CN105506147A - 玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记及其应用 - Google Patents

玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记，其PCR引物序列为IDF:？TATTCCCGAACGGGTCCC，IDR:？CGAGGTGGTGAAGCCGAAGAA；其内参引物序列为CF:？GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT，CR:？CGTTGAAGGCACGGGTAAGC。本发明玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记不依赖于分子遗传作图，利用该功能标记可大大提高分子标记辅助选择的效率，并可直接应用于实践，为通过分子标记辅助选择的方法选育发芽率高的优良自交系或杂交种提供技术支撑。

Description

玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记及其在育种中的应用。
背景技术
在玉米生产投入中，种子是最基本、最有效的投入，也是最特殊的生产资料，直接影响着生产者、经营者和使用者的经济利益。在诸多衡量种子质量的指标中，发芽率是最直接有效的评价标准，对于种子收购、储藏、调运等有重要意义，同时也是田间确定播种量的依据。在我国的农业生产中几乎每年都有因种子发芽率低而导致玉米减产的案例，近些年来，一些大型跨国种子企业如先锋、先正达等先后进入中国市场，除具有品牌优势外，其生产的玉米杂交种子同时还具有发芽率高、能够实现单粒播种的质量优势，这是其迅速占据国内市场的一个主要原因。因此，如何提高种子发芽率、培育适宜单粒点播的玉米新品种是增强我国玉米种业参与国际和国内竞争所亟待解决的问题，对保证我国粮食安全具有重要意义。
尽管种子发芽率是环境和遗传因素共同作用的结果，但其本身的遗传特性是造成不同品种间发芽率差异的主要原因。种子萌发能力的强弱是决定发芽率的关键因素，因此，阐明玉米种子萌发相关基因与发芽率之间的关系、发掘影响玉米萌发特性的优良等位基因，是选育高发芽率玉米新品种、确保种子质量的有效途径。大量的育种和生产实践证明不同玉米自交系的发芽率存在广泛的遗传变异，因此，可以利用现有种质资源发掘玉米发芽率相关的优良等位基因，进而通过分子标记辅助选择的方法选育发芽率高的优良自交系和杂交种，对提高我国玉米种子质量具有重要意义。
种子萌发特性是决定种子发芽率的一个最基本指标，许多学者对种子萌发相关基因进行了大量研究，但这些研究主要集中在麦类和拟南芥等植物中。如Dunwell等在小麦萌发早期的胚中发现了一种对热异常稳定的萌发素蛋白，该蛋白包含cupin蛋白的保守结构域，同时与萌发素蛋白相似的类萌发素蛋白也具有cupin蛋白的保守结构域。而cupin蛋白广泛存在于生物体中，它由一类结构相似、功能各异的蛋白组成超蛋白家族，cupin超蛋白家族具有保守的桶状折叠特征。在小麦、大麦和水稻的萌发过程中，萌发素蛋白具有草酸氧化酶活性，能够催化依赖锰离子的氧化脱羧反应，在植物的抗病性反应中起作用；在苔藓和高等植物中，天然萌发素和特定类型的类萌发素具有超氧化物歧化酶的活性，能够清除生长发育过程产生的活性氧自由基，在植物的抗胁迫反应中有重要作用；在拟南芥种子萌发过程中，信号转导相关G蛋白α亚基的互作因子是具cupin结构域的AtPirin1蛋白；Lapik等利用插入突变和体外实验证实了cupin蛋白对拟南芥种子萌发和幼苗发育的调控作用。可见，具有cupin结构域的基因在多种植物的种子萌发过程中起到重要作用。
玉米种子发芽率是一个复杂的数量性状，在自然群体中存在广泛的遗传变异，且玉米基因组的核苷酸多态性非常丰富，为利用关联分析方法解析种子发芽率相关性状奠定了基础。与连锁分析相比，关联分析不但能大大缩短研究年限，而且能同时检测同一基因座位的多个等位基因，作图精度可以达到单基因水平，更有可能检测到引起表型变异的真正核苷酸位点。因此，利用候选基因关联分析方法挖掘基因内对目标性状有正向贡献的等位基因，在植物的多个重要农艺性状的研究中得到了广泛应用，并在实际生产中得到了验证，如玉米类胡萝卜素合成途径关键酶编码基因的关联分析和功能标记应用（Hajesetal,2008；Yanetal.2008；Fuetal.2010），已展现了候选基因关联分析方法研究数量性状的美好前景。
发明内容
针对上述问题，本发明根据种子萌发过程中鉴定的差异表达蛋白质，克隆了该蛋白质的编码基因，通过候选基因关联分析发掘基因内的有利等位变异，并开发出了相应的功能分子标记，为通过分子标记辅助选择的方法选育发芽率高的优良自交系和杂交种提供技术支撑。
为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：
本发明以我国农业生产上大面积使用的农大108、郑单958、先玉335、豫玉22、浚单20和浚单18等玉米杂交种及其相应的亲本为基础材料，利用蛋白质双向电泳技术研究了不同杂交种及其相应亲本种子萌发过程中的蛋白质组学差异，在多个杂交种及其对应亲本萌发过程中均发现一个差异表达的蛋白，质谱分析结果表明该蛋白具有cupin蛋白的保守结构域。在此基础上，克隆该候选基因，并命名为ZmGLP，其核苷酸序列如序列1所示。通过候选基因关联分析方法证明该基因与玉米种子发芽势显著关联，并开发了PCR功能分子标记，对ZmGLP基因在生产中的应用提供了技术支撑。利用该功能分子标记辅助选择结合常规育种实现有利等位基因的定向转移，提高现有自交系的发芽率并创制高发芽率的新种质，组配出发芽率高的玉米新品种，有助于解决部分玉米杂交种及自交系种子发芽率低的问题。
上述玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记的PCR引物序列如下：
IDF:TATTCCCGAACGGGTCCC，
IDR:CGAGGTGGTGAAGCCGAAGAA；
其内参引物的核苷酸序列为：
CF:GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT，
CR:CGTTGAAGGCACGGGTAAGC。
上述玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记检测方法，包括以下步骤：
（1）配制15μL反应体系，包括：
DNA模板10ng/μL3.0μL
dNTP2.5mmol/L1.2μL
10×PCRBuffer1.5μL
IDF10μmol/L0.3μL
IDR10μmol/L0.3μL
CF10μmol/L0.3μL
CR10μmol/L0.3μL
TaqDNApolymerase2.5U/μL0.3μL
ddH2O7.8μL；
（2）进行PCR扩增程序：
TD65～56℃；
1个循环95℃3.0min；
10个循环95℃1.0min、65℃退火1.0min、72℃延伸1.5min；
25个循环95℃变性1.0min、56℃退火1.0min、72℃延伸1.5min；
Delay72℃10.0min；
Soak4℃；
其它步骤同常规方法。
本发明具有以下积极有益的技术效果：
（1）本发明得到的是基于功能基因内开发的引起表型变异的功能标记，是建立在关联群体中等位基因的功能性基序中单核苷酸多态性位点基础上的一类新型显性分子标记，它不依赖于分子遗传作图，利用该功能标记可大大提高分子标记辅助选择的效率。
（2）玉米自然群体中不同自交系的发芽率及萌发特性具有广泛的遗传变异，因此本发明通过候选基因关联分析发掘的ZmGLP基因内影响种子萌发特性的优异等位基因位点及其核心序列，开发的功能分子标记，可直接用于生产实践。
附图说明
图1.ZmGLP基因结构及核苷酸多态性信息图；
其中，TSS表示转录起始位点，其余黑色方框表示外显子，SP表示信号肽区域，3’端的三角表示PolyA尾巴；
图2.ZmGLP基因的信号肽预测图谱；
图3.ZmGLP基因的跨膜结构域预测图谱；
图4.ZmGLP基因Cupin结构域内的二级结构变异图谱之一；
其中，方框标出的为InDel9引起的蛋白质二级结构变异区；
图5.ZmGLP基因Cupin结构域内的二级结构变异图谱之二；
其中，方框标出的为InDel9引起的蛋白质二级结构变异区；
图6.ZmGLP基因的LD图；
图7.InDel9的PCR标记图；
其中，100-250bp之间的带表示18个碱基插入的有利等位变异，500bp附近的带表示内参对照片段；
图8.InDel9在大刍草中的核苷酸状态图；
其中，100-250bp之间的带表示18个碱基插入的有利等位变异，500bp附近的带表示内参对照片段。
具体实施方式
以下是对本发明的具体实施方式进一步的详细说明。下述实施中所涉及的方法，如无特别说明均为常规方法，所涉及的原料无特别说明，则均为市售原料。
实施例1：玉米种子发芽势基因ZmGLP功能分子标记的开发
（1）玉米ZmGLP基因序列结构分析
发明人在前期对农大108、郑单958、先玉335、豫玉22、浚单20和浚单18等玉米杂交种及其相应的亲本种子萌发过程中的差异表达蛋白质进行分析研究的基础之上，获得了影响种子萌发特性的gi|195606798蛋白质，提取ZmGLP基因的参考序列，并设计了多对扩增和测序引物对40份玉米自交系的ZmGLP基因进行扩增，确定用包含5’UTR、外显子、内含子和3’UTR在内的两对引物（cupinF2：CGTAGCACCAGAAAGAAATGTA/cupinR1：CACAGGTAGGCGGTAGCAGC，cupinF6：GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT/cupinR7：ACAAACGGTCACTGCGGGAC）对其它自交系的ZmGLP基因序列进行扩增和测序。
利用在线软件预测了该基因的启动子区(Promoter0.98scorehttp://molbiol-tools.ca/Promoters.htmhttp://132.248.32.45/cgi-bin/ribex.cgi)，用引物P-6F：TGCTATGCGGAGGGGTCTA/P-6R：AAGAGAAGGGCAAAGGCAAA对该区域进行扩增测序。对40份自交系ZmGLP基因序列进行比对分析后得到该基因的结构（见图1）。
SignalP4.1软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）的预测结果表明1-24个氨基酸是ZmGLP基因的信号肽区（见图2），该区域内的7-22个氨基酸是潜在的跨膜结构域（http://www.sbc.su.se/～miklos/DAS/tmdas.cgi，见图3）。蛋白质结构域分析结果表明，自然群体的ZmGLP基因都存在一个典型的Cupin结构域（329～478个氨基酸位置，http://smart.embl-heidelberg.de/），但该结构域中由于Indel9（TTCCCGAACGGGTCCCTG/------------------）的存在而产生较大差异（见图4、5），可能改变了Cupin蛋白的桶状折叠（http://swissmodel.expasy.org/）从而影响了不同自交系种子的萌发。
图2中具体数据如下：
#MeasurePositionValueCutoffsignalpeptide
max.C250.761
max.Y250.850
max.S160.983
meanS1-240.948
D1-240.9030.450YES
Name=SequenceSP='YES'Cleavagesitebetweenpos.24and25:CSA-AAD=0.903D-cutoff=0.450Networks=SignalP-noTM。
（2）ZmGLP基因序列的多态性分析
以B73为参考序列（http://www.maizegdb.org），通过在线序列比对（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）和BioEdit软件（www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit）中的手工调整，在131份自交系中共检测到112个多态性位点（TASSEL软件包中的sites功能提取概率>2%的多态性位点），其中5’和3’非翻译区各有三个indels（插入缺失标记），编码区共51个多态性位点。编码区中有18个SNPs（单核苷酸多态性）和4个indels引起氨基酸变异的非同义突变（见表1），其中SNP6、7、8位于一个LDblock，SNP9、10位于另一个LDblock。SNP1位于信号肽的跨膜域且改变了氨基酸的化学性质（亲水的碱性精氨酸变为疏水的亮氨酸），SNP13、14、15和Indel9位于保守的Cupin结构域，且Indel9改变了Cupin结构域中C螺旋，对ZmGLP基因的功能有重大影响。连锁不平衡（LD）分析表明，ZmGLP的衰退很快（见图6），可以通过关联分析鉴定ZmGLP基因内的功能标记。
在上述分析研究结果的基础之上，开发了5’UTR和3’UTR及信号肽内的SNP1和Cupin结构域中的Indel9的PCR标记，即为本发明玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记，其扩增引物序列为，
IDF:TATTCCCGAACGGGTCCC,
IDR:CGAGGTGGTGAAGCCGAAGAA；
其内参引物的核苷酸序列为：
CF:GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT，
CR:CGTTGAAGGCACGGGTAAGC。
表1ZmGLP基因内的非同义突变
。
（3）表型分析
对自然群体（508份）的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数进行了两年重复试验，每年试验设置三个重复，田间采取单行区完全随机区组试验。性状的具体测定方法如下：
①每份材料分3个重复，每个重复100粒；
②播种前头一天整地浇水保证土壤湿润，行长4米，行宽0.5米；
③开沟撒播；
④在出苗后第三天开始记录出苗数（6.20号播种，6.25号出苗，6.27号开始调查），以后每天记录一次出苗数（6.27、6.28、6.29、6.30、7.1、7.2、7.3天）；
⑤7月4号每行收获整齐一致的10株幼苗，用水冲洗干净，在自然条件下晾晒1周后称重。性状参数的具体计算方法是：
发芽率=总出苗数/种子数；
发芽指数（germinationindex,GI）=∑(Gt/Dt)，
Dt表示发芽日数，Gt是与Dt相对应的每天发芽种子数；
活力指数（vigorindex，VI）＝GI×S，S表示收获后幼苗单株的平均干重（g）；
发芽势（germinationvigor）=发芽过程中日发芽最高峰的种子数/供测样品种子数×100%。
（4）关联及进化分析
方差分析结果表明，基因型与环境间互作不显著，遗传因素是种子萌发相关性状表型差异的主要原因（见表2）。
表2关联群体种子萌发相关性状的方差分析
关联分析结果表明，这些核苷酸多态性位点中仅有InDel9与种子发芽势显著关联，其它多态性位点与表型性状关联不显著。关联分析和最优显性无偏估计（BestLinearUnbiasedPredictorBLUP）结果表明，InDel9分别能够解释4.99%和4.43%的种子发芽势表型变异（表3）。
表3InDel9在130份自交系中的关联分析结果
a仅列出了显著关联位点；
bInDel9的等位变异，加粗表示有利等位变异；
cGP表示发芽率;GI表示发育指数;VI表示活力指数;GV表示发芽势；
dp-value是通过tassel软件的混合线性模型整合了群体结构和亲缘关系得到的.BLUP是两年数据整合后得到的结果；
ep-value是利用BLUP数据通过ANOVA分析得到的结果；
fR2值是利用BLUP数据通过ANOVA分析得到的标记对表型的贡献率。
进一步利用527份自交系组成的关联群体进行分析，其结果验证了InDel9的功能，可解释4.43%的种子发芽势表型变异（表4）。
表4InDel9在527份自交系中的关联分析结果
a仅列出了显著关联位点；
bInDel9的等位变异，加粗表示有利等位变异；
cGP表示发芽率;GI表示发育指数;VI表示活力指数;GV表示发芽势；
dp-value是通过tassel软件的混合线性模型整合了群体结构和亲缘关系得到的.BLUP是两年数据整合后得到的结果；
ep-value是利用BLUP数据通过ANOVA分析得到的结果；
fR2值是利用BLUP数据通过ANOVA分析得到的标记对表型的贡献率。
基于简单PCR扩增得到的功能标记InDel9可直接用于分子标记辅助育种中（见图7）。InDel9的有利等位变异定义为对种子发芽势有促进作用的变异，因此，18个碱基的插入是有利等位变异。InDel9在41份大刍草中的变异分析表明18个碱基的缺失导致ZmGLP发生功能丧失突变（见图8），导致发芽势降低，该突变发生在玉米改良而非驯化过程中。
SEQUENCELISTING
<110>河南农业大学
<120>玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记及其应用
<130>/
<160>12
<170>PatentInversion3.5
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cgttgaaggcacgggtaagc20
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
cgtagcaccagaaagaaatgta22
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
cacaggtaggcggtagcagc20
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ggggaagcgaaggttgggtat21
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
acaaacggtcactgcgggac20
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
tgctatgcggaggggtcta19
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
aagagaagggcaaaggcaaa20

Claims (3)

1.一种玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记，其PCR引物序列为
IDF:TATTCCCGAACGGGTCCC，
IDR:CGAGGTGGTGAAGCCGAAGAA；
其内参引物序列为：
CF:GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT，
CR:CGTTGAAGGCACGGGTAAGC。
2.权利要求1所述功能分子标记在玉米育种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，包括以下步骤：
（1）配制15μL反应体系，包括：
DNA模板10ng/μL3.0μL
dNTP2.5mmol/L1.2μL
10×PCRBuffer1.5μL
IDF10μmol/L0.3μL
IDR10μmol/L0.3μL
CF10μmol/L0.3μL
CR10μmol/L0.3μL
TaqDNApolymerase2.5U/μL0.3μL
ddH2O7.8μL；
（2）进行PCR扩增程序：
TD65～56℃；
1个循环95℃3.0min；
10个循环95℃1.0min、65℃退火1.0min、72℃延伸1.5min；
25个循环95℃变性1.0min、56℃退火1.0min、72℃延伸1.5min；
Delay72℃10.0min；
Soak4℃。
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