CN101880664A - 单子叶植物启动子及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种单子叶植物启动子及其制备方法和用途。该启动子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。本发明的启动子可以调控单子叶植物中目的基因表达，尤其能够在水稻中调控GUS基因表达。能够调控植物高效率表达具有特殊性状的外源基因，对优良水稻的分子育种研究具有重大意义。

Description

单子叶植物启动子及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种启动子，特别是一种单子叶植物启动子，以及所述启动子的制备方法及用途。

背景技术

启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。在转基因植物中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。

根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。另一种高效的组成型启动子CsVMV是从木薯叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus)中分离的。单子叶植物基因中常见的启动子有：Ubi启动子(Plant ubiquitinpromoter)、Actin启动子(Plant Actin promoter)和Adh-1启动子(Maize alcohol dehydrogenase 1 promoter)。其中，Ubi启动子以其启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐。目前，已经从很多泛素基因中分离得到启动子序列，包括玉米基因组中的Ubi-1启动子、水稻泛素RUBQ2启动子、拟南芥泛素启动子、向日葵泛素UbB1启动子、烟草泛素Ubi.U4启动子、马铃薯泛素Ubi7启动子、番茄泛素Ubi1-1启动子，大麦泛素Mub1启动子。玉米泛素Ubi-1启动子已经广泛地应用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中，水稻泛素RUBQ2启动子在水稻和甘蔗中也有较多的应用。Actin启动子1990年由康奈尔大学的McElroy等首次在水稻中发现，属于强组成型启动子。Actin启动子在单子叶禾本科中作用显著，但是邻近科属的植物中的基因调控功能却十分不理想。因此，许多相关研究通过其他单子叶植物寻找Actin启动子，并成功在香蕉、甜瓜、玉米和拟南芥中陆续发现。Actin启动子由于对基因表达的强调控作用，在单子叶植物优良性状的转基因中已经得到越来越广泛的应用。Adh-1启动子调控ADH(alcohol dehydrogenase)基因，对植物在缺氧环境下乙醇脱氢酶的表达至关重要。Adh-1启动子对单子叶植物如谷类植物中的水稻、燕麦和大麦，以及对少部分双子叶植物如烟草等基因的调控功能比CaMV(花椰菜花叶病毒CaMV)35S启动子提高10-50倍。Adh-1启动子主要应用于单子叶植物，对绝大部分双子叶植物基因表达的调控效果都很有限。

人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子。例如肌动蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替(CaMV)35S启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替(CaMV)35S启动子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果【Naomi S S，Ichiro M.Constitutive Promoters  Available for transgene expressioninstead of CaMV35S RNA promoter：Arabidopsis promoters oftryptophan synthase protein subunit and phytochrome.Plantbiotechnology，2002，19(1)：19-26】。

单子叶植物是被子植物的主要类群，单子叶植物中的禾本科、百合科、棕榈科和天南星等，是非常重要的农业作物。单子叶植物基因的强效启动子，能够调控植物高效率表达具有特殊性状的外源基因，对优良作物的分子育种研究意义重大。

在强效启动子相关研究领域，发现并验证了许多单子叶植物的启动子。此外，双子叶植物中的一些强效启动子如CsVMV(Cassava VeinMosaic Virus)启动子、番茄E8启动子、白藜芦醇合酶基因Vst1启动子等高效启动子，在单子叶植物中也有很强的基因调控作用。

本发明的发明者们通过对水稻基因组的深入研究，提供了一种新的单子叶植物启动子——丙酮酸激酶启动子(PYRUVATE KINASEPROMOTER)，所述启动子能够用于调控单子叶植物中目的基因表达，同时为研究单子叶植物中目的基因表达提供了一种新的工具和选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单子叶植物启动子，以调控单子叶植物中目的基因表达。

本发明的另一目的在于提供上述单子叶植物启动子的重组载体。

本发明的一方面，提供单子叶植物启动子，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。

其中序列表中序列1的具体碱基序列长度为1357个碱基。

本发明所述单子叶植物启动子来源于水稻，具体为：水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Nipponbare)

本发明所提供的如序列表中序列1所示的单子叶植物启动子序列称为丙酮酸激酶启动子(PYRUVATE KINASE PROMOTER)，简称为PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)启动子。

本发明提供的单子叶植物启动子可以是下述核苷酸序列之一：

1)与序列表中序列1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

2)对序列表中序列1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；

3)与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90％以上相似性，且具有相同功能的核苷酸序列。

所述2)的对序列表中序列1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列包括但不限于分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

所述对序列表中序列1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与序列表中序列1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

在本发明中，用于确定序列相似性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列相似性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。

在本发明中，所述与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90％以上相似性的核苷酸序列包括：与序列表中序列1所示的核苷酸序列基本同一的多核苷酸序列，且多核苷酸序列与本发明序列表中序列1所示的核苷酸序列具有至少90％的相似性、优选95％或96％或97％或98％或99％的相似性，或更高相似性。

在本发明中，所述与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90％以上相似性的核苷酸序列具有与序列表中序列1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

本发明的另一方面，提供一种含有本发明所述单子叶植物启动子的重组载体，该重组载体可以通过将上述单子叶植物启动子插入到克隆载体或表达载体而得到，其中所述克隆载体包括但不限于pMD18-T，pUC9，所述表达载体包括但不限于pCambia1300，PDDLS-2。

所述重组载体为pDDLS-2+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)重组载体。

本发明的再一方面，还涉及含有本发明所述单子叶植物启动子的所述重组载体的重组细胞，该重组细胞可以通过将含有本发明所述单子叶植物启动子的所述重组载体转化至宿主细胞而得到，所述重组细胞具体为重组农杆菌EHA105-PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)。

本发明的又一方面，还涉及一种单子叶植物愈伤组织，并且所述愈伤组织转化为本发明所述的启动子。

本发明的又一方面，还涉及一种制备本发明所述启动子的方法，包括如下步骤：

1)根据序列表中序列1所示的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，

2)以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用步骤1)中所设计的PCR引物对进行PCR扩增。

本领域技术人员周知，可以根据待扩增的目的核苷酸序列按照碱基互补原则设计相应的PCR扩增引物对。

所述PCT扩增引物对为：

上游引物F1：CGGGATCCGTTGACTTCGGTGCAGGATGA，其中下划线部分代表BamH1酶切位点。

下游引物R1：AAGCTTGCAGACGACGAGAG，其中下划线部分代表HindIII酶切位点。

本发明的又一方面，还涉及一种调控单子叶植物中目的基因表达的方法，所述方法包括用本发明所述单子叶植物启动子转化单子叶植物的愈伤组织的步骤。

所述单子叶植物愈伤组织的转化利用了含有本发明所述单子叶植物启动子的重组细胞。

所述单子叶植物的愈伤组织为水稻愈伤组织，具体为水稻日本晴愈伤组织。

在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其它转化技术也可用于本发明所述单子叶植物的基因转化。当然，适于本发明的转化单子叶植物的另一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外，还可以采用的转化单子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。

本发明的又一方面，还涉及本发明所述单子叶植物启动子在单子叶植物中调控目的基因表达的应用。

在本发明的一个实施方案中，利用本发明所述启动子调控的目的基因是GUS。

在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物为水稻，具体是水稻日本晴种。

为实现上述调控目的基因表达的目的，本发明所述启动子可以以单拷贝和/或多拷贝的形式应用，也可以与现有技术中已知的启动子联用。

发明具有下列优点和有益效果：采用上述方案，找到了新的单子叶植物启动子，用于调控单子叶植物目的基因表达，同时为研究单子叶植物基因表达提供新的工具和选择，本发明的发明者们通过生物信息学研究获得单子叶植物启动子，并采用生物学实验验证了所述启动子PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)的功能。所述启动子能够在水稻中调控GUS基因表达。能够调控植物高效率表达具有特殊性状的外源基因，对优良水稻的分子育种研究具有重大意义。

附图说明

图1为本发明之单子叶植物启动子PKP(PYRUVATE KINASEPROMOTER)的PCR扩增检测结果。

图2为用于构建pDDLS-2质粒的pCAMBIA-1301质粒示意图。

图3为构建的pDDLS-2质粒示意图。

图4是经转化的水稻愈伤组织的GUS染色结果。

图4中，由带有本发明所述单子叶植物启动子PKP(PYRUVATEKINASE PROMOTER)序列的重组农杆菌pDDLS-2+PKP(PYRUVATE KINASEPROMOTER)转化的水稻愈伤组织(左)经GUS染色后呈现蓝色，由不带有本发明启动子序列的重组农杆菌pDDLS-2质粒的水稻愈伤组织(对照，右)经GUS染色后颜色未发生变化。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

下述实施例中未注明的具体技术或条件，均为常规技术或条件，或按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

A、单子叶植物启动子片段的PCR扩增：

使用新型植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN目录号：DP320-02)，根据该启动子在栽培水稻日本晴变种gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物，即：

上游引物F1：CGGGATCCGTTGACTTCGGTGCAGGATGA，其中下划线部分代表BamH1酶切位点；

下游引物R1：AAGCTTGCAGACGACGAGAG，其中下划线部分代表HindIII酶切位点；

以自行提取的水稻日本晴变种的gDNA为模板，高保真Ex Taq^TM(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行PCR扩增，其中：扩增的PCR体系见表1；

表1基因启动子扩增的PCR体系

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸90s，进行35个反应循环，最后72℃延伸7min；

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为1357bp的条带(图1)，用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)进行纯化回收，即得PCR扩增产物；

B、pMD18-T+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)重组载体的构建：

B1、将上述步骤A得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，其中，T/A克隆的连接条件如下：

T/A连接体系：        10μl

pMD18-T              1μl

2×solution I        5μl

PCR扩增产物          10～20ng，

ddH₂O                补齐至10μl

于16℃在PCR仪中连接8h以上，得到含有pMD18-T+PKP(PYRUVATEKINASE PROMOTER)重组载体的连接产物；

B2、将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：

从超低温冰箱中取出按照《分子克隆》(第三版)所示氯化钙法制备的感受态细胞DH5a 100μl，冰上融化后，加入10μl上述步骤B1所得的含有pMD18-T+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)重组载体的连接产物，轻轻搅匀，冰浴30mi n，42℃热激60s，冰浴5min，加入600μl 4℃预冷的SOC培养基，37℃220rpm复苏45min，玻璃珠涂布LB(卡那霉素)平板，37℃倒置培养16h-24h；获得含有pMD18-T+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)重组载体的重组大肠杆菌，命名为pMD18-T+PKP-DH5a；

B3、对pMD 18-T+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)重组载体中的PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)进行测序验证；

C、pDDLS-2+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)重组载体的构建：

C1、按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号：DP103-03)的操作手册，从上述步骤B2构建的转化有启动子PKP(PYRUVATE KINASEPROMOTER)的重组大肠杆菌pMD18-T+PKP-DH5a中，提取带有本发明PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)启动子序列的重组载体pMD18-T+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)，经过常规纯化后，用相应的限制性内切酶BamHI和HindIII进行酶切，回收相应的启动子插入片段，并分别与pDDLS-2质粒用相同的限制性内切酶切后回收的载体大片段进行连接，得连接产物；将所得连接产物pDDLS-2+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)重组载体转化按照《分子克隆》(第三版)所示氯化钙法制备的感受态细胞，待转化子长出菌落后，挑取单克隆进行PCR检测和酶切鉴定；

其中，pDDLS-2质粒的构建如下：将常规的pCAMBIA-1301(kan抗性)用Pst1和Nco1酶切，这一步的目的是将其原有的报告基因GUS前的35S启动子切除，因此酶切后可以看见大小两条带，小带约1kb，多为原有35S启动子，胶回收较大的条带(大约10kb以上)，接头pDDLS-2-AD-U(GAAGCTTGCGGCAAC)与pDDLS-2-AD-L(CATGGTTGCCGCAAGCTTCTGCA)退火，具体方法是将其1∶1摩尔比混合于水中，放置于1.5ml tube中，将其密封好，置于1-2L沸水中冷却至室温；加入少量接头，与载体混合，连接过夜，转化，筛选克隆，挑选PCR阳性结果(用载体通用引物做显示已经成功切除35S启动子的克隆)(参见图3)；

所述pDDLS-2质粒中的多克隆位点和GUS序列如序列表中序列2所示；

C2、pDDLS-2+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)重组载体的构建：

根据常规的限制性内切酶操作说明，按照下列条件分别处理上述步骤B1所得的含有pMD18-T+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)重组载体，以及上述步骤C1所构建的pDDLS-2质粒，其中，重组载体pMD18-T+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)以及pDDLS-2质粒的酶切条件如下：

酶切体系：         50μl

无菌水             34.8μl

10*buffer H        5μl

EcoRI              0.1μl(10U)

PstI               0.1μl(10U)

pMD18-T+PKP        10μl(＜1000ng)

或pDDLS-2质粒      10μl(＜1000ng)；

按照常规方法，分别回收经酶切的pDDLS-2质粒以及启动子PKP片段，根据T4连接酶(TaKaRa，D2011A)操作说明，按照如下条件进行连接：

连接体系：            10μl

10X T4buffer          1μl

pDDLS-2质粒           1μl(20ng)

启动子片段            10～20ng

无菌水                补齐至9.5μl

T4 ligase(TaKaRa，D2011A) 0.5μl

T4buffer冰上融化，载体加入量20ng，加入10ng本发明所示片段即上述PCR得到的产物PYRUVATE KINASE PROMOTER，于16℃在节能型智能恒温槽中连接8h以上，得到pDDLS-2+PKP(PYRUVATEKINASE PROMOTER)质粒；

D、重组农杆菌EHA105-PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)细胞的制备

D1、将上述步骤C2构建的pDDLS-2+PKP(PYRUVATE KINASEPROMOTER)重组载体和作为对照的pDDLS-2质粒分别转化按照(《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)所述氯化钙方法制备的农杆菌EHA105的感受态细胞，具体方法如下：将农杆菌感受态细胞EHA105于超低温冰箱中取出，置于冰上解冻，融化后，加入5μl质粒即：pDDLS-2+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)重组载体，轻轻混匀，冰浴10mi n，放入液氮中冷冻5min，37℃解冻5min，加入800μl常温的LB液体培养基，28℃160rpm复苏3h，8000rpm离心30s，吸去上清，留下200μl吹匀，涂布于常规的加有kan-ri f(卡那霉素-利福平)双抗的平板上，28℃倒置培养2-3天，得到带有重组载体pDDLS-2+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)的重组农杆菌，命名为重组农杆菌EHA105-PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)；

D2、按照本发明所述的上述方法，得到带有pDDLS-2质粒的对照重组农杆菌，命名为重组农杆菌EHA105-pDDLS-2；

E、水稻愈伤组织的诱导和转化：

按照如下步骤诱导水稻愈伤组织，并分别用重组农杆菌EHA105-PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)和EHA105-pDDLS-2转化所述愈伤组织：

1)水稻日本晴变种种子去壳，70％乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1.5％的次氯酸钠消毒30min，期间剧烈摇动，消毒后用灭菌水清洗5次；将消毒后的种子置于表2所示的N6D培养基上，用封口膜封口；29.5℃光照培养3～4周，直至长出愈伤组织；

2)选取活跃生长的愈伤组织(黄白色，干燥，直径1～3mm)，在新的表2所示的N6D培养基上29.5℃光照培养3天，得继代培养的愈伤组织；

3)分别挑取上述步骤D1、D2所构建的重组农杆菌EHA105-PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)单菌落和EHA105-pDDLS-2)，于表5所示的添加有抗生素(50mg/l Kan，10mg/l Rif)的YM液体培养基上划线培养3天，培养温度28℃；分别刮取上述重组农杆菌置于30ml表4所示的添加有30μl AS的AAM培养基中(OD600＝0.05-0.1)，温和重悬农杆菌细胞；

4)将步骤2)的继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中；将步骤3)制备的农杆菌悬液倒入培养皿中，将愈伤组织浸入其中15min；

5)倒掉农杆菌悬液，将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体；于表3所示的N6-AS培养基上放一张灭菌滤纸，加1ml表4所示的含AS的AAM培养基，将愈伤组织转移至滤纸上，密封培养皿，28℃暗培养48～60h，使愈伤组织受感染；

6)将上述受感染的愈伤组织置于50ml灭菌管中，用灭菌水摇动清洗，直至上清液变澄清；将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素(Carb)的无菌水中以杀死农杆菌细胞；用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分，然后将其转移至含1mg/l潮霉素B(HmB)和50mg/lCarb的表3所示的N6-AS培养基上；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3～4周，诱导产生愈伤组织；

F、水稻愈伤组织中的GUS的表达：

为检测经过步骤E中的6)所转化的水稻愈伤组织中目的基因GUS的表达情况，通过常规方法对分别用重组农杆菌EHA105-PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)和EHA105-pDDLS-2转化的水稻愈伤组织进行染色，其中：GUS染色液的配方为(1ml)：610μl0.2M Na₂HPO₄溶液(pH＝7.0)；390μl 0.2M NaH₂PO₄溶液和10μl0.1M X-gluc；

分别将用重组农杆菌EHA105-PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)和EHA105-pDDLS-2转化的水稻愈伤组织浸泡在GUS染色液中，37℃保温至出现蓝色，拍照记录，结果如图5所示，经含有启动子的pDDLS-2+PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)重组载体的重组农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(图4左)经染色后呈现蓝色，经不含有启动子的pDDLS-2质粒重组农杆菌介导转化的水稻愈伤组织经GUS染色后颜色未发生变化(作为对照，如图4右)。结果显示，本发明所述单子叶植物启动子PKP(PYRUVATE KINASE PROMOTER)对GUS基因表达具有调控作用。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

表2N6D培养基

(用1N氢氧化钾调节pH值到5.8，封口后按常规方法灭菌，121℃下灭菌20分钟)

表3N6-AS共培养基

表4AAM培养基

(加1N氢氧化钾调节pH值至5.2，按常规方法灭菌，121℃下灭菌20分钟)

表5YM液体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)：

表6YM固体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)：

序列表

<160>1

 

<210>1

 

<211>1357

 

<212>DNA

 

<213>水稻(Oryza sativa)

 

<400>1

 

gttgacttcg gtgcaggatg atcaatggac gcaaccacgt ctgcccatcg cgtgtacgta  60

cactgttggt caatcgtcac aagagaattc gaactgcaga ttctttctaa attttttttg  120

gcaaaacaaa acaaattaat gttttggccg tgtttagttg ttttggaaaa aaaattatca  180

tatacataca cacatttgaa gtattaaacg tagactaata acaaaactaa ttacagaatc  240

cgtcagtaaa tcgcgagacg aatttattaa gtctaattaa tctgttatta aaaaatgttt  300

actgtaacat cacattatca aatcatggcg taattaggct caaaagattc atctcgtaat  360

ttacatgtaa attgtttttt cgtccacatt taatacttat acatgtgtgc aaatgatgtg  420

aaggaaaaat taaaagttta aagggaacta aacacagcaa aaataacaaa atgatggagg  480

aatagaagca gagttgtgga gatgtagaga gaaaggaaaa cggaagagga gaaagaccag  540

gcagccagct agcagatgga tcgctggacc gacgaatggg aaacagaggg tgaggtcgcg  600

gtttttgacg cggacgtcgc tggttttgcc ggatgctggc gccgccctga ttgcccaccg  660

ccccatcgcc gttcgctggt atatgccgtt gtcttggaat catctcctcg agatgtcaaa  720

ctcaccccgg gattagcacg cccacacact ttacccaacc aactccattc agtgcgattt  780

tggccagtaa ttagccacac tgcatattag ccacgacacc acaagtttca aattataaac  840

cttaaagttg tgttaagttc atgttaaaat taaaaattta attgaaatta aaatgatacg  900

acagaaaagt taaaagttta tgtacgtagg aaagttttga tgtgataaaa aaatttagaa  960

atttgaaaaa aaaattgaga actaaaccag tcccaaatca aacagtccta ctagttgcat  1020

tttgtaactt cttccccaag aagatcagtg gggatgattt ccatgtggag aaatggagac  1080

agtgaggcag gcactgaatc gcctcacctc gaccctctgc ccctcaactc ggtggtgacc  1140

acgcgtccac atctctcatc tttctttctc cgctattctc ctccagtcct cttctcttct  1200

tcctccctcc cttcgcccac tgaatcgcca aaaaaattcc cctcctccac tccatctcta  1260

taaaaatcct cccccaaatc tcgcctcgtt tagccagcac aactcacaca actctctctc  1320

tctctctctc tctctctctc tcgtcgtctg caagctt                           1357

 

<160>1

 

<210>1

 

<211>2353

 

<212>DNA

 

<213>大肠杆菌、农杆菌穿梭载体

 

<400>2

 

gttggcaagc tgctctagcc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat     60

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt    120

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt    180

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat    240

tacgaattcg agctcggtac caagcttact agtcctgcag gtctagagga tccgtcgacc    300

atggtagatc tgagggtaaa tttctagttt ttctccttca ttttcttggt taggaccctt    360

ttctcttttt atttttttga gctttgatct ttctttaaac tgatctattt tttaattgat    420

tggttatggt gtaaatatta catagcttta actgataatc tgattacttt atttcgtgtg    480

tctatgatga tgatgatagt tacagaaccg acgactcgtc cgtcctgtag aaaccccaac    540

ccgtgaaatc aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg    600

aattgatcag cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg    660

cagttttaac gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta    720

tcagcgcgaa gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga    780

tgcggtcact cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg    840

cggctatacg ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg    900

tatcaccgtt tgtgtgaaca acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat    960

taccgacgaa aacggcaaga aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg   1020

aatccatcgc agcgtaatgc tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt   1080

ggtgacgcat gtcgcgcaag actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa    1140

tggtgatgtc agcgttgaac tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg    1200

cactagcggg actttgcaag tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct    1260

ctatgaactc gaagtcacag ccaaaagcca gacagagtct gatatctacc cgcttcgcgt    1320

cggcatccgg tcagtggcag tgaagggcca acagttcctg attaaccaca aaccgttcta    1380

ctttactggc tttggtcgtc atgaagatgc ggacttacgt ggcaaaggat tcgataacgt    1440

gctgatggtg cacgaccacg cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc    1500

gcattaccct tacgctgaag agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat    1560

tgatgaaact gctgctgtcg gctttcagct gtctttaggc attggtttcg aagcgggcaa    1620

caagccgaaa gaactgtaca gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt    1680

acaggcgatt aaagagctga tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag    1740

tattgccaac gaaccggata cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc    1800

ggaagcaacg cgtaaactcg acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg    1860

cgacgctcac accgatacca tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta    1920

cggatggtat gtccaaagcg gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact    1980

tctggcctgg caggagaaac tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac    2040

gttagccggg ctgcactcaa tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg    2100

gctggatatg tatcaccgcg tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg    2160

gaatttcgcc gattttgcga cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg    2220

gatcttcact cgcgaccgca aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac    2280

tggcatgaac ttcggtgaaa aaccgcagca gggaggcaaa caagctagcc accaccacca    2340

ccaccacgtg tga                                                       2353

Claims (6)

1.一种单子叶植物启动子，其特征在于其核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2.如权利要求1所述的单子叶植物启动子，其特征在于所述单子叶植物启动子是下述核苷酸序列之一：

A、在严格条件下与序列表中序列1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

B、对序列表中序列1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；

C、与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

3.含有权利要求1所述的单子叶植物启动子的重组载体，其特征在于该重组载体为pDDLS-2+PKP即：PYRUVATE KINASE PROMOTER重组载体，并通过将上述单子叶植物启动子插入到克隆载体或表达载体而得到，其中所述克隆载体包括但不限于pMD18-T，pUC9，所述表达载体包括但不限于pCambia1300，PDDLS-2。

4.含有权利要求3所述重组载体的重组细胞，其特征在于它通过将含有所述单子叶植物启动子的所述重组载体转化至宿主细胞而得到，其中，宿主细胞为大肠杆菌或者农杆菌菌株。

5.权利要求1所述的单子叶植物启动子在培育单子叶转基因植物中的应用。

6.如权利要求1所述的单子叶植物启动子的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

A、根据序列表中序列1所示的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，具体的PCT扩增引物对为：

上游引物F1：CGGGATCCGTTGACTTCGGTGCAGGATGA，其中下划线部分代表BamH1酶切位点；

下游引物R1：AAGCTTGCAGACGACGAGAG，其中下划线部分代表HindIII酶切位点；

B、以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用步骤A中所设计的PCR引物对进行PCR扩增。

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