CN102559507A - 用于制备感受态细胞的细胞与其用途、新颖的大肠杆菌与其用途以及制备感受态细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于制备感受态细胞的细胞与其用途、新颖的大肠杆菌与其用途以及制备感受态细胞的方法。本发明提供了一种用于制备感受态细胞的细胞，其中该细胞具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力，且该细胞用于感受态细胞的制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于制备感受态细胞的细胞，且特别涉及一种具备在细胞内自发性累积自体产生的(self-producing)海藻糖能力的细胞，以及以此细胞来制备感受态细胞的方法。
背景技术
使带有遗传信息的DNA分子进入宿主细胞的过程即所谓的“转化(transformation)”。而宿主细胞经过物理或化学方式处理而因此具有容易让DNA分子进入胞内的特性，即称为“感受态细胞(competent cell)”。在分子生物学领域及遗传工程操作上，为了使宿主细胞进行特定DNA或蛋白质的复制或表达，获得具有易于转化的感受态细胞，即成了重要而不可或缺的步骤。
由于大肠杆菌(Escherichia coli)具有生长快速、容易培养与研究较透彻等优势，目前已成为所有生物技术相关实验中最广泛地用作宿主细胞的微生物。在近代遗传工程技术演进的历程上，已有许多制备具转化能力的大肠杆菌感受态细胞的方法及转化程序，例如，最早1970年Mandel，M.和Higa A.(J.Mol.Biol.53：159)发表的CaCl2化学转化法，以及之后1983年Hanahan，D.(J.Mol.Biol.166：557)和1990年Inoue，H.(Gene 96：23)相继通过在转化试剂中加入其它不同浓度的阳离子和抗冻剂进行改良。而目前较佳的转化效率已可达约108转化子/微克质粒DNA(transformants/μg plasmid DNA)。
而根据上述制备具转化能力的大肠杆菌感受态细胞的方法所产生的感受态细胞，其后续所需的储藏温度仍皆需为-70至-80℃左右，才能使感受态细胞在保存数月后转化效率不至于明显降低。
近几年美国Life Technologies公司研发出一种对温度相对稳定型的感受态细胞的相关技术(美国专利号7,648,832)，其突破传统上感受 态细胞必需保存于-70至-80℃左右的低温才能维持稳定转化效率的限制。该实施方式是在制备和保存感受态细胞的试剂中添加特定糖类或化学聚合物分子作为抗冻保护剂，因而可将制备完成的感受态细胞置于较高温度(例如：-20℃)保存，且又不会明显降低原有的转化效率。前述技术虽然在保存条件的要求上较先前传统制备方法节能及方便运送，然而额外添加的特定抗冻保护剂相对地也提高了制备上的成本。
因此目前亟需开发出一种应用于感受态细胞的制备的新颖物件及方法，使因此产生的感受态细胞可于较高温进行保存并同时达到节能、低成本与易于运送等优点，进而使生物细胞的基因转化技术的实施更为简易且经济。
发明内容
本发明提供一种用于制备感受态细胞的细胞，其中该细胞具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力，且该细胞用于感受态细胞的制备。
本发明另外提供一种将具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力的细胞用于制备感受态细胞的用途。
本发明还提供一种大肠杆菌(Escherichia coli)，命名为大肠杆菌EcDTre001，其保藏于中国台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为BCRC No.910491，其中该大肠杆菌具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力。
所述大肠杆菌(命名为大肠杆菌(Escherichia coli)EcDTre001)也于2010年11月11日保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)，Inhoffenstr.7B，D-38124不伦瑞克)，保藏号为DSM 24175。
本发明还提供一种将上述大肠杆菌用于制备感受态细胞的用途。
本发明又提供一种制备感受态细胞的方法，包括：培养上述用于制备感受态细胞的细胞以获得细胞悬浮液；将该细胞悬浮液置于冰浴中；离心该细胞悬浮液以获得细胞沉淀；混合转化试剂和该细胞沉淀；以及获得感受态细胞悬浮液。
为了让本发明的上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂， 下文特举优选具体实施方案，并配合所附图式，详细说明如下：
附图说明
图1为曲线图，其显示WT和TG两种感受态细胞悬浮液在以-20℃保存6个月间的转化效率的稳定度差异。
图2为长条图，其显示WT(a)、TG(a)、WT(b)和TG(b)四种感受态细胞悬浮液以-80℃及-20℃保存6个月间的转化效率的稳定度差异。
图3A显示，在实施例3中形成WT-B和TG-B组的感受态细胞悬浮液的过程。
图3B为长条图，其显示WT、WT-B、TG和TG-B四组感受态细胞悬浮液在以-20℃保存6个月后的转化效率的差异。
主要组件符号说明
301～铝珠；
303～感受态细胞悬浮液；
305～试管；
307～感受态细胞悬浮液与铝珠的混合物；
309～质粒；
311～冰浴；
313～热休克；
315～琼脂培养基。
具体实施方式
在本发明中，本发明提供一种具备在细胞内自发性累积自体产生的(self-producing)海藻糖(trehalose)的能力的细胞，并将此细胞用于感受态细胞的制备。在细胞内累积的海藻糖可帮助细胞内蛋白质避免因低温造成的变性与聚集，同时也具有稳定细胞膜的功能。因此，由本发明细胞所制备出的感受态细胞，相对于先前技术具有可在相对于较高温且不需外加特定糖类或化学聚合物分子为抗冻剂的环境中进行保存等优点，且具有高转化效率。
另外此处使用的措辞“自体产生的海藻糖”是指细胞内(within a cell)所产生的海藻糖，而非额外添加于细胞培养基的海藻糖。
上述本发明的细胞可通过对微生物进行随机突变筛选或遗传工程改造而获得，但不限于此。微生物可包括，但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母菌或霉菌。大肠杆菌可包括，但不限于DH5α、JM109、XL1-Blue、HB101或BL21等。
在一个具体实施方案中，本发明的细胞通过对微生物进行遗传工程改造而获得。上述遗传工程改造可包括使微生物过表达至少一个内源性编码海藻糖合成相关酶的基因、和/或敲除微生物基因组中至少一个内源性编码海藻糖分解相关酶的基因、和/或将至少一个编码外源性海藻糖合成相关酶的基因引入微生物的基因组中。在一个具体实施方案中，使微生物过表达至少一个内源性编码海藻糖合成相关酶的基因是通过将至少一个与目标微生物基因组中的特定基因的核苷酸序列相同或相似的核苷酸序列插入目标微生物中实现的。
通过一般重组技术可实现上述微生物遗传工程改造(参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press.)。
在一个具体实施方案中，微生物遗传工程改造可以下述方法来进行。通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)从与目标微生物同种的细胞获得上述至少一个编码海藻糖合成相关酶的基因的核苷酸序列，和/或通过聚合酶链式反应从一种与目标微生物不同种的细胞获得上述至少一个编码海藻糖合成相关酶的基因的核苷酸序列。待获得的酶基因的信息可从例如GenBank检索。若需要的话，可根据所使用的目标微生物的不同，将所获得的序列进行编码最佳化以使其以后在宿主微生物中获得最佳使用。
之后，将由此制备的至少一个编码出海藻糖合成相关酶基因的核苷酸序列，和/或至少一个编码出海藻糖合成相关酶基因的核苷酸序列插入适合其表达的载体以产生表达上述酶的DNA构建体(DNAconstruct)。
或者，进一步将上述DNA构建所形成的基因表达盒的两端，再各连结一段可与编码出海藻糖分解相关酶基因的核苷酸序列进行重组交换进而删除此海藻糖分解相关酶基因的核苷酸序列。
或是制备出至少一段可与目标微生物基因组中编码出海藻糖分解 相关酶的基因的核苷酸序列进行重组交换进而删除此基因的核苷酸序列。
然后，将包含于表达构建体中的上述基因表达盒或上述可与目标细胞基因组中编码出海藻糖分解相关酶的基因的核苷酸序列进行重组交换进而删除此海藻糖分解相关酶基因的核苷酸序列引入目标细胞中，并选择阳性转化子(positive transformant)以获得本发明的经遗传工程改造的细胞。
又通过本技术领域所知的方法，例如，免疫印迹或酶活性分析，可确认上述基因的过表达或沉默删除，或者基因的插入。
此处使用的措辞“海藻糖合成相关酶”是指参与海藻糖合成的酶(例如，叙述于Seo等人，Appl.Environ.Microbiol.，66(6)：2484-2490，2000中的大肠杆菌(Escherichia coli)海藻糖合成相关酶)，其可为将其它分子经过至少一步的反应而转换为海藻糖(trehalose)的单一酶或酶群或其功能等同物(functional equivalents)。
在一个具体实施方案中，上述海藻糖合成相关酶可包括，但不限于海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase，TPS)(EC2.4.1.15)、海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP)(EC 3.1.3.12)、α，α-海藻糖磷酸合成酶(UDP形成)(α，α-trehalose-phosphate synthase(UDP-forming))(EC 2.4.1.15)、α，α-海藻糖合成酶(α，α-trehalose synthase)(EC 2.4.1.245)、海藻糖磷酸酶(trehalose-phosphatase)(EC 3.1.3.12)、4-α-D-((1→4)-α-D-葡萄糖酸)海藻糖水解酶(4-alpha-D-((1→4)-alpha-D-glucano)trehalosetrehalohydrolase)(EC 3.2.1.141)、(1→4)-α-D-葡聚糖1-α-D-葡糖基变位酶((1→4)-α-D-glucan 1-α-D-glucosylmutase)(EC 5.4.99.15)、α-D-葡萄糖基转移酶(α-D-glucosyltransferase)(EC 5.4.99.16)和/或前述酶的功能等同物等。上述海藻糖合成相关酶的详细资料如表1所示。
表1、示范的海藻糖合成相关酶
另外此处使用的措辞“海藻糖分解相关酶”是指参与海藻糖分解的酶(例如，叙述于Durfee等人，J.Bacteriol.，190(7)：2597-2606，2008)中的大肠杆菌海藻糖分解相关酶的基因)，其可为具有将海藻糖转换为其它小分子糖的能力的单一酶或酶群或其功能等同物。
在一个具体实施方案中，上述海藻糖分解相关酶可包括，但不限于细胞质海藻糖酶(cytoplasmic trehalase)、周质海藻糖酶(periplasmictrehalase)和/或前述酶的功能等同物等。
措辞“内源性酶基因”或其类似用语，是指目标微生物基因组中的特定酶的基因，或是指编码出酶的基因，其核苷酸序列与目标微生物基因组中的特定基因的核苷酸序列相同或相似者。措辞“外源性酶基因”或其类似用语，是指来自于与目标细胞不同种的微生物基因组中特定酶的基因。
在一个具体实施方案中，本发明的细胞可通过使大肠杆菌DH5α的细胞过表达至少一个内源性编码海藻糖合成相关酶的基因和敲除大肠杆菌DH5α基因组中至少一个内源性编码海藻糖分解相关酶的基因来获得。而在此具体实施方案中，海藻糖合成相关酶可包括海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶。海藻糖-6-磷酸合成酶的氨基酸序列和海藻糖-6-磷酸磷酸酶的氨基酸序列可分别为序列辨识号：1的序列和序列辨识号：2的序列。编码出海藻糖-6-磷酸合成酶基因的核苷酸序列与编码出海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因的核苷酸序列可分别为序列辨识号：3的序列和序列辨识号：4的序列，或与前述序列具有至少80％序列同源性(sequence homology)的序列，例如前述序列中其多个碱基经增加、缺失和/或置换后，仍具有至少80％的核苷酸序列是相同的序列。序列同源性可通过例如BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、FASTA(http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/)等公知软件比对两种以上的核苷酸序列而获得相似度。序列同源性愈高者，其所编码的蛋白通常具有相似的生物活性。另外在此具体实施方案中，海藻糖分解相关酶可包括细胞质海藻糖酶和/或周质海藻糖酶。编码出细胞质海藻糖酶基因的核苷酸序列为序列辨识号：5的序列(treF)，而编码出周质海藻糖酶基因的核苷酸序列为序列辨识号：6的序列(treA)。
在另一个具体实施方案中，本发明的细胞可通过将编码出海藻糖-6-磷酸合成酶基因的核苷酸序列和编码出海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因的核苷酸序列插入大肠杆菌DH5α的基因组中使内源性编码的海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因过表达，以及敲除大肠杆菌DH5α的基因组编码的细胞质海藻糖酶的基因来获得，其中编码出海藻糖-6-磷酸合成酶基因的核苷酸序列和编码出海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因的核苷酸序列分别为序列辨识号：3的序列和序列辨识号：4的序列，而编码出细胞质海藻糖酶的核苷酸序列分别为序列辨识号：5的序列，或与前述序列具有至少80％序列相似性的序列。而依照上述方法获得的大肠杆菌DH5α，命名为大肠杆菌EcDTre001的大肠杆菌，其于中国台湾2010年11月18日保藏于中国台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为BCRC No.910491。所述大肠杆菌也于2010年11月11日保藏在德国微生物菌种保藏中心DSMZ，保藏号为 DSM 24175。
由本发明细胞所制备出的感受态细胞可储存于-10℃以下，优选为-20℃以下。另外由本发明细胞所制备出的感受态细胞，其转化效率可达约107-109转化子/微克质粒DNA(transformants/μg plasmid DNA)。
由上述可知，本发明的细胞具备成为制造成本低和转化效率高的感受态细胞的潜力，因此，在本发明另一方面，本发明提供一种将本发明具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力的细胞用于制备感受态细胞的用途。另外本发明还提供一种新颖的大肠杆菌，其命名为大肠杆菌EcDTre001，其保藏于中国台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为BCRC No.910491，所述大肠杆菌也于2010年11月11日保藏在德国微生物菌种保藏中心DSMZ，保藏号为DSM 24175，以及将此大肠杆菌用于制备感受态细胞的用途，而此大肠杆菌具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力。
另外在本发明的另一方面，本发明提供一种制备感受态细胞的方法，其可包括如下所述的步骤。
首先将前述本发明的细胞进行培养以获得细胞悬浮液。在一个具体实施方案中，培养细胞的温度可为约20-40℃，优选为约37℃。另外，在一个具体实施方案中，培养时间可为约12-18小时，优选为约16小时。
接着，将上述培养步骤所得的细胞悬浮液置于冰浴中。在一个具体实施方案中，冰浴温度可为约0-10℃，优选为约0-4℃。另外，在一个具体实施方案中，细胞悬浮液置于冰浴的时间可为约0-120分钟，优选为约20分钟。
接着，在进行冰浴之后，将上述细胞悬浮液进行离心以获得细胞沉淀。
然后将转化试剂与上述细胞沉淀均匀混合。转化试剂可包括任何可促使宿主细胞变得容易让DNA分子进入其胞内的试剂。在一个具体实施方案中，转化试剂可包括本技术领域中常用的转化试剂，例如Mandel，M.和Higa A.(J.Mol.Biol.53：159)(1970)或Inoue，H.(Gene96：23)(1990)文献中所调配使用的转化试剂。
在上述转化试剂与上述细胞沉淀均匀混合后，即获得感受态细胞 悬浮液，其中此感受态细胞悬浮液中含有由本发明细胞所形成的感受态细胞。
由上述方法所获得的感受态细胞悬浮液可保存于约-10℃以下，优选为约-10至-130℃。在一个具体实施方案中，上述感受态细胞悬浮液细胞存于约-20℃。
此外，在一个具体实施方案中，上述本发明的制备感受态细胞的方法，还可包括将至少一个固体球状物加至该感受态细胞悬浮液中。固体球状物可为无菌的或经过灭菌处理。固体球状物的形成材料可为热传导比上述转化试剂(液态)更快速的材料，例如玻璃、陶瓷、不锈钢、铁或铝等，但不限于此。固体球状物的粒径可为约2-6mm，优选为约3-5mm。
熟知本技术领域的技术人员已知，在将所制备出的感受态细胞进行标准转化的过程中，热休克是为了提升感受态细胞的通透性的步骤。热休克为一种简单而有效的方式，但实施热休克时若时间太长会导致细胞衰弱、太短则会造成通透性不足，加上置于试管内细胞液容易受热不均，而导致细胞的转化效率明显降低。
而本发明在所获得的感受态细胞悬浮液中加入热传导性能好的固体球状物，可缩短标准转化过程中热休克步骤的时间，使试管内细胞受热均匀，达到通透性良好且热损伤低的稳定转化效率。此外，固体球状物也可直接用作转化过程最后步骤的菌液涂布工具，较以往的实施方法更具省时、方便且大幅降低杂菌污染率的优势。在一个具体实施方案中，在本发明所获得的感受态细胞悬浮液中加入热传导性能好的固体球状物可使感受态细胞的转化效率增加约3至10倍，换句话说，转化效率可达109转化子/微克质粒DNA(transformants/μg plasmidDNA)。
实施例
材料与方法
1.本发明具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力的细胞的制备：
以预先制备完成的大肠杆菌(Escherichia coli)基因组DNA为模板来源，设计以下两组DNA序列片段为引物，利用聚合酶链式反应(PCR， Polymerase Chain Reaction)分别取得大肠杆菌的海藻糖合成相关酶，海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase，TPS)基因的完整序列(序列辨识号：3)及海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trehalose-6-phosphatephosphatase，TPP)基因的完整序列(序列辨识号：4)：
(P1f)TPS-RE_F：GGACTAGTCCCCCCCGGGGGATGAGTCGTTTAGTCGTAGT(序列辨识号：7)
(P1r)TPS-L_R：TCCGCGCTGCGGCTGCCCAGCGCAAGCTTTGGAAAGGTAG(序列辨识号：8)
(P2f)TPP-L_F：GCAGCCGCAGCGCGGAACTGGTGACAGAACCGTTAACCGA(序列辨识号：9)
(P2r)TPP-RE_R：CCGGAATTCCGGTACGTACTTAGATACTACGACTAAACG(序列辨识号：10)
利用上述获得的PCR产物的完整基因片段混合液为模板，设计下列一对DNA序列片段为引物，经PCR反应后，得到一段含有海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase，TPS)基因(序列辨识号：3)及海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP)基因(序列辨识号：4)的TPSP融合基因DNA片段：
(P3f)TPSP-RE_F：GGACTAGTCCCCCCCGGGGG(序列辨识号：11)
(P3r)TPSP-RE_R：CCGGAATTCCGGTACGTAC(序列辨识号：12)
接着以pJET 1.2(Fermentas，USA)为克隆载体(cloning vector)，以限制酶及连接酶的剪接操作方式将“TPSP融合基因DNA片段”构建于载体中，完成pJET-TPSP。
以前述相同方式，利用大肠杆菌(Escherichia coli)基因组DNA为模板，设计下列一对DNA序列片段为引物，经PCR反应后，得到一段编码含EPGI启动子(promoter)的DNA片段：
(P4r)EPGI-P_F：CACGGATAACGTTCGGGTAAC(序列辨识号：13)
(P4r)EPGI-P_R：TAGCAATACTCTTCTGATTTTG(序列辨识号：14)
再以pJET-TPSP为克隆载体，以剪接操作方式将“EPGI启动子的 DNA片段”构建于载体中，完成pJET-EPGI::TPSP。
同样的方式，利用大肠杆菌基因组DNA为模板，设计以下两组DNA序列片段为引物，经PCR反应后，分别取得treF500L和treF500R的两段DNA片段，其分别含有细胞质海藻糖酶(cytoplasmic trehalase)基因(treF基因)(序列辨识号：5)的1-500bp和1151-1650bp：
(P5f)treF-L_F：CACGGATAACGTTCGGGTAAC(序列辨识号：15)
(P5r)treF-L_R：TAGCAATACTCTTCTGATTTTG(序列辨识号：16)
(P6f)treF-R_F：CACGGATAACGTTCGGGTAAC(序列辨识号：17)
(P6r)treF-R_R：TAGCAATACTCTTCTGATTTTG(序列辨识号：18)
再以pJET-EPGI::TPSP为克隆载体，以剪接操作方式将“treF500L和treF500R的两段DNA片段”分别构建于载体中EPGI::TPSP的DNA片段的上下游端，完成pJET-treF500L::EPGI::TPSP::treF500R。
另外，利用限制酶将pJET-treF500L::EPGI::TPSP::treF500R环形质粒上的“treF500L::EPGI::TPSP::treF500R”的DNA片段切下，形成一段直线型DNA。接着，再以大肠杆菌的电穿孔转化法将该DNA片段整合至胞内，经同源重组反应机制后，再通过菌落(colony)PCR及免疫印迹分析实验进行筛选，获得的阳性转化子(positive transformant)即为本发明具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力的大肠杆菌菌株。
将所获得的大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌EcDTre001(TG)的大肠杆菌，并将其于中国台湾2010年11月18日保藏于中国台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为BCRC No.910491。所述大肠杆菌也于2010年11月11日保藏在德国微生物菌种保藏中心DSMZ，保藏号为DSM 24175。
2.感受态细胞的制备
上述所获得的具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力的大肠杆菌菌株EcDTre001(TG)为感受态细胞来源。将EcDTre001菌株从单一菌落接种于5ml LB培养基，以37℃进行培养16小时后，将上述菌液以1∶100的比例接种于新的50ml LB培养基中，再继续培养 至菌液的OD600吸光值接近0.3～0.6。接着将上述菌液置于0-4℃冰浴处理，之后以3000rpm离心数分钟移除上清液以获得细胞沉淀。将转化试剂(其依照(a)Mandel，M.和Higa A.(J.Mol.Biol.53：159)(1970)，或者是(b)Inoue，H.(Gene 96：23)(1990))文献内容所述的成分进行配制)与细胞沉淀均匀混合形成感受态细胞悬浮液。将感受态细胞悬浮液分装至1.5ml离心管中。
3.转化步骤
将100μl感受态细胞悬浮液解冻，加入0.1ng pUC19质粒均质混合。加入质粒后，将感受态细胞悬浮液置于冰浴中30分钟。接着将感受态细胞悬浮液置于42℃进行热休克1.5分钟。热休克后，将感受态细胞悬浮液置于冰上2分钟、加入900μl SOC培养液，且于37℃震荡培养45分钟形成培养菌液。之后将菌液涂布于含特定抗生素的LB琼脂培养基上。
实施例
实施例1：
将传统DH5α(WT)和本发明EcDTre001(TG)以较高温度(-20℃)储存后的转化效率上的差异
选择市售传统DH5α(WT)及本发明EcDTre001(TG)为制作感受态细胞的宿主，以前述的感受态细胞制备流程为标准程序(其中，转化试剂为依照(a)Mandel，M.和Higa A.(J.Mol.Biol.53：159)(1970)文献内容所述的成分来配制)进行感受态细胞的制备，并分别获得WT和TG两种感受态细胞悬浮液。
将上述两种感受态细胞悬浮液，置于-20℃进行为期6个月的保存，之后自冷冻柜取出，以pUC19为质粒，以前述的转化步骤为标准程序对感受态细胞进行转化。上述两种感受态细胞的转化效率结果如图1所示。
图1显示本发明的EcDTre001(TG)，在经过为期6个月较高温度(-20℃)的储存后，仍可维持稳定转化效率。本发明的EcDTre001(TG)突破了传统感受态细胞株必需保存于-70至-80℃左右低温的限制。
实施例2：
本发明的基因修饰的EcDTre001(TG)感受态细胞以不同方法制备 后的转化效率上的差异
选择市售传统DH5α(WT)及本发明EcDTre001(TG)为制作感受态细胞的宿主。两者细胞皆分别以依照(a)Mandel，M.和Higa A.(J.Mol.Biol.53：159)(1970)，或者是(b)Inoue，H.(Gene 96：23)(1990)文献内容所述成分配制的转化试剂的前述感受态细胞制备流程为标准程序进行感受态细胞的制备，并分别获得(a)WT、(a)TG、(b)WT和(b)TG四种感受态细胞悬浮液。
将上述所获得的四种感受态细胞悬浮液WT(a)、TG(a)、WT(b)和TG(b)，分别置于-80℃及-20℃保存，为期6个月，之后自冷冻柜取出，以pUC19为质粒，以前述的转化步骤为标准程序对感受态细胞进行转化。上述四种感受态细胞的转化效率结果如图2所示。
图2显示通过本发明的EcDTre001(TG)，无论以方法(a)或(b)流程进行制备，在经过为期6个月较低温(-80℃)或高温(-20℃)的储存后，皆不影响其原来的转化效率，即证实EcDTre001(TG)的转化效率稳定。
实施例3：
在含悬浮细胞的转化试剂中加入固体球状物对感受态细胞转化效率的影响
选择市售传统DH5α(WT)及本发明的EcDTre001(TG)为制作感受态细胞的宿主，以前述的感受态细胞制备流程为标准程序(其中，转化试剂为依照(b)Inoue，H.(Gene 96：23)(1990)文献内容所述的成分来配制)进行感受态细胞的制备，并分别获得WT和TG两种感受态细胞悬浮液。其中两种不同宿主细胞的制备完成后，再将所获得的且分别获得的WT和TG两种感受态细胞株分别分成两组，其中将一组加入3颗大小为5mm热传导性良好的4℃预冷的铝珠至感受态细胞悬浮液中以分别形成WT-B和TG-B组的感受态细胞悬浮液。因此共获得WT、WT-B、TG和TG-B四组感受态细胞悬浮液。
将上述四种感受态细胞悬浮液，置于-20℃保存，为期6个月；之后自冷冻柜取出，以pUC19为质粒，以前述转化步骤为标准程序对感受态细胞进行转化，其中在转化过程中的热休克步骤的时间缩短为20秒，且WT-B和TG-B组直接以铝珠做为菌体涂布工具。WT-B和TG-B组形成的过程如图3A所示。WT、WT-B、TG和TG-B四组感受态细 胞的转化效率分别如图3B所示。图3A显示，将铝珠301加入含感受态细胞悬浮液303的试管305中。接着将含感受态细胞的悬浮液与铝珠的混合物307的试管301储存于-20℃，6个月。然后以pUC19为质粒，对感受态细胞进行转化。首先将感受态细胞悬浮液与铝珠的混合物307解冻并在其中加入质粒309之后，将感受态细胞悬浮液与铝珠的混合物307置于冰浴311中30分钟。接着将感受态细胞悬浮液与铝珠的混合物307置于42℃，20秒以进行热休克313。热休克313后，将感受态细胞悬浮液与铝珠的混合物307置于冰浴311中2分钟、加入900μl SOC培养液，且于37℃震荡培养45分钟。培养后，将感受态细胞悬浮液与铝珠的混合物307涂布于含特定抗生素的LB琼脂培养基315上。
图3B显示通过本发明的TG和TG-B，在经过为期6个月较高温(-20℃)的储存后，突破了传统感受态细胞必需保存于-70至-80℃左右低温才能维持稳定转化效率的限制；另外，WT-B和TG-B(含有铝珠)相对于WT和TG(不含有铝珠)而言，其转化效率皆相对提升了3-10倍，TG-B可达1.5×109转化子/微克质粒DNA(transformants/μg plasmidDNA)。
实施例4：
不同材质固体球状物对感受态细胞转化效率的差异
以本发明的EcDTre001(TG)为制作感受态细胞的宿主，以前述的感受态细胞制备流程为标准程序(其中，转化试剂为依照(b)Inoue，H.(Gene 96：23)(1990)文献内容所述的成分来配制)进行感受态细胞的制备，其中在制作的最后一步，加入3颗大小为5mm热传导性良好的4℃预冷的固体球状物至感受态细胞悬浮液中。本实验共制备出分别含有“玻璃球”、“不锈钢球”、“铝球”和“不含球状物”的四组感受态细胞悬浮液。
将上述四组感受态细胞悬浮液，置于-20℃进行为期6个月的保存，之后自冷冻柜取出，以pUC19为质粒，以前述的转化步骤为标准程序对感受态细胞进行转化。上述四组感受态细胞悬浮液的转化效率如表2所示。
表2.示范不同材质固体球状物对感受态细胞转化效率的差异
根据表2可了解，经本发明加入的固体球状物对感受态细胞转化效率皆具有正向提升的效果。
虽然本发明已以优选实施例公开如上，然而这并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作出适当的修改与改进，因此本发明的保护范围应该以随附的权利要求所界定的范围为准。
Claims (25)
1.一种用于制备感受态细胞的细胞，其中该细胞具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力，且该细胞用于感受态细胞的制备。
2.如权利要求1所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中该细胞通过对微生物进行随机突变筛选或遗传工程改造而获得。
3.如权利要求2所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中所述微生物包括大肠杆菌、酵母菌或霉菌。
4.如权利要求3所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中所述大肠杆菌包括DH5α、JM109、XL1-B1ue、HB101或BL21。
5.如权利要求2所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中所述遗传工程改造包括使所述微生物过表达至少一个内源性编码海藻糖合成相关酶的基因、和/或敲除所述微生物基因组中至少一个内源性编码海藻糖分解相关酶的基因、和/或将至少一个编码外源性海藻糖合成相关酶的基因引入该微生物的基因组中。
6.如权利要求5所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中该海藻糖合成相关酶包括海藻糖-6-磷酸合成酶(EC 2.4.1.15)、海藻糖-6-磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.12)、α，α-海藻糖磷酸合成酶(UDP形成)(EC 2.4.1.15)、α，α-海藻糖合成酶(EC 2.4.1.245)、海藻糖磷酸酶(EC 3.1.3.12)、4-α-D-((1→4)-α-D-葡萄糖酸)海藻糖水解酶(EC 3.2.1.141)、(1→4)-α-D-葡聚糖1-α-D-葡糖基变位酶(EC 5.4.99.15)、α-D-葡萄糖基转移酶(EC5.4.99.16)和/或前述酶的功能等同物。
7.如权利要求5所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中所述海藻糖分解相关酶包括细胞质海藻糖酶、周质海藻糖酶和/或前述酶的功能等同物。
8.如权利要求1所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中该细胞通过使大肠杆菌DH5α的细胞过表达至少一个内源性编码海藻糖合成相关酶的基因和敲除该大肠杆菌DH5α的细胞基因组中至少一个内源性编码海藻糖分解相关酶的基因来获得。
9.如权利要求8所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中所述海藻糖合成相关酶包括海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶。
10.如权利要求9所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中所述海藻糖-6-磷酸合成酶的氨基酸序列和该海藻糖-6-磷酸磷酸酶的氨基酸序列分别为序列辨识号：1的序列和序列辨识号：2的序列。
11.如权利要求9所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中编码所述海藻糖-6-磷酸合成酶基因的核苷酸序列和编码所述海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因的核苷酸序列分别为序列辨识号：3的序列和序列辨识号：4的序列，或与前述序列具有至少80％序列相似性的序列。
12.如权利要求8所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中该海藻糖分解相关酶包括细胞质海藻糖酶。
13.如权利要求12所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中编码该细胞质海藻糖酶基因的核苷酸序列为序列辨识号：5的序列，或与前述序列具有80％序列相似性的序列。
14.如权利要求8所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中所述海藻糖分解相关酶包括周质海藻糖酶。
15.如权利要求14所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中编码出该周质海藻糖酶基因的核苷酸序列为序列辨识号：6的序列，或与前述序列具有80％序列相似性的序列。
16.如权利要求1所述的用于制备感受态细胞的细胞，其中所述细胞于2010年11月11日保藏在德国微生物菌种保藏中心，保藏号为DSM 24175。
17.一种将具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力的细胞用于制备感受态细胞的用途。
18.一种新颖的大肠杆菌，其保藏于德国微生物菌种保藏中心，保藏号为DSM 24175，其中该大肠杆菌具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力。
19.一种将权利要求18所述的大肠杆菌用于制备感受态细胞的用途。
20.一种制备感受态细胞的方法，包括：
培养如权利要求1所述的用于制备感受态细胞的细胞以获得细胞悬浮液；
将该细胞悬浮液置于冰浴中；
离心该细胞悬浮液以获得细胞沉淀；
混合转化试剂和该细胞沉淀；以及
获得感受态细胞悬浮液。
21.如权利要求20所述的制备感受态细胞的方法，其中所述感受态细胞悬浮液保存于-10℃以下。
22.如权利要求20所述的制备感受态细胞的方法，其中所述感受态细胞悬浮液保存于-20℃。
23.如权利要求20所述的制备感受态细胞的方法，另外包括将至少一个固体球状物加至所述感受态细胞悬浮液中。
24.如权利要求23所述的制备感受态细胞的方法，其中所述固体球状物的形成材料包括玻璃、陶瓷、不锈钢、铁或铝。
25.如权利要求23所述的制备感受态细胞的方法，其中所述固体球状物的粒径为约2-6mm。
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