CN104592369A - OsMADS57及其相关生物材料在调控植物低温耐受性中的应用 - Google Patents

OsMADS57及其相关生物材料在调控植物低温耐受性中的应用 Download PDF

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CN104592369A CN201310526659.6A CN201310526659A CN104592369A CN 104592369 A CN104592369 A CN 104592369A CN 201310526659 A CN201310526659 A CN 201310526659A CN 104592369 A CN104592369 A CN 104592369A
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nucleic acid
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Abstract

本发明公开了OsMADS57及其相关生物材料在调控植物低温耐受性中的应用。其中的一个应用是OsMADS57或与OsMADS57相关的生物材料在调控植物低温耐受性中的应用；所述OsMADS57是如下a）或b）的蛋白质：a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物低温耐受性相关的由a）衍生的蛋白质。OOsMADS57及其相关生物材料可用于提高植物对低温的耐受性。

Description

OsMADS57及其相关生物材料在调控植物低温耐受性中的应用
技术领域
本发明涉及OsMADS57及其相关生物材料在调控植物低温耐受性中的应用。
背景技术
植物在生长和发育过程中往往会受到环境中非生物因素的影响，其中低温引起的冻害及冷胁迫是影响农作物产量的主要因素之一。低温会影响植物的生长发育，更是植物地理分布的重要限制因素。低温促使细胞内成分的改变，包括不饱和酸的多少(Cossins,1994)、糖脂组成(Lynch and Thompson,1982)、蛋白质组成和碳水化合物成分的改变，以及离子通道的活性(Knight et al.,1996)。
水稻是世界上最重要的粮食作物，也是单子叶植物的模式植物，它为全球近一半的人口提供食物。而低温天气及冷水灌溉等造成的冷害是水稻生产中的一大限制因子（Khan et al.,1986）。水稻在整个生长和发育的过程中都会受到冷害的袭击，在生产中水稻幼苗期和生殖发育时期对低温最敏感。水稻幼苗受到低温后，会发育迟缓，黄化，萎蔫，分蘖减少甚至死亡。低温冷害导致的水稻减产在世界许多国家均有发生，比较严重的地区主要集中在南亚、东南亚的高海拔地区（Sharifi，2010）。低温灾害多发生在这些地区的早春。在南亚、东南亚，有大约700万公顷的水稻因为低温的原因不能种植(Sthapit et al.,1998)。我国的大部分稻作区也遭遇到不同程度的低温冷害，尤其东北寒地和云贵高原高寒冷凉稻作区，冷害一直是频繁发生的灾害性天气之一。
为减轻低温冷害对水稻产量和分布的影响，除采取一般的农业措施及耐冷品种选育外，借助分子生物学手段，获得耐冷性遗传资源，从根本上提高水稻对低温的耐受性，培育耐寒水稻，拓展其分布区域，是一件非常重要且有意义的工作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供来源于水稻的蛋白质OsMADS57及其相关生物材料的新用途。
本发明所提供的一种新用途是OsMADS57或与OsMADS57相关的生物材料在调控植物低温耐受性（抗冷性）中的应用；
所述OsMADS57是如下a）或b）的蛋白质：
a）由序列表中序列2（SEQ ID No.2）所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物低温耐受性相关的由a）衍生的蛋白质；
所述与OsMADS57相关的生物材料，为下述B1）至B7）中的任一种：
B1）编码所述OsMADS57的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6）降低所述OsMADS57表达的核酸分子；
B7）含有B6）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
其中，序列表中序列2由241个氨基酸残基组成。
上述应用中，所述调控植物低温耐受性可为提高植物低温耐受性或降低植物低温耐受性。
上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述应用中，B1）所述核酸分子可为如下1）或2）或3）或4）所示的基因：
1）其编码序列是序列表中序列1（SEQ ID No.1）的第1-726位核苷酸的cDNA分子；
2）核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA；
4）与1）或2）限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述OsMADS57的cDNA分子或基因组DNA；
B6）所述核酸分子可为与序列表中序列1的第1-726位核苷酸所示的DNA分子中任一片段反向互补的cDNA分子。
其中，SEQ ID No.2由762个核苷酸组成。
含有B1）所述核酸分子的表达盒具体可为OsMADS57基因表达盒。本发明中所述OsMADS57基因表达盒均可含有所述OsMADS57基因和启动所述OsMADS57基因转录的启动子。本发明中所述OsMADS57基因表达盒均指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.2所示的OsMADS57的DNA，该DNA不但可包括启动所述OsMADS57基因转录的启动子，还可包括终止所述OsMADS57基因转录的终止子。进一步，所述OsMADS57基因表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人（1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128（CN101063139B(中国专利200710099169.7)），种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子（Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell等人（I985)Nature313:810；Rosenberg等人（1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等人Genes Dev.,5:141;Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人（1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
B6）所述核酸分子具体可为与序列表中序列1的第1-726位核苷酸所示的DNA分子反向互补的cDNA分子。
在本发明的实施例中，所述OsMADS57基因表达盒中，启动所述OsMADS57基因转录的启动子是玉米泛素启动子（Ubi），终止所述OsMADS57基因转录的终止子是农杆菌胭脂碱合成酶终止子（Nos-T）。
可用现有的植物表达载体构建含有所述OsMADS57基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pGWB412、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。在本发明的一个具体实施方式中，B3）所述的重组载体为将pUN1301的BamHI和KpnI酶切位点间的片段替换为序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸得到的重组载体pUN-MADS57。pUN-MADS57中含有如下OsMADS57基因表达盒：启动所述OsMADS57基因转录的启动子是玉米泛素启动子（Ubi），终止所述OsMADS57基因转录的终止子是农杆菌胭脂碱合成酶终止子（Nos-T）。
上文中，所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia）,欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属（Agrobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）,产碱菌属（Alcaligenes）,假单胞菌属（Pseudomonas）,芽胞杆菌属（Bacillus）等。所述转基因植物细胞系为非植物繁殖材料。
上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，如水稻。本发明的实验证明，转入OsMADS57基因的水稻可耐受4℃的低温。
本发明所提供的另一个用途是培育低温耐受性增强的转基因植物的方法和提高植物低温耐受性的方法。本发明所提供的培育低温耐受性增强的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入OsMADS57基因，得到低温耐受性高于所述受体植物的转基因植物的步骤；所述OsMADS57基因编码所述OsMADS57。
上述方法中，所述低温耐受性高于所述受体植物的转基因植物中所述OsMADS57基因的表达水平高于所述受体植物。
上述方法中，所述OsMADS57基因通过含有OsMADS57基因表达盒的重组表达载体导入所述受体植物中，所述OsMADS57基因表达盒中，启动所述OsMADS57基因转录的启动子是玉米泛素启动子（Ubi），终止所述OsMADS57基因转录的终止子是农杆菌胭脂碱合成酶终止子（Nos-T）。
在本发明的一个具体实施方式中，含有OsMADS57基因表达盒的重组表达载体为上述pUN-MADS57。
本发明所提供的提高植物低温耐受性的方法，包括提高目的植物中所述OsMADS57基因表达水平，得到低温耐受性增强的转基因植物；所述OsMADS57基因编码所述OsMADS57。
上述方法中，提高目的植物中所述OsMADS57基因表达水平具体可为向目的植物中导入所述OsMADS57基因。
所述OsMADS57基因为下述1）或2）或3）或4）所示的基因：
1）其编码序列是序列表中序列1的第1-726位核苷酸的cDNA分子；
2）核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA；
4）与1）或2）限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述OsMADS57的cDNA分子或基因组DNA。
上述方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，如水稻。当所述植物为水稻时，所述低温可为4℃。
上述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
上述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述方法中，其中所述OsMADS57基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
1）根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述OsMADS57基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2）修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3）与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4）与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5）引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel）和病毒前导序列（例如来源于TMV,MCMV和AMV）。
上述方法中，所述OsMADS57基因通过含有所述OsMADS57基因表达盒的重组表达载体导入所述受体植物中。
所述OsMADS57基因表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach,1998，Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463;Geisersonand Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。
上文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上文中，所述低温耐受性也称为抗冷性。
本发明的实验证明，OsMADS57基因表达量提高的转基因水稻的在4℃的存活率显著高于野生型水稻；OsMADS57基因表达量降低的转基因水稻在4℃的存活率显著低于野生型水稻。OsMADS57及其相关生物材料可用于提高植物对低温的耐受性。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为RT-PCR方法扩增到OsMADS57基因的全长
图2为超表达载体pUN-OsMADS57的物理图谱
图3为超表达及反义转基因水稻的定量PCR鉴定
图4为OsMADS57超表达水稻耐低温（4℃）表型
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的水稻中花十号（李梅芳，水稻花培品种—中花10号，农业科技通讯，1998年第1期第26页）公众可从中国科学院植物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、OsMADS57蛋白及其编码基因的获得
根据数据库分析的结果设计引物：
超表达载体构建使用引物：5′端引物：5’-CGGGATCCATGGGGAGGGGGAAGATAGT-3’(下划线序列为BamHI位点，序列3)，3′端引物：
5’-GGGGTACCTTAAGGCAGATGAAGTCCCAGT-3’(下划线序列为KpnI位点，序列4)。
提取粳稻中花十号三叶期幼苗总RNA，采用RT-PCR方法扩增到编码OsMADS57的726bp全长cDNA。具体操作过程如下：
1）植物总RNA的提取：选取100mg三叶期水稻中花十号（Oryza sativa L.cvZhonghua10）的幼苗为材料，在液氮中研磨，将液氮中研碎的冻干粉转入到含1mlTrizol试剂（Invitrogen）的1.5ml离心管中，充分混匀；25℃放置5分钟；每管中加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15秒，25℃温育2-3分钟；12,000rpm，4℃，离心15分钟；把上清的水相0.5ml转移到一个新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，25℃放置10分钟使RNA沉淀；12,000rpm，4℃，离心10分钟；去上清，将RNA沉淀用1ml75%乙醇清洗2次，超净台吹至半干；用50μl DEPC-ddH2O重悬沉淀，60℃水浴10分钟，以溶解RNA沉淀获得RNA溶液。将此RNA溶液分装后-70℃保存，备做反转录的模板。
2）RT-PCR：取1μl上述RNA溶液，用DEPC-ddH2O稀释100倍，用分光光度计测定RNA浓度。参照RT-PCR试剂盒（Promega）说明书，根据RNA的定量结果，取含有2μgRNA的上述RNA溶液，加1.0μg Oligo dT引物，用DEPC-ddH2O补充至15μl，混匀后70℃变性5分钟，冰浴5分钟。短暂离心后，加入25μl反转录混合物（5μlM-MLV5×Reaction Buffer，6μl dNTP Mixture(2.5mM)，1μl M-MLV ReverseTranscriptase，0.5μl RNase Inhibitor，12.5μl DEPC-ddH2O）。混匀后，42℃水浴1小时完成反转录过程；75℃水浴10分钟使反转录酶失活，得到含有第一链cDNA的混合物。
取1μl上述第一链cDNA作为PCR的模板，按以下体系进行PCR反应：0.2μl LATaq（5U/μl）、10μl2×GC buffer，1.8μl dNTPs,0.5μl5′端引物(10μM)，0.5μl3′端引物(10μM)，加ddH2O终体积20μl。
其中，5′端引物和3′端引物分别如下：
5’-CGGGATCCATGGGGAGGGGGAAGATAGT-3’(下划线序列为BamHI位点，序列3)，3′端引物：5’-GGGGTACCTTAAGGCAGATGAAGTCCCAGT-3’(下划线序列为KpnI位点，序列4)为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物。
上述PCR程序为：94℃预变性30s后进入PCR循环，循环参数为98℃10秒变性→55℃15秒复性→72℃40秒延伸,35个循环后在72℃继续合成10分钟。
将上述PCR产物经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，PCR产物的条带大小为726bp。
回收PCR产物进行测序，结果为PCR产物的核苷酸序列具有序列表中序列1自5’末端第1-726位核苷酸，该PCR产物为OsMADS57的编码基因，其编码序列为序列表中序列1自5’末端第1-726位核苷酸，编码氨基酸序列为序列表中的序列2的蛋白质OsMADS57。
实施例2、OsMADS57蛋白及其编码基因的应用
一、超表达载体（pUN-MADS57）
1、pUN1301质粒的获得
第一步：剪取约0.2g玉米幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800μL新配制的提取缓冲液(含0.1M Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA，0.5M NaCl，1%SDS和1％β-巯基乙醇)，剧烈振荡使其全部悬浮；65℃水浴30分钟，每5分钟颠倒混匀一次；然后加入250μL预冷的5M乙酸钾水溶液，立即颠倒混匀，冰浴5分钟；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm离心5分钟；收集上清液，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置40分钟；4℃12000rpm离心15分钟,弃上清；沉淀用70%、100%乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μL含100μg/mL RNaseA的ddH2O中，得到玉米基因组DNA。
第二步：取上述玉米基因组DNA溶液2μL作为模板，以带有Hind III识别位点的5′引物（GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG）和带有BamHI识别位点的3′引物（CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG）为引物，进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃3分钟；再94℃45秒，62℃45秒，72℃2分钟，共35个循环，最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，表明得到长度约为2kb的扩增片段，与预期结果相符，回收该目的片段，用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切后回收，得到片段经测序，该片段为序列表中的序列5自5’末端的第1-1986位核苷酸,为带有粘性末端的玉米泛素启动子（UbiPro）。（玉米泛素启动子（UbiPro）也可以人工合成获得。）
第三步：用限制性内切酶Sac I和EcoR I将Noster poly A终止序列从质粒载体pBI121（北京拜尔迪生物技术有限公司目录号：MP-091）上切下，连接到载体pUC19（北京百泰克生物技术有限公司目录号：DP7801）的Sac I和EcoR I位点间，得到重组载体，命名为pUC19-Noster。再用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切pUC19-Noster，琼脂糖凝胶电泳检测后，回收线性化的载体大片段，并将该回收片段与第二步中经酶切获得的带有粘性末端的玉米泛素启动子（UbiPro）相连，得到重组载体，命名为pUN19。
第四步：用限制性内切酶EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切从第三步购建的重组载体pUN19切下包含UbiPro和Noster的长度约为2.3kb的片段，将该片段克隆入质粒载体pCAMBIA1301(Biovector Co.,LTD公司目录号Biovec-11)的EcoR I和HindIII位点处，得到重组载体，命名为pUN1301。
2、超表达载体（pUN-MADS57）的获得
用限制性内切酶BamHI和KpnI对步骤1获得的质粒pUN1301进行双酶切，酶切体系为：质粒10μl、10x酶切缓冲液5μl、BamHI1μl（10U/μl）、KpnI0.8μl（10U/μl），加ddH2O补充反应体系至50μl，37℃酶切4小时。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收线性化的pUN1301大片段，溶于20μl ddH2O中。
用限制性内切酶BamHI和KpnI对由实施例1得到的具有序列表中序列1自5’末端第1-726位核苷酸的PCR产物进行双酶切，酶切体系为：质粒10μl，酶切缓冲液5μl、BamHI1μl（10U/μl）、加ddH2O补充反应体系至50μl，37℃酶切4个小时。再加入KpnI0.2μl（10U/μl），37℃酶切20分钟。用0.8%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用AxyPrep公司的DNA凝胶回收试剂盒回收该片断，回收到具有序列表中序列1自5’末端第1-726位核苷酸的OsMADS57。
将10μl回收的具有序列表中序列1自5’末端第1-726位核苷酸的OsMADS57、6μl回收的载体pUN1301大片段溶液、2μl(3U/μl)T4DNA连接酶和2μl10x连接酶缓冲液混和，16℃连接16小时，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆。
提取阳性克隆中的重组质粒，进行测序验证，该质粒为将序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸插入pUN1301的BamHI和KpnI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pUN-MADS57。pUN-MADS57为将pUN1301的BamHI和KpnI酶切位点间的片段替换为序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸得到的重组载体。pUN-MADS57中，序列表中序列1的第1-726位核苷酸的5’端通过所述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接，序列表中序列1的第1-726位核苷酸的3’端通过所述pUN1301的KpnI酶切位点与其连接。pUN-MADS57是OsMADS57基因表达载体，pUN-MADS57中启动子、基因和终止子（农杆菌胭脂碱合成酶终止子（Nos-T））的结构正确，玉米泛素启动子（UbiPro）启动OsMADS57基因在植物中表达，其物理图谱示意图如图2所示。
3、OsMADS57反义基因表达载体pUN-antiMADS57的获得
1）、以反义表达构建引物序列5′端引物：
5’-GGGGTACCATGGGGAGGGGGAAGATAGT-3’(下划线序列为KpnI位点，序列5)，3′端引物：5’-CGGGATCCTTAAGGCAGATGAAGTCCCAGT-3’(下划线序列为BamHI位点，序列6)为引物，按照实施例1中方法进行PCR扩增，得到具有序列表中序列1自5’末端第1-726位核苷酸的PCR产物（反义）。
2）、同超表达载体构建方法，用限制性内切酶KpnI和BamHI对以上得到的PCR产物（反义），进行双酶切，酶切体系为：质粒10μl，酶切缓冲液5μl、KpnI1μl（10U/μl）、加ddH2O补充反应体系至50μl，37℃酶切4个小时。再加入BamHI0.2μl（10U/μl），37℃酶切20分钟。用0.8%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，用AxyPrep公司的DNA凝胶回收试剂盒回收该片断，回收到具有序列表中序列1自5’末端第1-726位核苷酸的antiOsMADS57。
3）将10μl回收的具有序列表中序列1自5’末端第1-726位核苷酸的antiOsMADS57、6μl步骤2回收的载体pUN1301大片段溶液、2μl(3U/μl)T4DNA连接酶和2μl10x连接酶缓冲液混和，16℃连接16小时，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆。
提取阳性克隆中的重组质粒，进行测序验证，该质粒为将序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸反向插入步骤1获得的质粒pUN1301的KpnI和BamHI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pUN-antiMADS57。pUN-antiMADS57为将pUN1301的KpnI和BamHI酶切位点间的片段替换为序列表中的序列1自5’末端第1-726位核苷酸的反向互补序列得到的重组载体。pUN-antiMADS57中，序列表中序列1的第1-726位核苷酸的5’端通过所述pUN1301的KpnI酶切位点与其连接，序列表中序列1的第1-726位核苷酸的3’端通过所述pUN1301的BamHI酶切位点与其连接。
pUN-antiMADS57是OsMADS57的反义基因表达载体，pUN-antiMADS57中启动子、基因和终止子（农杆菌胭脂碱合成酶终止子（Nos-T））的结构正确，玉米泛素启动子（UbiPro）启动OsMADS57基因在植物中表达。
二、转OsMADS57水稻的获得及鉴定
1、转OsMADS57水稻的获得
参照电激仪（EasyJecT Plus电激仪，英国EquiBio公司）操作指南，将pUN-MADS57用电击法转化农杆菌EHA105（Biovector Co.,LTD公司目录号Biovec-11），经含卡那霉素的抗性平板筛选得到转入pUN-MADS57的重组菌，命名为EHA105/pUN-MADS57。
将EHA105/pUN-MADS57导入中花十号水稻（Oryza sativa L.cv Zhonghua10，以下简称野生型水稻）的愈伤组织中，再用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至N6D2S1培养基上，筛选一代；两周后，转移至N6D2S2培养基上筛选二代（2周/代）；取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基（1），上，在分化培养箱（每天12小时光照，12小时黑暗，白天28℃，夜晚25℃）中培养7天；然后转移至分化培养基（2）上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗；待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，获得10个转pUN-MADS57水稻的T0代株系。
上述方法中，所用培养基如表1。
表1、培养基
2、转OsMADS57水稻的鉴定
1）、GUS组织化学染色：
将步骤1获得的60棵T0代转pUN-MADS57水稻的2-3mm长的根段分别放到GUS染色液中，抽气几分钟，然后置于37℃温育过夜，染色后的组织用70%乙醇脱色。根呈蓝色的植株即为阳性转基因材料。GUS染色液（pH7.0）组分为：100mM Na3PO4(pH7.0)，0.1%Triton X-100，10mM EDTA，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mM铁氰化钾，1mg/mlX-Gluc。结果共鉴定出6个GUS阳性的转pUN-MADS57水稻的T0代株系，将此幼苗移至温室栽培，按照不同株系收种，得到转pUN-MADS57水稻的T1代转基因种子，在此基础上经过繁种得到转pUN-MADS57水稻的纯合T2代种子。
按照上述方法，将OsMADS57反义基因表达载体pUN-antiMADS57导入中花十号水稻，得到转pUN-antiMADS57水稻的纯合T2代种子。
2）、定量PCR鉴定：
从经步骤1）GUS组织化学染色鉴定阳性的转pUN-MADS57水稻株系和转pUN-antiMADS57水稻株系的T2代水稻幼苗中提取mRNA，并分别转录获得cDNA，以野生型水稻（水稻中花十号）为对照。利用荧光实时定量PCR法，以cDNA为模板，以1μl5′端引物1(10μM)(5′-GCACCAACATGAAAACTGTGA-3′)，1μl3′端引物1(10μM)(5′-CTCCCTCTGCCAAATCTTAATT-3′)为引物，对转pUN-MADS57水稻株系和转pUN-antiMADS57水稻株系的OsMADS57表达丰度进行检测。用于定量分析的试剂为SYBRGreen Realtime PCR Master Mix（TOYOBO）。所用仪器为美国Stratagene公司实时荧光定量PCR仪Mx3000P。吸取1μl第一链cDNA溶液，稀释50倍作为模板，按以下体系进行PCR反应：10μl SYBR Green Realtime PCR Master Mix,4μl模板,1μl5′端引物1(10μM)，1μl3′端引物1(10μM)，加ddH2O终体积20μl。用t-Test进行差异显著性分析。结果如图3所示，在Actin基因作为内参的情况下，与野生型水稻相比，转pUN-MADS57水稻株系（OE）的T2代幼苗中OsMADS57的表达丰度有明显的上调，而AS的T2幼苗中OsMADS57的表达丰度较野生型下调，说明目的基因（OsMADS57）在转录水平已经成功表达。图3的纵坐标是OsMADS57的相对表达量，ZH10为水稻中花十号，OE1和OE2为两个转pUN-MADS57水稻株系的T2代，AS1和AS2为两个转pUN-antiMADS57水稻株系的T2代。其中ZH10取一个株系，OE和AS各取两个株系，每个株系取一周龄幼苗十株，试验重复三次。
三、转OsMADS57水稻的低温耐受性检测
实验重复三次，每次重复中，将经步骤2）定量PCR鉴定的转pUN-MADS57水稻株系OE1和OE2的纯合T2代种子、转pUN-antiMADS57水稻株系AS1和AS2的纯合T2代种子和中花十号（野生型）水稻种子（ZH10）在水中30℃萌发后，分别置于木村B培养液里，在光照培养箱中（光强为10000μmol/m2/s,光照时间为16h/d,温度为30℃）培养至3叶期；再将3叶期幼苗放在4℃低温循环冷水浴（水温4℃）中处理7天，然后转移至木村B培养液中，于光照培养箱（光强为10000μmol/m2/s,光照时间为16h/d,温度为30℃）内恢复培养14天，照相、统计存活率。每个株系各处理32株幼苗，中花十号野生型水稻作为一个株系。用t-Test进行差异显著性分析。其中，木村B培养液按照如下方法配制：将A液母液、B液母液、EDTA-Fe母液和微量元素母液混合，并加入蒸馏水，使A液母液和B液母液均稀释200倍，EDTA-Fe母液和微量元素母液均稀释1000倍，并加入硅酸钠至硅酸钠的终浓度为200mg/L，并用1N HCl（8.17mL37%HCl用蒸馏水稀释至1000mL）调木村B培养液PH值为5.8。其中，
各母液组成如下：
A液母液：1L(200х)
溶解5.57g FeSO4.7H2O于200mL蒸馏水中，溶解7.45g Na2EDTA于200mL蒸馏水中，加热Na2EDTA溶液，加入FeSO4.7H2O溶液，不断搅拌，冷却后定容至1L。
微量元素母液：1L(1000х)
结果表明，转pUN-MADS57水稻株系的纯合T2代水稻株系OE1和OE2在低温（4℃）处理7天的存活率分别为58％和70%；转pUN-antiMADS57水稻株系的纯合T2代水稻株系AS1和AS2在低温（4℃）处理7天的存活率分别为36％和25%，中花十号野生型水稻在低温（4℃）处理7天的存活率为38%；表明与中花十号相比，转pUN-MADS57水稻株系的纯合T2代对低温（4℃）具有耐受性，说明OsMADS57超表达水稻耐低温。图4显示了中花十号（WT）、pUN-MADS57水稻株系的纯合T2代（OE）、转pUN-antiMADS57水稻株系的纯合T2代（AS）在低温处理前和低温处理7天后恢复培养14天的表型。
表2各个水稻株系在低温（4℃）处理7天的存活率（%）结果
株系 4℃处理7天
OE1 57.7500±7.28547*
OE2 69.9568±8.18113*
AS1 36.3750±7.81925
AS2 25.3750±4.06394*
中花10号 38.3750±3.27634
注:*表示株系与中花十号（野生型水稻）有显著差异（P<0.05水平）。

Claims (10)

1.OsMADS57或与OsMADS57相关的生物材料在调控植物低温耐受性中的应用；
所述OsMADS57是如下a）或b）的蛋白质：
a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物低温耐受性相关的由a）衍生的蛋白质；
所述与OsMADS57相关的生物材料，为下述B1）至B7）中的任一种：
B1）编码所述OsMADS57的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6）降低所述OsMADS57表达的核酸分子；
B7）含有B6）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下1）或2）或3）或4）所示的基因：
1）其编码序列是序列表中序列1的第1-726位核苷酸的cDNA分子；
2）核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA；
4）与1）或2）限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述OsMADS57的cDNA分子或基因组DNA；
B6）所述核酸分子为与序列表中序列1的第1-726位核苷酸所示的DNA分子中任一片段反向互补的cDNA分子。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：编码所述OsMADS57的核酸分子是序列表中序列1的cDNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述调控植物低温耐受性为提高植物低温耐受性。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为水稻。
6.培育低温耐受性增强的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入OsMADS57基因，得到低温耐受性高于所述受体植物的转基因植物的步骤；所述OsMADS57基因编码权利要求1所述OsMADS57。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述OsMADS57基因为下述1）或2）或3）或4）所示的基因：
1）其编码序列是序列表中序列1的第1-726位核苷酸的cDNA分子；
2）核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA；
4）与1）或2）限定的cDNA分子具有90％以上的同一性且编码所述OsMADS57的cDNA分子或基因组DNA。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述OsMADS57基因通过含有OsMADS57基因表达盒的重组表达载体导入所述受体植物中，所述OsMADS57基因表达盒中，启动所述OsMADS57基因转录的启动子是玉米泛素启动子，终止所述OsMADS57基因转录的终止子是农杆菌胭脂碱合成酶终止子。
9.提高植物低温耐受性的方法，包括提高目的植物中所述OsMADS57基因表达水平，得到低温耐受性增强的转基因植物；所述OsMADS57基因编码权利要求1所述OsMADS57。
10.根据权利要求6-9中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为水稻。
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