CN102260694A - 耐酸中温α-淀粉酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了耐酸中温α-淀粉酶及其制备方法，包括以下步骤：步骤A1，前体α-淀粉酶基因的扩增：步骤A2，前体α-淀粉酶的的定点突变；步骤A3，突变α-淀粉酶表达载体的构建；步骤A4，表达载体转化枯草芽孢杆菌。应用本发明获得的重组体菌株可以进行耐酸性α-淀粉酶突变体的工业化生产，在有选择压力的液体培养基中培养重组体细胞，无需经诱导表达，上清用硫酸铵沉淀，沉淀透析除盐之后加入丙烯葡聚糖凝胶S300凝胶柱，用洗脱液洗脱即可得到所需的耐酸α-淀粉酶突变体。
Description
技术领域
本发明涉及耐酸中温α-淀粉酶及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
α-淀粉酶(α-1，4-glucanhydrolase EC3.2.1.1)，又称为液化型淀粉酶。它能从淀粉分子的内部任意切开α-1，4糖苷键，产生分子量较小的麦芽糊精、葡萄糖及其它低聚糖。淀粉在α-淀粉酶的作用下，分子迅速降解，粘度下降，即完成液化作用。在淀粉糖加工业、纺织工业、造纸工业、制药行业、酿酒行业及燃料乙醇生产中被广泛应用，具有相当大的商业价值。目前在工业生产中，α-淀粉酶一般以微生物发酵法进行大规模生产，这些微生物包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌等。
近年来随着淀粉原料深加工工业的发展，酒精行业工艺条件的改变，要求酶制剂工业不断更新和完善酶的种类，以满足工业生产的要求。对于淀粉糖化工业，一般是采用双酶法进行液化、糖化，即先加α-淀粉酶液化，再加糖化酶来糖化产生葡萄糖。目前市售的淀粉酶最适pH为6.0-7.0，糖化酶的最适pH为4.5左右，两者的作用pH值差异较大，而淀粉原料液的天然pH为4.5-5.0左右。传统工艺淀粉液化后需添加酸来降低pH值后糖化酶才起作用，这样用酸碱反复调节原料液的pH，既增加工艺，又引入外源离子，加重了分离的负担。在酒精行业中，由于废水的回填，使得原料液的pH值降为4-5，也不适合α-淀粉酶的作用。而在我国传统白酒生产中，由于固态发酵不彻底，在酒糟中普遍含有10％以上的淀粉，但酒糟的pH很低，此酸性条件下的淀粉利用就需要开发适合该生产条件的酸性α-淀粉酶。此外，以淀粉质为原料的酒精发酵工业中，淀粉中低温液化工艺(75-85℃喷射中温α-淀粉酶液化1-2小时，然后降温至60℃左右部分糖化后同步糖化发酵生产酒精)与传统的高温液化糖化(高温105℃喷射液化，95℃液化1-2小时，然后降温至60℃左右部分糖化后发酵)的工艺相比，具有节能省耗、可发酵性糖损失少的优点。由于耐酸性的α-淀粉酶能在酸性条件下保持高活性，不仅可以简化酿酒发酵工业的液化、糖化过程，降低淀粉深加工的生产成本，而且在消化类药物、酒精糟液利用、一步法生产糖浆等诸多方面显示出巨大的利用前景。
随着我国淀粉糖、酿造及发酵工业的日益发展，对耐酸性淀粉水解酶的需求也将越来越大。为了适应整个淀粉糖化、食品、纺织、制药及酒精行业的需要，简化工艺，降低成本、省水节能，满足一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求，开发一种耐酸中温的α-淀粉酶就势在必行。
发明内容
针对上述情况，本发明解决了现有α-淀粉酶耐酸性和温度适应性不能同时兼顾，以致应用受到限制的问题；采用重组DNA技术，提供了定点突变前体α-淀粉酶以改善其特性，得到了活力提高的耐酸耐温α-淀粉酶突变体及其制备方法。
本发明从枯草芽孢杆菌[中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC 10028)]中克隆前体α-淀粉酶基因，对其141及558位点的氨基酸残基进行突变，并在芽孢杆菌中高效表达α-淀粉酶突变体。从而为耐酸性α-淀粉酶的工业化生产提供一条可行途径。本发明将分离到的编码前体α-淀粉酶的基因的141及558位点的氨基酸残基进行突变，以改变其酸稳定性和酶活力。并构建重组表达载体，转化枯草芽孢杆菌宿主，高效表达了突变体α-淀粉酶，突变酶具有良好的酸稳定性，有较宽的pH适用范围，更适于工业化应用。
α-淀粉酶突变体，是突变α-淀粉酶编码DNA序列的表达产物。α-淀粉酶突变体具有的氨基酸序列是通过对SEQ ID NO：12所示的前体α-淀粉酶氨基酸序列中R141及L558的氨基酸位点的替换而得到的。α-淀粉酶突变体的序列是在前体α-淀粉酶原有序列上发生了氨基酸替换。本发明涉及了两对完全互补的引物，用重组PCR方法将前体α-淀粉酶的141及558位的氨基酸进行突变(图1)，得到经过耐酸性改造的本发明突变体基因。编码α-淀粉酶突变体的基因序列见SEQ ID NO：2。本发明的α-淀粉酶突变体pH低于5.0时具有酸稳定性，且其活力提高为前体α-淀粉酶的3.5倍。
本发明所用的前体α-淀粉酶来源是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。
耐酸α-淀粉酶，包括突变体α-淀粉酶DNA序列的重组表达载体：重组表达载体除包括编码突变α-淀粉酶的DNA序列外，还具有表达该基因所需的调控元件。可供选择使用的在枯草芽孢杆菌中表达的质粒载体有很多。这些载体都带有完整的阅读框架，即含有一个启动子和终止子，或另外带有其它表达调控元件。优选的启动子是枯草芽孢杆菌中的P43启动子。在启动子和终止子之间有一段多克隆位点，这些多克隆位点分别包含有若干单一酶切位点，选用限制酶将载体切成线状，并用DNA连接酶将突变α-淀粉酶基因连接到所选载体上，从而构成一个在启动子和终止子之间含有目的基因的重组分泌型载体。本发明使用枯草芽孢杆菌表达载体pWB980，插入本发明的突变的α-淀粉酶DNA编码序列以后得到重组表达载体，它除了携带有所述的淀粉酶DNA编码序列外，还带有P43启动子、sacB基因信号肽序列、卡那霉素抗性基因，以及为外源蛋白高效表达所需的调控元件。
重组体细胞指的是包含编码本发明的α-淀粉酶的DNA的表达载体的适当宿主。本发明所适用的宿主细胞包括任何可表达本发明的α-淀粉酶的可转化微生物，即枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌细胞，优选蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌细胞。
本发明包括产生α-淀粉酶突变体的方法，包括以下步骤：
通过定点突变技术，突变编码前体α-淀粉酶的DNA序列，得到编码α-淀粉酶突变体的DNA序列；
将上述的突变DNA序列与载体相连接，得到携带α-淀粉酶突变体基因的重组表达载体；
将重组表达载体转化宿主菌株，得到重组体细胞；将重组体进行发酵制备α-淀粉酶突变体。
分离并纯化提取耐酸(pH4.0-6.0)耐中温(65-75℃)的淀粉酶突变体。
具体操作方法为：
耐酸中温α-淀粉酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤A1，前体α-淀粉酶基因的扩增：提取枯草芽孢杆菌染色体DNA，根据Genbank中已报道的枯草芽孢杆菌淀粉酶基因为依据，设计如下引物：
上游引物F1：5’-GCGCGAATTCGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物R1：5’-CGCGAAGCTTATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3’(SEQ ID NO：2)；
PCR产物经纯化、双酶切后，连接到同样经双酶切线性化的pET-22b，转化大肠杆菌JM109，得到pET22-ACN7；
步骤A2，前体α-淀粉酶的的定点突变：设计含突变氨基酸残基的互补引物如下：
引物1：5’-TTGGTCGGACGGATGGGACATCACT-3’(SEQ ID NO：4)
引物2：5’-AGTGATGTCCCATCCGTCCGACCAA-3’(SEQ ID NO：5)
引物3：5’-GGGCCATAGAAGATACCGGATCATG-3’(SEQ ID NO：6)
引物4：5’-CATGATCCGGTATCTTCTATGGCCC-3’(SEQ ID NO：7)
以重组质粒pET22-ACN7为模板进行PCR扩增，按以下次序，将各成分在薄壁离心管内混合：PCR1：采用50μL体系，ddH2O38.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物1(20μmol/L)2μL，引物2(20μmol/L)2μL，DNA模板1μL，pfu高保真DNA聚合酶0.5μL。扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃40s，60℃，40s，72℃，2min，20个循环；最后1个循环为72℃7min。PCR2：采用50μL体系，ddH2O38.5Ml，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物3(20μmol/L)2μL，引物4(20μmol/L)2μL，DNA模板1μL，pfu高保真DNA聚合酶0.5μL.扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃40s，60℃，40s，72℃，2min，20个循环；最后1个循环为72℃7min。
PCR产物经纯化、转化大肠杆菌XL-10感受态细胞，挑选阳性克隆，经过测序验证，最终得到含有突变α-淀粉酶基因的重组表达载体pET-ACN7-2；
步骤A3，突变α-淀粉酶表达载体的构建：枯草芽孢杆菌表达载体采用pWB980，设计如下引物：
上游引物F2：5’-CGCGGATCCAGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3’(SEQ ID NO：9)；
下游引物R2：5’-CGCGGCATGCATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3’(SEQ ID NO：10)；
以重组表达载体pETCN7-2为模板进行PCR扩增，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合：采用50μL扩增体系：ddH2O 41.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，上下游引物2(20μmol/L)各0.5μL，DNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL.扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃40s，58℃，40s，72℃，2min，30个循环；最后1个循环为72℃10min；
将所得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测、纯化、双酶切，然后连接到同样双酶切线性化的pWB980载体上：在1.5mL离心管中加入12μL纯化的DNA，4μL线性pWB980载体，2μL 10×连接酶buffer，1μL T4 DNA连接酶，加水至总体积为20μL，16℃连接过夜；
步骤A4，表达载体转化枯草芽孢杆菌，将步骤A3的连接混合物转化枯草芽孢杆菌WB600的感受态细胞，枯草芽孢杆菌转化子提取质粒，提取的质粒用限制性内切酶BamH I和Sph I进行酶切鉴定，测序，构建了枯草芽孢杆菌重组表达载体pWB980-ACN7-2。
所述的前体α-淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌等芽孢杆菌属的菌株；所述的载体适于在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中表达；尤其适于在蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌中表达。
可使用的任何已知的转化方法，如感受态法、电转化法、原生质体转化方法等将本发明的重组表达载体转入宿主细胞中，以实现α-淀粉酶突变体的表达。
应用本发明获得的重组体菌株可以进行耐酸性α-淀粉酶突变体的工业化生产，在有选择压力的液体培养基中培养重组体细胞，无需经诱导表达，上清用硫酸铵沉淀，沉淀透析除盐之后加入丙烯葡聚糖凝胶S300凝胶柱，用洗脱液洗脱即可得到所需的耐酸α-淀粉酶突变体。
附图说明
图1为α-淀粉酶的编码基因定点突变示意图；
图2为α-淀粉酶突变体的PCR扩增电泳图
图3为重组质粒Pet22-ACN7的构建示意图；
图4为重组质粒pWB980-ACN7-2的构建示意图；
图5为α-淀粉酶突变体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图6为α-淀粉酶突变体在不同pH值下的稳定性；
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，而非任何方式限制本发明的范围。
实施例1：前体α-淀粉酶基因的扩增
提取枯草芽孢杆菌[购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC 10028)]染色体DNA。根据Genbank中已报道的枯草芽孢杆菌淀粉酶基因为依据，设计如下引物(引物委托上海生物工程有限公司合成)：
上游引物F1：5’-GCGCGAATTCGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3’(SEQID NO：1)
下游引物R1：5’-CGCGAAGCTTATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3’(SEQID NO：2)
其中上游引物F1 5’端含有EcoR I酶切位点(下划线)，下游引物5’端含有Hind Ⅲ酶切位点(下划线)。以枯草芽孢杆菌染色体DNA为模板进行PCR扩增，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合：采用50μL扩增体系：ddH2O 41.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，上下游引物(20μmol/L)各0.5μL，DNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL.扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃40s，58℃，40s，72℃，2min，30个循环；最后1个循环为72℃10min。
将所得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测到扩增产物约为1.9kb。结果如图2所示，可以看到在约1.9kb处出现了一条特异性条带(图2)，其大小与目的基因片段大小完全吻合。
PCR产物用DNA纯化试剂盒(天根公司)进行纯化。具体步骤参考DNA产物纯化试剂盒说明书。
纯化的产物按以下方法用EcoR I和HindⅢ进行双酶切：将各成分在薄壁管内混合，采用50μL体系，ddH2O13μL，10×buffer 5μL，PCR纯化产物30μL，HindⅢ酶和EcoRI酶各1μL，混匀，稍离心之后置37℃水浴锅保温3-4h，65℃保温20min灭酶活。
酶切产物加入2.5倍体积的无水乙醇，1/10倍体积的3mol/L的醋酸钠，-20℃冰箱放置20min，12000r/min，4℃离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，晾干，用30μL 1×TE溶解即可得到两端是粘性末端的α-淀粉酶基因片段。然后连接到同样经双酶切线性化的pET-22b[购自美国Novagen，Inc.]载体上：在1.5mL离心管中加入6μL纯化的DNA，2μL线性pET-22b载体，1μL 10×连接酶buffer，1μL T4 DNA连接酶，加水至总体积为101μL，16℃连接过夜。所得到的连接混合物转化大肠杆菌JM109[购买自自中国工业微生物菌种保藏管理中心]感受态细胞。
挑选转化子，阳性转化子经过PCR验证和酶切验证得到pET22-ACN7，其构建示意图如图3。将其测序(委托上海生工)可知扩增到的前体α-淀粉酶基因的DNA序列(SEQ ID NO：3)。
实施例2：前体α-淀粉酶的的定点突变
α-淀粉酶的突变示意图见图1，设计含突变氨基酸残基的互补引物如下：
引物1：5’-TTGGTCGGACGGATGGGACATCACT-3’(SEQ ID NO：4)
引物2：5’-AGTGATGTCCCATCCGTCCGACCAA-3’(SEQ ID NO：5)
引物3：5’-GGGCCATAGAAGATACCGGATCATG-3’(SEQ ID NO：6)
引物4：5’-CATGATCCGGTATCTTCTATGGCCC-3’(SEQ ID NO：7)
引物1和引物2互补，引物3和引物4互补。引物1和2中包含了对223位氨基酸的突变，而引物3和4中则包含了对558位氨基酸的突变。以重组质粒pET22-ACN7(实施例1所构建)为模板进行PCR扩增，按以下次序，将各成分在薄壁离心管内混合：PCR1：采用50μL体系，ddH2O38.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物1(20μmol/L)2μL，引物2(20μmol/L)2μL，DNA模板1μL，pfu高保真DNA聚合酶0.5μL。扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃40s，60℃，40s，72℃，2min，20个循环；最后1个循环为72℃7min。PCR2：采用50μL体系，ddH2O38.5Ml，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物3(20μmol/L)2μL，引物4(20μmol/L)2μL，DNA模板1μL，pfu高保真DNA聚合酶0.5μL.扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃40s，60℃，40s，72℃，2min，20个循环；最后1个循环为72℃7min。
PCR产物用实施例1中的DNA纯化方法纯化后，转化大肠杆菌XL-10感受态细胞，挑选阳性克隆，经过测序验证，最终得到含有突变α-淀粉酶基因的重组表达载体pET-ACN7-2(SEQ ID NO：8)。
编码α-淀粉酶的突变体的DNA序列(SEQ ID NO：8)；
gaaactgcaaacaaatcgaatgaggtgaccgattcatcggtcaaaaacgggaccatccttcatgcatggaattggtcattcaatacgttaacacaaaatatgaaagagattcgtgatgcgggttatgcagccattcagacgtctccgattaaccaagtaaaggaagggaaccaaggagataaaagcatgtcgaactggtactggctctatcagccgacatcgtaccaaatcggcaaccgttacttaggcactgaacaagaatttaaggacatgtgtgcagccgcggaaaagtatggcgtaaaagtcattgtcgatgcggttgtcaatcataccaccagcgattatggcgcgatttctgatgagattaagcgtattccaaactggacccatggaaacacacaaattaaaaattggtcggacggatgggacatcactcaaaatgcattgcttgggctgtatgattggaatactcagaatactgaggtgcaagcctacctgaaaggtttcttggaaagagcattgaatgacggagcagacgggttccgctatgatgccgccaagcatatagagcttccggatgatgggaattacggcagccaattttggccgaatatcacaaatacatcggcggagttccaatacggagaaatcctgcaagacagcgcgtccagagatactgcttatgcgaattatatgaatgtgacggcttctaactatgggcattccatcagatccgctttaaagaatcgtaatctgagtgtgtcgaatatctcccattatgcatctgatgtgtctgcggacaagttagtcacatgggtggaatcacatgatacgtatgccaatgatgatgaagagtccacatggatgagtgatgacgatattcgtttaggctgggcagtgattggttcccgctcaggaagcacgcctcttttcttttccagacctgagggcggaggaaatggtgtaagatttcccggaaaaagtcaaataggagatcgcgggagcgccttatttaaagaccaggcgatcactgcggtcaatcaatttcacaatgaaatggccgggcagcctgaggaactctcaaatccgaatggcaacaatcaaatatttatgaatcagcgcggctcaaaaggcgttgtgctggcaaatgcaggatcgtcttctgtcaccatcaatacttcaacgaaattacctgacggcaggtatgataatagggccggcgccggttcatttcaagtagcgaacggcaaactgacaggtacgatcaatgccagatccgcggctgttctttatcctgatgatattggaaatgcgcctcatgtctttcttgagaattaccaaacagaggcagtccattctttcaatgatcagctgacggtcaccctgcgtgcaaatgcgaaaacaacaaaagccgtttaccaaatcaataatgggcagcagacagcatttaaggatggagaccgattaacgatcgggaaagaagatccaatcggcacgacatacaacattaaattaaccggaacgaacggcgagggtgcagcgagaacccaagaatacacgtttgtcaaaaaagacccgtcccaaaccaacatcattgggtatcaaaatccggatcattggggacaggtaaatgcttatatctataaacatgatggaggcggggccatagaagataccggatcatggccggggaaagccatgaccaagaatgcagatggaatgtacacgctgacgctgcctgagaatgcggatacggccgacgccaaagtgatttttaacaatggcagcgcccaagtgcccggccagaaccagcccggctttgattatgtgcagaatggtttgtataacaactccggtttgaatggttatcttccgcat
实施例3：突变α-淀粉酶表达载体的构建
枯草芽孢杆菌表达载体采用pWB980[购自American Biogenetic Sciences，Inc]，设计如下引物：
上游引物F2：5’-CGCGGATCCAGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3’(SEQ ID NO：9)
下游引物R2：5’-CGCGGCATGCATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3’(SEQ ID NO：10)
其中上游引物F25’端含有BamH I酶切位点(下划线)，下游引物5’端含有Sph I酶切位点(下划线)。以重组表达载体pETCN7-2为模板进行PCR扩增，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合：采用50μL扩增体系：ddH2O 41.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，上下游引物2(20μmol/L)各0.5μL，DNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL.扩增条件为：94℃2min，1个循环：94℃40s，58℃，40s，72℃，2min，30个循环；最后1个循环为72℃10min。
将所得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测到扩增产物约为1.9kb。PCR产物用DNA纯化试剂盒(天根公司)进行纯化。具体步骤参考DNA产物纯化试剂盒说明书。
纯化的产物经限制酶BamH I和Sph I双酶切，双酶切步骤如下：按以下次序，将各成分在薄壁管内混合：采用50μL体系，ddH2O13μL，10×buffer 5μL，PCR纯化产物30μL，BamH I和Sph I酶各1μL，混匀，稍离心之后置37℃水浴锅保温3-4h，65℃保温20min灭酶活。酶切产物加入2.5倍体积的无水乙醇，1/10倍体积的3mol/L的醋酸钠，-20℃冰箱放置20min，12000r/min，4℃离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，晾干，用30μL 1×TE溶解即可得到两端是粘性末端的α-淀粉酶基因片段。然后连接到同样双酶切线性化的pWB980载体上：在1.5mL离心管中加入12μL纯化的DNA，4μL线性pWB980载体，2μL 10×连接酶buffer，1μL T4 DNA连接酶，加水至总体积为20μL，16℃连接过夜。
实施例4：表达载体转化枯草芽孢杆菌
按下述方法制备枯草芽孢杆菌WB600[购买自中国高校工业微生物资源资源和信息中心(CICIMB 0132)]的感受态细胞。
1)将菌种接种在LB平板上37℃培养过夜。
2)用接种环接一环菌苔于5mL GM I溶液，在30℃慢摇床(125r/min)振荡培养过夜。
3)次日取2mL转接到18mL GM I中，37℃快摇床(250r/min)培养3.5h。
4)再取10mL上一步骤的培养液转接到90mL GM II中，37℃慢摇床培养90min后5,000g，10min离心收集菌体。
5)用10mL原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞可以直接用来转化。
6)感受态细胞的保存：加30％的灭菌甘油至终浓度为10％，混匀后分装到离心管中(0.5mL/tube)，随即放到-70℃保存。
7)转化时取出离心管，放在45℃水浴中溶化，然后在0.5mL菌液中加入适量DNA(～1ug/ml)。
8)于37℃振荡(200r/min)保温30min后涂布相应抗性平板，再在37℃培养过夜，次日检查和验证转化子。
枯草杆菌普通化学感受态细胞制备用试剂：
[1]10×最低盐溶液：K2HPO4 70g，KH2PO4 30g，(NH4)2SO4 10g，(Na3C6H5O7·2H2O)5g，MgSO4·7H2O 1g，在蒸馏水中依次溶解，加水至500mL。
[2]氨基酸溶液(根据不同菌株的基因缺陷型准备)：10mg/mL，贮于棕色瓶内，113℃灭菌30min，用黑纸包裹。
[3]GM I溶液：1×最低盐溶液95.6mL，20％葡萄糖2.5mL，5％水解酪蛋白0.4mL，10％酵母汁1mL，10mg/mL氨基酸溶液0.5mL(50μg/mL)。
[4]GM I溶液：1×最低盐溶液96.98mL，20％葡萄糖2.5mL，5％水解酪蛋白0.08mL，10％酵母汁0.04mL，1M MgCl20.25mL(2.5mM)，1M CaCl20.05mL(0.5mM)，10mg/mL氨基酸溶液0.1mL(5μg/mL)。
将实施例3的连接混合物转化枯草芽孢杆菌WB600的感受态细胞，转化方法如下：取出-70℃低温冰箱保存的装有感受态的离心管，放在45℃水浴中溶化，然后在0.5mL菌液中加入连接混合物，于37℃振荡(200r/min)保温30min后涂布卡那霉素抗性平板，再在37℃培养过夜，次日检查和验证转化子。
枯草芽孢杆菌转化子质粒的提取和检测如下：接种转化子一环于5mL含5μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜(培养时间不超过16h)。12000r/min离心1min收集菌体，用180μL的TET溶液(TET配方：50Mm Tris-HCL，pH8.0，1MmNa2EDTA，0.1％的Triton-100)悬浮细胞，加入20μL用TET溶液配制的溶菌酶(浓度为40mg/Ml)，37℃保温1h。4000r/min离心10min收集菌体，弃上清，沉淀用质粒DNA提取试剂盒进行质粒抽提，具体步骤参考质粒提取试剂盒的说明书。提取的质粒用限制性内切酶BamH I和Sph I进行酶切鉴定，测序。构建了枯草芽孢杆菌重组表达载体pWB980-ACN7-2，构建示意图如图4。其序列见SEQ ID NO：11。
枯草芽孢杆菌重组表达载体pWB980-ACN7-2DNA序列(SEQ ID NO：11)：
agaacctaaaaagaacgaatttgaactaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaagtcgagatcagggaatgagtttataaaataaaaaaagcacctgaaaaggtgtctttttttgatggttttgaacttgttctttcttatcttgatacatatagaaataacgtcatttttattttagttgctgaaaggtgcgttgaagtgttggtatgtatgtgttttaaagtattgaaaacccttaaaattggttgcacagaaaaaccccatctgttaaagttataagtgactaaacaaataactaaatagatgggggtttcttttaatattatgtgtcctaatagtagcatttattcagatgaaaaatcaagggttttagtggacaagacaaaaagtggaaaagtgagaccatggagagaaaagaaaatcgctaatgttgattactttgaacttctgcatattcttgaatttaaaaaggctgaaagagtaaaagattgtgctgaaatattagagtataaacaaaatcgtgaaacaggcgaaagaaagttgtatcgagtgtggttttgtaaatccaggctttgtccaatgtgcaactggaggagagcaatgaaacatggcattcagtcacaaaaggttgttgctgaagttattaaacaaaagccaacagttcgttggttgtttctcacattaacagttaaaaatgtttatgatggcgaagaattaaataagagtttgtcagatatggctcaaggatttcgccgaatgatgcaatataaaaaaattaataaaaatcttgttggttttatgcgtgcaacggaagtgacaataaataataaagataattcttataatcagcacatgcatgtattggtatgtgtggaaccaacttattttaagaatacagaaaactacgtgaatcaaaaacaatggattcaattttggaaaaaggcaatgaaattagactatgatccaaatgtaaaagttcaaatgattcgaccgaaaaataaatataaatcggatatacaatcggcaattgacgaaactgcaaaatatcctgtaaaggatacggattttatgaccgatgatgaagaaaagaatttgaaacgtttgtctgatttggaggaaggtttacaccgtaaaaggttaatctcctatggtggtttgttaaaagaaatacataaaaaattaaaccttgatgacacagaagaaggcgatttgattcatacagatgatgacgaaaaagccgatgaagatggattttctattattgcaatgtggaattgggaacggaaaaattattttattaaagagtagttcaacaaacgggccagtttgttgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcataccattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttctcctagtattagtaattatcatggctgtcatggcgcattaacggaataaagggtgtgcttaaatcgggccattttgcgtaataagaaaaaggattaattatgagcgaattgaattaataataaggtaatagatttacattagaaaatgaaaggggattttatgcgtgagaatgttacagtctatcccggcattgccagtcggggatattaaaaagagtataggtttttattgcgataaactaggtttcactttggttcaccatgaagatggattcgcagttctaatgtgtaatgaggttcggattcatctatgggaggcaagtgatgaaggctggcgctctcgtagtaatgattcaccggtttgtacaggtgcggagtcgtttattgctggtactgctagttgccgcattgaagtagagggaattgatgaattatatcaacatattaagcctttgggcattttgcaccccaatacatcattaaaagatcagtggtgggatgaacgagactttgcagtaattgatcccgacaacaatttgattagcttttttcaacaaataaaaagctaaaatctattattaatctgttcagcaatcgggcgcgattgctgaataaaagatacgagagacctctcttgtatcttttttattttgagtggttttgtccgttacactagaaaaccgaaagacaataaaaattttattcttgctgagtctggctttcggtaagctagacaaaacggacaaaataaaaattggcaagggtttaaaggtggagattttttgagtgatcttctcaaaaaatactacctgtcccttgctgatttttaaacgagcacgagagcaaaacccccctttgctgaggtggcagagggcaggtttttttgtttcttttttctcgtaaaaaaaagaaaggtcttaaaggttttatggttttggtcggcactgaattcgagctcagcattattgagtggatgattatattccttttgataggtggtatgttttcgcttgaacttttaaatacagccattgaacatacggttgatttaataactgacaaacatcaccctcttgctaaagcggccaaggacgctgccgccggggctgtttgcgtttttgccgtgatttcgtgtatcattggtttacttatttttttgccaaagctgtaatggctgaaaattcttacatttattttacatttttagaaatgggcgtgaaaaaaagcgcgcgattatgtaaaatataaagtgatagcggtaccaggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactaccgcactgctggcaggaggcgcaactcaagcttttgcctcgagctcggtacccggggatccaggaaactgcaaacaaatcgaatgaggtgaccgattcatcggtcaaaaacgggaccatccttcatgcatggaattggtcattcaatacgttaacacaaaatatgaaagagattcgtgatgcgggttatgcagccattcagacgtctccgattaaccaagtaaaggaagggaaccaaggagataaaagcatgtcgaactggtactggctctatcagccgacatcgtaccaaatcggcaaccgttacttaggcactgaacaagaatttaaggacatgtgtgcagccgcggaaaagtatggcgtaaaagtcattgtcgatgcggttgtcaatcataccaccagcgattatggcgcgatttctgatgagattaagcgtattccaaactggacccatggaaacacacaaattaaaaattggtcggacggatgggacatcactcaaaatgcattgcttgggctgtatgattggaatactcagaatactgaggtgcaagcctacctgaaaggtttcttggaaagagcattgaatgacggagcagacgggttccgctatgatgccgccaagcatatagagcttccggatgatgggaattacggcagccaattttggccgaatatcacaaatacatcggcggagttccaatacggagaaatcctgcaagacagcgcgtccagagatactgcttatgcgaattatatgaatgtgacggcttctaactatgggcattccatcagatccgctttaaagaatcgtaatctgagtgtgtcgaatatctcccattatgcatctgatgtgtctgcggacaagttagtcacatgggtggaatcacatgatacgtatgccaatgatgatgaagagtccacatggatgagtgatgacgatattcgtttaggctgggcagtgattggttcccgctcaggaagcacgcctcttttcttttccagacctgagggcggaggaaatggtgtaagatttcccggaaaaagtcaaataggagatcgcgggagcgccttatttaaagaccaggcgatcactgcggtcaatcaatttcacaatgaaatggccgggcagcctgaggaactctcaaatccgaatggcaacaatcaaatatttatgaatcagcgcggctcaaaaggcgttgtgctggcaaatgcaggatcgtcttctgtcaccatcaatacttcaacgaaattacctgacggcaggtatgataatagggccggcgccggttcatttcaagtagcgaacggcaaactgacaggtacgatcaatgcca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实施例5：枯草芽孢杆菌重组菌株中α-淀粉酶基因的表达及纯化α-淀粉酶突变体
接种一环重组枯草芽孢杆菌于5mL含5μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。接种1mL菌液于100mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养30h。表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图5。分泌的α-淀粉酶用以下方法纯化：上清边搅拌边加入硫酸铵至1.3M，4℃冰箱静置1h，8000r/min，4℃离心收集沉淀，沉淀用0.1M Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，pH6.0溶解，装入透析袋，在20mM的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中进行透析除盐，之后加入丙烯葡聚糖凝胶S300凝胶柱，用洗脱液洗脱即可得到所需的耐酸α-淀粉酶突变体。
α-淀粉酶突变体性能测定：
1)测定α-淀粉酶突变体最适pH值
重组菌株表达之后，12000r/min离心10min去除细胞，收集上清液，然后按实施例5的方法纯化酶液，得到的纯酶液达到90％以上的纯度，用于测定酶活力。酶活单位定义：在相应反应条件下，每分钟转化等价于1μmol葡萄糖的还原糖所需的酶量。以1U表示。测定方法如下：将500μL pH 6.0柠檬酸缓冲液配制的0.1g/L的可溶性淀粉置于65℃水浴保温5min，加入10μL纯酶液反应5min，DNS法测定生成还原糖的量
表1
| pH | 3.6 | 4.0 | 4.4 | 4.8 | 5.2 | 5.6 | 6.0 |
| 酶活力(U/mL) | 22.1 | 33.5 | 34.1 | 37.1 | 38.0 | 40.0 | 37.0 |
如表1所示，pH4.0仍具有很强的酶活，为最适pH5.6时酶活力的83％。
2)测定α-淀粉酶突变体耐酸活性测定
配制柠檬酸缓冲液，pH分别为3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.0/5.2、5.6、6.0将不同梯度pH缓冲液与浓缩纯酶按4∶1的比例稀释，于4℃冰箱保存24h后测定残余酶活力。结果如表2。
表2
如表2所示突变体酶具有较好酸性耐受性，在酸性条件下仍具有较高的酶活力，在宽泛的pH范围(pH4.0-6.0)酶活力稳定。说明按按上述方法制备的α-淀粉酶突变体具有酸稳定性(图6)。
2)α-淀粉酶突变体热稳定性测定
将酶液分别在60℃，65℃，70℃，75℃，80℃保温30min，按上述1)α-淀粉酶突变体耐酸活性测定方法测定酶活力，结果如表3所示：
表3
3)突变体酶和前体酶活力比较
在最适pH5.6和最适温度65℃条件下，将突变体酶和前体酶进行酶活力测定，测定结果见表4：
表4
| 菌株 | 酶活力/U/ml |
| CN7(对照) | 39 |
| CN7-2 | 140 |
由表4可知，α-淀粉酶突变体活力提高为前体酶的3.5倍。
本发明使用重组PCR技术，对前体α-淀粉酶基因进行定点突变，得到耐酸中温的α-淀粉酶突变体，并构建了重组分泌型表达载体，转化枯草芽孢杆菌，使耐酸(pH4.0-6.0)耐温(65-75℃)的α-淀粉酶突变体得以高效表达。α-淀粉酶突变体具有良好的酸稳定性，为耐酸性中温α-淀粉酶的工业化大生产提供一条可行途径，不仅适应我国双酶法及中低温液化的生产工艺的要求，且提高得率、降低能耗、提高产品的质量、增加效益。不仅具有重要的经济效益，也具有明显的社会效益。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，例如，所述的前体α-淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌等芽孢杆菌属的菌株；所述的载体适于在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中表达；尤其适于在蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌中表达。也可使用的任何已知的转化方法，如感受态法、电转化法、原生质体转化方法等将本发明的重组表达载体转入宿主细胞中，以实现α-淀粉酶突变体的表达。而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (2)
1.耐酸中温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A1，前体α-淀粉酶基因的扩增：提取枯草芽孢杆菌染色体DNA，根据Genbank中已报道的枯草芽孢杆菌淀粉酶基因为依据，设计如下引物：
上游引物F1：5’-GCGCGAATTCGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物R1：5’-CGCGAAGCTTATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3’(SEQ ID NO：2)；
PCR产物经纯化、双酶切后，连接到同样经双酶切线性化的pET-22b，转化大肠杆菌JM109，得到pET22-ACN7；
步骤A2，前体α-淀粉酶的的定点突变：设计含突变氨基酸残基的互补引物如下：
引物1：5’-TTGGTCGGACGGATGGGACATCACT-3’(SEQ ID NO：4)
引物2：5’-AGTGATGTCCCATCCGTCCGACCAA-3’(SEQ ID NO：5)
引物3：5’-GGGCCATAGAAGATACCGGATCATG-3’(SEQ ID NO：6)
引物4：5’-CATGATCCGGTATCTTCTATGGCCC-3’(SEQ ID NO：7)
以重组质粒pET22-ACN7为模板进行PCR扩增，按以下次序，将各成分在薄壁离心管内混合：PCR1：采用50μL体系，ddH2O38.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物1(20μmol/L)2μL，引物2(20μmol/L)2μL，DNA模板1μL，pfu高保真DNA聚合酶0.5μL。扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃40s，60℃，40s，72℃，2min，20个循环；最后1个循环为72℃7min。PCR2：采用50μL体系，ddH2O38.5Ml，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物3(20μmol/L)2μL，引物4(20μmol/L)2μL，DNA模板1μL，pfu高保真DNA聚合酶0.5μL.扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃40s，60℃，40s，72℃，2min，20个循环；最后1个循环为72℃7min。
PCR产物经纯化、转化大肠杆菌XL-10感受态细胞，挑选阳性克隆，经过测序验证，最终得到含有突变α-淀粉酶基因的重组表达载体pET-ACN7-2；
步骤A3，突变α-淀粉酶表达载体的构建：枯草芽孢杆菌表达载体采用pWB980，设计如下引物：
上游引物F2：5’-CGCGGATCCAGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG-3’(SEQ ID NO：9)；
下游引物R2：5’-CGCGGCATGCATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG-3’(SEQ ID NO：10)；
以重组表达载体pETCN7-2为模板进行PCR扩增，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合：采用50μL扩增体系：ddH2O 41.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，上下游引物2(20μmol/L)各0.5μL，DNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL.扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃40s，58℃，40s，72℃，2min，30个循环；最后1个循环为72℃10min；
将所得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测、纯化、双酶切，然后连接到同样双酶切线性化的pWB980载体上：在1.5mL离心管中加入12μL纯化的DNA，4μL线性pWB980载体，2μL 10×连接酶buffer，1μL T4 DNA连接酶，加水至总体积为20μL，16℃连接过夜；
步骤A4，表达载体转化枯草芽孢杆菌，将步骤A3的连接混合物转化枯草芽孢杆菌WB600的感受态细胞，枯草芽孢杆菌转化子提取质粒，提取的质粒用限制性内切酶BamH I和Sph I进行酶切鉴定，测序，构建了枯草芽孢杆菌重组表达载体pWB980-ACN7-2。
2.根据权利要求1所述的制备方法得到的耐酸中温α-淀粉酶，其特征在于，编码耐酸中温α-淀粉酶的突变体的DNA序列为SEQ ID NO：8。
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