTCCC-3’，如SEQ ID No.1所示；
反向扩增引物FGR5-R：5’-CGCTCTAAATTCTAACCCACGG-3’，如SEQ ID No.2所示；
以种子萌发能力较强的玉米自交系W22和种子萌发能力较弱的玉米野生近缘种CIMMYT 8759的基因组DNA为模板，用SEQ ID No.1所示的正向扩增引物和SEQ ID No.2所示的反向扩增引物进行PCR扩增，检测所得PCR产物的序列。
其中，10μL PCR扩增的反应体系如下：
(1)1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.1所示的正向扩增引物；
(2)1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.2所示的反向扩增引物；
(3)1μL浓度为100ng/μL的DNA模板；
(4)5μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye(北京康润诚业生物科技有限公司，货号：A012-01)；
(5)2μL ddH2O。
PCR扩增的程序如下：
(1)95℃预变性10min；
(2)95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸60s，35个循环；
(3)72℃延伸10min；
(4)4℃保存。
PCR仪型号：Eppendorf Mastercycler nexus。
将PCR扩增产物在3.5％的琼脂糖凝胶(每100mL凝胶溶液中含有3.5g琼脂糖)中进行电泳分离并进行测序分析，结果显示，以玉米自交系W22的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物的分子量大小为161bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；以玉米野生近缘种CIMMYT 8759的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物的分子量大小为125bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
SEQ ID No.3：
GCATTCTAGTTTCTCCTTTTCCCCCATGACTATTTCTCTCCCTGCTTTCAAGTTTATGGGTTTTCTCCAGCCTATCCTGAAGATGGGAAGCATAGTCTCCCGTTCTTCTTTGCTGCTACCTACCCCTGTTGATCTTCTTCCGTGGGTTAGAATTTAGAGCG。
SEQ ID No.4：
GCATTCTAGTTTCTCCTTTTCCCCCATGACTATTTCTCTCCCTGCTTTCAAGTTTATGGGTTTTCTCCAGTCTTTGTTGCTACCTACCCCGGTTGATCTTCTTCCGTGGGTTAGAATTTAGAGCG。
其中，玉米自交系W22的扩增带型为提高种子萌发能力的优异等位基因。所以，如果待测玉米样品PCR扩增产物的分子量大小为161bp，则该待测玉米样品含有提高玉米种子萌发能力的等位基因；如果待测玉米样品PCR扩增产物的分子量大小为125bp，则该待测玉米样品含有降低玉米种子萌发能力的等位基因。
将SEQ ID No.3和SEQ ID No.4序列比对结果如图1所示。玉米自交系W22和玉米野生近缘种CIMMYT 8759的PCR扩增产物的电泳结果如图2所示。
实施例2：分子标记FGR5的获得方法
分子标记FGR5的获得方法具体包括以下步骤：
步骤1：构建包含866个家系的BC2S3渗入系群体
以玉米自交系W22作为受体亲本，以玉米野生近缘种CIMMYT 8759作为供体亲本，通过杂交1代，回交2代，自交3代得到包含866个家系的BC2S3渗入系群体。
步骤2：渗入系群体的田间种植与表型测定
2019年春季在湖南省浏阳市(28.2°N,113.6°E)国家农作物品种区域试验站种植BC2S3渗入系群体。田间试验采用扩增式不完全随机区组设计。每个小区种植2行，每行种植15株，株距25cm。每垄种植2个家系。垄高15cm，垄宽70cm，沟宽30cm。
萌发标准：玉米第1片真叶完全伸展，叶环可见。在田间全部出土苗达到萌发标准时统计萌发数，并计算萌发率。
步骤3：进行QTL定位分析
利用R/qtl的多QTL模型进行QTL定位分析。首先应用Haley-Knott回归进行QTL简单区间定位分析，并采用置换检验10000次的方法确定种子萌发能力QTL的LOD阈值(α＝0.05)。将简单区间定位得到的QTL模型进行多QTL模型拟合，并利用R/qtl的refineqtl命令优化每个QTL的位置。进一步利用addqtl命令检测基因组是否存在其他显著改善模型的QTL，如果检测到新的QTL，则重新拟合多QTL模型和优化QTL位置，重复此过程，直到检测不到新的QTL。最后利用fitqtl命令计算所有QTL解释的总表型变异及单个QTL的加性效应和表型贡献率。
QTL定位结果分析：共检测到3个控制玉米种子萌发能力的QTL，其中在第5染色体上检测到一个表型效应最大的QTL qFGR5-1。qFGR5-1的LOD值为9.38，加性效应大小为-7％，显性效应大小为1％，表型贡献率为4.8％，位于玉米第5染色体169785900bp至176866862bp区间内。
步骤4：分子标记FGR5的开发与合成
利用在线引物设计软件primer3(https://primer3.ut.ee/)对qFGR5-1在第5染色体169785900bp至176866862bp的物理区间进行搜索，设计正向扩增引物FGR5-F和反向扩增引物FGR5-R，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，核苷酸序列如下：
正向扩增引物FGR5-F：5’-GCATTCTAGTTTCTCCTTTTCCC-3’，如SEQ ID No.1所示；
反向扩增引物FGR5-R：5’-CGCTCTAAATTCTAACCCACGG-3’，如SEQ ID No.2所示。
实施例3：分子标记FGR5的应用
以仅在qFGR5-1区段杂合，而在基因组其他位点纯合的渗入系MR0212为起始材料并进行自交授粉，产生一个仅在qFGR5-1区段分离的F2群体。以包含468个单株的F2群体为材料对本发明获得的分子标记FGR5进行验证，以确定该分子标记应用于分子标记辅助选择育种的准确性。具体包括以下步骤：
步骤1：F2群体种子萌发率的测定
按照实施例2的步骤2测定F2植株所结种子的萌发率。
步骤2：采用CTAB法提取F2植株玉米叶片DNA。
步骤3：PCR扩增
PCR扩增的反应体系为10μL，包括：
(1)1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.1所示的正向扩增引物；
(2)1μL浓度为10μmo1/L的SEQ ID No.2所示的反向扩增引物；
(3)1μL浓度为100ng/μL的DNA模板；
(4)5μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye(北京康润诚业生物科技有限公司，货号：A012-01)；
(5)2μL ddH2O。
PCR扩增的程序如下：
(1)95℃预变性10min；
(2)95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸60s，35个循环；
(3)72℃延伸10min；
(4)4℃保存。
PCR仪型号：Eppendorf Mastercycler nexus。
步骤4：电泳
分子标记FGR5在部分F2单株中PCR扩增产物的电泳图谱如图3所示。
步骤5：结果分析
根据PCR扩增产物的分子量大小确定待测玉米样品的基因型：如果待测玉米样品PCR扩增产物仅有一条161bp的条带，则该待测玉米为纯合的W22基因型(即与玉米自交系W22相同的基因型)；如果待测玉米样品PCR扩增产物仅有一条125bp的条带，则该待测玉米为纯合的CIMMYT 8759基因型(即与玉米野生近缘种CIMMYT 8759相同的基因型)；如果待测玉米样品PCR扩增产物不仅有一条161bp的条带，而且还有一条125bp的条带，则该待测玉米为杂合基因型。
F2单株中共有112株为纯合的W22基因型，对PCR产物测序显示，其序列均为SEQ IDNo.3，112株纯合的W22基因型F2单株所结种子的萌发率为69％±11％；共有118株为纯合的CIMMYT 8759基因型，对PCR产物测序显示，其序列均为SEQ ID No.4，118株纯合的CIMMYT8759基因型F2单株所结种子的萌发率为54％±17％；共有238株为杂合基因型，对PCR产物测序显示，其序列均为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，238株杂合基因型F2单株所结种子的萌发率为63％±7％。
进一步对各组的种子萌发率表型值进行方差分析(图4)。结果表明：纯合的W22基因型F2单株所结种子的萌发率极显著高于纯合的CIMMYT 8759基因型F2单株，纯合的W22基因型F2单株所结种子的萌发率显著高于杂合基因型F2单株，杂合基因型F2单株所结种子的萌发率显著高于纯合的CIMMYT 8759基因型F2单株，说明分子标记FGR5与玉米的种子萌发能力有关，具有重要的育种应用价值。
综上所述，本发明提供的分子标记FGR5与qFGR5-1紧密连锁，可以快速准确地鉴定出玉米种子萌发能力，能够促进该位点在玉米新品种选育中的应用，也有利于该位点与其它优良性状位点的分子聚合育种。通过本发明提供的方法，在玉米任何阶段均可鉴定和筛选玉米种质资源的种子萌发能力，具有简便、快速、高效、准确的优点，适于大规模推广应用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (8)
1.检测玉米种子萌发分子标记的物质在检测或辅助检测玉米种子萌发能力中的应用，所述玉米种子萌发分子标记为SEQ ID No.3所示的DNA片段和SEQ ID No.4所示的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测玉米种子萌发分子标记的物质为由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对。
3.检测玉米种子萌发能力的方法，包括：以待测玉米的基因组DNA为模板，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，所得PCR产物序列为SEQ ID No.3的纯合玉米的种子萌发能力高于或候选高于所得PCR产物序列为SEQ ID No.4的纯合玉米的种子萌发能力，所得PCR产物序列为SEQ ID No.3的纯合玉米的种子萌发能力高于或候选高于所得PCR产物序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的杂合玉米的种子萌发能力，所得PCR产物序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的杂合玉米的种子萌发能力高于或候选高于所得PCR产物序列为SEQID No.4的纯合玉米的种子萌发能力。
4.检测玉米种子萌发能力的方法，包括：以待测玉米的基因组DNA为模板，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，所得PCR产物大小为161bp的纯合玉米的种子萌发能力高于或候选高于所得PCR产物大小为125bp的纯合玉米的种子萌发能力，所得PCR产物大小为161bp的纯合玉米的种子萌发能力高于或候选高于所得PCR产物大小为161bp和125bp的杂合玉米的种子萌发能力，所得PCR产物大小为161bp和125bp的杂合玉米的种子萌发能力高于或候选高于所得PCR产物大小为125bp的纯合玉米的种子萌发能力。
5.玉米育种方法，包括：以待测玉米的基因组DNA为模板，利用由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，选择PCR产物为SEQ IDNo.3的待测玉米作为亲本完成育种。
6.权利要求1或2中所述检测玉米种子萌发分子标记的物质在制备检测玉米种子萌发能力产品中的应用。
7.权利要求1或2中所述玉米种子萌发分子标记在检测或辅助检测玉米种子萌发能力中的应用。
8.权利要求1或2中所述玉米种子萌发分子标记在玉米育种中的应用。
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