CN101519652A - 海藻糖合成酶及其编码基因与它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海藻糖合成酶及其编码基因与应用。该海藻糖合成酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有海藻糖合成酶相关功能的由SEQ ID №：1衍生的蛋白质。以麦芽糖为底物，用该海藻糖合成酶蛋白进行催化，可得到海藻糖，并且该催化反应具有催化时间短、所需底物浓度低，以90mM麦芽糖为底物，催化8小时，转化率达69％的优点。

Description

海藻糖合成酶及其编码基因与它们的应用

技术领域

本发明涉及一种海藻糖合成酶及其编码基因与应用。

背景技术

海藻糖由两个吡喃环葡萄糖以1，1-糖苷键连结而成，是一种非还原性二糖。海藻糖有3种光学异构体，其中αβ和ββ型在自然界中很少存在，αα型是最常见的海藻糖，αα型海藻糖结构式如式I所示。

(式I)

海藻糖无色无嗅，口感略带甜味，其甜度相当于蔗糖的45％。海藻糖的理化性质稳定，不会焦糖化，不能使斐林试剂还原，也不能被α-糖苷酶水解，但能被海藻糖酶水解为两个葡萄糖分子。

海藻糖的制备方法：传统方法有化学合成法和微生物抽提法，特别是酵母提取法曾经是海藻糖的主要商品生产方式。但这些方法产品收率低，制造成本过高，价格昂贵，近年来已经逐步被淘汰。

海藻糖的生物合成途径有5种，磷酸化酶法利用转基因植物生产海藻糖，有关研究在国内外也颇为活跃。荷兰植物生物技术公司将编码大肠杆菌的6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖酯酶的基因OtsA和OtsB导入甜菜、马铃薯基因组中，然后从块茎中提取海藻糖。其缺点是目前块茎中海藻糖的含量还不够高。酶转化法是制备海藻糖的新方法。1990年意大利M De Rosa小组首先发现了能够将淀粉水解物转化为海藻糖的酶，但未申请专利。1994年日本林原生化研究所发明了用两种酶，即麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖基海藻糖水解酶(MTHase)，协同作用，由淀粉直接酶法生产海藻糖。配合其它淀粉水解酶，海藻糖转化率可达70％。1995年林原公司实现了双酶转化法的工业化生产，是当时海藻糖生产方法中成本最低的途径。

酶转化法分为两种：双酶法和单酶法。单酶法是由TreS基因编码的海藻糖合成酶通过分子内转糖基作用，可把海藻糖转化为麦芽糖：

双酶法首先由MTSase作用于麦芽糊精末端，催化分子内的转糖基化，形成麦芽寡糖基海藻糖。然后在MTHase作用下断裂麦芽寡糖和海藻糖间的α-1，4-糖苷键，释放出海藻糖。编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因分别是Trey和TreZ。

这两种酶系在自然界的微生物中广泛存在，至少有15个菌属含有上述单酶或双酶系，但主要存在于古细菌、极端环境微生物中，或是在极端环境下诱导生成。关于海藻糖生成和代谢机制的研究一直是极端微生物(Extremophiles)研究的热点课题，在Nature，Science等顶级杂志上常有相关论文，也有大量研究课题，如近年的欧盟课题QLK1-CT-2000-01376；POCTI/BIO/48333/2002.有大量关于海藻糖合成酶系的基因工程表达研究，但海藻糖合成酶基因的编码特征特殊，在异源生物中不易表达，或表达量偏低，因此虽然有大量论文发表，但很少有依据基因工程表达申报的专利公开，据此推测相关技术尚待研究开发。

经过联网检索，关于海藻糖的酶法转化共检索到23个专利。其中林原生化研究所的国际专利01100417.7是日本生产海藻糖的主要方法。南宁中诺生物工程有限责任公司申请的中国专利200410013006.9公开的一种海藻糖合成酶，在40L发酵罐水平上表达，以27.27％的麦芽糖为底物，转化时间32h，转化率70％。是目前国内生产海藻糖的主要方法。中国专利200410013007.3、200410013008.8结果类似。

工业化生产：1995年日本林原Hayashibara公司首先实现了双酶法规模化生产海藻糖，大幅降低了生产成本和产品价格。目前海藻糖生产生产企业主要有日本林原研究所、美国Cargill公司、广西南宁中诺公司。其中广西南宁中诺公司通过选用木薯淀粉做原料，优化转化工艺，已经将海藻糖的价格降低到25000元/吨。

长期以来制约海藻糖广泛应用的根本原因是生产成本偏高。由于海藻糖和麦芽糖一样，都由淀粉二步转化生成：麦芽糖由淀粉酶和糖化酶转化，海藻糖由麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶转化，因此一旦海藻糖生产酶的产量、生产成本和效率能够和麦芽糖生产酶的一样，海藻糖的价格就可以和麦芽糖一样，其的产品竞争力和市场份额将非常巨大。

发明内容

本发明的目的是提供一种海藻糖合成酶及其编码基因与应用。

本发明所提供的海藻糖合成酶，来源于金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)名称为AA-TreS；是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与海藻糖合成酶相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由598个氨基酸残基组成。

所述一个或数几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

为了使(a)中的AA-TreS便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

 

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的AA-TreS可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的AA-TreS的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述海藻糖合成酶(AA-TreS)的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述海藻糖合成酶(AA-TreS)的编码基因为如下1)或2)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述海藻糖合成酶的DNA分子；

序列表中的序列2由1797个核苷酸组成。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有所述海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述转基因重组菌具体可为含有所述海藻糖合成酶编码基因的重组大肠杆菌，如含有上述基因的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)PlysS。所述重组大肠杆菌优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)PlysS aaN-TreS-30a，产生重组海藻糖合成酶。

本发明还提供了一种表达海藻糖合成酶的方法。

本发明所提供的表达海藻糖合成酶的方法，是培养上述含有海藻糖合成酶AA-TreS编码基因的转基因重组菌，得到海藻糖合成酶。

海藻糖合成酶AA-TreS的分子量为68kDa，酶活性的pH范围为4.5～8.5，最适pH为6.5；酶活性的温度范围为20～45℃，最适反应温度为35℃。

本发明的又一个目的是提供一种制备海藻糖的方法。

本发明所提供的制备海藻糖的方法，是以麦芽糖为底物，用海藻糖合成酶AA-TreS进行催化，得到海藻糖。

所述方法中，反应温度可为20～45℃，反应液的pH可为4.5～8.5；所述反应温度优选为20～40℃，尤其优选为35℃，所述反应液的pH优选为5.0～8.0，尤其优选为6.5。

所述方法中，反应时间可为4～10小时，尤其优选为8小时。

本发明制备海藻糖的方法，海藻糖合成酶催化时间短、所需底物浓度低，以90mM麦芽糖为底物，催化8小时，转化率达69％。

附图说明

图1为大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS aaN-TreS-30a的PCR鉴定结果图

图2为大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS aaN-TreS-30a表达的本发明的海藻糖合成酶的SDS-PAGE图

图3为本发明的海藻糖合成酶最适反应pH和pH稳定性检测结果图

图4为本发明的海藻糖合成酶最适反应温度检测和热稳定性检测结果图

图5为本发明的海藻糖合成酶随催化时间转化率变化测定结果图

图6为本发明的海藻糖合成酶催化反应产物监测TLC分析图

图7为本发明海藻糖合成酶制备海藻糖转化效率检测结果图

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例的主要试剂：限制性内切酶、T4DNA连接酶为TaKaRa公司产品；Pfu DNA聚合酶购自天为时代公司；X-Gal购自Promega公司；DNA凝胶回收试剂盒购自上海申能博彩公司；Ni-NTA His·Bind Resins购自德国Novagen公司；DNA分子量标准DL2000购自天根生化科技有限公司；麦芽糖及海藻糖标准品购自北京化学试剂公司；薄层色谱(TLC)预制板购自Merck公司；糊精购自北京双旋微生物培养基制品厂；其他化学试剂为国产和进口分析纯试剂。

实施例1、海藻糖合成酶的获得及其效果验证

一、海藻糖合成酶编码基因的获得

1、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescences ATCC 13344)基因组DNA的提取

将活化的金黄节杆菌(Arthrobacter aurescences ATCC 13344)(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)转接至营养肉汁液体培养基(含有蛋白胨10g/L，牛肉提取物3g/L，氯化钠5g/L，pH7.0的培养基)中，30℃摇床210rpm培养24h。取100mL培养液离心收集菌体，加9.5ml TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)悬浮沉淀，并加0.5ml10％(质量含量)SDS，50μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时；加1.5ml 5mol/L NaCl，混匀；再加1.5ml 10％(质量含量)CTAB溶液(用0.7mol/LNaCl溶液配制)，混匀，65℃保温20分钟；用等体积酚、氯仿和异戊醇的混合液(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1)抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管；用等体积氯仿和异戊醇的混合液(氯仿和异戊醇的体积比为24：1)抽提，上清液加1倍体积异丙醇，沉淀DNA；5000rpm离心10min，去上清，70％乙醇漂洗，吸干，溶解于1mL TE或ddH₂O，—20℃保存。

2、PCR扩增海藻糖合成酶编码基因

以步骤1提取的金黄节杆菌CGMCC 1.1892的基因组DNA为模板，用引物AaTreSF和AaTreSR为进行PCR扩增。其中，上游引物AaTreSF：5’-AGATCTGAGTTTTTCTCCGCAGAACC-3’(下划线部分示BglII识别位点)，下游引物AaTreSR：5’-CTCGAGTCATCCTTTG AGGTCAC-3’(下划线部分示Xho I识别位点)。PCR条件为：94℃预变性4min；然后94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环后72℃延伸5min。

将得到的PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明得到的PCR产物大小约为1800bp。PCR扩增产物加A后用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，与pGEM-T Vector(购自Promega公司)连接，将连接产物转化大肠杆菌Top10(购自Invitrogen)，挑取阳性克隆。进行序列测定，结果表明该PCR产物具有序列表中序列2的DNA序列(AA-TreS)，编码序列表中序列1的海藻糖合成酶AA-TreS。将含有序列表中序列2的DNA序列的重组载体命名为pGEM-AA-TreS。

二、海藻糖合成酶AA-TreS的表达

1、制备表达海藻糖合成酶AA-TreS的重组菌

分别用Bgl II和Xho I双酶切pGEM-AA-TreS，回收1800bp的AA-TreS片段，pET-30a(+)，将AA-TreS片段插入到pET-30a(+)BglII和Xho I酶切位点之间得到重组载体，将该重组载体转化大肠杆菌Top10，挑取阳性克隆，进行PCR测序鉴定和酶切鉴定，得到含有具有序列表中序列2的DNA序列的AA-TreS片段的重组载体pET-AA-TreS。提取pET-AA-TreS，转化表达宿主菌BL21(DE3)pLysS(购自Invitrogen)，步骤如下：

1)冰上融化-70℃保存的宿主菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞。

2)加入pET-AA-TreS质粒，轻轻旋转混匀，冰浴放置30min。

3)将离心管放入预加温至42℃的水浴中，静止放置90s。

4)快速将离心管转移到冰浴中，冷却1～2min。

5)加400μL LB培养基于转化细胞中。

6)37℃轻柔振荡45～60min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗性标记基因。

7)将200μL已转化的感受态细胞转移到含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上，用无菌涂布棒轻轻的将菌液涂布均匀。

8)将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12～16h。

通过PCR、测序鉴定和酶切鉴定，得到含有重组载体pET-AA-TreS的重组菌，将其命名为大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS aaN-TreS-30a。其中，大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS aaN-TreS-30a的PCR鉴定结果如图1所示，表明得到大小约为1800bp的产物。图1中，泳道1为DNA分子量标准DL2000，泳道2为PCR产物。

按照上述的方法将pET-30a(+)转入BL21(DE3)pLysS得到重组菌BL21(DE3)pLysS-30a作为对照。

2、重组菌的诱导表达与海藻酸合成酶的纯化

挑取大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS aaN-TreS-30a单菌落接种到含卡那霉素50μg/mL和氯霉素34μg/mL的LB液体培养基，在37℃振荡12小时。按照1％(体积比)的接种量转接至30mL上述含卡那霉素50μg/mL和氯霉素34μg/mL的LB液体培养基，37℃振荡培养至OD600为0.6时，加IPTG至终浓度0.4mmol/L，25℃诱导培养6h后，离心收集菌体。用100mmol/L pH7.5的磷酸缓冲液重悬菌体，超声破碎(功率300W，工作时间2秒，间歇时间8秒，总时间2.0分钟)，4℃12000rpm离心1min后，取上清液。上清液采用Ni-NTA His·Bind Resins(购自Novagen)纯化，回收得到纯化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，取纯化的样品进行SDS-PAGE分析。以BL21(DE3)pLysS-30a全蛋白作为对照，BL21(DE3)pLysS-30a的细胞破碎全蛋白的获得方法为：挑取大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS aaN-TreS-30a单菌落接种到含卡那霉素50μg/mL和氯霉素34μg/mL的LB液体培养基，在37℃振荡12小时。按照1％(体积比)的接种量转接至30mL上述含卡那霉素50μg/mL和氯霉素34μg/mL的LB液体培养基，37℃振荡培养至OD600为0.6时，加IPTG至终浓度0.4mmol/L，25℃诱导培养6h后，离心收集菌体。用100mmol/L pH7.5的磷酸缓冲液重悬菌体，超声破碎(功率300W，工作时间2秒，间歇时间8秒，总时间2.0分钟)，4℃12000rpm离心1min后，取上清液。

结果如图2所示，结果表明在68kDa处出现了较明显的单一条带，与理论分子量基本符合(图2)。图2中，泳道1为低分子量标准，泳道2为Ni-NTA His·BindResins(Novagen)纯化后的重组海藻酸合成酶，泳道3为纯化前PlysS aaN-TreS-30a细胞破碎上清液蛋白，泳道4为BL21(DE3)pLysS-30a的细胞破碎全蛋白。

对上述发酵得到的海藻糖合成酶AA-TreS进行酶活力测定，具体方法如下所述：

取100μL纯化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，用100mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液稀释至500μL，加麦芽糖至终浓度为90mM，35℃反应20min，100℃煮沸5min终止反应，12000rpm离心5min，取上清，稀释1000倍用离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。离子色谱为DIONEX 2500(戴安(DlONEX)公司)，柱子：CarboPac PA-2(戴安(DlONEX)公司)，流动相：体积比为70:30的100nmol/L NaOH和500nmol/LNaAC，流速1.0mL/min，进样量10μL。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量。

酶活力单位的定义：在35℃，pH6.5条件下，1分钟内转化1μmol麦芽糖成为海藻糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

同时以相同条件培养BL21(DE3)pLysS-30a作为对照，结果表明BL21(DE3)pLysS-30a的菌体破碎上清液无海藻糖合成酶活性。酶活力测定结果表明酶比活力为1.525U/mg。

3、大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS aaN-TreS-30a表达的海藻糖合成酶的性质分析

1)海藻糖合成酶AA-TreS最适pH的测定：

分别配制pH4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0的100mmol/LKH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液。

分别取100μl步骤2纯化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，分别用100mmol/L上述pH值的磷酸缓冲液稀释至500μl，按照步骤2的测定方法测定酶活力，35℃振荡反应30min，沸水浴5min终止反应。用步骤2所述离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式如下：样品浓度＝样品峰面积÷标样峰面积×标样浓度×进样稀释倍数；转化率＝产物海藻糖含量÷底物麦芽糖含量×100％。以转化率最高的条件的相对酶活力为100％，其余条件的相对酶活力为其转化率与最高转化率的比值，即得到pH对海藻糖合成酶AA-TreS酶活力的影响曲线。

分别取1ml步骤2纯化的海藻糖合成酶液，分别用100mmol/L上述pH值的磷酸缓冲液稀释至5ml，35℃温育20min后，用氢氧化钾或磷酸溶液调节pH值到6.5，按照步骤2的测定方法测定剩余的酶活力，35℃振荡反应30min，沸水浴5min终止反应。用步骤2所述离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式如下：样品浓度＝样品峰面积÷标样峰面积×标样浓度×进样稀释倍数；转化率＝产物海藻糖含量÷底物麦芽糖含量×100％。以转化率最高的条件的相对酶活力为100％，其余条件的相对酶活力为其转化率与最高转化率的比值，即得到海藻糖合成酶AA-TreS的pH稳定性的曲线。

结果如图3所示，“■”是pH对海藻糖合成酶AA-TreS酶活力的影响曲线，“▲”是海藻糖合成酶AA-TreS的pH稳定性的曲线。结果表明，海藻糖合成酶AA-TreS酶活性的pH范围为4.5～8.5，特别是在pH6.5，海藻糖合成酶AA-TreS对底物有60％左右的转化率，说明海藻糖合成酶AA-TreS在中性及偏酸条件下具有较高的活性，最适pH为6.5。pH稳定性的曲线结果表明，海藻糖合成酶AA-TreS在pH5.5～7.5范围内酶活力保持高度稳定。

2)海藻糖合成酶AA-TreS最适温度的测定：

温度对重组酶合成酶活的影响主要表现在两方面：一方面当温度升高时，反应速度加快；另一方面随着温度的升高，由于酶是蛋白质，酶逐渐变性而失活，从而引起酶反应速度的下降。酶反应所表现的最适温度是这两种因素综合影响的结果。根据反应的时间，可合理的选择反应的温度。氨基酸序列分析显示，海藻糖合成酶基因中含有α-淀粉酶的多个保守序列，较高的温度可能导致α-淀粉酶活力升高，把部分底物水解为葡萄糖，从而降低了海藻糖的转化率。

分别取100μl步骤2纯化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，按照步骤2的方法，分别在20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，50℃，60℃振荡反应30min，沸水浴5min终止反应。用离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式如下：样品浓度＝样品峰面积÷标样峰面积×标样浓度×进样稀释倍数；转化率＝产物海藻糖含量÷底物麦芽糖含量×100％。以转化率最高的条件的相对酶活力为100％，其余条件的相对酶活力为其转化率与最高转化率的比值，即获得温度对海藻糖合成酶AA-TreS酶活力的影响曲线。

分别取100μl步骤2纯化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，分别在20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，50℃，60℃条件下温育20min，然后立即调节温度至35℃，按照步骤2的方法，振荡反应30min，沸水浴5min终止反应。用离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式如下：样品浓度＝样品峰面积÷标样峰面积×标样浓度×进样稀释倍数；转化率＝产物海藻糖含量÷底物麦芽糖含量×100％。以转化率最高的条件的相对酶活力为100％，其余条件的相对酶活力为其转化率与最高转化率的比值，即获得海藻糖合成酶AA-TreS的温度稳定性的曲线。

结果如图4所示，结果表明海藻糖合成酶AA-TreS酶活性的温度范围为20～45℃，当温度继续升高时，酶活力迅速下降，最适反应温度为35℃(图4)。温度稳定性曲线结果表明，海藻糖合成酶AA-TreS在20～40℃温度范围内酶活力保持高度稳定。图4中，“■”是温度对海藻糖合成酶AA-TreS酶活力的影响曲线，“▲”是海藻糖合成酶AA-TreS的温度稳定性的曲线。

3)金属离子和化学试剂对酶活力的影响：

分别配制100mM的CuSO₄、MgCl₂、CaCl₂、MnCl₂、Tris、SDS、EDTA溶液。分别取100μl步骤2纯化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，按照步骤2的方法，再加入上述溶液至终浓度1mM或5mM，35℃，pH6.5振荡反应30min，沸水浴5min终止反应。以仅含酶液和麦芽糖溶液的混合液作为对照组。用上述离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式如下：样品浓度＝样品峰面积÷标样峰面积×标样浓度×进样稀释倍数；转化率＝产物海藻糖含量÷底物麦芽糖含量×100％。不同离子浓度下测定的转化率除以对照组的转化率即为相对转化率。

结果如表2所示，结果表明，1mM的Cu²⁺和SDS对酶有强烈抑制，当浓度增大到5mM时，上述试剂对酶都有抑制作用。

表2.金属离子和化学试剂对海藻糖合成酶AA-TreS酶活力的影响

4)海藻糖合成酶AA-TreS随催化时间转化率变化测定：

分别取100μl步骤2纯化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，按照步骤2的方法，35℃振荡反应，分别在0h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h取样，沸水浴5min终止反应。用上述离子色谱法检测产物中海藻糖的含量。以10h时的转化率(转化率＝(产物海藻糖含量÷底物麦芽糖含量)×100％)为100％基准，其他值与其相比得出相对转化率。结果如图5所示，可以看出，随着反应时间的延长转化率逐渐提高，在0-1h转化率呈线性快速增长，随后开始减缓，在8h以后反应趋于平衡。

5)重组酶转化产物的TLC分析

将步骤2纯化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液与麦芽糖溶液(麦芽糖终质量百分离心10min去除不溶物，取上清，用超纯水稀释10倍后点样，上样量1μl，进行薄层色谱检测。薄层色谱(TLC)预制板购自Merck公司，展层剂(正丁醇：吡啶：水＝4：5：1)，显色剂(98％硫酸：甲醇＝1：4)，105℃显色8min。以BL21(DE3)pLysS(pET-30a)的胞质上清液为对照，结果如图6所示，泳道1是海藻糖合成酶AA-TreS酶液与麦芽糖的反应产物；泳道2是(BL21(DE3)pLysS(pET-30a)的胞质上清液与麦芽糖反应产物；泳道3和4分别是麦芽糖和海藻糖的标样；结果表明该海藻糖合成酶AA-TreS能将底物麦芽糖转化成海藻糖，而对照组(BL21(DE3)pLysS(pET-30a)的胞质上清液)没有生成海藻糖的能力。

实施例2、大肠埃希氏菌(E.coli)PlysS aaN-TreS-30a表达的海藻糖合成酶制备海藻糖

取0.5ml实施例1中步骤二的步骤2纯化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，用100mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液稀释至500μL，加入麦芽糖至终浓度为90mM，35℃振荡反应8h，沸水浴5min终止反应。用离子色谱测定样品中海藻糖的含量。离子色谱的测定方法如下：离心收集反应液上清液，用100mmol/L pH7.0的磷酸缓冲液稀释1000倍进样。离子色谱为DIONEX2500，柱子：CarboPac PA-100，流动相：体积比为70：30的100nmol/L NaOH和500nmol/L NaAC，流速1.0mL/min，进样量10μL。

已知标样浓度，根据标样及待测样品的峰面积计算出待测样品中海藻糖的含量，计算公式为：

样品浓度＝(样品峰面积÷标样峰面积)×标样浓度×进样稀释倍数。

转化率＝(产物海藻糖含量÷底物麦芽糖含量)×100％。

结果如图7所示，标准样品中海藻糖的出峰时间是1.4min，葡萄糖的出峰时间是2.1min，麦芽糖的出峰时间是4.6min。样品图中第一个峰是海藻糖(T)，第二个峰是葡萄糖(G)，第三个峰是麦芽糖(M)。此条件下，该酶对90mM的麦芽糖转化效率约为69％。

序列表

<160>2

<210>1

<211>598

<212>PRT

<213>金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)

<400>1

<210>2

<211>1797

<212>DNA

<213>金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)

<400>2

Claims (10)

1、一种海藻糖合成酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列；

2)将序列表中的SEQ ID №.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有海藻糖合成酶相关功能的由SEQ ID №：1衍生的蛋白质。

2、权利要求1所述的海藻糖合成酶的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述海藻糖合成酶的编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与1)或2)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4、含有权利要求2或3所述的海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。

5、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求2或3所述的海藻糖合成酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达海藻糖合成酶的重组表达载体；所述大肠杆菌表达载体优选为pET30a载体。

6、根据权利要求4所述的转基因重组菌，其特征在于：所述转基因重组菌是将权利要求4或5所述重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达海藻糖合成酶的转基因重组菌；所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。。

7、权利要求2或3所述的海藻糖合成酶编码基因在表达海藻糖合成酶中的应用。

8、权利要求1所述的海藻糖合成酶及其编码基因在制备海藻糖中的应用。

9、一种表达海藻糖合成酶的方法，是培养权利要求4或6所述的转基因重组菌得到海藻糖合成酶。

10、一种制备海藻糖的方法，是以麦芽糖为底物，用权利要求1所述的海藻糖合成酶进行催化反应，得到海藻糖；所述反应温度优选为20～45℃，最优选为20～40℃，反应液的pH优选为4.5～8.5，最优选为5.0～8.0，特别优选为6.5；所述反应时间优选为4～10小时，最优选为8小时。

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