CN108603197A

CN108603197A - 提高植物氮利用效率的方法

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Publication number: CN108603197A
Application number: CN201680076198.9A
Authority: CN
Inventors: 范晓荣; 曹林
Original assignee: Nanjing Maple Biotechnology Co Ltd; Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Maple Biotechnology Co Ltd; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2015-12-24
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2036-12-23
Also published as: CN108603197B; US20190100766A1; WO2017107983A1

Abstract

本发明公开一种提高植物产量、生长和/或氮利用效率的方法，其包含改变NRT的表达谱。本发明还提供制备这种植物的方法，包括核酸构建体和具有上述性状的遗传改变的植物。

Description

提高植物氮利用效率的方法

技术领域

本发明涉及一种提高植物产量、生长和/或氮利用效率的方法，所述方法包括改变NRT2核酸的表达谱。本发明还涉及制备这种植物的方法，包括核酸构建体和具有上述性状的遗传改变的植物。

背景技术

氮(N)营养影响从代谢到资源分配、生长和发育的所有植物功能水平(Crawford,1995；Scheible等人,1997；Stitt,1999；Scheible等人,2004)。植物根部获取N的最丰富的来源是硝酸盐(NO3-)，其由于施用的有机N和化肥N的强化硝化作用而存在于自然有氧土壤中。NO3-充当营养物质并且作为诱导生长和基因表达改变的信号(Crawford和Glass等人,1998；Wang等人,2000；Zhang和Forde等人,2000；Coruzzi和Bush等人,2001；Coruzzi和Zhou等人,2001；Crawford和Forde等人,2002；Kronzucker等人,2000；Kirk和Kronzucker等人,2005)。相反，由于厌氧土壤条件，铵(NH4+)是淹水稻田土壤中可用N的主要形式(Sasakawa和Yamamoto,1978)。在不同程度上，根据土壤条件和其它因素，如生长阶段，所有作物植物需要能够管理硝酸盐和铵的吸收、转运和代谢。

植物对氮的利用涉及数个步骤，包括吸收、同化、转运和植物老化时的再循环和再活化。植物中两种不同的NO3-吸收系统，即称为HATS和LATS的高亲和力和低亲和力NO3-吸收系统受NO3-供应调节，并使植物能够分别应对土壤中的低或高NO3-浓度(Fan等人,2005)。

组成型HATS(cHATS)和硝酸盐诱导型HATS(iHATS)用以在外部培养基中的低硝酸盐浓度下吸收硝酸盐，饱和度在0.2-0.5mM范围内。相反，LATS用以在较高的外部硝酸盐浓度下获取硝酸盐。经由LATS和HATS的吸收分别由属于NRT1和NRT2家族的硝酸盐转运蛋白调节。根的吸收受到负反馈的调节，这将硝酸盐吸收的表达和活性与植物的N状况联系起来。

电生理学和分子学研究都表明，通过HATS和LATS的硝酸盐吸收是由质子/硝酸盐共转运蛋白介导的活跃过程(Zhou等人,2000；Miller等人,2007)。在拟南芥基因组中，至少有53个和7个成员分别属于NRT1和NRT2家族(Miller等人,2007；Tsay等人,2007)。已经表征数个拟南芥NRT1和NRT2家族成员在硝酸盐吸收和长距离转运中的功能。AtNRT1.1(CHL1)被描述为一种转运感受体(transceptor)，其发挥作为双重亲和力硝酸盐转运蛋白和外部硝酸盐供应浓度传感器(Liu和Tsay,2003；Gojon等人,2011)以及在低硝酸盐浓度下转运生长素的多重作用。相反，AtNRT1.2(NTL1)是组成性表达的低亲和力硝酸盐转运蛋白(Huang等人,1999)。AtNRT1.4是一种叶柄表达的硝酸盐转运蛋白，在调节叶片硝酸盐稳态和叶片发育方面发挥关键作用(Chiu等人,2004)。AtNRT1.5在靠近木质部的根中柱鞘细胞中表达，并且负责将硝酸盐装载到木质部用于根部至冠部(shoot)硝酸盐转运(Lin等人,2008)。AtNRT1.6仅在生殖组织中表达，并参与将母本组织中的硝酸盐递送至早期发育的胚(Almagro等人,2008)。AtNRT1.7在韧皮部装载硝酸盐中起作用，以允许从较老的叶片转运出并进入较新的叶片，这表明硝酸盐的源到库再活化由韧皮部调节(Fan等人,2009)。AtNRT1.8主要在脉管系统内的木质部薄壁细胞中表达，并在从木质部液汁中回收硝酸盐中起作用(Li等人,2010)。AtNRT1.9促进硝酸盐装载到根韧皮部，增强根部的向下运输，其敲除增加根部向冠部木质部的硝酸盐转运(Wang和Tsay,2011)。在拟南芥中的7个NRT2家族成员中，AtNRT2.1和AtNRT2.2都已经被表征为iHATS的贡献者。在水稻基因组中，已经鉴定了五个NRT2基因(Araki和Hasegawa,2006；Cai等人,2008；Feng等人,2011)。OsNRT2.1和OsNRT2.2共有一个具有不同5'-和3'-非转录区(UTR)的相同编码区序列，并且与其它单子叶植物的NRT2基因具有高度相似性，而OsNRT2.3和OsNRT2.4与拟南芥NRT2基因更紧密相关。

已显示一些属于NRT2家族的高亲和力NO3-转运蛋白需要伴侣蛋白NAR2来发挥它们的功能(Xu等人,2012)。Quesada、Galvan和Fernandez(1994)鉴定出CrNar2基因，其编码一个约200个氨基酸残基的小蛋白质，所述蛋白质没有已知的转运活性，但在吸收缺陷的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)突变体中是补充NO3-转运所需要的。在拟南芥中，Okamoto等人(2006)表明，组成型和NO3-诱导型HATS(而非LATS)都依赖于NAR2型基因(例如拟南芥AtNRT3.1)的表达。Orsel等人(2006)使用酵母分裂泛素和卵母细胞表达系统来显示AtNAR2.1(AtNRT3.1)和AtNRT2.1相互作用以产生功能性HATS。Yong、Kotur和Glass(2010)表明，NRT2.1和NAR2.1多肽直接在质膜上相互作用，构成一种低聚物，所述低聚物可以充当用于拟南芥根中高亲和力NO3-内流的功能单元。在水稻中，类似地显示OsNRT2.1、OsNRT2.2和OsNRT2.3a基因产物需要由OsNAR2.1编码的蛋白质来进行NO3-吸收(Feng等人,2011；Yan等人,2011；Liu等人,2014)，并且使用酵母双杂交分析法和蛋白质印迹证明了它们在蛋白质水平上的相互作用(Yan等人,2011；Liu等人,2014)。由于OsNRT2.1表达增加，水稻秧苗生长略有改善，但N吸收不受影响(Katayama等人,2009)，这可能是由于缺乏与功能性NO3-运输所需的OsNAR2.1的相互作用(Feng等人,2011；Yan等人,2011)。

植物通过改变其生长来适应不断变化的环境条件。植物生长和发育是一个复杂的过程，涉及许多环境和内源信号的整合，所述环境和内源信号与内在遗传程序一起确定植物形态。这个过程涉及的因素包括统称为植物激素(plant hormones或phytohormones)的数种生长调节剂。非生物胁迫会对植物生长造成负面影响，导致严重的农业损失。即使是适度的胁迫也会对植物生长产生重大影响，从而对农业上重要的作物植物的产量产生显著影响。因此，找到一种改善生长的方法，特别是改善在胁迫条件下的生长的方法，具有很大的经济利益。

需要提供不仅在胁迫和非胁迫条件下具有较高产量而且更有营养效率以确保可持续的作物生产的作物植物。这些作物对于全球粮食安全和降低矿物肥料投入的成本和负面环境影响(如空气和水质以及生物多样性的丧失)是必要的。本发明旨在解决这种需求。

发明内容

我们使用OsNAR2.1基因的NO3-诱导型启动子改变了编码高亲和力NO3-转运蛋白的OsNRT2.1基因的相对表达，以驱动在转基因水稻植株中的OsNRT2.1表达。与野生型(WT)植物相比，表达pOsNAR2.1:OsNRT2.1构建体的转基因株系分别表现出T0和T1植物的谷粒产量增加30.7％和28.1％。pOsNAR2.1:OsNRT2.1株系的农业NUE(ANUE)增加到WT植物的128％。相对于WT，在pOsNAR2.1:OsNRT2.1株系中向谷粒内的干物质转移(DMT)增加了46％。OsNRT2.1在冠部和谷粒中的表达显示，与WT相比，OsNAR2.1启动子将OsNRT2.1表达水平增加至约180％。有趣的是，我们还发现在pOsNAR2.1:OsNRT2.1株系的根、叶鞘和节间中OsNAR2.1表达增加。因此，由OsNAR2.1启动子驱动OsNRT2.1的表达不仅增加了NRT2.1的表达，而且改变了其表达谱。因此，我们表明，改变NRT2.1的表达谱可以提高作物植物的产量和NUE。

在一个方面，本发明涉及用于提高植物的生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量的方法，所述方法包括改变植物中NRT2核酸的表达谱，其中所述NRT2核酸选自分别如SEQ ID NO:1、3和5中定义的NRT2.1、NRT2.2和/或NRT2.3a或其功能同源物或变体。

在另一方面，本发明涉及核酸构建体，其包含与调控序列可操作地连接的如SEQID No:1、3或5中任一项所定义的核酸序列或其功能变体或同源物，其中所述调控序列是硝酸盐诱导型启动子，并且其中优选地，所述硝酸盐诱导型启动子是包含如SEQ ID No:7中所定义的序列或其功能同源物或变体的NAR2.1启动子。

在另一方面，本发明涉及包含如本文所述的核酸构建体的载体。

在另一方面，本发明涉及包含如本文所述的核酸构建体的宿主细胞。

在另一方面，本发明涉及表达如本文所述的核酸构建体的转基因植物。

在另一方面，本发明涉及表达核酸序列的转基因植物，所述核酸序列包含与硝酸盐诱导型启动子可操作地连接的SEQ ID No 1、3或5中任一项所定义的序列或其功能变体或同源物，其中所述硝酸盐诱导型启动子包含如SEQ ID NO:7中所定义的核酸序列或其同源物或变体。

在另一方面，本发明涉及用于制备具有提高的生长、生物量、产量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量的转基因植物的方法，所述方法包括在植物或植物细胞中引入并表达如本文所述的核酸构建体。

本发明还涉及如本文所述的核酸构建体用于提高植物的生长、生物量、产量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量的用途。

在另一方面，本发明涉及产生具有提高的植物生长、生物量、产量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量的突变植物的方法，所述方法包括向所述植物的基因组中引入突变，其中所述突变通过诱变或靶向基因组编辑引入，并且其中所述突变引入至少一个或多个额外拷贝的以下各项：

-NRT2.1、2.2或2.3a基因序列，使得至少一个序列与内源性硝酸盐诱导型启动子、优选内源性NAR2.1启动子序列可操作地连接；

-NAR 2.1启动子序列，使得所述启动子序列与至少一种内源性NRT2.1、2.2或2.3a基因序列可操作地连接；和/或

-与NAR2.1启动子序列可操作地连接的NRT 2.1、NRT 2.2或NRT 2.3a基因序列。

在另一方面，本发明涉及遗传改变的植物，其中所述植物在其基因组中携带突变，并且其中所述突变向植物基因组中引入以下各项的一个或多个额外拷贝：

在又一方面，本发明涉及改变植物中NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a与NAR2.1的表达比率的方法，所述方法包括在植物中引入并表达如本文所述的核酸构建体。

在一替代性实施例中，本发明涉及改变植物中NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a与NAR2.1的表达比率的方法，所述方法包括将至少一个突变引入植物的基因组，其中所述突变引入以下各项的一个或多个额外拷贝：

-NRT 2.1、NRT 2.2或NRT 2.3a基因序列，使得至少一个序列与内源性硝酸盐诱导型启动子、优选内源性NAR2.1启动子序列可操作地连接；

-NAR 2.1启动子序列，使得所述启动子序列与至少一个内源性NRT 2.1、NRT 2.2或NRT 2.3a基因序列可操作地连接和/或

-NRT 2.1、NRT 2.2或NRT 2.3a基因序列和NAR 2.1启动子序列

并且其中所述突变使用诱变或靶向基因组编辑引入。

在另一方面，本发明涉及遗传改变的植物，其特征在于NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1和/或NRT2.3a:NAR2.1的表达比率与对照植物的所述比率相比较低。

在最后的方面中，提供了通过如本发明的任何方法中所定义的方法获得或可获得的植物。

在下面的非限制性附图中进一步描述了本发明。

附图说明

图1转基因系的表征。

(a)pUbi:OsNRT2.1转基因系(OE1、OE2和OE3)和WT的总体形态。(b)pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因系(O6、O7和O8)和WT的总体形态。(c,d)各种转基因系和野生型(WT)植物中内源性OsNRT2.1表达的实时定量RT-PCR分析。(c)pUbi:OsNRT2.1转基因系(OE1、OE2和OE3)和WT，(d)pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因系(O6、O7和O8)和WT。从叶片I、秆和根提取RNA。(e,f)田间生长的转基因植物和WT植物的每株植物的谷粒产量和干重。干重平均值是针对所有地上生物量，包括谷粒产量。(e)pUbi:OsNRT2.1转基因系和WT，(f)pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因系和WT。对来自T3代的数据进行统计分析。误差条：SE(n＝3)。转基因系与WT之间的显著差异由不同的字母表示(P<0.05，单向ANOVA)。

图2在WT和转基因植物的两个生长阶段的各个部分中的N含量。

(a)移植后六十天，开花期。(b)移植后九十天，成熟期。误差条：SE(n＝3)。对来自T3代的数据进行统计分析。转基因系与WT之间的显著差异由不同的字母表示(P<0.05，单向ANOVA)。

图3OsNRT2.1和OsNAR2.1的表达模式。

授粉后14天，(a)OsNRT2.1和(b)OsNAR2.1在各器官中的相对表达。pUbi:OsNRT2.1代表OE1、OE2和OE3的平均值。pOsNAR2.1:OsNRT2.1代表O6、O7和O8的平均值。对来自T4代的数据进行统计分析。我们将WT表达的发育种子定义成等于1。误差条：SE(n＝3)。转基因系与WT之间的显著差异由不同的字母表示(P<0.05，单向ANOVA)。

图4在实验生长期间WT和转基因系的生长状况。

(a)在实验生长期内OsNRT2.1表达的变化。(b)在实验生长期内OsNAR2.1表达的变化。从秆中提取RNA。(c)干重。干重平均值是针对所有地上生物量，包括谷粒产量。(d)生长速率。幼苗移植到田间后，间隔15天收集样品。对来自T3代的数据进行统计分析。误差条：SE(n＝3)。在x轴的D意味着移植后的第二天。时程结束时的星号表示它们在植物当中的统计学显著性差异，并且#表示它们在生长阶段期间的统计学显著性差异(P<0.05，ANCOVA)。

图5研究过程中OsNRT2.1与OsNAR2.1在WT和转基因系秆中的表达比率。

呈现在幼苗移植到田间后在15天间隔下的不同时期在pUbi:OsNRT2.1系(OE1、OE2、OE3)、pOsNAR2.1:OsNRT2.1系(O6、O7和O8)以及WT的秆中OsNRT2.1与OsNAR2.1的表达比率。

图6 T1-T3代WT与转基因系之间的谷粒产量、干重和农艺氮利用效率(ANUE)的比较。

干重平均值是针对所有地上生物量，包括谷粒产量。对于每个平均值，n＝3。转基因系与WT之间的显著差异由不同的字母表示(P<0.05，单向ANOVA)。

图7WT与转基因系农艺性状的比较。

对来自T3代的数据进行统计分析。转基因系与WT之间的显著差异由不同的字母表示(P<0.05，单向ANOVA，n＝3)。

图8WT与转基因系之间干物质积累量和N含量的比较。

对来自T3代的数据进行统计分析。对于每个平均值，n＝3。转基因系与WT之间的显著差异由不同的字母表示(P<0.05，单向ANOVA)。

图9WT与转基因水稻系之间N利用效率、干物质转运效率和N转运效率的比较。

对来自T3代的数据进行统计分析。图13中的计算方法。对于每个平均值，n＝3。转基因系与WT之间的显著差异由不同的字母表示(P<0.05，单向ANOVA)。

图10用于扩增OsNRT2.1开放阅读框的引物。

图11用于扩增OsNAR2.1和泛素启动子的引物

图12用于检测OsActin、OsNAR2.1和OsNRT2.1基因表达的引物。

图13NUE计算方法。

图14各种转基因系和野生型(WT)植物中内源性OsNRT2.1和OsNAR2.1表达的实时定量RT-PCR分析。

图15(a)pUbi:OsNRT2.1和(b)pOsNAR2.1:OsNRT2.1构建体的图解。

LB，左边界；RB，右边界；35S，花椰菜花叶病毒35S启动子；Ubi1-1，泛素启动子；pOsNAR2.1，OsNAR2.1启动子；NOS，胭脂碱合酶终止子。

图16 T0代转基因系的表征。

(a,b)各种转基因系和WT中内源性OsNRT2.1表达的实时定量RT-PCR分析。(a)pUbi:OsNRT2.1转基因系和WT。(b)pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因系和WT。从秆中提取RNA。误差条：SE(n＝3)。(c,d)来自田间生长的转基因植物和WT植物的每株植物产量。(c)pUbi:OsNRT2.1转基因系和WT。(d)pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因系和WT。(e,f)田间生长的转基因系和WT植物的每株植物干重。(e)pUbi:OsNRT2.1转基因系和WT。(f)pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因系和WT。误差条：SE(n＝3)。转基因系与WT之间的显著差异由不同的字母表示(P<0.05，单向ANOVA)。

图17WT和T1代转基因植物的谷粒产量和干重。

(a)pUbi:OsNRT2.1转基因系和WT，(b)pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因系和WT。误差条：SE(n＝3)。

图18转基因拷贝数的Southern印迹分析。

用HindIII和EcoRI限制酶消化从T1代pUbi:OsNRT2.1和pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因植物分离的基因组DNA。潮霉素基因探针用于杂交。M，标记；P，阳性对照。

图19低N和正常N供应下WT和T4代转基因植物的谷粒产量、干重和ANUE。

在氮肥以(a)180kg N/ha和(b)300kg N/ha的比率施加下的谷粒产量和干重。(c)在180kg N/ha和300kg N/ha供应下的ANUE。误差条：SE(n＝3)。转基因系与WT之间的显著差异由不同的字母表示(P<0.05，单向ANOVA)。

图20 T4代转基因系和WT植物中的RNA采样图。授粉后14天提取RNA。

图21在WT和转基因系的不同器官中OsNRT2.1与OsNAR2.1的表达比率。

呈现在授粉后14天pUbi:OsNRT2.1系(OE1、OE2、OE3)、pOsNAR2.1:OsNRT2.1系(O6、O7和O8)和WT的不同器官中的OsNRT2.1与OsNAR2.1的表达比率。

图22 T3代转基因系和WT植物中的RNA采样。

从叶片I和秆中提取RNA。(a)指示在移植后十五、三十和四十五天的植物。(b)指示在移植后六十、七十五和九十天的植物。

图23在整个实验生长期内叶片I中基因表达的变化。

(a)OsNRT2.1表达的变化。(b)OsNAR2.1表达的变化。在移植幼苗后，在15天的间隔下从叶片I提取RNA并收集。对来自T3代的数据进行统计分析。误差条：SE(n＝3)。

图24不同时期WT和转基因植物的叶片I中OsNRT2.1与OsNAR2.1的表达比率。

呈现在pUbi:OsNRT2.1系(OE1、OE2、OE3)、pOsNAR2.1:OsNRT2.1系(O6、O7和O8)和WT的叶片I中在不同时期的OsNRT2.1与OsNAR2.1的表达比率。

图25WT和T3代转基因植物的田间实验照片。这张照片是2014年10月1日在南京拍摄的。

图26NAR和NRT2同源物的比对。

图27pOsNAR2.1:OsNRT2.1和WT形态

在(a)对照，(b)10％PEG，(c)100mM NaCl和(d)寒冷的情况下生长的pOsNAR2.1:OsNRT2.1系(O6和O7)和WT的总体形态。WT和转基因植物的水稻幼苗在IRRI溶液中生长2周，然后在不同的胁迫条件下生长9天。条＝10m

图28野生型(WT)和pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因植物在不同胁迫条件下生长的比较。

(a)鲜重和(b)根/冠比。误差条：SE(n＝4株植物)。WT与转基因系之间的显著差异由不同的字母表示(P<0.05，单向ANOVA)，其中与不同字母相关的值在统计学上彼此不同。

图29与对照的野生型(WT)相比鲜重增加的比较。

具体实施方式

现在将进一步描述本发明。在下面的段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非相反地清楚指示，否则如此定义的每个方面都可以与任何其它一个或多个方面组合。确切地说，任何指示为优选或有利的特征都可以与任何其它指示为优选或有利的特征组合。

除非另外指明，否则本发明的实践将采用在本领域技术范围内的植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术、生物信息学的常规技术。在文献中全面解释了这些技术。

如本文所用，词语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、天然存在的、突变的、合成的DNA或RNA分子，以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。它可以是单链或双链的。这类核酸或多核苷酸包括但不限于结构基因的编码序列、反义序列和不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调控序列。这些术语也涵盖基因。术语“基因”或“基因序列”广义地用于指与生物学功能相关的DNA核酸。因此，基因可以包括如基因组序列中的内含子和外显子，或者可以仅包含如cDNA中的编码序列，和/或可以包括与调控序列组合的cDNA。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且指通过肽键连接在一起的任何长度的聚合形式的氨基酸。

出于本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”意指关于例如核酸序列、表达盒、基因构建体或包含核酸序列的载体或用根据本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物体，通过重组方法产生的所有那些构建体，其中：

(a)编码可用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或

(b)与根据本发明的核酸序列可操作地连接的遗传控制序列，例如启动子，或

(c)a)和b)

不位于其天然遗传环境中或已经通过重组方法修饰，修饰可以采取例如一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入的形式。天然遗传环境被理解为意指原始植物中的天然基因组或染色体基因座或基因组文库中的存在。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选至少部分保留。所述环境至少在一侧位于核酸序列的侧翼，并具有至少50bp、优选至少500bp、尤其优选至少1000bp、最优选至少5000bp的序列长度。如上所述，当表达盒通过非天然的、合成(“人造”)方法修饰时(例如诱变处理)，天然存在的表达盒-例如核酸序列的天然启动子与编码可用于本发明方法的多肽的相应核酸序列的天然存在的组合-成为转基因表达盒。合适的方法描述在例如US 5,565,350或WO 00/15815中，两者均通过引用并入。

因此，为了本发明的目的，转基因植物应理解为意味着如上所述，本发明方法中使用的核酸不在其所述植物基因组中的天然基因座上，其中核酸可以被同源或异源表达。然而，如所提及，转基因还意味着，虽然根据本发明的不同实施例的核酸处于植物基因组中的天然位置，但序列已经相对于天然序列进行了修饰，和/或天然序列的调控序列已被修饰。优选将转基因理解为意味着根据本发明的核酸在基因组中非天然基因座处的表达，即发生核酸的同源或优选异源表达。

本发明的方面涉及重组DNA技术，并且排除仅基于通过传统育种方法产生植物的实施例。

为了本发明的目的，“突变体”植物是与天然存在的野生型(WT)植物相比已被遗传改变的植物。在一个实施例中，突变植物是相比天然存在的野生型(WT)植物已经使用诱变方法(例如本文所述的诱变方法)改变的植物。在一个实施例中，诱变方法是靶向基因组修饰或基因组编辑。在一个实施例中，植物基因组与野生型序列相比已经使用诱变方法改变。在一个实例中，与野生型植物相比，突变可用于插入NRT2.1、NRT 2.2和/或NRT2.3a基因序列以增强NRT2.1NRT 2.2和/或NRT2.3a(和/或NAR2.1)核酸的表达水平。在这个实例中，NRT2.1、NRT 2.2和/或NRT2.3a基因序列可操作地连接至内源性NAR2.1启动子。与野生型植物相比，这类植物具有如本文所述的改变的表型，例如生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量提高。因此，在这个实例中，由存在改变的植物基因组(例如，突变的内源性NAR2.1启动子序列)赋予生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量。在一个优选实施例中，使用靶向的基因组修饰特异性靶向内源性启动子序列，并且突变的NAR2.1启动子序列的存在不由植物中表达的转基因的存在赋予。

根据本发明的所有方面，包括上述方法并且包括如下所述的植物、方法和用途，术语“调控序列”在本文中可与“启动子”互换使用，并且所有术语应在广泛的上下文中指代能够实现与其连接的序列的表达的调控核酸序列。术语“调控序列”还涵盖赋予、激活或增强细胞、组织或器官中的核酸分子表达的合成融合分子或衍生物。

术语“启动子”通常指位于基因转录起点上游的核酸控制序列，其参与RNA聚合酶和其它蛋白质的结合，从而指导可操作地连接的核酸的转录。前述术语涵盖来源于经典真核生物基因组基因的转录调控序列(包括精确转录起始所需的TATA盒，有或没有CCAAT盒序列)和响应于发育和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。所述术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在这种情况下，它可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。

“植物启动子”包含介导植物细胞中编码序列区段表达的调控元件。可用于本文所述核酸构建体中的核苷酸序列上游的启动子也可以通过一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失进行修饰而不干扰启动子、开放阅读框(ORF)或3'-调控区(如终止子或远离ORF的其它3'调控区)的功能或活性。此外可能的是，启动子的活性通过修饰它们的序列而增加，或者它们被更活跃的启动子、甚至来自异源生物体的启动子完全替代。为了在植物中表达，如上所述，NRT2.1、NRT2.2和/或2.3a核酸分子优选可操作地连接或包含合适的启动子，其在正确的时间点以及所需的空间表达模式表达基因。在一个实施例中，调控序列是组织特异性启动子。组织特异性启动子是转录控制元件，其在植物发育期间的特定时间仅在特定细胞或组织中有活性。或者，启动子是硝酸盐诱导型启动子。硝酸盐诱导型启动子的实例包括NRT2.1、NRT 2.3a的启动子和硝酸盐还原酶基因(如NIA和NIR)的启动子。在一个优选实施例中，组织特异性启动子包含SEQ ID No.7或其功能变体或同源物。

为了鉴定功能等同的启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以通过例如将启动子可操作地连接到报道基因并分析报道基因在各种植物组织中的表达水平和模式来分析。合适的众所周知的报道基因是技术人员已知的并且包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子序列与所关注基因之间的功能性连接，使得启动子序列能够启动所关注基因的转录。

我们已经将OsNRT2.1基因的开放阅读框(ORF)转化进入水稻，并且由OsNAR2.1启动子驱动表达以改变水稻植株中OsNRT2.1的表达谱，并研究这种改变的体内表达谱的生物学功能。与在泛素启动子控制下表达OsNRT2.1的转基因系相比，在OsNAR2.1启动子控制下表达OsNRT2.1基因的转基因系表现出极大提高的生长、产量和生物量。我们分析了整株植物生长过程中的OsNRT2.1和OsNAR2.1表达模式，并且表明修饰OsNRT2.1与OsNAR2.1在茎中表达的比率改变了水稻生长和农业N利用效率(ANUE)。

相比之下，与野生型(WT)植物相比，表达pUbi:OsNRT2.1的转基因系使总生物量(包括产量)增加了约21％。pUbi:OsNRT2.1系的农业NUE(ANUE)下降到WT植物的83％，并且在pUbi:OsNRT2.1系中干物质转移(DMT)至谷粒下降了68％。OsNRT2.1在冠部和谷粒中的表达显示Ubi平均增加OsNRT2.1表达7.5倍。有趣的是，我们还发现OsNAR2.1在pUbi:OsNRT2.1系的所有器官中都表达得更高。

因此，在本发明的一个方面中，提供了优选在胁迫或非胁迫条件下用于提高植物的生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量的方法，所述方法包括改变植物中NRT2核酸的表达谱。在一替代方面，提供了用于改善胁迫耐受性和/或减轻胁迫对植物的影响的方法，所述方法包括改变植物中NRT2核酸的表达谱。在一个实施例中，这意味着改变植物中NRT2核酸的水平和/或改变植物中NRT2蛋白质的蛋白质水平。

在一个实施方案中，胁迫耐受性是对非生物胁迫的耐受性，优选其中非生物胁迫是寒冷、干旱和/或高盐条件。在本发明的另一个实施例中，胁迫是非生物胁迫，优选其中非生物胁迫是寒冷、干旱和/或高盐条件。

在一个实施例中，NRT2核酸选自分别如SEQ ID NO:1、3和5中所定义的NRT2.1、NRT2.2和/或NRT2.3a，或其功能同源物或变体，并编码分别如SEQ ID NO:2、4和6中所定义的NRT2.1NRT2.2和NRT2.3a蛋白质或其功能变体。

在一个实施例中，所述方法包括向植物中引入并表达包含与调控序列可操作地连接的NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a核酸序列或由其组成的核酸构建体，其中所述调控序列是硝酸盐诱导型启动子，并且其中优选所述核酸构建体的表达改变NRT2核酸的表达谱。在一个实施例中，硝酸盐诱导型启动子指导所述核酸在植物的根和秆中的表达。在另一个实施例中，硝酸盐诱导型启动子不是NRT2.1启动子。优选地，NO3-诱导型启动子是如SEQ IDNo:7中所定义的NAR2.1启动子或其功能同源物或变体。优选地，NRT 2.1、NRT 2.2或NRT2.3a核酸序列选自SEQ ID NO:1、3或5或其功能同源物或变体。在一个实施例中，NRT 2.1、NRT 2.2或NRT 2.3a核酸和调控序列来自相同的植物科、属或种。在一替代性实施例中，NRT2.1、NRT 2.2或NRT 2.3a核酸和调控序列来自不同的植物科、属或种。

在一替代性实施例中，所述方法包括向植物基因组中引入突变，其中所述突变是插入以下各项的至少一个或多个额外拷贝：

-NAR 2.1启动子序列，使得所述启动子序列与至少一种内源性NRT2.1、2.2或2.3a基因序列可操作地连接和/或；

-与NAR2.1启动子序列可操作地连接的NRT 2.1、NRT 2.2或NRT 2.3a基因序列；

其中使用靶向基因组编辑引入这种突变，并且其中优选所述突变导致NRT2核酸的改变的表达谱。

在一个优选实施例中，NRT2.1、2.2或2.3a基因序列选自SEQ ID No:1、3或5或其功能同源物或变体。在另一个优选实施例中，NAR2.1启动子序列是SEQ ID NO:7或其功能同源物或变体。

在一个实施例中，NRT核酸的表达谱与对照植物相比有所改变。在另一个实施例中，改变表达谱包含增加植物的根和秆、特别是节间和/或叶鞘中NRT核酸的水平。在另一优选实施例中，改变表达谱包含改变植物中NRT与NAR的相对表达比率。在一个实施例中，植物中NRT2.1、NRT2.2或NRT2.3a与NAR2.1的比率与对照植物中的比率相比降低。在另一个实施例中，所述比率在植物的茎或秆中有所改变。

在另一个实施例中，植物器官中的NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR2.1或NRT2.3a:NAR2.1比低于至少7:1、优选低于6:1、优选低于5:1、更优选低于4:1并且甚至更优选为3.6:1，与此相比，在对照植物中的比率为至少7:1、优选低于6:1、优选低于5:1、更优选低于4:1并且甚至更优选为3.9:1，其中所述比率低于对照植物的比率。

在另一个实施例中，植物秆中的NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1或NRT2.3a:NAR2.1比低于至少7:1、优选低于6:1、更优选低于5:1并且甚至更优选为4.7:1，与此相比，对照植物中的比率至少低于10:1、优选低于9:1、更优选低于8:1并且甚至更优选为7.2:1，其中所述比率低于对照植物的比率。

在一个实施例中，用于提高植物的生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)、胁迫耐受性和/或总N含量和/或减轻胁迫对植物的影响的方法可以进一步包括包含以下各项中的一个或多个的步骤：评估转基因植物的表型，测量NUE和/或NO3-吸收，将NUE和/或NO3-吸收与对照植物进行比较，测量总N含量，测量产量和/或将产量和/或生物量与对照植物进行比较。

在上述方法的另一个实施例中，所述方法在低N输入(例如180kg N/ha或更低)下提高生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)和/或N回收效率(NRE)。因此，在一个实施例中，所述方法在氮胁迫条件下提高生长、产量、农业氮利用效率(ANUE)、生物量和/或N回收效率(NRE)。在另一个实施例中，所述方法在正常(例如300kg/Nha)或高N输入下提高生长、产量、农业氮利用效率(ANUE)和/或N回收效率(NRE)。

根据本发明的各个方面，与对照植物相比，转基因植物中观察到的表型(例如提高的生长、产量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量)增加了约5％-50％或更多，例如增加了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。优选地，通过测量下胚轴或茎长来测量生长。在一个实施例中，使用凯氏定氮法(Kjeldahlmethod)测量总N含量。

根据本发明的各个方面使用的术语“提高”、“改善”或“增强”是可互换的。与对照植物相比，生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)和/或N回收效率(NRE)提高至少5％-50％或更多，例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

术语“产量”包括以下一个或多个非限制性特征列表：早期开花时间、生物量(营养生物量(根部和/或冠部生物量)和/或种子/谷粒生物量)、种子/谷粒产量(包括每穗粒数)穗长、结实率、种子/谷粒活力和发芽效率、种子/谷粒大小、谷粒淀粉含量、早期活力、绿色指数、生长速率增加、绿色组织延迟衰老。术语“产量”一般意味着具有经济价值的可测量产量，典型地与特定作物、面积和一段时间相关。个别植物部分根据其数量、大小和/或重量直接有助于产量。实际产量是作物一年每平方米的产量，这是通过将总产量(包括收获和评估产量)除以种植平方米来确定的。

因此，根据本发明，产量包括以下一项或多项，并且可以通过评估以下一项或多项来测量：单株种子产量增加、种子灌浆速率增加、饱满种子数量增加、收获指数增加、存活力/发芽效率增加、种子/蒴果/豆荚/谷粒的数量或尺寸增加、增加生长或增加分枝(例如具有更多分枝的花序)、生物量或谷粒灌浆增加。优选地，产量增加包含谷粒/种子/蒴果/豆荚数量增加、生物量增加、增加生长、花器官数量增加和/或花分枝增加。相对于对照植物，产量增加。例如，与对照植物相比，产量增加了2％、3％、4％、5％-50％或更多，例如增加了至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

术语“氮利用效率”或NUE可以定义为作物产量(例如谷粒产量)。或者，NUE可以定义为农业NUE，即谷粒产量/N。植物的总N利用效率包含吸收和利用效率，并可以计算为UpE。在一个实施例中，与对照植物相比，NUE增加了5％-50％或更多，例如增加了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在另一个实施例中，与对照植物相比，氮吸收增加了5％-50％或更多，例如增加了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

术语“氮回收效率”(NRE)可以定义为每单位施用氮由植物回收的N。在一个实施例中，与对照植物相比，NRE增加了5％-50％或更多，例如增加了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一个实施例中，植物的秆和/或谷粒中的总N含量增加。

在本发明的另一方面，提供了一种增加开花期干物质(DMA)、成熟期干物质(DMM)、开花期总N积累量(TNAA)、成熟期总N积累量(TNAM)、干物质转运(DMT)、开花期后N吸收(PANU)和/或N转运(NT)的方法，所述方法包括如上所定义的改变植物中NRT2核酸的表达谱。在本发明的另一方面，提供了一种减少开花期前N对谷粒N积累量贡献(CPNGN)的方法，所述方法包括如本文所述改变植物中NRT2核酸的表达谱。根据本文所述的各个方面，观察到的表型与对照植物相比增加或减少，如本文中已经定义的。在一个实施例中，与对照植物相比，观察到的表型的增加或减少为5％-90％或更多，例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。

所述方法可以进一步包含筛选具有如本文所述的NRT2核酸的表达谱改变和/或具有本文描述的任何表型(例如生长、产量、生物量和/或氮利用效率提高)的那些植物，并且选择具有所述表型(例如生长、产量、生物量和/或氮利用效率提高)的植物。在另一个实施例中，另外的步骤包括测量所述植物子代或其部分中提高的生长、产量、生物量和/或氮利用效率，并将所述表型与对照植物进行比较。在一个实施例中，子代植物用本文所述的核酸构建体稳定转化并包含可遗传地保持在植物细胞中的外源性多核苷酸。所述方法可以包括验证构建体被稳定整合的步骤。所述方法还可以包括从选择的子代植物收集种子的附加步骤。

本发明还延伸到通过如本文所述的方法，例如用于提高生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)、胁迫耐受性和/或总N含量和/或减轻胁迫对植物的影响的方法获得或可获得的植物。

在本发明的另一方面，提供了包含与调控序列可操作地连接的NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a核酸序列的核酸构建体，其中所述调控序列是NO3-诱导型启动子。在一个实施例中，NO3-诱导型启动子是如SEQ ID No:7中所定义的NAR2.1启动子或其功能同源物或变体。优选地，NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a核酸序列选自SEQ ID NO:1、3或5中的任何一个，或其功能同源物或变体。

在一个优选实施例中，提供了包含与调控序列可操作地连接的OsNRT2.1的核酸构建体，其中所述调控序列是OsNAR2.1启动子，并且其中所述核酸构建体包含SEQ ID NO:1或其功能变体或同源物或由其组成，并且编码如SEQ ID NO:2中所定义的NRT2.1蛋白质或其功能变体。在一个实施例中，NRT2核酸和调控序列来自相同的植物科、属或种。在一替代性实施例中，NRT2核酸和调控序列来自不同的植物科、属或种。

在另一方面，本发明涉及用如上所述的核酸构建体或载体转化的经分离的宿主细胞。宿主细胞可以是细菌细胞，例如根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；或经分离的植物细胞。本发明还涉及如下所述的培养基或包含培养基和经分离的宿主细胞的试剂盒。

上述核酸构建体或载体可以用于使用本领域已知的和本文描述的转化方法产生转基因植物。

因此，在另一方面，本发明涉及表达如本文所述的核酸构建体的转基因植物。

本发明还涉及表达核酸序列的遗传改变的植物，所述核酸序列包含与硝酸盐诱导型启动子可操作地连接的选自SEQ ID NO:1、3或5中任一个的序列或其功能变体或同源物。在一个实施例中，硝酸盐诱导型启动子是NAR2.1启动子。在另一个实施例中，NAR2.1启动子序列包含SEQ ID NO.7或其功能变体或同源物。所述植物的特征在于，与对照或野生型植物相比，其显示生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量提高。在另一方面，本发明涉及表达外源性核酸序列的遗传改变的植物，所述外源性核酸序列包含选自SEQ ID NO 1、3或5的序列或功能变体或同源物，其中所述外源性序列在植物的根、叶鞘、节间和/或谷粒中表达。

根据本文所述的方法，植物表达对于单株植物呈“外源性”的多核苷酸，所述多核苷酸是通过除有性杂交以外的任何方式引入植物的多核苷酸。以下描述可以实现这一点的手段的实例。在所述方法的一个实施例中，外源性核酸在转基因植物中表达，所述外源性核酸是包含NAR2.1启动子基因序列和NRT2.1、NRT2.2和/或NRT2.3a基因序列的核酸构建体，其对于所述植物不是内源性的，而是来自另一种植物物种。例如，pOsNAR2.1:OsNRT2.1构建体可以在不是水稻的另一种植物中表达。在所述方法的一个实施例中，内源性核酸构建体在转基因植物中表达。例如，pOsNAR2.1:OsNRT2.1构建体可以在水稻中表达。

在另一方面，本发明涉及用于制备具有提高的生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)、胁迫耐受性和/或总N含量和/或减轻胁迫对植物的影响的转基因植物的方法，所述方法包括在植物或植物细胞中引入并表达如本文所述的核酸构建体。在一个优选实施例中，所述方法增加了植物的谷粒产量。

在一个实施例中，与对照植物相比，观察到的表型(例如提高的生长、产量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)、胁迫耐受性和/或总N含量)增加了约5％-50％或更多，例如增加了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。优选地，通过测量下胚轴或茎长来测量生长。在一个实施例中，使用凯氏定氮法测量总N含量。

所述方法可以进一步包括从植物或植物细胞再生转基因植物，其中转基因植物在其基因组中包含与调控序列可操作地连接的选自SEQ ID NO:1、3或5的核酸序列或其功能变体或同源物，并获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代表现出生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)、胁迫耐受性和/或总N含量有所提高和/或胁迫对植物的影响得到缓解。在一个优选实施例中，调控序列是如上所定义的NAR2.1启动子。

用于产生本发明的转基因植物的转化方法是本领域已知的。因此，根据本发明的各个方面，将如本文所定义的核酸构建体引入植物中并作为转基因进行表达。通过称为转化的过程将核酸构建体引入所述植物。如本文所提及的术语“引入”或“转化”涵盖将外源性多核苷酸转移至宿主细胞中，而不考虑用于转移的方法。能够随后克隆增殖的植物组织，无论是通过器官发生还是胚胎发生，都可以用本发明的遗传构建体转化并从其中再生出整个植物。选择的特定组织将根据可用于并且最适合正在转化的特定物种的克隆繁殖系统而变化。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以被瞬时或稳定地引入宿主细胞中，并且可以保持未整合，例如作为质粒。或者，它可以整合到宿主基因组中。然后可以本领域技术人员已知的方式将所得转化的植物细胞用于再生转化的植物。

外源基因转入植物基因组称为转化。植物转化现在是许多物种的常规技术。有利地，可以使用数种转化方法中的任何一种将所关注基因引入合适的祖先细胞中。所描述的用于从植物组织或植物细胞转化和再生植物的方法可用于瞬时或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、将DNA直接注入植物、粒子枪轰击、使用病毒或花粉转化和微喷射。方法可以选自原生质体的钙/聚乙二醇方法、原生质体的电穿孔、微注入植物材料、DNA或RNA包被的粒子轰击、(非整合)病毒感染等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选通过根癌土壤杆菌介导的转化来产生。

为了选择转化的植物，将转化中获得的植物材料置于选择条件下，从而可以将转化的植物与未转化的植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并且在初始生长期后，通过喷雾进行适当的选择。另一可能性是如果合适的话灭菌后使用合适的选择剂在琼脂平板上培育种子，使得只有转化的种子才能生长成植物。或者，筛选转化的植物中是否存在可选标记。在DNA转移和再生之后，也可以使用例如Southern分析来评估推定转化的植物中是否存在所关注基因、拷贝数和/或基因组组织。替代或另外地，可以使用Northern和/或Western分析来监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员熟知的。

所产生的转化植物可以通过各种手段繁殖，例如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可以是自交的并选择纯合的第二代(或T2)转化体，然后可以通过经典育种技术进一步繁殖T2植物。所产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和未转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如转化为含有表达盒的所有细胞)；转化和未转化的组织的移植物(例如在植物中，转化的砧木嫁接到未转化的接穗)。

在另一方面，本发明涉及用于提高植物的生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)、胁迫耐受性和/或总N含量和/或减轻胁迫对植物的影响的方法，所述方法包括在植物中引入并表达如上所定义的核酸构建体。

用于提高植物的生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)、胁迫耐受性和/或总N含量和/或减轻胁迫对植物的影响的方法，所述方法包括如上所述引入并表达核酸构建体可以包括其它步骤，其包含以下一项或多项：评估转基因植物的表型，测量NUE和/或NO3-吸收，将NUE和/或NO3-吸收与对照植物进行比较，测量总N含量，测量产量和/或将产量和/或生物量与对照植物进行比较。

在另一个实施例中，本发明涉及如本文所述的核酸构建体在提高植物的生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量中的用途。

在本发明的另一方面，提供了一种增加开花期干物质(DMA)、成熟期干物质(DMM)、开花期总N积累量(TNAA)、成熟期总N积累量(TNAM)、干物质转运(DMT)、开花期后N吸收(PANU)和/或N转运(NT)的方法，所述方法包括引入并表达如本文所述的核酸构建体。在本发明的另一方面，提供了一种减少开花期前N对谷粒N积累量贡献(CPNGN)的方法，所述方法包括引入并表达如本文所述的核酸构建体。根据本文所述的各个方面，观察到的表型与对照植物相比增加或减少，如本文中已经定义的。在一个实施例中，与对照植物相比，观察到的表型的增加或减少为5％-90％或更多，例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。

在另一方面，本发明涉及具有改变的NRT2核酸表达谱和/或改变的NRT2蛋白质的蛋白质水平的遗传改变的或突变的植物，其中所述NRT2核酸或蛋白质选自NRT2.1、2.2和/或NRT2.3a，并且其中所述增加由植物基因组中的突变引起，其中所述突变通过诱变或靶向基因组编辑引入。在这个实施例中，表达谱相对于对照或野生型植物的表达谱有所改变，如本文其它地方所定义。在一个实施例中，使用靶向基因组编辑来将以下各项的至少一个或多个额外拷贝修饰(即插入)至植物基因组中：

-NAR 2.1启动子序列，使得所述启动子序列与至少一种内源性NRT2.1、NRT2.2或NRT2.3a基因序列可操作地连接和/或；

在另一个实施例中，NRT2.1、NRT2.2和/或NRT2.3a的表达水平在植物的根和/或秆中有所改变(或增加)。在另一个实施例中，突变还导致植物中NAR2.1、NRT2.2和/或NRT2.3a的表达或蛋白质水平增加。

在一个优选实施例中，NRT2.1、NRT2.2和/或NRT2.3a基因序列选自SEQ ID No:1、3或5中的任一个，或其功能同源物或变体。在另一个优选实施例中，NAR2.1启动子序列是SEQID NO:7或其功能同源物或变体。

在本发明的另一方面，提供了一种用于产生生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)、胁迫耐受性和/或总N含量提高和/或减轻胁迫对植物的影响的突变植物的方法，所述方法包括向植物基因组中插入突变，其中所述突变是向植物基因组中插入以下各项的至少一个或多个额外拷贝：

在一个优选实施例中，所述突变是通过诱变或靶向基因组编辑引入的。在另一个实施例中，突变还导致NRT2.1的表达增加。

在本发明的一替代方面，提供了一种用于提高植物的生长、产量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量的方法，所述方法包括产生突变植物，其中所述植物如上所定义地在植物基因组中携带突变。在一个优选实施例中，使用靶向基因组编辑来插入突变。

在一个实施例中，如上所定义的用于提高突变植物的生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量的方法可以包括其它步骤，包括以下各项中的一个或多个：评估突变植物的表型，测量NUE和/或NO3-吸收，将NUE和/或NO3-吸收与对照植物进行比较，测量总N含量，测量产量和/或并且将产量和/或生物量与对照植物进行比较。

在上述植物和方法的一个优选实施例中，NRT2.1、NRT2.2和/或NRT2.3a的核酸序列(即基因序列)选自SEQ ID NO:1、3或5中的任一个，并且分别编码如SEQ ID NO:2、4或6中所定义的NRT2.1、NRT2.2和/或NRT2.3a蛋白质或其SEQ ID NO:1、3或5的功能变体或同源物。在另一个实施例中，NAR2.1启动子的核酸序列是7或其功能变体或同源物。

在上述实施例中，‘内源性’核酸可以指植物基因组中的天然序列。在一个实施例中，内源性OsNRT 2.1序列包含如SEQ ID NO:1中所定义的序列，内源性OsNRT2.2序列包含如SEQ ID NO:2中所定义的序列，内源性OsNRT2.3a序列包含如SEQ ID NO:3中所定义的序列，并且内源性pOsNAR2.1序列包含如SEQ ID NO:7中所定义的序列。本发明范围内还包括以上所鉴定序列的功能变体和同源物。

靶向基因组修饰或靶向基因组编辑是基因组工程技术，其使用靶向DNA双链断裂(DSB)通过同源重组(HR)介导的重组事件来刺激基因组编辑。为了通过引入位点特异性DNADSB实现有效的基因组编辑，可以使用四种主要类型的可定制DNA结合蛋白：来源于微生物移动遗传元件的大范围核酸酶、基于真核转录因子的ZF核酸酶、来自黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌的转录激活因子样效应子(TALE)和来自II型细菌适应性免疫系统CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)的RNA引导的DNA核酸内切酶Cas9。大范围核酸酶、ZF和TALE蛋白质均通过蛋白质-DNA相互作用识别特定的DNA序列。尽管大范围核酸酶整合了核酸酶和DNA结合结构域，但ZF和TALE蛋白质分别由靶向DNA的3或1个核苷酸(nt)的单独模块组成。ZF和TALE可以按照所需的组合组装并连接到FokI的核酸酶结构域，以指导对特定基因组基因座的核酸分解活性。

在通过III型细菌分泌系统递送到宿主细胞中后，TAL效应子进入细胞核，与宿主基因启动子中的效应子特异性序列结合并激活转录。它们的靶向特异性由串联的33-35个氨基酸重复序列的中心结构域决定。随后是20个氨基酸的单个截短重复序列。所检查的大多数天然存在的TAL效应子具有12至27个完整重复序列。

这些重复序列仅在两个相邻的氨基酸(它们的重复可变二残基(RVD))上彼此不同。确定TAL效应子将识别哪个单核苷酸的RVD：一个RVD对应于一个核苷酸，其中四个最常见的RVD各自优先与四个碱基之一相关联。天然存在的识别位点均匀地位于TAL效应子活性所需的T之前。TAL效应子可以与FokI核酸酶的催化结构域融合以产生TAL效应子核酸酶(TALEN)，其在体内进行靶向DNA双链断裂(DSB)以用于基因组编辑。这项技术在基因组编辑中的使用在本领域中有充分的描述，例如在US 8,440,431、US 8,440,432和US 8,450,471中。Cermak T等人描述了一套定制的质粒，可用于金门(Golden Gate)克隆方法组装多个DNA片段。如其中所述，金门方法使用IIS型限制性核酸内切酶，其在识别位点外部切割以产生独特的4bp突出端。通过消化和连接在相同的反应混合物中加快克隆，因为正确的组装消除了酶识别位点。组装定制的TALEN或TAL效应子构建体并且涉及两个步骤：(i)将重复模块组装成1-10个重复序列的中间阵列，和(ii)将中间阵列连接到骨架以制造最终构建体。

可以根据本发明的各个方面使用的另一种基因组编辑方法是CRISPR。这项技术在基因组编辑中的使用在本领域中有充分的描述，例如在US 8,697,359和本文引用的参考文献中。简而言之，CRISPR是一种防御侵入噬菌体和质粒所涉及的微生物核酸酶系统。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相关(Cas)基因以及能够编程CRISPR介导的核酸切割的特异性的非编码RNA元件(sgRNA)的组合。已经在多种细菌宿主中鉴定了三种类型(I-III)的CRISPR系统。每个CRISPR基因座的一个关键特征是存在一系列重复序列(直接重复)，这些重复序列间杂有短的非重复序列段(间隔子)。非编码CRISPR阵列在直接重复序列内被转录并切割成含有单独间隔序列的短crRNA，其将Cas核酸酶引导至靶位点(原间隔子)。II型CRISPR是最充分表征的系统之一，并通过四个连续步骤执行靶向DNA双链断裂。首先，从CRISPR基因座转录两种非编码RNA，即pre-crRNA阵列和tracrRNA。其次，tracrRNA与pre-crRNA的重复区杂交，并介导pre-crRNA加工成含有单独间隔序列的成熟crRNA。第三，成熟的crRNA:tracrRNA复合物通过crRNA上的间隔子与原间隔子相邻基序(PAM)旁边的目标DNA上的原间隔子之间的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对将Cas9引导至目标DNA，这是目标识别的附加要求。最后，Cas9介导目标DNA的切割以在原间隔子内产生双链断裂。

因此，Cas9是II型CRISPR-Cas系统的标志性蛋白质，并且是由两种非编码RNA：CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的复合物引导至与PAM(原间隔子邻接基序)序列基序相邻的DNA目标序列的大单体DNA核酸酶。Cas9蛋白质含有与RuvC和HNH核酸酶同源的两个核酸酶结构域。HNH核酸酶结构域切割互补DNA链，而RuvC样结构域切割非互补链并因此在目标DNA中引入钝切口。Cas9与sgRNA的异源表达可将位点特异性双链断裂(DSB)引入来自各种生物体的活细胞的基因组DNA中。对于真核生物中的应用，已经使用了最初来自细菌化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的密码子优化版本的Cas9。

单指导RNA(sgRNA)是与Cas9核酸酶形成复合物的CRISPR/Cas系统的第二组分。sgRNA是通过将crRNA与tracrRNA融合而产生的合成RNA嵌合体。位于其5'末端的sgRNA指导序列赋予DNA靶特异性。因此，通过修饰指导序列，可以产生具有不同靶特异性的sgRNA。指导序列的规范长度为20bp。在植物中，使用植物RNA聚合酶III启动子(如U6和U3)表达sgRNA。

用于本发明方法中的Cas9表达质粒可以如本领域所述构建。

因此，本发明的方面涉及定向诱变方法，特别是基因组编辑，并且在一个优选实施例中排除仅基于通过传统育种方法产生植物的实施例。

如上所述，本发明人还意外地表明，在硝酸盐诱导型启动子、优选NAR2.1启动子的控制下表达NRT2核酸，优选NRT2.1、NRT2.2和/或NRT2.3a核酸不仅改变了NRT2核酸的表达谱，而且改变了植物中NRT2.1、2.2和/或2.3a:NAR2.1的表达比率。

因此，在一个方面，提供了一种改变植物中NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a与NAR2.1的表达比率的方法。在一个实施例中，所述方法包括引入并表达如本文所述的核酸构建体以改变表达比率。在一替代性实施例中，所述方法包括将突变引入植物中以产生具有改变的表达比率的遗传改变的或突变的植物，也如上所述。

在一个实施例中，植物中的NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a与NAR 2.1的比率与对照植物中的比率相比有所降低。在另一个实施例中，所述比率在植物的茎或秆中有所改变。

在另一个实施例中，植物器官中的NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1或NRT2.3a:NAR2.1比低于至少7:1、优选低于6:1、优选低于5:1、更优选低于4:1并且甚至更优选为3.6:1，与之相比，对照植物中的比率为至少7:1、优选低于6:1、优选低于5:1、更优选低于4:1并且甚至更优选为3.9:1，并且其中所述比率低于对照植物中的比率。

在另一个实施例中，植物秆中的NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR2.1和/或NRT2.3a:NAR2.1比低于至少7:1、优选低于6:1、更优选低于5:1并且甚至更优选为4.7:1，与之相比，对照植物中的比率至少低于10:1、优选低于9:1、更优选低于8:1并且甚至更优选为7.2:1，并且其中所述比率低于对照植物中的比率。

在本发明的另一方面，提供了一种转基因植物，其特征在于NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1和/或NRT2.3a:NAR2.1的表达比率与对照植物中的所述比率相比较低。再次，在一个实施例中，植物在植物的秆或茎中具有较低的比率。在另一个实施例中，表达本发明的核酸构建体的植物中NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1或NRT2.3a:NAR2.1比低于至少7:1、优选低于6:1、优选低于5:1并且甚至更优选为4.7:1，而对照植物中的比率至少低于10:1、优选低于9:1、更优选低于8:1并且甚至更优选为7.2:1，并且其中转基因植物的秆中的比率低于对照植物。

在一个实施例中，转基因植物表达如本文所述的核酸构建体。在一替代性实施例中，转基因植物表达包含与硝酸盐诱导型启动子可操作地连接的选自SEQ ID NO:1、3或5中任一个的序列或其功能变体或同源物的核酸序列。在一个实施例中，硝酸盐诱导型启动子是NAR2.1启动子。在另一个实施例中，NAR2.1启动子序列包含SEQ ID NO.7或其功能变体或同源物。

在另一方面，还提供了NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1和/或NRT2.3a:NAR2.1的表达比率与对照植物中的所述比率相比较低的遗传改变的或突变的植物，其中所述改变的比率由植物基因组中的突变引起，并且其中所述突变修饰(即插入)以下各项的至少一个或多个额外拷贝：

在一个优选实施例中，所述突变是通过诱变或靶向基因组编辑引入的。

植物定义在别处，但是在一个实施例中是水稻。

在本发明的另一方面，提供了用于检测生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量提高的植物品种的筛选方法，所述方法包括测定至少一种植物中的NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1和/或NRT2.3a:NAR2.1的表达比率，并选择具有最低比率的所述一种或多种植物。在一个优选实施例中，选择的植物通过多种手段进一步繁殖，例如上述那些手段。在另一优选实施例中，所述比率在植物的秆中测定。在一个实施例中，植物表达如本文所述的核酸构建体。在一替代性实施例中，植物是如本文所述的遗传改变的植物。

在本发明的另一方面，提供了用于改变植物的生长、产量、生物量和/或氮利用效率、N回收效率(NRE)和/或总N含量的方法，所述方法包括改变植物中的NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1和/或NRT2.3a:NAR2.1的表达比率。在一个实施例中，通过在植物中表达如本文所定义的核酸构建体来改变NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1和/或NRT2.3a:NAR2.1的表达比率。在一替代性实施例中，NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1和/或NRT2.3a:NAR2.1的表达比率通过向植物基因组中引入至少一个如上所定义的突变而改变。在一个实施例中，所述方法降低NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1和/或NRT2.3a:NAR2.1比率的表达比率。

在上述方法的一个优选实施例中，NRT2.1的核酸序列选自SEQ ID NO:1或其功能变体或同源物，NRT2.2选自SEQ ID No:3或其功能变体或同源物并且NRT2.3a选自SEQ IDNO:5或其功能变体或同源物，并分别编码SEQ ID NO:2、4和6的NRT2.1、2.2和2.3a蛋白质或其功能变体或同源物。在另一个实施例中，NAR2.1的核酸序列包含如SEQ ID NO:8中所定义的序列，并且编码如SEQ ID NO:9中所定义的NAR2.1蛋白质或SEQ ID NO:8或9的功能变体或同源物。

在最后一方面，本发明涉及一种共表达NAR2.1和NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a核酸的方法，所述方法包括在植物中引入并表达如本文所定义的构建体。在一替代性实施例中，本发明涉及一种共表达NAR2.1和NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a核酸的方法，所述方法包括将如本文所定义的突变引入植物基因组中。在所述方法的一个实施例中，NAR2.1和NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a在植物的根、叶鞘、节间和/或谷粒中共表达。在另一个实施例中，NAR2.1和NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a不在叶片中共表达。在另一个实施例中，所述植物是水稻，并且所述方法涉及OsNAR2.1和OsNRT2.1的共表达。

如本文中参照SEQ ID No:1、3、5或8中的任一个或SEQ ID NO:7所使用的术语“核酸序列的功能变体”是指保留完整非变体序列的生物学功能，例如当在转基因植物中表达时赋予提高的生物量、生长、产量和/或氮利用效率(NUE)的变体基因序列或部分基因序列。功能变体还包含具有不影响功能(例如在非保守残基中)的序列改变的所关注基因的变体。还涵盖与本文所示的野生型序列相比基本上一致的变体，即仅具有一些序列变异(例如在非保守残基中)，并且具有生物活性。

因此，如本领域技术人员将理解的那样，应理解的是，本发明的方面(包括方法和用途)不仅涵盖包含选自SEQ ID NO.1至9的序列或由其组成的核酸序列或氨基酸序列，还涵盖不影响所得蛋白质的生物学活性和功能的这些SEQ ID NO的功能变体或部分。导致在给定位点产生不影响编码多肽的功能特性的不同氨基酸的核酸序列中的改变是本领域众所周知的。例如，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(如甘氨酸)或疏水性更强的残基(如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电的残基替代另一个(例如天冬氨酸替代谷氨酸)或一个带正电的残基替代另一个(例如赖氨酸替代精氨酸)的变化也可以预期产生功能等同的产物。导致多肽分子的N端和C端部分发生改变的核苷酸改变也不会预期改变多肽的活性。所提出的各种修饰都在本领域的常规技术范围内，正如确定编码产物的生物活性的保留一样。

在一个实施例中，功能变体与非变体核酸或氨基酸序列具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的整体序列一致性。

技术人员将理解，本发明不限于使用OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a和/或OsNAR2.1启动子(pOsNAR2.1)的方面。因此，在本发明方面的一个实施例中，核酸序列编码OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a和/或pOsNAR2.1的同源物

如本文所用，术语同源物还指示来自其它植物物种的OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a或pOsNAR2.1直系同源物。OsNRT2.1、OsNRT2.2或OsNRT2.3a多肽或OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a或pOsNAR2.1核酸序列的同源物按递增的优先顺序分别与由SEQ IDNO:2、4或6表示的氨基酸或由SEQ ID NO:1、3、5、7、8、9或10所示的核酸序列具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的整体序列一致性。在一个实施例中，整体序列一致性为至少37％。在一个实施例中，整体序列一致性为至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，最优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。

OsNRT2.1或pOsNAR2.1同源物的功能变体也在本发明的范围内。

如果两个序列中核苷酸或氨基酸残基的序列分别在如下所述进行最大对应比对时相同，则称两个核酸序列或多肽为“一致的”。在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“一致的”或百分比“一致性”是指在比较窗口中进行比较和比对以获得最大对应关系时，如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有规定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的。当关于蛋白质或肽使用序列一致性的百分比时，认识到不一致的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基取代具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，因此不会改变分子的功能特性。当序列在保守取代中不同时，可以向上调整序列一致性百分比以校正取代的保守性质。进行这种调整的手段是本领域技术人员所熟知的。对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。适用于确定百分比序列一致性和序列相似性的算法的非限制性实例是BLAST和BLAST 2.0算法。

同源物的实例显示于图26和SEQ ID No 13至60中。

合适的同源物可以通过序列比较和保守结构域的鉴定来鉴定。本领域中有预测因子可用于鉴定这类序列。同源物的功能可以如本文所述鉴定，并且技术人员因此能够确认功能，例如当在植物中过表达时。

因此，本发明和本文所述的OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a和/或pOsNAR2.1核苷酸序列也可以用于从其它生物体，特别是其它植物，例如作物植物中分离相应的序列。以此方式，如PCR、杂交等的方法可用于基于它们与本文所述序列的序列同源性来鉴定这类序列。鉴定和分离同源物时，也可考虑序列拓扑和特征结构域结构。序列可以基于其与整个序列或其片段的序列一致性来分离。在杂交技术中，全部或部分已知核苷酸序列被用作探针，其选择性地与存在于来自所选植物的克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即，基因组或cDNA文库)中的其它相应核苷酸序列杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用可检测基团或任何其它可检测标记进行标记。用于制备用于杂交和构建cDNA和基因组文库的探针的方法通常是本领域已知的并且公开于Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning:A Library Manual(第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Plainview,New York)中。

这些序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”是探针与其靶序列杂交至比其它序列可检测的程度更高(例如至少2倍于背景)的预期条件。严格条件是依赖于序列的，并且在不同情况下会有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调整严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度小于约1000个核苷酸，优选小于500个核苷酸。

典型地，严格条件将是其中盐浓度小于约1.5M Na离子，典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，在pH 7.0至8.3下以及温度对于短探针(例如10至50个核苷酸)至少约30℃和对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约60℃的那些条件。杂交的持续时间通常小于约24小时，通常约4至12小时。严格条件也可以通过加入去稳定剂(如甲酰胺)来实现。

根据本发明，优选的OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a和/或pOsNAR2.1同源物选自玉米、小麦、油菜(oilseed rape)/加拿大油菜(canola)、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、芸豆、生菜、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其它芸苔属蔬菜或杨树、牧草或草坪草。

根据本发明的各个方面，胁迫优选是寒冷条件、缺水(例如干旱条件)或盐度(高盐)。在另一个实施例中，本发明的方法用于改善植物对寒冷、干旱条件或盐度的耐受性。

根据本发明的各个方面(包括本文所述的转基因植物、方法和用途)的植物可以是单子叶植物或双子叶植物。

双子叶植物可以选自以下各科，包括但不限于菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)(例如欧洲油菜(Brassica napus))、藜科(Chenopodiaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、豆科(Leguminosae)(苏木科(Caesalpiniaceae)、苏木亚科(Aesalpiniaceae)、含羞草科(Mimosaceae)、蝶形化科(Papilionaceae)或豆科(Fabaceae))、锦葵科(Malvaceae)、蔷薇科(Rosaceae)或茄科(Solanaceae)。例如，植物可以选自莴苣、向日葵、拟南芥、花椰菜、菠菜、西瓜、南瓜、卷心菜、番茄、马铃薯、山药、辣椒、烟草、棉花、秋葵、苹果、玫瑰、草莓、苜蓿、豆、大豆、芸豆、豌豆、小扁豆、花生、鹰嘴豆、杏、梨、桃、葡萄藤、灯笼椒、辣椒或柑橘物种。

单子叶植物可以例如选自槟榔科(Arecaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)或禾本科(Poaceae)。例如，植物可以是谷类作物(如玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、黑麦、小米、荞麦)或草本作物(如黑麦草属(Lolium species)或羊茅属(Festuca species))，或作物(如甘蔗、洋葱、韭菜、山药或香蕉)。

还包括生物燃料和生物能源作物，如油菜/加拿大油菜、甘蔗、甜高粱、柳枝稷(Panicum virgatum)、亚麻籽、羽扇豆和柳树、杨树、杨树杂交种、芒草或裸子植物，如火炬松。还包括青贮作物(玉米)、放牧或饲料作物(草、三叶草、红豆草、苜蓿)、纤维(例如棉花、亚麻)、建筑材料(例如松树、橡树)、制浆(例如杨树)、用于化学工业(例如高芥酸油籽油菜、亚麻籽)和用于舒适目的(例如用于高尔夫球场的草坪草)的原料、用于公共和私人花园的观赏性植物(例如金鱼草、矮牵牛、玫瑰、天竺葵、烟草属)以及用于家庭的植物和切花(非洲紫罗兰、秋海棠、菊花、天竺葵、锦紫苏吊兰、龙血树属植物、橡胶植物)。

优选地，所述植物是作物植物。作物植物是指以商业规模生长用于人类或动物消费或使用的任何植物。在一个优选实施例中，所述植物是谷类植物。

最优选的植物是玉米、水稻、小麦、油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、芸豆、莴苣、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其它芸苔属蔬菜或杨树。在一个最优选实施例中，所述植物是水稻。

如本文所用的术语“植物”涵盖整株植物、植物的祖先和子代以及植物部分，包括种子、果实、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，其中前述中的每种包含如本文所述的核酸构建体。术语“植物”还涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，其中前述中的每种也包含如本文所述的核酸构建体。

本发明还延伸到如本文所述的本发明植物的可收获部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。本发明的方面还延伸到衍生自、优选直接衍生自这种植物的可收获部分的产品，例如干燥小丸或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及包含本发明的植物或其部分的食品和食品补充剂。

根据本发明的所有方面，如本文所用的对照植物是未根据本发明的方法修饰的植物。因此，在一个实施例中，对照植物不具有NRT2核酸的改变的表达谱。在一替代性实施例中，如上所述，对照植物不表达本文所述的核酸构建体，植物也没有被遗传修饰。在一个实施例中，对照植物是野生型植物。对照植物通常属于与修饰植物相同的植物物种，优选具有与修饰植物相同的遗传背景。

虽然前述公开内容提供了涵盖在本发明的范围内的主题的一般描述，包括制造和使用本发明的方法及其最佳模式，但是提供以下实例以进一步使得本领域技术人员能够实施本发明并提供其完整的书面描述。然而，本领域技术人员将理解，这些实施例的细节不应被理解为对本发明的限制，其范围应该从本公开所附的权利要求书及其等同物中理解。鉴于本公开，本发明的各种其它方面和实施例对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

“和/或”在本文中使用时被认为是两个特定特征或组件中的每一个与或不与另一特定特征或组件的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，就像每个在本文中单独列出一样。

本文将“胁迫”描述为影响或阻碍植物新陈代谢、生长或发育的不利条件或物质。“非生物”胁迫定义为由非生存因素(例如干旱、极端温度、盐度(例如100mM NaCl))和污染物(例如重金属)引起的胁迫。胁迫对植物的影响和/或植物对胁迫的耐受性可以通过比较植物在胁迫和非胁迫条件下的生长速率和/或产量来评估。

除非上下文另有规定，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施例，并且同样适用于所描述的所有方面和实施例。

上述申请以及其中引用或在其审批期间引用的所有文献和序列登记号(“申请引用文献”)以及申请引用文献中引用或参考的所有文献，以及本文引用或参考的所有文献(“本文引用文献”)以及本文引用文献中引用或参考的所有文献，以及用于本文或通过引用并入本文的任何文献中提及的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品规格和产品说明书，在此通过引用并入本文，并且可以是用于实施本发明。更具体地说，所有参考文献通过引用并入相同程度，就好像每个单独文献被具专门和单独指示通过引用并入。

实施例

实施例1.

1.1.材料和方法

载体的构建和水稻转化

我们使用图10中列出的引物从粳稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.Japonicacv.Nipponbare)中分离的cDNA扩增了OsNRT2.1/OsNRT2.2开放阅读框(ORF)序列，其中两个基因是一致的。我们使用图11中列出的引物分别从pOsNAR2.1(1698bp):GUS(Feng等人,2011)和pUbi:OsPIN2(Chen等人,2012)构建体扩增OsNAR2.1和泛素启动子。将PCR产物克隆到pMD19-T载体(TaKaRa)中并通过限制酶消化和DNA测序确认。如图15所示构建pUbi:OsNRT2.1和pOsNAR2.1:OsNRT2.1载体。通过电穿孔将这些构建体引入根癌土壤杆菌菌株EHA105中，然后如先前所述(Tang等人,2012)将其转化至水稻中。

1.1.1.Southern印迹分析

转基因拷贝数按照先前描述的程序(Jia等人,2011)通过Southern印迹分析来确定。简言之，从野生型(WT)叶提取基因组DNA，并用HindIII和EcoRI限制酶消化。消化的DNA在1％(w/v)琼脂糖凝胶上分离，转移到Hybond-N+尼龙膜上，并与潮霉素抗性基因杂交。

1.1.2.生物量，总氮(N)测量和N利用效率(NUE)的计算

在上午9:00收获WT和转基因水稻植株并在105℃加热30分钟。然后将穗，叶和秆在75℃下干燥3天。记录干重作为生物量值。使用以15天的间隔从盆栽土壤中生长的WT和转基因系收集的样品来计算整株植物生物量值。

使用凯氏定氮法测量总N含量(Li等人,2006)。总干重(生物量)估计为所有植物部分重量的总和。总N积累量估计为所有植物部分N含量的总和。农业NUE(ANUE，g/g)计算为(谷粒产量-零N地块的谷粒产量)/N供应量；N回收效率(NRE，％)计算为(N处理地块成熟期总N积累量-零N地块成熟期总N积累量)/N供应量；生理NUE(PNUE，g/g)计算为(谷粒产量-零N地块的谷粒产量)/成熟期总N积累量；并且N收获指数(NHI，％)被计算为(成熟期谷粒N积累量/成熟时总N积累量。Ntanos等人(2002)和Zhang等人(2009)参考文献中关于计算的干物质和N转运以及转运效率方法。干物质转运(DMT，g/m2)计算为开花期干物质-(成熟期干物质-谷粒产量)；DMT效率(DMTE，％)计算为(DMT/开花期干物质)×100％；开花期前同化物对谷粒产量的贡献(CPAY，％)计算为(DMT/谷粒产量)×100％；收获指数(HI，％)计算为(谷粒产量/成熟期干物质)×100％；开花期后N吸收量(PANU，g/m2)计算为成熟期总N积累量-开花期总N积累量；N转运(NT，g/m2)计算为开花期总N积累量-(成熟期总N积累量-成熟期谷粒N积累量)；N转运效率(NTE，％)计算为(NT/开花期总N积累量)×100％；开花期前N对谷粒N积累量的贡献(CPNGN，％)计算为(NT/成熟期谷粒N积累量)×100％(图13)。

1.1.3.生长条件

T0、T2、T3和T4代植物在江苏南京的南京农业大学的地块上生长(图25)。T1代植物在海南三亚生长。江苏属亚热带季风气候带。南京农业大学地块土壤的化学性质包括有机质，11.56g/kg；总N含量，0.91g/kg；可用P含量，18.91mg/kg；可更换K，185.67mg/kg；以及pH6.5。在移植前3天对所有地块进行30kg P/ha Ca(H2PO4)2形式和60kg/K ha(KCl)的基础施用。分别在移植前、分蘖期、临抽穗期前施用占总N肥的40％、30％和40％的N肥。

1.1.4.胁迫条件

水稻‘武运粳7号’种子和转基因植物用10％(v/v)过氧化氢表面灭菌30分钟，然后用去离子水彻底冲洗。将灭菌的种子在装在塑料容器中的塑料支撑网(1mm-2的网)上发芽2周。选择均匀的幼苗，然后转移到含有8L国际水稻研究所(IRRI)营养液(1.25mM NH4NO3，0.3mM KH2PO4，0.35mM K2SO4，1mM CaCl2·2H2O，1mM MgSO4·7H2O，0.5mM Na2SiO3，20μMNaFeEDTA，20μM H3BO3，9μM MnCl2·4H2O，0.32μM CuSO4·5H2O，0.77μM ZnSO4·7H2O和0.39μM Na2MoO4·2H2O，pH 5.0)的槽中。使所有植物在具有16小时光照(30℃)/8小时黑暗(22℃)光周期的生长室中生长，并将相对湿度控制在约70％。溶液每2天更新一次。在生长两周后进行处理，然后使幼苗在不同胁迫条件下生长9天。寒冷处理是在室外生长，最高温度和最低温度分别是18℃和2℃。使用10％聚乙二醇(PEG)来模拟干旱胁迫。

1.1.5.产量收获的田间实验

除在三亚的T1外，T0-T4代幼苗在南京同一实验点种植。用10％(v:v)过氧化氢(H₂O₂)将种子代转基因系和WT表面灭菌30分钟并用去离子水彻底冲洗。将转基因种子浸泡在含有25mg/L潮霉素的水中，并将WT种子浸泡在水中。3天后，将灭菌的种子均匀地播种在潮湿的土壤中。发芽三周后，将类似的幼苗移植到田间地块。

将T1-T3植物种植在以300kg N/ha的比率以尿素形式施肥的地块和没有施用N肥的地块中。地块尺寸为2×2.5m，幼苗以10×10阵列种植。成熟时，每个地块四边的边缘植物都被去除，以避免边缘效应的影响。在余下的中心8×8阵列的植物中随机选择四个点，每个点含有四棵幼苗，共16棵幼苗，并收集样品(Ookawa等人,2010；Pan等人,2013；Khuram等人,2013；Srikanth等人,2015)。在每个地块中由这四个点确定的产量和生物量值被用于计算各系的每公顷产量和生物量，并且在实验中设计了各系的3个随机地块(图25)。

T3代植物以15天的间隔取样用于测定谷粒产量、生物量和N含量。生长速率是幼苗移植到地块后单位时间重量增加的干重。

将T4代植物种植在以0、180和300kg N/ha的比率以尿素形式施肥的地块中。为T1-T3植物设计具有3个重复的相同随机田间地块，并且使用从这四个点确定的产量和生物量值来计算每株植物的产量和生物量以及各系的ANUE。

1.1.6.表达比率分析

我们做了两个实验来解决这个比率模式。第一个实验确定了在移植到田间后每15天与水稻秆相同的组织中OsNRT2.1和OsNAR2.1的表达。我们在田间对水稻植株的秆进行采样，并将样品放入液氮中，研磨样品以提取RNA。使用TRIzol试剂(Vazyme Biotech Co.,Ltd，http://www.vazyme.com)从WT和转基因植物的各种组织制备总RNA。如先前所述(Li等人,2014)进行实时PCR。所有用于qRT-PCR的引物列于图12。首先，我们将OsNRT2.1和OsNAR2,1表达与OsActin基因进行比较以得到表达数据。然后，使用OsNAR2.1的表达数据作为X轴，并且使用与OsNAR2.1的表达相同的样品中的OsNRT2.1的表达数据作为Y轴，绘制点并制作点的连线以及计算Y和X关系的公式。斜率将是OsNRT2.1与OsNAR2.1的比率。在第二个实验中使用相同的方法来研究OsNRT2.1和OsNAR2.1在与灌浆期相同的时期在不同器官中的表达模式。

1.1.7.mRNA采样和qRT-PCR分析

为了研究植物器官中的表达模式，我们在灌浆期对种子、内稃和外稃、叶片I、叶片II、叶片III、叶鞘I、叶鞘II、叶鞘III、节间I、节间II、节间III以及新发育的根(距根尖3cm)的mRNA进行了采样(在图20中所描述)。在T3代基因表达的整个生长期追踪水稻，我们在移植后15天、30天、45天、60天、75天、90天从包括叶鞘和节间I的秆(在图22中描述)对mRNA进行了采样。

使用TRIzol试剂(Vazyme Biotech Co.,Ltd，http://www.vazyme.com)从WT和转基因植物的各种组织制备总RNA。如先前所述(Li等人,2014)进行实时PCR。所有用于qRT-PCR的引物列于图12。

1.1.8.统计分析

数据通过单向方差分析(ANOVA)的Tukey检验进行分析，除了协变量分析(ANCOVA)用于生长阶段期间的生物量和生长速率(图4ab)之外。直方图上或平均值后的不同字母表示转基因植物与WT之间在P<0.05时的统计学显著性差异(单向ANOVA)。时程结束时的星号表示它们在植物当中的统计学显著性差异，并且#表示它们在生长阶段期间P<0.05的统计学显著性差异(ANCOVA)。所有统计评估均使用IBM SPSS Statistics 20版本软件进行。(SPSS Inc.,Chicago,IL)

1.2.结果

1.2.1.产生表达pUbi:OsNRT2.1和pOsNAR2.1:OsNRT2.1构建体的转基因水稻植株和性状的田间分析

泛素启动子(pUbi)已被用作基因转移研究的各种应用中的强启动子，并且显示它在快速分裂的细胞中最有效地驱动基因表达(Cornejo等人,1993)。先前表明仅在水稻中OsNRT2.1基因的过表达不会增加NO3-吸收(Katayama等人,2009)。

使用根癌土壤杆菌介导的转化，我们将pUbi:OsNRT2.1(图15a)和pOsNAR2.1:OsNRT2.1(图15b)表达构建体引入到江苏省高产的水稻品种武运粳7号(WYJ7)。我们产生了23个显示增加的OsNRT2.1表达的系，包括12个pUbi:OsNRT2.1系和11个pOsNAR2.1:OsNRT2.1系(图16)。

我们分析了T0和T1代的转基因系的谷粒产量和生物量。相对于野生型(WT)植物，12个pUbi:OsNRT2.1系的生物量(包括谷粒产量)在T0和T1植物中分别增加了大约21.8％(图16e)和20.9％(图17a)，但谷粒产量在T0和T1植物中分别下降了大约18.4％(图16c)和16.6％(图17a)。相对于WT，11个pOsNAR2.1:OsNRT2.1系的生物量(包括谷粒产量)在T0和T1植物中分别增加了32.2％(图16f)和27.1％(图17b)的平均值，并且谷粒产量在T0和T1植物中分别增加了30.7％(图16d)和28.1％(图17b)的平均值。基于T1植物的Southern印迹分析(图18)和T0代的RNA表达数据(图16a，b)，我们选择三个独立的pUbi:OsNRT2.1T1系OE1-2、OE2-5和OE3-4(重新命名为OE1、OE2和OE3(图1a))和三个独立的pOsNAR2.1:OsNRT2.1T1系O6-4、O7-6和O8-3(重新命名为O6、O7和O8(图1b))。

在T1至T4代在田间研究了这6个系的农业性状，特别关注T3代。相对于野生型，根中OsNRT2.1的表达在OE1、OE2和OE3系中增加4至7倍，但在O6、O7和O8系中仅增加2.5至3倍。在秆中，OsNRT2.1表达在OE系中增加约6倍，在O系中增加约3倍。然而，在叶片中，与WT相比，只有OE系表现出OsNRT2.1表达增加(4至7倍)，并且在O系中没有观察到表达变化(图1c，d)。田间数据显示OE和O系都表现出增加的生长和生物量，但只有O系产生比WT更高的产量(图1e，f)。

基于田间T1-T4代植物的农业性状，包括谷粒产量在内的总地上生物量对于pUbi:OsNRT2.1系增加21％并且对于pOsNAR2.1:OsNRT2.1系增加38％，而没有谷粒产量的生物量对于pUbi:OsNRT2.1系增加190％并且对于pOsNAR2.1:OsNRT2.1系增加160％。pUbi:OsNRT2.1系的谷粒产量在连续三代中下降(图6)，但pOsNAR2.1:OsNRT2.1系的产量从T1至T3代显著增加(图6)。相对于WT，O系的产量在乐东生长的T1植物中增加了大约33％，在南京生长的T2和T3代中增加了34-42％，而OE系在所有三代中表现出产量比WT降低了大约17％(图6)。我们还分析了在低(180kg N/ha)和正常N(300kg N/ha)供应下南京的WT和T4代转基因植物的产量和生物量。在180kg N/ha的水平下，与WT相比，OE系的产量减少了17％，生物量增加了14％，而O系的产量和生物量增加了25％和27％(图19a)。在300kg N/ha的水平下，OE系的产量减少了16％，生物量增加了12％，对于O系，产量和生物量与WT相比增加了21％和22％(图19b)。

pOsNAR2.1:OsNRT2.1和pUbi:OsNRT2.1转基因植物的T3代在收获期每株植物的总分蘖数相对于WT平均增加了27.1％，其中转基因系之间无差异(图7)；然而，OE系与O系之间的每穗粒数显著不同(图7)。O系的每穗粒数分别增加了大约15％；O系的穗长增加了大约12％；并且O系中的结实率相对于WT增加了14％(图7)。O系的谷粒产量相对于WT增加了24.2％(图7)。

1.2.2.转基因系的NUE

因为pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因植物的生物量和产量增加，我们还分析了转基因植物T1-T4代的ANUE、N回收效率(NRE)、生理N利用效率(PNUE)和T3代转基因系收获期的N收获指数(NHI)性状，以确定这些植物中的N利用是否被改变，由此修改Zhang等人(2009)的参考文献的计算方法。相对于WT，O系的ANUE在乐东生长的T1植物中增加了大约33％，在南京生长的T2和T3代中增加了34-42％，而OE系在所有三代中表现出ANUE比WT降低了大约17％(图6)。在南京的T4植物中，在180kg N/ha的水平下，与WT相比，OE系的ANUE降低了22％，O系的ANUE增加了33％，在300kg N/ha的水平下，OE系的ANUE降低了17％，O系的ANUE增加了28％(图19c)。在OE系中，NRE增加至WT的大约115％；并且PNUE和NHI降低至WT值的大约71％。在O系中，ANUE增加至WT的大约128％；NRE增加至WT的大约136％；并且PNUE和NHI与WT值没有显著差异(图9)。

我们在开花期(移植后60天)和成熟期(移植后90天)对枝条组织进行采样以确定总N含量。在开花期，总N主要集中在秆中，OE和O系之间没有差异，但相对于WT增加大约27％。在叶中，O和WT系的总N含量相同，但OE系中高出大约33％。谷粒中的总N含量在所有系中都是相同的(图2a)。在成熟期，总N主要集中在谷粒中，相对于WT，N含量在OE系中降低了大约10％，在O系中增加了大约38％(图2b)。

1.2.3.转基因系中干物质和N的转运

我们通过测定开花期干物质(DMA)、成熟期干物质(DMM)、开花期总N积累量(TNAA)和成熟期总N积累量(TNAM)研究了水稻植株中的干物质和N转运。对于OE系，相对于WT，DMA、DMM、TNAA和TNAM分别增加了大约27％、21％、25％和21％。对于O系，相对于WT，DMA、SDMM、TNAA和TNAM分别增加了大约46％、38％、15％和27％(图8)。

我们还基于Ntanos等人(2002)的参考文献的计算方法，研究了干物质转运(DMT)、DMT效率(DMTE)、开花期前同化物对谷粒产量的贡献(CPAY)和收获指数(HI)。对于OE系，相对于WT，DMT、DMTE、CPAY和HI分别降低了大约68％、75％、61％和31％。对于O系，DMT增加了大约46％，而DMTE、CPAY和HI在O系和WT之间没有差异(图9)。

我们研究了开花期后的N吸收(PANU)、N转运(NT)、NT效率(NTE)和开花期前N对谷粒N积聚量的贡献(CPNGN)，由此修改Ntanos等人(2002)和Zhang等人(2009)中参考文献的计算方法。PANU和CPNGN在OE系和WT之间没有差异，但是NT和NTE在OE系中相对于WT分别降低了大约16％和32％。NTE在O系和WT之间没有差异，而PANU和NT分别增加了大约87％和18％，并且CPNGN在O系中相对于WT降低了大约16％(图9)。

1.2.4.OsNRT2.1和OsNAR2.1在WT和转基因系的不同器官中的表达模式

先前显示水稻具有由OsNRT2.1和OsNAR2.1组成的双组分的NO3-吸收系统，与拟南芥系统相似(Feng等人,2011；Yan等人,2011；Liu等人,2014)。我们分析了灌浆期的WT和转基因系中OsNRT2.1和OsNAR2.1的表达模式。图20和方法中描述了关于RNA样品的细节。WT中的OsNRT2.1表达模式表明，OsNRT2.1基因在根中表达最多，其次在叶鞘中，第三在叶片和节间中，而在包括种子、内稃和外稃的谷粒中最少(图14，图3a)。对于OsNAR2.1，它在根中也表达最多，其次在叶鞘中，第三在节间中，而在谷粒和叶片中最少(图14，图3b)。OsNRT2.1和OsNAR2.1的共表达模式发生在根、叶鞘、节间和谷粒中，但不在叶片中(图14，图21)。

与WT相比，OsNRT2.1的表达在包括根的OE系的所有器官中平均增加了约7.5倍。OE系中OsNRT2.1的增加模式表现出与WT中OsNRT2.1的天然表达相似的趋势，其中在根中最多，其次在叶鞘中，第三在叶片和节间中，而在谷粒中最少(图14，图3a)。非常有趣的是，我们在OE系中发现OsNAR2.1也增加，其中首先在根中表达量最高，其次在叶鞘中，第三在节间中，第四在叶片中而在谷粒中最少(图14，图3b)。OsNRT2.1和OsNAR2.1的共表达增加模式发生在OE系的所有器官中(图14，图21)。

与WT相比，OsNRT2.1表达在O系的谷粒和叶片中没有变化，而在叶鞘、节间和根中显著增加，与WT的模式相同，在根中最多，其次在叶鞘中，第三在节间中，第四在叶片中，而在谷粒中最少(图14，图3a)。对于O系中的OsNAR2.1表达，其在谷粒和叶片中也没有增加，但在叶鞘、节间和根中显著增加，与WT的模式相同，在根中最多，其次在叶鞘中，第三在节间中，而在谷粒和叶片中最少(图14，图3b)。OsNRT2.1和OsNAR2.1的共表达增加模式发生在O系的叶鞘、节间和根中(图14，图21)。

1.2.5.OsNRT2.1和OsNAR2.1在WT和转基因系的不同生长阶段的表达模式

在这项研究中，我们发现在所有转基因植物中，包括叶鞘和节间的秆(图22)中的OsNRT2.1和OsNAR2.1mRNA水平显著高于WT植物(图4a，b)。OsNRT2.1表达在OE系中比在WT中高3-20倍，但在O系中仅比WT中高31-45％(图4a)。OsNAR2.1表达在OE系中比在WT中高2至9倍，在O系中高出1至8倍(图4b)。在整个实验生长期，OE系的秆中OsNRT2.1的表达显著高于O系，但在OE和O转基因系之间没有观察到OsNAR2.1表达的显著差异。

在整个实验生长期，在O系和WT植物的叶片I之间没有发现OsNRT2.1和OsNAR2.1表达的显著差异，但是OE植物中OsNRT2.1和OsNAR2.1的表达水平相对于WT显著上调(图23)。

1.2.6.转基因系的生长速率

N运输和水稻生物量的生长密切相关，并且先前表明OsNRT2.1过表达影响水稻生长(Katayama等人,2009)。在这项研究中，OE和O系在移植后45天开始显示出比WT植物显著更高的生物量，并且在90天时积累了更多21％和38％的生物量(图4c)。OE和O系的生长速率在60天达到峰值，并且高于WT植物(图4d)。OE和O系的生长速率分别比WT高大约25％和58％。在灌浆期75天后，转基因和WT植物的生长速率是相同的(图4d)。

1.2.7.OsNRT2.1和OsNAR2.1在WT和转基因植物中的共表达

OsNRT2.1和OsNAR2.1在不同器官中的表达模式表明这两个基因在水稻植株中存在强烈的共表达模式(图21)。与O和WT系相比，OE系中OsNRT2.1和OsNAR2.1的共表达模式改变极大(图21)。OE器官中OsNRT2.1与OsNAR2.1 5.4:1的表达比率在O系中为3.6:1，而在WT器官中为3.9:1(图21)。此外，我们还特别研究了根中OsNRT2.1与OsNAR2.1的表达比率，在OE系中为6.3:1，O系中为4.1:1，WT植物中为4.2:1，O系与WT植物之间没有显著差异(图14)。

秆对于水稻秧苗的N储存和转运非常重要。在水稻秧苗中，OsNRT2.1和OsNAR2.1的表达在秆的叶鞘中表达最多(图3)。我们的表达数据也证实OsNRT2.1和OsNAR2.1在秆中的表达可能在NO3-再活化中起关键作用。为了进一步研究OsNRT2.1和OsNAR2.1表达与水稻生长之间的可能关系，我们比较了OsNRT2.1和OsNAR2.1在水稻植株中的表达比率。表达比率在OE系中为约11.3:1，在O系中为约4.7:1，而在WT植物中为约7.2:1(图5)。我们还研究了叶片I中OsNRT2.1与OsNAR2.1的表达比率。表达比率在OE系中为7.3:1，在O系中为4:1，在WT植物中为5.2:1，在O系和WT植物之间没有显著差异(图24)。OsNRT2.1与OsNAR2.1的表达比率与谷粒产量相关。

1.2.8.pOsNAR2.1:OsNRT2.1系对胁迫的反应

评估了不同胁迫条件对WT和转基因植物(2个pOsNAR2.1:OsNRT2.1细胞系，O6和O7)的水稻幼苗生长的影响(图27)。如通过鲜重测定，O6和O7幼苗生长显着高于WT幼苗(图28A，29)。O6和O7的高盐(100mM NaCl)条件和O6的寒冷条件都保持了这种效应。

根系在植物生长和抗胁迫性方面起着重要的作用，根/冠比反映了植物的根和冠生物量积累关系。在对照条件下，相对于对照植物，转基因植物具有显著更大的根系统(图28B)。这种效应在胁迫条件下得以保持(图28B)，表明与对照植物相比，转基因植物在胁迫和非胁迫条件下都会产生更好的作物产量。

1.3.讨论

N营养影响从代谢到资源分配、生长和发育的所有植物功能水平(Crawford,1995；Scheible等人,1997；Stitt,1999；Scheible等人,2004)。作为植物可用N营养的一种形式，NO3-通过主动运输过程被吸收到根中，并储存在水稻秧苗的液泡中(Fan等人,2007；Li等人,2008)。在水稻中，OsNAR2.1作为OsNRT2.1的伴侣蛋白在NO3-的吸收和运输中起作用(Yan等人,2011；Tang等人,2012；Liu等人,2014)。已显示OsNAR2.1基因表达通过NO3-上调，并通过NH4+下调(Zhuo等人,1999；Nazoa等人,2003；Feng等人,2011)。

Rooke等人(2000)报道，玉米Ubi-1启动子在年轻代谢活跃组织和花粉粒中具有强活性。此外，Cornejo等人(1993)进行了Ubi-GUS活性的组织化学定位，并显示Ubi启动子在快速分裂的细胞中最具活性；然而，Chen等人(2012)报道，Ubi启动子驱动所有组织中强烈的OsPIN2表达。Chen等人(2015)报道，由OsHAK16基因的启动子驱动的WOX11基因的异位表达，所述基因编码由低K水平诱导的钾(K)转运蛋白，在水稻中导致广泛的根系、不定根和增加的分蘖数。相反，由Ubi启动子驱动的WOX11过表达诱导水稻中的异位冠根，并且未能在田间呈现任何类似的超生长表型(Zhao等人,2009)，如Chen等人(2015)所述。这些结果表明，使用特定的诱导型启动子驱动基因功能可能是植物育种的好策略。

在这项研究中，OsNRT2.1表达在pUbi:OsNRT2.1转基因植物的地上和地下部分相对于WT显著上调(图1c)，而pOsNAR2.1:OsNRT2.1转基因植物中的OsNRT2.1表达仅在根和秆中显著增加，而在叶中没有显著增强(图1d)。先前已经报道了基于GUS融合体数据的OsNAR2.1启动子在水稻根和秆中特异性诱导表达(Feng等人,2012)；因此，我们研究了组织特异性诱导OsNRT2.1在根和秆中表达对植物生长和NUE的影响。

1.3.1.pOsNAR2.1:OsNRT2.1表达对转基因水稻NUE的影响

在不同的N管理策略下，不同品种间生殖期的N重新分配差异显著(Souza等人,1998)。Mae和Ohira(1981)报道，在灌浆过程中，大部分N从营养器官重新分配到穗，其中64％来自叶片，36％来自秆。WT、pUbi:OsNRT2.1和pOsNAR2.1:OsNRT2.1植物的NTE值平均为49.5％、33.4％和50.3％，表明pUbi:OsNRT2.1转基因植物中从枝条转移到谷粒中的N转移相比WT或pOsNAR2.1:OsNRT2.1植物显著较少(图9)。与WT和pOsNAR2.1:OsNRT2.1植物相比，在pUbi:OsNRT2.1植物灌浆过程中，从营养器官到谷粒的这种N转移水平较低影响穗形成和最终谷粒产量(图6)。WT、pUbi:OsNRT2.1和pOsNAR2.1:OsNRT2.1植物的DMTE值平均为22.1％、5.5％和22.1％(图9)，表明pUbi:OsNRT2.1系中显著较少的干物质转入谷粒产量。这些数据证实，从开花到收获期过渡期间N和生物量的转运影响了水稻的最终产量和NUE(Zhang等人,2009)，并且还表明Ubi启动子降低了N和生物量转运，而OsNAR2.1启动子没有。

在两种类型的OsNRT2.1过表达系中，NT在繁殖期降低，NUE在开花前降低。WT、pUbi:OsNRT2.1和pOsNAR2.1:OsNRT2.1植物的CPAY平均值分别为28.5％、11％和34.9％。pOsNAR2.1:OsNRT2.1植物的CPAY高于WT植物，而WT植物的CPAY高于pUbi:OsNRT2.1植物(图9)。pUbi:OsNRT2.1植物的HI比WT或pOsNAR2.1:OsNRT2.1植物低得多(图9)，表明Ubi启动子在开花期之前影响NO3-吸收和N利用，OsNRT2.1在水稻中的过表达水平过度在营养或生殖期无益于N利用。

1.3.2.OsNRT2.1和OsNAR2.1的共表达模式是控制水稻N转运的重要因子

如何评估NO3-转运蛋白表达对水稻NUE的影响是水稻育种的关键问题。NO3-转运蛋白OsNRT1.1B被证明将水稻的NUE提高大约30％(Hu等人,2015)，而我们的数据表明，NO3-转运蛋白的高表达水平与水稻的较高产量和NUE无关(表1和4，以及图4)。在确定OsNRT2.1及其配偶体基因OsNAR2.1的表达水平之后，我们计算了这些基因在水稻植株中的共表达比率。

OsNRT2.1和OsNAR2.1的共表达模式发生在WT和转基因植物中(图3，图4和图14)。然而，与O和WT系相比，OE系中OsNRT2.1和OsNAR2.1的共表达模式发生了改变(图21)，这表明不同的启动子驱动OsNRT2.1具有与OsNAR2.1不同的共表达模式。但仍不清楚为何增加OsNRT2.1的表达会诱导OsNAR2.1的表达，以及OsNRT2.1和OsNAR2.1在基因调控中的共表达模式背后存在着什么机制。

然而，OsNRT2.1与OsNAR2.1表达比率的变化可能是解释野生型和转基因系中水稻生长和氮利用差异的线索。与WT和pOsNAR2.1:OsNRT2.1系相比，pUbi:OsNRT2.1系的不同器官中OsNRT2.1与OsNAR2.1表达比率的变化显著增加(图21)。另外在生长阶段期间，与WT和pOsNAR2.1:OsNRT2.1系相比，在pUbi:OsNRT2.1系中，秆(包括节间和叶鞘)中OsNRT2.1与OsNAR2.1的表达比率增加(图5)。这些数据表明，在pUbi:OsNRT2.1植物中OsNRT2.1与OsNAR2.1之间的相互作用与WT和pOsNAR2.1:OsNRT2.1系中的相互作用不同。此外，在秆中，pOsNAR2.1:OsNRT2.1系显示这两个基因的表达比率较低，其中更多OsNAR2.1蛋白可用于与OsNRT2.1蛋白相互作用。因此，水稻植株中OsNRT2.1功能的效率应该在两种类型的转基因植物之间有所不同，从而导致不同的水稻产量和NUE表型。另一方面，OsNRT2.1和OsNAR2.1在pUbi:OsNRT2.1的所有器官中的高表达可能导致植物的其它缺点，例如mRNA合成的成本高。或者，这种高表达水平可能干扰叶片中的氮运输。所有可能性仍有待进一步分析证实。

在这项研究中，我们表明水稻产量和NUE可以通过增加OsNRT2.1表达来提高，特别是与其编码高亲和力NO3-转运蛋白的配偶体基因OsNAR2.1的较低表达比率组合时。

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序列信息

水稻(ORYZA SATIVA)

SEQ ID NO:1:OsNRT2.1AB008519mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:2:OsNRT2.1翻译

SEQ ID NO:3:OSNRT2.2AK109733 MRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:4:OsNRT2.2翻译

SEQ ID NO:5:OsNRT2.3a AK109776 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:6:OsNRT2.3a翻译

SEQ ID NO:7:OSNAR2.1启动子

SEQ ID NO:8:OSNAR2.1AP004023.2 MRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:9:OsNAR2.1翻译

SEQ ID NO:10:OsNAR2.2AK109571 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:11:SEQ ID NO 11:OsNAR2.2翻译

SEQ ID NO:12:SEQ ID NO 12:OsNAR2.2启动子

拟南芥(ARABIDOPSIS THALIANA)

SEQ ID NO:13:AtNAR2.1 AJ311926.1 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:14:AtNAR2.2AJ310933.1 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:15:ATNRT2.1NM_100684.2 MRNA，，完整编码序列

SEQ ID NO:16:ATNRT2.2NM_100685.1 MRNA，，完整编码序列

SEQ ID NO:17:AtNRT2.3NM_125471.1 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:18:AtNRT2.4 At5g60770 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:19:AtNAR2.1翻译

SEQ ID NO:20:AtNAR2.2翻译

SEQ ID NO:21:AtNRT2.1翻译

SEQ ID NO:22:AtNRT2.2翻译

SEQ ID NO:23:AtNRT2.3翻译

SEQ ID NO:24:AtNRT2.4翻译

SEQ ID NO:25:AtNAR2.1启动子

SEQ ID NO:26:AtNAR2.2启动子

大麦(HORDEUM VULGARE)

SEQ ID NO:27:HvNAR2.1 AY253448.1 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:28:HvNAR2.2 AY253449.1 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:29:HvNAR2.3 AY253450.1 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:30:HVNRT2.1 U34198.1 MRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:31:HVNRT2.2(HVBCH2)U34290.1 MRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:32:HVNRT2.3(HVBCH3)AF091115.1 MRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:33:HVNRT2.4(HVBCH4)AF091116.1 MRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:34:HvNAR2.1翻译

SEQ ID NO:35:HvNAR2.2翻译

SEQ ID NO:36:HvNAR2.3翻译

SEQ ID NO:37:HvNRT2.1翻译

SEQ ID NO:38:HvNRT2.2(HvBCH2)翻译

SEQ ID NO:39:HvNRT2.3(HvBCH3)翻译

SEQ ID NO:40:HvNRT2.4(HvBCH4)翻译

玉米(ZEA MAYS)

SEQ ID NO:41:ZmNAR2.1 AY968678.1 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:42:ZmNAR2.2 AY968679.1 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:43:ZmNRT2.1 AY129953.1 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:44:ZmNRT2.2 AY559405.1 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:45:ZmNAR2.1翻译

SEQ ID NO:46:ZmNAR2.2翻译

SEQ ID NO:47:ZmNRT2.1翻译

SEQ ID NO:48:ZmNRT2.2翻译

SEQ ID NO:49:ZmNAR2.1启动子

SEQ ID NO:50:ZmNAR2.2启动子

普通小麦(TRITICUM AESTIVUM)

SEQ ID NO:51:TaNAR2.1 AY763794.1 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:52:TaNAR2.2 AY763795.1 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:53:TaNRT2 AF288688 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:54:TaNAR2.1翻译

SEQ ID NO:55:TaNAR2.2翻译

SEQ ID NO:56:TaNRT2翻译

莱茵衣藻(CHLAMYDOMONAS REINHARDTII)

SEQ ID NO:57:CrNRT2.3 AJ223296.2 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:58:CrNRT2.3翻译

大豆(GLYCINE MAX)

SEQ ID NO:59:GmNRT2 AF047718.1 mRNA，完整编码序列

SEQ ID NO:60:GmNRT2翻译

Claims

1.用于提高植物的生长、产量、生物量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)、胁迫耐受性和/或总N含量和/或减轻胁迫对植物的影响的方法，所述方法包括改变植物中NRT2核酸的表达谱，其中优选地，所述NRT2核酸包含选自分别如SEQ ID NO:1、3和5中所定义的NRT2.1、NRT2.2和/或NRT2.3a或其功能同源物或变体的序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括向植物中引入并表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与硝酸盐诱导型启动子可操作地连接的NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT2.3a核酸序列，其中优选地，所述硝酸盐诱导型启动子是包含如SEQ ID No:7中所定义的序列或其功能同源物或变体的NAR2.1启动子。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a核酸包含选自SEQ ID NO:1、3和/或5或其功能同源物或变体的序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括向所述植物的基因组中引入突变，其中所述突变是插入至少一个或多个额外拷贝的以下各项：

-NRT2.1、NRT 2.2和/或NRT2.3a基因序列，使得至少一种序列与内源性硝酸盐诱导型启动子、优选内源性NAR2.1启动子序列可操作地连接；

其中使用靶向基因组编辑引入所述突变。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述NRT2.1基因序列包含SEQ ID NO:1，所述NRT2.2序列包含SEQ ID NO:3，并且所述NRT2.3a序列包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO 1、3或5中任一个的其功能同源物或变体，并且其中优选地，所述序列编码如SEQ ID NO:2中所定义的NRT2.1蛋白或其功能同源物或变体、如SEQ ID NO:4中所定义的NRT2.2蛋白或其功能变体或同源物以及如SEQ ID NO:6中所定义的NRT 2.3a蛋白或其功能同源物或变体。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述NAR2.1启动子序列是SEQ ID NO:7或其功能同源物或变体。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中NRT2核酸的表达谱与对照植物相比被改变。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中改变所述表达谱包括改变植物中NRT2与NAR的相对表达比率，优选地，其中所述比率与对照植物中的比率相比是降低的。

9.根据权利要求8所述的方法，其中植物秆中的NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1和/或NRT2.3a:NAR2.1比率低于至少7:1、优选低于6:1、更优选低于5:1并且甚至更优选为4.7:1，与此相比，对照植物中的比率至少低于10:1、优选低于9:1、更优选低于8:1并且甚至更优选为7.2:1，其中所述比率低于对照植物中的比率。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物选自水稻、玉米、小麦、油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、芸豆、生菜、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其它芸苔属蔬菜或杨树、牧草或草坪草。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胁迫耐受性是对非生物胁迫的耐受性，优选其中所述非生物胁迫是干旱、寒冷和/或高盐条件。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胁迫是非生物胁迫，优选其中所述非生物胁迫是寒冷和/或高盐条件。

13.通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得或可通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的植物。

14.核酸构建体，其包含与调控序列可操作地连接的如SEQ ID No:1、3或5中任一项所定义的核酸序列、其功能变体或同源物，其中所述调控序列是硝酸盐诱导型启动子，并且其中优选地，所述硝酸盐诱导型启动子是包含如SEQ ID No:7中所定义的序列或其功能同源物或变体的NAR2.1启动子。

15.包含根据权利要求14所述的核酸构建体的载体。

16.包含根据权利要求14所述的核酸构建体的宿主细胞。

17.根据权利要求16所述的宿主细胞，其中所述细胞是细菌或植物细胞。

18.表达根据权利要求14所述的核酸构建体的转基因植物。

19.根据权利要求16所述的转基因植物，其中所述植物选自水稻、玉米、小麦、油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、芸豆、生菜、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其它芸苔属蔬菜或杨树、牧草或草坪草。

20.转基因植物，其表达包含与硝酸盐诱导型启动子可操作地连接的如SEQ ID No 1、3或5中任一项所定义的序列或其功能变体或同源物的核酸序列，其中所述硝酸盐诱导型启动子包含如SEQ ID NO:7中所定义的核酸序列或其同源物或变体。

21.根据权利要求20所述的转基因植物，其中所述转基因植物选自水稻、玉米、小麦、油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、芸豆、生菜、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其它芸苔属蔬菜或杨树、牧草或草坪草。

22.用于制备具有提高的生长、生物量、产量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)、胁迫耐受性和/或总N含量或减轻胁迫对植物的影响的转基因植物的方法，所述方法包括在植物或植物细胞中引入并表达权利要求14所述的核酸构建体。

23.用于制备在胁迫条件下具有提高的产量的转基因植物的方法，所述方法包括在植物或植物细胞中引入并表达权利要求14所述的核酸构建体。

24.权利要求14所述的核酸构建体在提高植物的植物的生长、生物量、产量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)和/或总N含量中的用途。

25.根据权利要求22或23所述的方法或根据权利要求22所述的用途，其中所述植物选自水稻、玉米、小麦、油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、芸豆、生菜、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其它芸苔属蔬菜或杨树、牧草或草坪草。

26.通过根据权利要求22或23所述的方法获得或可通过根据权利要求22或23所述的方法获得的植物。

27.产生具有提高的植物的生长、生物量、产量、农业氮利用效率(ANUE)、N回收效率(NRE)、提高的胁迫耐受性和/或总N含量或减轻胁迫对植物的影响的突变植物的方法，所述方法包括向所述植物的基因组中引入突变，其中所述突变通过诱变或靶向基因组编辑引入，并且其中所述突变引入至少一个或多个额外拷贝的以下各项：

-NRT2.1、2.2或2.3a基因序列，使得至少一种序列与内源性硝酸盐诱导型启动子、优选内源性NAR2.1启动子序列可操作地连接；

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述NRT2.1基因序列包含SEQ ID NO:1或其功能同源物或变体，所述NRT 2.2序列包含SEQ ID NO:3或其功能同源物或变体，并且所述NRT2.3a序列包含SEQ ID NO:5或其功能同源物或变体，并且其中优选地，所述序列编码如SEQ ID NO:2中所定义的NRT2.1蛋白或其功能同源物或变体、如SEQ ID NO:4中所定义的NRT2.2蛋白或其功能变体或同源物以及如SEQ ID NO:6中所定义的NRT 2.3a蛋白或其功能同源物或变体。

29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述NAR2.1启动子序列是SEQ ID NO:7或其功能同源物或变体。

30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中使用ZFNs、TALENs或CRISPR/Cas9引入所述突变。

31.通过根据权利要求27至30中任一项所述的方法获得或可通过根据权利要求27至30中任一项所述的方法获得的植物。

32.遗传改变的植物，其中所述植物在其基因组中携带突变，并且其中所述突变向所述植物的基因组中引入一个或多个额外拷贝的以下各项：

33.根据权利要求32所述的遗传改变的植物，其中使用诱变或靶向基因组编辑引入所述突变。

34.根据权利要求32或33所述的遗传改变的植物，其中所述突变使用ZFNs、TALENs或CRISPR/Cas9引入。

35.根据权利要求32至34中任一项所述的遗传改变的植物，其中所述NRT2.1基因序列包含SEQ ID NO:1或其功能同源物或变体，所述NRT 2.2序列包含SEQ ID NO:3或其功能同源物或变体，并且所述NRT2.3a序列包含SEQ ID NO:5或其功能同源物或变体，并且其中优选地，所述序列编码如SEQ ID NO:2中所定义的NRT2.1蛋白或其功能同源物或变体、如SEQID NO:4中所定义的NRT2.2蛋白或其功能变体或同源物以及如SEQ ID NO:6中所定义的NRT2.3a蛋白或其功能同源物或变体。

36.根据权利要求32至34中任一项所述的遗传改变的植物，其中所述NRT 2.1a启动子序列包含如SEQ ID NO:7中所定义的序列或其功能同源物或变体。

37.改变植物中NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a与NAR2.1的表达比率的方法，所述方法包括在所述植物中表达权利要求14的核酸构建体。

38.改变植物中NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT 2.3a与NAR2.1的表达比率的方法，所述方法包括在植物的基因组中引入至少一个突变，其中所述突变引入一个或多个额外拷贝的以下各项：

-NRT 2.1、NRT 2.2或NRT 2.3a基因序列，使得至少一种序列与内源性硝酸盐诱导型启动子、优选内源性NAR2.1启动子序列可操作地连接；

-NAR 2.1启动子序列，使得所述启动子序列与至少一种内源性NRT 2.1、NRT 2.2或NRT2.3a基因序列可操作地连接；和/或

-NRT 2.1、NRT 2.2或NRT 2.3a基因序列和NAR 2.1启动子序列；

并且其中使用诱变或靶向基因组编辑引入所述突变。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述NRT2.1基因序列包含SEQ ID NO:1或其功能同源物或变体，所述NRT 2.2序列包含SEQ ID NO:3或其功能同源物或变体，并且所述NRT2.3a序列包含SEQ ID NO:5或其功能同源物或变体，并且其中优选地，所述序列编码如SEQ ID NO:2中所定义的NRT2.1蛋白或其功能同源物或变体、如SEQ ID NO:4中所定义的NRT2.2蛋白或其功能变体或同源物以及如SEQ ID NO:6中所定义的NRT 2.3a蛋白或其功能同源物或变体。

40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述NRT 2.1a启动子序列包含如SEQ IDNO:7中所定义的序列或其功能同源物或变体。

41.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其中植物中NRT 2.1、NRT 2.2和/或NRT2.3a与NAR2.1与NAR2.1的表达比率与对照植物中的所述比率相比是降低的。

42.根据权利要求37至41中任一项所述的方法，其中所述表达水平在所述植物的秆中被改变。

43.根据权利要求37至42中任一项所述的方法，其中植物秆中的NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1和/或NRT2.3a:NAR2.1比率低于至少7:1、优选低于6:1、更优选低于5:1并且甚至更优选为4.7:1，与此相比，对照植物中的比率至少低于10:1、优选低于9:1、更优选低于8:1并且甚至更优选为7.2:1，并且其中所述比率低于对照植物中的比率。

44.根据权利要求37至43中任一项所述的方法，其中所述植物选自水稻、玉米、小麦、油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、芸豆、生菜、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其它芸苔属蔬菜或杨树、牧草或草坪草。

45.遗传改变的植物，其特征在于，表达比率NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1和/或NRT2.3a:NAR2.1比率低于对照植物中的所述比率。

46.根据权利要求45所述的遗传改变的植物，其中植物秆中的NRT2.1:NAR2.1、NRT2.2:NAR 2.1和/或NRT2.3a:NAR2.1比率低于至少7:1、优选低于6:1、更优选低于5:1并且甚至更优选为4.7:1，与此相比，对照植物中的比率至少低于10:1、优选低于9:1、更优选低于8:1并且甚至更优选为7.2:1，并且其中所述比率低于对照植物中的比率。

47.根据权利要求45或46所述的遗传改变的植物，其中所述植物在所述植物的秆或茎中具有较低的比率。

48.根据权利要求45至47中任一项所述的遗传改变的植物，其中所述植物表达权利要求14所述的核酸构建体或表达与硝酸盐诱导型启动子可操作地连接的包含如SEQ ID No:1、3或5中任一项所定义的序列或其功能变体或同源物的核酸序列，其中所述硝酸盐诱导型启动子包含如SEQ ID NO:7中所定义的核酸序列或其同源物或变体。

49.根据权利要求45至47中任一项所述的遗传改变的植物，其中所述较低的比率由所述植物基因组中的突变导致，并且其中所述突变向所述植物基因组中插入至少一个或多个额外拷贝的以下各项：

-NAR 2.1启动子序列，使得所述启动子序列与至少一种内源性NRT2.1、2.2或2.3a基因序列可操作地连接；和/或；

其中通过诱变或靶向基因组编辑引入所述突变。

50.根据权利要求49所述的遗传改变的植物，其中所述NRT2.1基因序列包含SEQ IDNO:1或其功能同源物或变体，所述NRT 2.2序列包含SEQ ID NO:3或其功能同源物或变体，并且所述NRT2.3a序列包含SEQ ID NO:5或其功能同源物或变体，并且其中优选地，所述序列编码如SEQ ID NO:2中所定义的NRT2.1蛋白或其功能同源物或变体、如SEQ ID NO:4中所定义的NRT2.2蛋白或其功能变体或同源物以及如SEQ ID NO:6中所定义的NRT 2.3a蛋白或其功能同源物或变体。

51.根据权利要求45至50中任一项所述的遗传改变的植物，其中所述植物选自水稻、玉米、小麦、油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、芸豆、生菜、棉花、甘蔗、甜菜、花椰菜或其它芸苔属蔬菜或杨树、牧草或草坪草。

52.根据权利要求51所述的遗传改变的植物，其中所述植物是水稻。