CN101392257A - 水稻硝酸盐运输蛋白基因组OsNRT2.3的基因工程应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻硝酸盐运输蛋白基因组OsNRT2.3的基因工程应用，属于基因工程领域。水稻硝酸盐运输蛋白基因组OsNRT2.3的核苷酸序列SEQ ID NO.1及其表达的OsNRT2.3a蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.2和OsNRT2.3b蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.3。本发明基因为水稻中的首次报道，参与水稻硝酸盐的运输尤其在缺氮和环境pH恶劣的情况下，mRNA表达分析表明OsNRT2.3a受低硝态氮的诱导，只在侧根中表达；OsNRT2.3b在根系与地上部分都有表达，负责硝酸盐的转运。在蛙卵异源体系中表达OsNRT2.3a和OsNRT2.3b蛋白，确定它们为高亲和硝酸盐运输蛋白，并发现这两个蛋白存在一个pH调控位点，受pH调控。在低氮条件下OsNRT2.3转基因植株表现能更有效运输硝酸盐，提高氮素利用效率和最终产量。

Description

水稻硝酸盐运输蛋白基因组OsNRT2.3的基因工程应用

技术领域

本发明公开了水稻硝酸盐运输蛋白基因组OsNRT2.3的基因工程应用，属于基因工程技术领域，具体地讲涉及水稻中编码硝酸盐吸收及其调控的基因应用。

背景技术

氮素是作物重要的大量营养元素之一，参与生物体各种代谢过程。它是植物体中很多生命物质的组成成分，比如：氨基酸、蛋白质、核酸、酶、叶绿素等。氮分别占植物体干重的1.5—2％和植物总蛋白的16％(Frink CR.，Waggoner PE.and Ausubel JH.Nitrogen fertilizer：retrospect and prospect.Proc.Natl Acad.Sci.USA.1999.96：1175-1180.)。目前，中国氮肥用量占全球氮肥用量的30％(彭少兵，黄见良，钟旭华，杨建昌，王光火，邹应斌，张福锁，朱庆森，Roland Buresh，Christian Witt.提高中国稻田氮肥利用率的研究策略.中国农业科学.2002，35(9)：1095～1103)，成为世界第一大消费国。其中水稻田中氮肥的施用量超过其它任何农作物，氮肥的损失量占施肥总量的70％。我国普遍存在着由于氮肥利用率低和大量的氮素损失导致的一系列环境问题。水稻虽然是喜铵作物，但是已经有研究表明一定量的硝态氮能够促进水稻对铵的吸收，而且在水稻生长发育的后期田里和旱作水稻主要以硝态氮为主。因此高亲和硝酸盐运输蛋白OsNRT2.3a和OsNRT2.3b对水稻在低氮条件下吸收及其调控硝酸盐有很大的作用，能够提高水稻对氮肥的利用率、增加水稻的产量。

发明内容

技术问题：

本发明的目的在于提供水稻硝酸盐运输蛋白基因组OsNRT2.3的基因工程应用，该基因在水稻中过量表达，提高水稻在低硝态氮条件下对硝态氮的吸收以及氮素利用效率甚至可以提高水稻产量。

技术方案

本发明提供了水稻硝酸盐运输蛋白基因组OsNRT2.3的基因工程应用，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1，1893bp。该基因表达产物为水稻硝酸盐运输蛋白OsNRT2.3a的应用，其氨基酸序列为SEQ IDNO.2，共516个氨基酸或者为水稻硝酸盐运输蛋白OsNRT2.3b的应用，共486个氨基酸其氨基酸序列为SEQ IDNO.3。

上述水稻硝酸盐运输蛋白基因OsNRT2.3a，基因登录号是AK109776，其特异引物为：

OsNRT2.3a-F：5′-GCTCATCCGCGACACCCT-3′

OsNRT2.3a-R：5′-GTCGAAGCGGTCGTAGAA-3′

水稻硝酸盐运输蛋白基因OsNRT2.3b，基因登录号是AK072215，其特异引物为：

OsNRT2.3b-F：5′-CGTTCGCCGTGTT-3′

OsNRT2.3b-R：5′-TCGAAGCGGTCGTAGAAG-3′

与基因组OsNRT2.3相关的基因工程可以应用在提高作物氮肥利用效率或根系发育调节等方面。

有益效果：

1、通过系统研究，首次提供了水稻硝酸盐运输蛋白基因组OsNRT2.3，并发现具有选择性RNA剪并现象(alternative splicing)，而其它高等植物中并没有发现过具有RNA剪并现象的硝酸盐运输蛋白基因。揭示了水稻在对氮素利用的进化过程中具有了更复杂的调控机制。试验证明，同时应用OsNRT2.3的两个剪并产物OsNRT2.3a和OsNRT2.3b可以提高作物对恶劣pH的适应性。

2、从KOME网站(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)上得到了这两个基因OsNRT2.3a和OsNRT2.3b的全长cDNA克隆。利用PCR技术构建了蛙卵异源表达载体和水稻超表达载体。通过蛙卵异源表达和超表达转基因应用，验证了这两个cDNA产物OsNRT2.3a和OsNRT2.3b的功能。

3、在蛙卵异源表达体系中进行基因功能分析，首次鉴定了基因组OsNRT2.3属于高亲和硝酸盐运输蛋白基因(亲和力K_m<1mM)，其中OsNRT2.3a对硝酸盐的亲和力(K_m)为0.31mM，而OsNRT2.3b对硝酸盐的亲和力(K_m)为0.45mM。并发现它们具有特异pH调控位点。这对理解水稻在淹水条件下吸收利用硝酸盐具有重大的意义。

4、利用特异引物研究OsNRT2.3a和OsNRT2.3b在水稻中的表达，发现OsNRT2.3a只在侧根中表达，且受低氮调控，说明该蛋白产物主要参与硝酸盐调控的侧根发育过程。该基因的应用可以提高作物侧根对于硝酸盐响应的效率，增加硝酸盐对侧根诱导作用，促进作物根系发育。而OsNRT2.3b在地上部与根系都表达，过酸或过碱的条件表达增加，说明该蛋白产物主要负责硝酸盐运输，并且对pH逆境有一定的抗性。将OsNRT2.3超表达后提高了氮素利用效率及对环境的适应能力。

附图说明

图1：水稻硝酸盐运输蛋白基因OsNRT2.3结构分析

其中1：启动子位置：-1577bp；TATA box位置：-1618bp；2：内含子；3：终止子

图2：蛙卵异源表达系统的载体--pT7Ts图谱

图3：N¹⁵在表达OsNRT2.3a和OsNRT2.3b蛋白的蛙卵中的积累

图4：OsNRT2.3a和OsNRT2.3b在水稻不同部位(叶片，茎秆，侧根区，根尖区)表达特征

1：根尖区(3-4cm)；2：侧根区；3：茎秆；4：叶片

图5：OsNRT2.3a和OsNRT2.3b在不同氮素诱导处理下的表达特征

1：缺氮；2：缺氮后供0.2mM硝酸盐 3：缺氮后供0.2mM铵盐；4：缺氮后供5mM硝酸盐；5：缺氮后供5mM硝酸盐

图6：OsNRT2.3a和OsNRT2.3b在不同pH处理下的表达特征

1：pH3.0；2：pH5.5；3：pH8.0

具体实施方式

一、基因序列的获得

通过在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上搜索得到拟南芥高亲和硝酸盐运输蛋白基因AtNRT2.1的氨基酸序列，以AtNRT2.1的氨基酸序列为比对的模版在KOME网站(http://cdna01.dna.affrc.go.ip/cDNA/)上搜索得到水稻中与其具有高度同源的氨基酸序列共4个。通过对上述4个氨基酸序列的全长基因组序列的同源性分析，发现其中两个氨基酸序列来源一个基因组序列，我们定义这段基因组序列为OsNRT2.3。它所编码的两个氨基酸序列分别为OsNRT2.3a和OsNRT2.3b。并从KOME网站(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)上得到了这两个全长cDNA克隆，OsNRT2.3a基因登录号是AK109776；OsNRT2.3b基因登录号是AK072215，位于在第一条染色体上。它们基因组序列是100％同源，OsNRt2.3b在从ATG开始+190位置出现一个90bp的内含子，不包含在cDNA序列中；而对于OsNRT2.3a来说这段90bp依然是外显子序列，包含在cDNA序列中。它们的具体结构分析见图1。

二、蛙卵异源表达OsNRT2.3a和OsNRT2.3b蛋白

1)构建蛙卵异源表达载体

从克隆载体pCMV-SPORT6(由KOME网站http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)将基因OsNRT2.3a亚克隆到蛙卵异源表达载体pT7Ts(Tong Y P，Zhou J J，Li Z，Miller A J.2005.A two-component highaffinity nitrate uptake system in barley.The Plant Journal 41，442-450.)上(图2)，有3个多克隆位点(BglII，EcoR V和SpeI)，设计引物：

02-2R：5’-CAGAACTAGTTAAGCTTGGGCCCCTC-3’(BglII)

02-2F：5’-AATCAGATCTGAATTCCTCGAGCACTG-3’(SpeI)

PCR过程94℃预变性5分钟，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸1min30s，35个循环后，72℃ 7min，跑胶检测，OsNRT2.3a的亚克隆PCR产物大小为1963bp。

从克隆载体Lambda-FLC I(由KOME网站http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)将基因OsNRT2.3b亚克隆到蛙卵异源表达载体pT7Ts上(见图2)，设计引物：

JoP-2R：5’-CAGAACTAGTCCCCCCCTCGAAGG-3’(BglII)

JoP-2F：5’-AATCAGATCTTTGGAGCTCCACCGC-3’(SpeI)

PCR过程94℃预变性5分钟，94℃变性30s，52℃复性1min，72℃延伸1min30s，35个循环后，72℃ 7min，跑胶检测。OsNRT2.3b的PCR产物大小为2070bp

PCR产物电泳胶纯化回收后，BglII和SpeI酶切再次电泳胶纯化回收，电泳检测定量，-20℃保存。利用BglII和SpeI双酶切pT7Ts质粒后电泳胶纯化回收，电泳检测定量，与PCR酶切产物回收后混合于4度下连接过夜。热激转化到DH5α大肠杆菌中37度培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，分别得到含基因OsNRT2.3a和基因OsNRT2.3a亚克隆质粒的菌液。

2)cRNA的体外合成

提取质粒(Tong Y P，Zhou J J，Li Z，Miller A J.2005.A two-component high affinity nitrate uptakesystem in barley.The Plant Journal 41，442-450.)：分别取含基因OsNRT2.3a和基因OsNRT2.3a亚克隆质粒的菌液25ml，按照中量提取质粒试剂盒(QIAGEN，UK)提取质粒说明操作，得到浓度为OD260＝1.395μg/μl(要求质粒浓度必须大于1μg/μl)的基因OsNRT2.3a亚克隆质粒和OD260＝1.7μg/μl基因OsNRT2.3b亚克隆质粒。

线性化质粒：分别用XbaI单酶切基因OsNRT2.3a亚克隆质粒和基因OsNRT2.3b亚克隆质粒，50μl反应体系：6μg质粒DNA，2μl XbaI(promega)，5μl缓冲液，水补充到终体积为50μl。37℃水浴酶切2小时，电泳验证。纯化线性质粒DNA(Tong et al 2005)。得到OD260浓度为2μg/μl基因OsNRT2.3a亚克隆质粒线性DNA和1.2μg/μl基因OsNRT2.3b亚克隆质粒DNA线性DNA。cRNA合成(Tong Y P，Zhou J J，Li Z，Miller A J.2005.A two-component high affinity nitrate uptakesystem in barley.The Plant Journal 41，442-450.)，体外合成RNA的试剂盒为MEGAscript T7 kit，Ambion)得到2.5μg/μl基因OsNRT2.3a亚克隆质粒cRNA和4μg/μl基因OsNRT2.3bcRNA

3)蛙卵的获得与cRNA的注射(Tong Y P，Zhou J J，Li Z，Miller A J.2005.A two-component highaffinity nitrate uptake system in barley.The Plant Journal 41，442-450)

注射毛细管为是Higenberg公司出产的直径为1mm，内径为0.8mm的无内芯的毛细管长11cm。拉针仪(PE-21型，日本产)拉制成约5到6cm长的微注射针；微量注射仪(PLI-100 Pico-Injector，HarvardApparatus，CIB，USA.)为气压为推动力。每个蛙卵注射cRNA量为50ng。18℃培养2天，保证基因OsNRT2.3a和基因OsNRT2.3b的cRNA在蛙卵中表达翻译成蛋白质。

4)OsNRT2.3a和OsNRT2.3b蛋白功能的检测

电压钳测定跨蛙卵细胞膜的电流(Tong Y P，Zhou J J，Li Z，Miller A J.2005.A two-componenthigh affinity nitrate uptake system in barley.The Plant Journal 41，442-450.)：数据采集器为Digidata1320 A，16-bit Digidata Acquisition systerm，Axon Instruments，USA)，数据采集与处理软件ClamfitClampox8.2。电压嵌为HighVoltage V Clamp(Devtech，UK)，得到OsNRT2.3a蛋白和OsNRT2.3b蛋白对硝酸盐运输的亲和力K_m参数，OsNRT2.3a蛋白的K_m为0.31mM；OsNRT2.3b蛋白的K_m为0.45mM(注：硝酸盐亲和力Km<1mM的蛋白属于高亲和硝酸盐运输蛋白系统)。

N¹⁵的吸收实验(Tong Y P，Zhou J J，Li Z，Miller A J.2005.A two-component high affinity nitrateuptake system in barley.The Plant Journal 41，442-450.)：表达了OsNRT2.3a和OsNRT2.3b蛋白的蛙卵在0.5mM NaN¹⁵O₃过夜后测定细胞中积累的N¹⁵。结果表明(图3)，OsNRT2.3a和OsNRT2.3b蛋白可以独立吸收硝酸盐，且受pH调控。当外界pH逐渐降低时，OsNRT2.3a对硝酸盐的吸收逐渐降低，但是在pH5.5时恢复；同时当外界pH逐渐降低时，OsNRT2.3b对硝酸盐的吸收逐渐增加，在pH5.5时得到最大积累。说明基因组OsNRT2.3a和OsNRT2.3b共同应用其效果更好，不受pH值影响。

三、OsNRT2.3a和OsNRT2.3b的在水稻中表达特征

1)总RNA的提取水稻(日本晴)幼苗长至3叶期后，用低硝态氮进行处理6小时后立即取根迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右根，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入1ml Trizol试剂(购自Invitrogen，USA)，充分摇匀振荡后，抽提总RNA。

我们设计了特殊的引物能够特异性的扩增OsNRT2.3a和OsNRT2.3b，对于OsNRT2.3a来说，正向引物在内含子在里就能特异地扩增OsNRT2.3a；而OsNRT2.3b的正向引物有5个碱基在内含子前、7个碱基在内含子后，这样OsNRT2.3b的引物就不能够与OsNRT2.3a结合，确保OsNRT2.3b的引物扩增产物只能是OsNRT2.3b而不包含OsNRT2.3a。

引物序列如下：

OsNRT2.3a-F：5′-GCTCATCCGCGACACCCT-3′(在cDNA序列的位点：252bp)

OsNRT2.3a-R：5′-GTCGAAGCGGTCGTAGAA-3′(在cDNA序列的位点：924bp)

OsNRT2.3b-F：5′-CGTTCGCCGTGTT-3′(在cDNA序列的位点：408bp)

OsNRT2.3b-R：5′-TCGAAGCGGTCGTAGAAG-3′(在cDNA序列的位点：1014bp)

以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸30s，30个循环后，72℃ 7min，跑胶检测，OsNRT2.3a的PCR产物大小为673bp，OsNRT2.3b的PCR产物大小为607bp。通过对这两个基因在水稻不同部位(叶片，茎秆，侧根区，根尖区)和不同环境处理下的表达模式进行分析，发现OsNRT2.3a只在侧根中表达(图4)，且受低氮调控(不供氮)(图5)，说明该蛋白产物主要参与硝酸盐调控的侧根发育过程。而OsNRT2.3b在地上部与根系都表达，过酸或过碱的条件表达增加(见图4，5，6)。

四、OsNRT2.3基因的超量表达植株

1)超量表达载体的构建

根据水稻高亲和硝酸盐运输蛋白基因OsNRT2.3a和OsNRT2.3b的cDNA序列，设计引物包含完整的OsNRT2.3a和OsNRT2.3b的阅读框，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点SpeI，引物序列为：

overNRT2.3a-F：5’-CAACTAGTGCTACCACGTGTTGGAGATG-3”(SpeI_)

overNRT2.3a-R：5’-GAACTAGTGAGCAAACCACCAACAAGC-3’(SpeI_)

overNRT2.3b-F：5’-CAACTAGTGCTACCACGTGTTGGAGATG-3”(SpeI_)

overNRT2.3b-R：5’-GAACTAGTGAGCAAACCACCAACAAGC-3’(SpeI_)

以步骤一中获得的cDNA克隆为模板，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，55℃复性1min30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃ 7min，跑胶检测，OsNRT2.3a的PCR产物大小为1983bp，OsNRT2.3b的PCR产物大小为2093bp。经PCR扩增后，将OsNRT2.3a和OsNRT2.3b的全长编码序列克隆至pMD-19载体(Takara公司)，测序正确后通过相应的酶切位点导入双元表达载体p1390(ChenTL，Lin Y L，Lee YL，Yang NS Chan MT 2004 Expression of bioactive human interferon-gamma intransgenic rice cell suspension cultures Transgenic Research 13：499-510)，然后转化至农杆菌EHA 105(Xu M，Zhu L，Shou H，Wu P.A PIN1 family gene，OsPIN1，involved in auxin-dependent adventitiousroot emergence and tillering in rice.Plant Cell Physiol.2005 Oct；46(10)：1674-81.)中。

2)转基因植株的获得

将步骤1)获得的转有表达载体的农杆菌，进一步转化至水稻，对获得的转基因植株进行PCR检测，以及RT-PCR验证后，利用N¹⁵标记硝态氮进行吸收实验，分析水稻对硝态氮的吸收，观察转基因水稻与野生型水稻的生长差异。发现超表达材料可以在不施氮肥条件下获得比野生型高15％的产量，即提高氮素利用效率15％。

综上所述，本发明人提供的OsNRT2.3基因是首次在水稻分离的新基因，其功能参予水稻侧根发育与硝酸盐运输。可利用本发明OsNRT2.3基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。

本发明的OsNRT2.3基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。

序列表

<110>南京农业大学

<120>水稻硝酸盐运输蛋白基因组OsNRT2.3的基因工程应用

<130>说明书

<140>00

<141>2008-11-07

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1893

<212>DNA

<213>Oryza sativa(水稻)

<220>

<221>水稻硝酸盐运输蛋白基因组OsNRT2.3

<222>(1)..(1893)

<223>

<400>1

<210>2

<211>516

<212>PRT

<213>Oryza sativa(水稻)

<220>

<221>水稻高亲和硝酸盐运输蛋白OsNRT2.3a氨基酸序列

<222>(1)..(516)

<223>

<400>2

<210>3

<211>486

<212>PRT

<213>Oryza sativa(水稻)

<220>

<221>水稻高亲和硝酸盐运输蛋白OsNRT2.3b氨基酸序列

<222>(1)..(486)

<223>

<400>3

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>OsNRT2.3a-F

<222>(1)..(18)

<223>

<400>4

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>OsNRT2.3a-R

<222>(1)..(18)

<223>

<400>5

<210>6

<211>13

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>OsNRT2.3b-F

<222>(1)..(13)

<223>

<400>6

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>OsNRT2.3b-R

<222>(1)..(18)

<223>

<400>7

Claims (6)

1、水稻硝酸盐运输蛋白基因组OsNRT2.3的基因工程应用，该基因组的核苷酸序列为SEQ IDNO.1。

2、权利要求1所述基因组表达的水稻硝酸盐运输蛋白OsNRT2.3a的应用，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3、权利要求1所述基因表达的水稻硝酸盐运输蛋白OsNRT2.3b的应用，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

4、权利要求2所述水稻硝酸盐运输蛋白基因OsNRT2.3a的特异引物，其序列为：

OsNRT2.3a-F:5′-GCTCATCCGCGACACCCT-3′

OsNRT2.3a-R:5′-GTCGAAGCGGTCGTAGAA-3′。

5、权利要求3所述水稻硝酸盐运输蛋白基因OsNRT2.3b的特异引物，其序列为：

OsNRT2.3b-F:5′-CGTTCGCCGTGTT-3′

OsNRT2.3b-R:5′-TCGAAGCGGTCGTAGAAG-3′。

6、根据权利要求1所述基因组OsNRT2.3的基因工程应用，其特征在于，该基因在提高氮肥利用效率或作物根系发育调节方面的应用。

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