CN102965359A - 一种耐酸性淀粉酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

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本发明公布了一种耐酸性淀粉酶突变体及其制备方法，属于遗传工程领域。本发明以枯草芽孢杆菌（Bacilus ssubtilis）淀粉酶为母本，采用分子生物学技术对枯草芽孢杆菌淀粉酶序列进行定点突变，在此改造条件下，枯草芽孢杆菌淀粉酶最适反应pH由对照（突变前）例的7.0变为4.5；突变后，在pH4.5条件下，淀粉酶催化效率提高5倍。利用此策略可以大大提高淀粉酶的耐酸性，为其工业化生产提供了基础。此策略对其它酶的性质改造具有重要的指导意义。

Description

一种耐酸性淀粉酶突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种耐酸性淀粉酶突变体及其制备方法。
背景技术
酸性淀粉酶是在酸性条件下能水解淀粉的酶类，可应用于酸性条件下淀粉原料的加工，显著的耐酸性使其具有很大的应用潜力和开发前景，广泛应用于青贮饲料、发酵饮料、废液的处理等多种领域。酸性淀粉酶生产菌株的获得主要通过筛选和突变获得。筛选的盲目性较大，不容易获得目的菌株。突变包括：自然突变和诱变，自然突变的几率相当小，诱变的工作量较大且不可控出现负突变的几率较大。
发明内容
本发明提供了一种耐酸性淀粉酶突变体，其特征在于，淀粉酶催化区域内组氨酸替换为天冬氨酸。
所述淀粉酶突变体是以SEQ ID NO.1为出发序列，分别将第222位、第275位、第293位和第310位的组氨酸突变成天冬氨酸得到的突变体。
所述SEQ ID NO.1已提交NCBI，序列号NO:JQ768415。
本发明还提供一种制备所述淀粉酶突变的方法，是将催化区域内组氨酸突变成天冬氨酸。
具体而言，是以SEQ ID NO.1为出发序列，分别将第222位、第275位、第293位和第310位的组氨酸突变成天冬氨酸。
所述制备所述淀粉酶突变的方法，具体步骤如下：
1）根据枯草芽孢杆菌淀粉酶序列SEQ ID NO.1所示，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-20b(+)中，构建重组质粒pAmyQ；
2）利用Swiss-model软件对源自枯草芽孢杆菌淀粉酶（SEQ ID NO.1）进行模拟，获得淀粉酶空间结构；
3）通过对淀粉酶空间结构进行分析，确定要突变的组氨酸位点；
4）设计突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，将组氨酸位点突变为天冬氨酸，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；
5）将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得淀粉酶突变体。
表1淀粉酶突变引物序列
Figure BDA00002569187100011
Figure BDA00002569187100021
本发明提供的淀粉酶突变体耐酸性强，针对单突变而言，在pH4.5条件下，淀粉酶的催化效率（kcat）由2.1×102s-1增长为6.0×102s-1，增加了3倍；复合突变后，催化效率（kcat）增长为10.7×102s-1，增加了5倍。同时，复合突变后，淀粉酶最适反应pH由7.0降低为4.5，耐酸性显著提高。相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。将该耐酸性淀粉酶突变体应用于食品、医药、化工等领域，可以在强耐酸性环境下高效降解淀粉，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：pAmyQ的质粒图谱。
图2：淀粉酶3D空间结构。
图3：突变前后，淀粉酶最适反应pH变化趋势。
具体实施方式
实施例1：淀粉酶耐酸性定点突变分析与方法
通过对淀粉酶3D空间结构（图2）进行分析，确定催化区域内对酶的耐酸性不稳定的组氨酸残基（His222,His275,His293,His310）。
根据枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）淀粉酶序列，采用化学全合成的方法全合成后，克隆到质粒pET-20b(+)中，构建重组质粒pAmyQ。
针对不同His位点的定点突变，设计相对应的定点突变引物（表1）。利用定点突变引物，淀粉酶进行定点突变。采用PCR酶，利用突变引物对重组质粒pAmyQ进行扩增。将扩增后片段利用胶回收试剂盒进行回收纯化。将获得的纯化后片段，采用磷酸化试剂盒对片段两端进行磷酸化。将磷酸化后的片段，利用连接酶进行连接，获得突变后的重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌宿主BL21，进行诱导表达，获得耐酸性突变后的重组淀粉酶(His222位点突变成Asp后，酶的活性失活)。
实施例2：淀粉酶耐酸性定点突变分析与方法
DNS法测定碱性淀粉酶酶活
1）DNS试剂的配置：称取2.5g3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，加入0.5g苯酚，再溶解0.075g亚硫酸钠、2.5g氢氧化钠、50g酒石酸钾钠，将其转入500mL容量瓶中摇匀定容，储存于棕色瓶放置在4°C冰箱中待用。
2）麦芽糖标准曲线的制作：配制0.2g/L-1.0g/L不同浓度的麦芽糖溶液。取1mL不同浓度的麦芽糖与同体积的DNS溶液混合，放入沸水浴中，水浴10min。用冷水冷却，定容至10mL，A540测定吸光值。以麦芽糖的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线。
3）将2mL1%的可溶性淀粉加入到试管中，加入1mL的缓冲液，混匀，60°C预热5min，加入0.4mL稀释好的酶液，反应5min。取1mL反应液与同体积的DNS试剂混匀，沸水浴煮沸10min，用冷水冷却，定容至10mL，混匀后，以没有加酶液但加入当量的去离子水的反应体系作为对照，测定A540吸光值。
淀粉酶在不同pH条件下酶活力测定
采用不同pH缓冲液，测定分析淀粉酶的耐酸性变化。采用pH4.5柠檬酸缓冲液，将缓冲液与可溶性淀粉混匀，采用3）的方法测定淀粉酶酶活力（见图3）。H275,H293,H310突变成Asp后，获得3个突变体。进一步对其进行复合突变，获得H275/293D,H275/310D,H293/310D,H275/293/310D复合突变体。对上述7个突变后的突变体，测定最适反应pH。H275D,H293D和H310D的最适反应pH由原来的7.0降低为5.5；复合突变体H275/293D,H275/310D,H293/310D,H275/293/310D最适反应pH有原来的7.0降低为4.5。该淀粉酶的耐酸性获得极大提高，在酸性环境下可以高效降解淀粉
酶活力单位定义：在pH6.5,温度60°C,在1min降解可溶性淀粉产生1μmol还原物质（以麦芽糖计算）所需要的酶量，为1个酶活单位（U）。
实施例3：淀粉酶在耐酸性条件下（pH4.5），催化效率测定分析
将耐酸性定点突变后的重组淀粉酶在pH4.5条件下测定淀粉酶的催化效率。在pH4.5的柠檬酸缓冲液条件下，将缓冲液与可溶性淀粉酶混匀，采用3）的方法测定淀粉酶的催化效率（kcat）。通过测定发现，单突变体H275D,H293D和H310D的催化效率（kcat）由原来的2.1×102s-1分别增长为4.7×,5.3×和6.0×102s-1；复合突变体H275/293D,H275/310D,H293/310D和H275/293/310D的催化效率（kcat）由原来的2.1×102s-1分别增长为5.8×,8.7×,9.8×和10.7×102s-1。该淀粉酶在酸性条件下具有较强的耐酸性和较高的催化效率。
Figure IDA00002569188000011
Figure IDA00002569188000041
Figure IDA00002569188000051
Figure IDA00002569188000061

Claims (5)

1.一种耐酸性淀粉酶突变体，其特征在于，淀粉酶催化区域内组氨酸替换为天冬氨酸。
2.权利要求1所述突变体，其特征在于，以SEQ ID NO.1为出发序列，分别将第222位、第275位、第293位和第310位的组氨酸突变成天冬氨酸得到的突变体。
3.权利要求1所述淀粉酶突变体的制备方法，其特征在于，将催化区域内组氨酸突变成天冬氨酸。
4.权利要求3所述方法，其特征在于，以SEQ ID NO.1为出发序列，分别将第222位、第275位、第293位和第310位的组氨酸突变成天冬氨酸。
5.权利要求3所述方法，其特征在于，步骤如下：
1）根据枯草芽孢杆菌淀粉酶序列SEQ ID NO.1所示，采用化学全合成的方法全合成
后克隆到质粒pET-20b(+)中，构建重组质粒pAmyQ；
2）利用Swiss-model软件对源自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）淀粉酶进行模拟，获得淀粉酶空间结构；
3）通过对淀粉酶空间结构进行分析，确定要突变的组氨酸位点；
4）设计突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，将组氨酸位点突变为天冬氨酸，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；
5）将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得淀粉酶突变体。
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