CN102925419B - 一种有机磷农药降解酶突变体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有更优良酶活性的有机磷农药降解酶突变体及其制备方法。通过分析降解酶的活性中心，获得多个酶的突变体，结果发现突变体M164F和L116M,尤其是M164F具有更优良的酶活性。本发明还提供了一种经毕赤酵母密码子优化后的降解酶突变体基因序列及利用酵母表达该基因的方法，其制备方法简单，由于使用毕赤酵母优化后的密码子，产量更高。获得有机磷农药降解酶可以应用在水果，蔬菜，茶叶等农产品农药残留处理等领域，具有广泛的应用前景，经济意义和社会意义。

Description

一种有机磷农药降解酶突变体及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说，涉及一种有机磷农药降解酶突变体及其制备方法。

背景技术

有机磷农药（organophosphorus pesticides，OPs）是农业生产中使用最为广泛的一大类农药(Singh BK.2009.Organophosphorus-degrading bacteria:ecology and industrial applications.Nature Reviews Microbiology.7:156-164)。自1944年德国拜耳公司首先发现有机磷具有杀虫特性并制造出第一种杀虫剂“l605-对硫磷”以来，有机磷作为一类高效、广谱的杀虫剂被广泛应用，在很大程度上提高了农作物的产量。据统计,2010年我国农药的总产量超过200万吨（中华人民共和国国家统计局中国统计年鉴-2010。北京:中国统计出版社,2011:14-221），其中有机磷农药产品占到其总量的80%。目前市场上有机磷农药商品的种类达上百种之多,我国所广泛使用的,包括毒死蜱、丙溴磷、乙酰甲胺磷、二嗪农和敌敌畏等杀虫剂(巨修练,李常平2010。有机磷杀虫剂的选择性与安全性。农药科学与管理。31:19-211),稻瘟净、克瘟净等杀菌剂的种类就达到30多种。此外,在我国经常使用的其他有机磷产品还有有机磷灭鼠剂、有机磷除草剂、生长调节剂等(张婵,廖晓兰2010。有机磷农药的微生物降解技术研究进展。广西农业科学。41:1079-10821)。大部分有机磷农药不溶于水(乐果、敌百虫除外)，而易溶于有机溶剂，在中性和酸性条件下稳定，不易水解，在碱性条件下因水解而失效。

有机磷农药属有机氯农药的取代物，具有药效高,品种多,防治范围广,成本低,比有机氯农药容易降解,对环境的污染及对生态系统的危害和残留均未有机氯农药普遍和突出等优点，为增加粮食生产、防治疾病传播作出了巨大贡献。但是,随着农业的发展,有机磷农药的使用量越来越大,大量有机磷农药残存于水和土壤中,不仅对地表农药残留量超标,造成食品污染，而且通过各种途径和地下水资源造成污染。

有机磷农药是一种神经性毒物,在人体内长期蓄积滞留会引发慢性中毒,导致人体神经功能紊乱,发生出汗,迟钝,神经失常和语言失常等症状。含有有机磷的农药通过食物残留等方式进入食物链，并在生物体中进行生物富积，从而造成致畸、致癌、致突变等危害，最终威胁到人类的生存与社会的可持续发展。因此,在日益重视环境保护能力的趋势下,加强有机磷农药降解方法的研究,解决有机磷农药对环境及食物的污染问题,是人类当前迫切需要解决的问题之一。

有机磷农药污染降解技术可分为热降解、光降解、化学降解和生物降解。生物降解是通过生物的作用将农药分解为无毒或低毒小分子化合物，并最终降解为水、CO2和矿物质的过程。相对于物理、化学降解技术，生物降解具有高效、彻底、无二次污染的优势。作物本身、微生物都能够降解有机磷农药残留，但植物的降解很缓慢，周期很长，微生物由于其强大的代谢多样性，在有机磷农药残留降解中具有更大的优势。现今,用微生物或微生物源酶制剂降解残留农药越来越受到重视,对微生物降解有机磷农药的研究已成为环保的一大重要课题。

有机磷农药降解酶微生物对于农药的降解可分为酶促和非酶促反应。所谓酶促反应是指微生物以胞内酶或分泌的胞外酶直接作用于农药，经过一系列生理生化反应，最终将农药完全降解或分解成分子量较小的无毒或毒性较小的化合物的过程。而非酶促形式指的是微生物通过代谢改变农药的环境离子浓度、pH等物理、化学性质，从而间接促使降解农药的过程。酶促反应是微生物降解农药的主要形式。当有机磷农药进入土壤后,微生物马上能产生降解有机磷农药的降解酶;另一种是微生物本身并无可降解该有机磷农药的酶系,当农药进入环境后,由于微生物生存的需要,微生物在适应环境的过程中基因发生重组或突变,产生新的降解酶系。

有机磷农药降解酶目前已被公认为是消除农药残留的最有潜力的新方法。常见的有机磷农药降解酶主要是水解酶类，包括磷酸酶、对硫磷水解酶、酯酶、硫基酰胺酶、裂解酶等，它们主要通过裂解P-O，P-S，P-N等键，使有机磷农药被降解，生成简单无机化合物。由于各种有机磷农药都有类似的结构，只是取代基不同，所以一种有机磷农药降解酶往往可降解多种有机磷农药（Theriot CM,Grunden AM.2011.Hydrolysis of organophosphorus compounds by microbialenzymes.Appl Microbiol Biotechnol.89,35-43）。

最早发现有机磷农药降解酶是在1973年前后。Sethunahan和Yoshida从土壤中分离出一株可以降解二嗪农和对硫磷的黄杆菌并发现其降解的原因是这些菌分泌一种水解磷酸酯键的酶，有机磷降解酶（Sethunahan N,Yoshida T.1973.A Flavobacterium that degrades diazinon and parathion.Can.J.Microbiol.19,873-875）。1974年Munnecke等从假单胞杆菌中检测出磷酸酯酶的活性，发现其对对硫磷具有降解作用，同时对甲基对硫磷、二嗪农、毒死蜱等有机磷农药均能有效降解，且该酶不为农药及农药制剂中溶剂所抑制（MunneckeD.M.,Hsieh P.D.1974.Microbial decontamination of parathion andp-nitrophenol in aqueous media.Applied Microbiol.28:212-217)。

20世纪80年代，Munnecke等发现有机磷农药降解酶比产生这类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件，如来源于假单胞菌的降解酶在10%的无机盐、1%的有机溶剂、50℃下都能保持高活性，而该酶的产生菌在同样的条件下却不能生长，而且，酶的降解效果远远胜于微生物本身，特别是对低浓度的农药更有效。因此，人们的思路从应用微生物菌体净化农药污染转向利用有机磷农药降解酶。

1980年，Brown等就对来源于黄杆菌的有机磷农药降解酶进行了部分纯化并对酶的性质进行了研究，发现酶反应的最适pH范围为8-10；酶的活性不受金属离子的影响，被非离子去污剂抑制（Brown KA.1980.Phosphotriesterases ofFlavobacterium sp.Soil Biology and Biochemistry.12:105-112）。1989年，Dumas等纯化得到来源于假单胞菌的有机磷农药降解酶，发现此酶是单体球蛋白，分子量为39kDa,有一个锌离子，被巯基试剂竞争性抑制，金属螯合剂、EDTA等可使其失活。除了对氧磷以外，此酶还可水解多种有机磷杀虫剂如毒死蜱，对硫磷，蝇毒磷，二嗪农，甲基对硫磷等（Dumas,DP,Caldwell,SR,Wild JR,RaushelFM.1989.Purification and properties of the phosphotriesterase fromPseudomonas diminuta.J Biol Chem,264,19659-19665)。

1996年，Vanhooke等对来源于黄杆菌的有机磷降解酶进行X光晶体衍射分析，发现此酶在自然条件下是二聚体，每个单体上含有2个锌离子，构成酶催化反应所需要的双金属中心(Vanhooke,J.L.,Benning,M.M.,Raushel,F.M.andHolden,H.M.1996.Three-dimensional structure of the zinc-containingphosphotriesterase with the bound substrate analog diethyl4-methylbenzylphosphonate.Biochemistry,35,6020-6025)。这些研究对有机磷农药降解酶无论是在结构上还是在作用机理上都有了进一步的了解。

我国近年来也在有机磷降解酶菌种筛选方面做了很多工作并取得了很大进展。楚晓娜等从假单胞菌中Pseudomonas sp．WBC—3中获得了甲基对硫磷水解酶。动力学分析显示该酶为非特异性有机磷降解酶，但最适底物为甲基对硫磷，对甲基对硫磷的耐受浓度在单纯无机盐培养基中可达800mg/L，在含有葡萄糖的培养基中可达2000mg/L（楚晓娜，张先恩，陈亚丽，刘虹，宋冬林。2003。假单胞菌WBC-23甲基对硫磷水解酶性质的初步研究。微生物学报,43:453—456）。刘玉焕等从华丽曲霉菌中分离纯化出有机磷农药降解酶。此酶对有机磷农药乐果具有较好的降解作用，该酶的最适反应温度45°C，最适反应pH7.2，对热较稳定，并且能在pH 6-10范围保持活性。重金属Cu²⁺对该酶具有明显的促进作用，而SDS对其具有抑制作用（刘玉焕和钟英长。2000。华丽曲霉Z58有机磷农药降解酶的纯化和性质。微生物学报。40：430-434）。

刘阳等对来源于米曲霉LY-128的有机磷农药水解酶的性质进行了分析，底物的专一性实验表明，该酶不仅可以作用于含P-O键的有机磷农药；而且也能水解含P-S键的有机磷农药。该酶的最适反应温度为45℃，最适pH6．8，在50℃以下及pH 6.0-9.5范围内活性稳定。Hg²⁺、Fe³⁺、碘乙酸和N-乙基马来酰亚胺对该酶有强烈的抑制作用，而Cu²⁺、巯基试剂和去污剂对酶有不同程度的激活作用（刘阳,刘玉焕,陈志仕,廉婕,罗维佳,黄晓,钟英长。2003。米曲霉LY-128广谱有机磷农药水解酶的纯化和鉴定。菌物系统。22,557-564）。由此可看出，已纯化和鉴定的几种有机磷农药水解酶在底物特异性、对化学物质的敏感性等方面存在明显差异。

伍宁丰等从农药厂被污染的土壤中分离到一株降解有机磷农药的高效菌株，假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)C2-1,并对其酶学性质进行了研究。其降解甲基对硫磷的最适温度为65℃,最适pH为9,并且此酶具有很好的热稳定性和pH稳定性,对大多数金属离子和化学试剂不敏感。该酶氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列分析表明,此酶与目前发表的有机磷降解酶没有同源性(伍宁丰,邓敏捷,史秀云,梁果义,姚斌,范云六。2003。一种新的有机磷降解酶的分离纯化及酶学性质研究。科学通报48,2446-2450)。同一实验室其后还进一步做了大量的基因表达工作。

为了使有机磷农药降解酶在农业生产中得到更好地应用,其降解机理也受到人们很大的关注。这种作用方式其实主要是一系列的酶促水解反应。要使进入土壤中的有机磷农药完全被分解为二氧化碳等简单的无毒性的化合物，其整个过程如下：首先农药吸附于微生物表面，然后穿透细胞膜进入细胞膜内部，最后在膜内与微生物所产生的降解酶结合发生酶促反应，以达到降解农药的目的。微生物直接作用于有机磷农药常见的方式主要有氧化、脱氢、还原、水解、合成等反应类型。

目前，微生物对有机磷农药的代谢途径研究比较清楚的是甲基对硫磷。微生物代谢甲基对硫磷，初始反应一般为水解反应，产物为二甲基硫代磷酸（dimethylthiophosphoricacid，DMTP）和对硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP），DMTP为无毒化合物，PNP的毒性与其母体甲基对硫磷相比下降了100倍，PNP通过产生4-硝基邻苯二酚(4-nitrocatechol,4-NC)和1,2,4-苯三酚(1,2,4-benzenetriol)的途径完全降解（柏文琴,李梅,邱星辉,何凤琴,冷欣夫.。2004.。苍白杆菌B2对甲基对硫磷降解途径研究.农药学学报.6：48-54）。

有机磷农药降解酶在原始天然菌株中含量太低，难以大量生产，且生产成本高昂。应用有机磷农药降解酶制剂就必须解决一个关键性的问题—如何工业化廉价生产有机磷农药降解酶制剂。近年来随着分子生物学及基因工程的发展，为有机磷降解酶制剂的基因工程大规模廉价生产奠定了基础，人们试图构建高效生物反应器来提高有机磷农药降解酶的表达量。

目前已从不同的微生物中分离到多种有机磷农药降解基因并进行了基因表达。1985年Serdar等首次尝试在大肠杆菌中表达有机磷农药降解酶，表达产物虽具有生物学活性，但表达量还未到原始天然菌株的1/10（Serdar CM and GibsonDT.1985.Enzymatic hydrolysis of organo-phosphates:cloning andexpression of a parathion hydrolase gene from Pseudomonas diminuta，Bio/Technol.3:567-571)。

刘智等从降解菌Peudomonas putida克隆到一个甲基对硫磷水解酶基因，并将其转化至大肠杆菌中。同时他还构建了能降解有机氯及有机磷和同时降解3种以上有机磷农药的降解菌各1株，能同时高效降解甲基对硫磷和呋喃丹农药的工程菌1株，在实验室条件下降解性能显著，酶活性提高6倍，获得既有农药降解能力又有生物防治功能的工程菌株（刘智,洪青,徐剑宏,武俊,张晓舟,张小华,马爱芝,朱军,李顺鹏。2003。甲基对硫磷水解酶基因的克隆与融合表达。遗传学报9:1020—1026）。

傅国平等用PCR方法获得甲基对硫磷水解酶编码基因，构建了重组表达质粒pET29a-mpd，将其转化至Escherichia coli BL21(DE3)中表达。该酶最适pH8.6-8.8，最佳反应温度15°C；Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺可使酶活性增加15％～20％（傅国平,崔中利,徐玮,吴旭平,李顺鹏。2004。甲基对硫磷水解酶的重组表达及其纯化和性质研究。微生物学报。44:357-360）。

Yang等利用pET表达系统,将甲基对硫磷水解酶（MPH）的mpd基因异源表达于大肠杆菌，其表达的酶比活性为1.4x10⁴U/mg蛋白。在50mM的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液（pH8.0）中的粗酶能够降低约98％的喷雾在甘蓝上的有机磷类农药,解毒效率优于水，洗涤剂，和市售的酶产品（Yang J,Yang C,Jiang H,Qiao C.2008.Overexpression of methyl parathion hydrolase and its applicationin detoxification of organophosphates.Biodegradation.19:831-9）。

中国农科院生物技术研究所范云六院士、伍宁丰研究员从被有机磷农药污染的土壤中筛选出能够降解多种有机磷农药的细菌，从中克隆出了有机磷降解酶的编码基因（邓敏捷,伍宁丰,梁果义,初晓宇,姚斌,范云六。2004。一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达。科学通报49:1068-1072），并成功的利用“毕赤酵母”高效表达了有机磷降解酶，其表达量在在3升高密度发酵罐中为5.5g/L（Chu XY,Wu NF,Deng MJ,Tian J,Yao B,Fan YL.2006.Expressionof organophosphorus hydrolase OPHC2 in Pichia pastoris:purification andcharacterization.Protein Expr Purif.49:9-14)。该成果已在3t发酵罐的中试水平上确立了基因工程酵母菌生产有机磷降解酶的稳定的发酵工艺，其商品“比亚蔬菜瓜果农药降解酶”生物制剂也已进入市场

天然菌株中的有机磷农药降解酶，大多对有机磷农药的降解率较低或作用较慢，不能达到期望的效果，可以通过基因工程或蛋白质工程的办法，改造降解酶的催化活性。有机磷农药降解酶OPH的254和257位组氨酸残基位于每个单体双金属活性位点的附近，这些残基决定了活性位点与底物的相互作用。diSioudi等利用基因工程技术定点改造oph，产生的突变体H254R、H257L、H254R/H257L的每个活性位点只含有1个金属离子，改变后的酶对内吸磷（P-S健）的水解作用提高了2～30倍，而对二异丙基氟磷酸（P-F键）水解作用下降，H257L和H254R/H257L突变体对NPPMP（神经毒剂梭曼的类似物）水解能力分别提高了11倍和18倍。这些结果表明，通过对H254和/或H257位点的定点修饰可以改变OPH对底物的专一性，这意味着对金属含量要求的改变增加了酶分子结构的灵活性，使得大底物易进入到活性位点，同时降低对小底物的催化效率，从而改变了酶的催化特性（diSioudi B,Grimsley JK,Lai K,Wild JR.1999.Modificationof near active site residues in organophosphorus hydrolase reduces metalstoichiometry and alters substrate specificity.Biochemistry.38:2866-2872).

Rochu等2004年报道有机磷农药降解酶活性中心的两个锌离子可由其他过渡金属阳离子取代，而不丧失活性，但显示不同的催化性能。高效酶突变体的先决条件是要求高的热稳定性。通过对金属阳离子锌²⁺，钴²⁺和Cd²⁺一系列实验，他们发现锌^2+可获得最高的酶稳定性，而钴²⁺可获得最高酶活性（Rochu D,ViguiéN,Renault F,Crouzier D,Froment MT,Masson P.2004.Contribution of theactive-site metal cation to the catalytic activity and to theconformational stability of phosphotriesterase:temperature-andpH-dependence.Biochem J.380:627-363）。

尤其是Dong等于2005年确定了Pseudomonas sp.WBC-3的甲基对硫磷水解酶为酶的基因改变奠定了基础。该酶是一个锌（II）二聚体，每个亚基包含混合的双核锌中心。这两种离子被配位体以八面体结构所包围。离子之间距离为3.5埃并由氨基酸残基His147，His149，Asp151，His152，His234和His302和一个水分子环绕。Asp255和一个水分子作为锌离子之间的桥梁。在催化中心的入口处存在着芳香族氨基酸Trp179，Phe196和Phe119。这三个氨基酸由丙氨酸置换导致酶的K(m)显着增加，但催化活性消失，表明这些芳香族氨基酸在酶对甲基对硫磷的亲和性方面具有重要的作用（Dong YJ,Bartlam M,Sun L,Zhou YF,ZhangZP,Zhang CG,Rao Z,Zhang XE.2005.Crystal structure of methyl parathionhydrolase from Pseudomonas sp.WBC-3.J Mol Biol.353:655-663）。

Reeves等2008年报道通过位点定向诱变和生物物理分析，可以使有机磷水解酶（OPH）突变体在保持酶稳定性的同时，提高酶的催化能力(Reeves TE,WalesME,Grimsley JK,Li P,Cerasoli DM,Wild JR.2008.Balancing the stabilityand the catalytic specificities of OP hydrolases with enhanced V-agentactivities.Protein Eng Des Sel.21:405-12)。

Su等2011年报道通过提高增加酶表面上的离子键，可以提高酶的热稳定性。通过比较耒自假单胞菌C2-1的有机磷水解酶OPHC2（具高热稳定性）和耒自苍白杆菌属甲基对硫磷水解酶（MPH OCH），对位于蛋白质表面上的两个脯氨酸（Pro76和Pro78）进行了突变。双位点突变（P76D/P78K），在失活50％（T50）的温度约为68°C，高于野生型酶（64°C），P76D（67°C），P78K（59°C）。结构分析显示P76D/P78K被取代的残基（Asp76和Lys78）可能产生了离子键并增加了静电能量，然后增加了酶的稳定性（Su Y,Tian J,Wang P,Chu X,Liu G,Wu N,FanY.2011.Improving the thermostability of a methyl parathion hydrolase byadding the ionic bond on protein surface.Appl Biochem Biotechnol.165:989-97）。

Tian等2010年报道甘氨酸脯氨酸突变也可增加酶的热稳定性。在苍白杆菌属M231的甲基对硫磷水解酶（MPH），使用同源建模和分子动力学模拟，精心挑选适当的甘氨酸的突变位点，他们发现G194P具有较高的热稳定性（Tian J,Wang P,Gao S,Chu X,Wu N,Fan Y.2010.Enhanced thermostability of methylparathion hydrolase from Ochrobactrum sp.M231 by rational engineeringof a glycine to proline mutation.FEBS J.277:4901-4908）。同一研究组还发现假单胞菌C2-1中的OPHC2具有较高热稳定性的原因可能是C110-C146二硫键构像（Chu XY,Tian J,Wu NF,Fan YL.2010.An intramolecular disulfidebond is required for the thermostability of methyl parathion hydrolase,OPHC2.Appl Microbiol Biotechnol.88:125-31）。

在已知的有机磷降解酶中，虽然其氨基酸序列，三维结构以及酶催化机理不同，但它们具有某些共同特性。所有这些酶是金属依赖型的水解酶，含有疏水的活性中心，其活性中心拥有3个口袋状空间，以结合有机磷农药的3个磷酯键基团。随着越来越多的有机磷降解酶晶体结构得到阐述，有机磷降解酶的活性中心和催化机理得到进一步了解。其中最重要而且研究得最多的是酯酶类中的磷酸三酯酶（phosphotriesterase,PTE）。此酶的晶体具有8次交替出现的α螺旋和β面片，也就是TIM-桶（TIM-Barrel)结构，由于多种不同耒源的酶晶体的报道，酶活性部位以及催化机制都较为清晰（Bigley AN,Raushel FM.2012.Catalyticmechanisms for phosphotriesterases.Biochim.Biophy.Acta.doi:10:1016/j.bbapap.2012.04.004）。

相对于磷酸三酯酶PTH，甲基对硫磷水解酶（Methyl parathionhydrolase,MPH)所知的信息有限。含有此酶的多种细菌可以甲基对硫磷作为唯一的碳源和氮源。通过晶体结构分析，此酶是一个2聚体，每个单体为αβ/βα结构，中央为β面片，周边为三明治式的α螺旋，金属离子位于中央的活性区，是一种典型的β-内酰胺酶结构。分子模拟研究预测有机磷农药的解离基团与由氨基酸残基F119,W179,F196组成的口袋相互作用；其它2个口袋位点分别由R72,L258,L273；和L65，L167组成。两金属位点中的α位点与H152,H302,D151连接，β位点与H147,H149,H234连接（Dong YJ,Bartlam M,Sun L,Zhou YF,Zhang ZP,Zhang CG,Rao Z,Zhang XE.2005.Crystal structure of methylparathion hydrolase from Pseudomonas sp.WBC-3.J Mol Biol.353:655-663）。最近Huang等报道使用分子动力学模拟，通过选择性地改变碱性氨基酸酸性，甲基对硫磷水解酶（OCHR-MPH）的酸性稳定性得到改善。三个突变体（K208E，K277D，和K208E/K277D）比野生型更稳定。他们的酶半衰期在pH值5.0时分别为64，68，65分钟，而野生型为39分钟（Huang L,Wang P,Tian J,Jiang H,Wu N,YangP,Yao B,Fan Y.2012.Improving the acidic stability of a methyl parathionhydrolase by changing basic residues to acidic residues.BiotechnolLett.34:1115-1121）。

但综观PMH酶研究现状，不仅没有此酶催化机理方面的报道，而且对酶动力学也所知甚少（Bigley AN,Raushel FM.2012.Catalytic mechanisms forphosphotriesterases.Biochim.Biophy.Acta.doi:10:1016/j.bbapap.2012.04.004）。综上所述，各种降解酶的酶学性质、底物范围等方面存在差异，但通过分子进化和定向突变，完全可以获得具有特殊性能（例如更高酶活性，更佳的酶耐受性等）的酶（Khare SD,Kipnis Y,Greisen P Jr,Takeuchi R,AshaniY,Goldsmith M,Song Y,Gallaher JL,Silman I,Leader H,Sussman JL,Stoddard BL,Tawfik DS,Baker D.2012.Computational redesign of amononuclear zinc metalloenzyme for organophosphate hydrolysis.Nat ChemBiol.8:294-300）。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种具有更优良酶活性的有机磷农药降解酶突变体及其制备方法。通过分析降解酶的活性中心，获得多个酶的突变体，结果发现突变体M164F和L116M,尤其是M164F具有更优良的酶活性。本发明还提供了一种经毕赤酵母密码子优化后的降解酶突变体基因序列及利用酵母表达该基因的方法，其制备方法简单，由于使用毕赤酵母优化后的密码子，产量更高。获得有机磷农药降解酶可以应用在水果，蔬菜，茶叶等农产品农药残留处理等领域，具有广泛的应用前景，经济意义和社会意义。

有机磷农药降解酶蛋白具有300个氨基酸残基，其基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。发明人通过比较并分析其它有机磷农药降解酶包括甲基对硫磷水解酶，选取可能位于酶活性中心或者附近的氨基酸残基进行突变，意外发现在确定活性中心的基础上，当对以下两个氨基酸残基进行点突变（L116或M164）时，所获的有机磷农药降解酶突变体比未突变的酶蛋白的生物学活性至少要增强10%以上。

因此，本发明的一个目的是提供一种有机磷农药降解酶突变体，其对有机磷农药降解酶164位的蛋氨酸（M）或第116位的亮氨酸（L）进行突变，所述突变体具有如Seq ID No.8或Seq ID No.13所述的氨基酸序列。其中所述Seq ID No.8中第164个氨基酸X₁为苯丙氨酸（F）、色氨酸（W)或异亮氨酸（I），优选为苯丙氨酸。当X₁为苯丙氨酸时，所述的有机磷农药降解酶突变体具有如Seq ID No.6所述的氨基酸序列。其中所述Seq ID No.13中第116个氨基酸X₁为蛋氨酸（M）、,异亮氨酸（I）、苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y），优选为蛋氨酸。当X₁为蛋氨酸时，所述的有机磷农药降解酶突变体具有如Seq ID No.11所述的氨基酸序列。

本发明还提供了编码上述有机磷农药降解酶突变体蛋白的基因序列，所述的基因序列具有如Seq ID No.12或Seq ID No.7所述的核苷酸序列。所述序列Seq IDNo.12中第346-348位的核苷酸N₁N₂N₃为分别编码蛋氨酸（M）、,异亮氨酸（I）、苯丙氨酸（F）或酪氨酸（Y）的密码子。当编码蛋氨酸时，所述的突变体基因具有如Seq ID No.10所述的核苷酸序列。所述序列Seq ID No.7中第490-492位的核苷酸N₁N₂N₃为分别编码苯丙氨酸（F）、色氨酸（W)或异亮氨酸（I）的密码子。当编码苯丙氨酸时，所述的突变体基因具有如Seq ID No.5所述的核苷酸序列。

本发明还提供了一种制备有机磷农药降解酶突变体蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）在有机磷农药降解酶突变体基因的两端引入限制性酶切位点，通过酶切操作连接到酵母表达载体上，

（2）将表达载体转化导入酵母菌中，经筛选得到重组基因工程菌；

（3）高密度发酵重组酵母菌，诱导表达后离心收集发酵上清液，经分离纯化获得重组有机磷农药降解酶突变体蛋白。

上述方法步骤（1）中，可根据全球公共序列数据库GeneBank记载序列号为AJ605330.1的有机磷农药降解酶的核苷酸序列为模板，分别在成熟有机磷农药降解酶两端引入限制性酶切位点，优选在前端加入限制性内切酶Xho I的酶切位点，后端加入限制性内切酶Xba I的酶切位点，并在限制性内切酶Xba I的酶切位点前端连续加入两个终止密码子。Xho I所导致的两个氨基酸（LE）和引入的两个碱性氨基酸（KR）密码子属于毕赤酵母α信号肽，也是毕赤酵母内在酶切位点。按照毕赤酵母的密码子偏好性改变核苷酸序列，将设计好的有机磷农药降解酶cDNA序列（SEQ ID No.1）进行化学合成。此DNA序列在毕赤酵母表达时最前面编码的4个氨基酸属于信号肽而被酶切除去，最后得到有机磷农药降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。如前所述，有机磷农药降解酶突变体基因的操作与此基本类似。

上述化学合成的有机磷农药降解酶基因可用本领域公知的方法克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。许多表达载体和其对应的宿主可以从公司购得，如酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D₂，pPIC9，pHIL-S1（Invitrogen Corp.San Diego.California.USA），动物细胞表达载体pSVK3、pMSG（Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA）等。优选的方法是将编码本发明中的目标蛋白或多肽的核酸克隆至酵母表达载体pPICZ-α-A，该质粒为酵母整合型质粒，带有醇氧化酶操纵子（AOX1）5’序列和3’序列，用于方便编码基因整合至酵母染色体，和控制编码基因的表达。这些质粒及对应的宿主菌等可以从Invitrogen Corp.San Diego.California.USA构得，优选的启动子为AOX1。

在一个优选的实施例中，对有机磷农药降解酶基因和酵母表达载体pPICZ-α-A进行双酶切，优选用限制性内切酶Xho I和限制性内切酶Xba I分别对有机磷农药降解酶基因和酵母表达载体pPICZ-α-A进行双酶切，将酶切后的有机磷农药降解酶基因与酵母表达载体pPICZ-α-A进行连接，将连接后的产物转入大肠杆菌DH5α内。选取重组菌落pPICZαA-OP，提取质粒经过双酶切证实并进行序列测定，经确认无误后，继续下面突变工作。

通过比较并分析其它有机磷农药降解酶包括甲基对硫磷水解酶，选取可能位于酶活性中心或者附近的氨基酸残基进行突变，尤其是以下两个氨基酸残基进行点突变：L116或M164，更优选的是进行如下的点突变L116M或M164F。点突变可通过本领域常用的基因定点突变技术进行，优选按照碧云天生物技术研究所的《基因定点突变试剂盒》，对这些突变位点合成引物。此试剂盒的原理是只需通过基于PCR的突变质粒的合成,和基于Dpn I的模板质粒的消化,转化培养以及后续的酶切或测序鉴定,即可得到预期的突变质粒。

使用此试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的两个引物,在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模板,用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒,但这个双链质粒中有两个裂口（nick)位点。待突变的质粒通常耒源于大肠杆菌等细菌,在细菌中会被甲基化修饰,而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理,可以消化掉待突变的质粒模板,而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。把Dpn I处理过的产物转化细菌后,质粒中有两个裂口（nick)位点可以被大肠杆菌修复,得到的克隆就会含有预期的突变质粒。

按照试剂盒要求，合成以下所需的引物

I、L116M：

1.pL116M_F：5’cacggtcttgctgactcatATGcaccctgatcatgcatgc 3’；

2.pL116M_R：5’gcatgcatgatcagggtgCATatgagtcagcaagaccgtg 3’；

II.、M164F

3.pM164F_F：5’ccagaaggaatgcaaggaTTCttcaaaatggctcaacaggc 3’；

4.pM164F_R：5’gcctgttgagccattttgaaGAAtccttgcattccttctgg 3’；

以前述制备得到的含有有机磷农药降解酶基因的质粒为模版，进行常规的基因定点突变PCR反应。PCR反应后,直接在PCR反应体系中加入Dpn I孵育，DpnI消化完毕后可以直接用于转化,或者-20℃保存备用。

根据所使用的感受态细菌,加入尽量多的经过Dpn I消化后的突变产物用于转化。通常每100微升感受态细菌中可以加入5-10微升经过Dpn I消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作,在涂板前通过离心浓缩的办法,把所有被转化后的细菌,全部涂布到含有适当抗生素的平板上,培养过夜。对于得到的克隆,可以先提取少量质粒酶切鉴定，以确认得到的质粒的大小和质粒中插入片断的大小与预期结果是否相符。取3-5个酶切鉴定正确的克隆去测序,以最终确认得到的克隆是符合预期序列的突变克隆。

载体可经转化或转染至原核生物或真核生物宿主。转化所需核酸至宿主细胞中去可用通常的方法，如：电穿孔，制备感受态的原生质球等。成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴定。

表达目标蛋白的宿主可以是酵母、哺乳动物细胞、细菌、动物、植物等,优选为酵母菌，如酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌属酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母等，更优选为毕赤酵母。目标蛋白或多肽可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的，是从宿主中分泌出来。分泌所用的信号肽，优选的是酵母MFα信号肽。编码目标蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。

可以通过培养含有本发明DNA构建体的宿主，如重组酵母、重组哺乳动物细胞、重组细菌、转基因动植物等，生产本发明的有机磷农药降解酶突变体。具体的培养方法，可以用摇瓶或生物反应器等，生产时优选的为生物反应器。培养基应能提供菌体（或细胞）生长和产物表达所需的物质，应包含氮源、碳源、pH缓冲成分等，培养基配方一般应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分两个阶段，第一阶段主要用于菌体（或细胞）的生长，第二阶段主要用于诱导表达目标产物。

将构建完成的基因工程菌进行液体培养和发酵,通过甲醇诱导。将经甲醇诱导后的培养液离心，收集上清液。可以用各种蛋白分离的方法分离纯化蛋白，如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。

在一个优选的实施例中，通过加入70%饱和度的硫酸铵,4°C,1小时后离心沉淀，使用1mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液透析。纯化后的重组酶经SDS-PAGE电泳分析为均一条带,纯度超过95%。以牛血清白蛋白为标准，计算有机磷农药降解酶，两突变体的的含量均超过6.5克/升,高于Chu等报道的5.5g/L产量（Chu XY,Wu NF,Deng MJ,Tian J,Yao B,Fan YL.2006.Expression of organophosphorushydrolase OPHC2 in Pichia pastoris:purification andcharacterization.Protein Expr Purif.49:9-14)。

对表达产物有机磷农药降解酶OP及其突变体进行聚丙烯酰胺电泳检测，在凝胶成像系统中确认上样液中含有表达产物农药降解酶OP以及突变体，其检测分子量与理论值一致，约为32.4kDa。

通过使用甲基对硫磷作底物测试重组降解酶活性，结果显示：与野生型有机磷降解酶OP相比，突变体M164F的酶比活提高23.6%，L116M的酶比活提高了13.2%。为了了解突变酶对其它有机磷农药的降解活性，使用液相识谱方法，对三唑磷、对氧磷、毒死稗进行了测试，结果证明突变体M164F的酶比活提高>20%，L116M的酶比活>10%。M164和L116其他突变体与野生型有机磷降解酶OP相比，其酶比活性均有一定程度的增加。例如M164W，M164I的酶比活性与野生型有机磷降解酶OP相比超过8%；L116其他突变体例如L116I，L116F，L116Y，与野生型有机磷降解酶OP相比超过5%。

附图说明

图1有机磷农药降解酶和突变体表达质粒的构建过程。

图2重组有机磷农药降解酶突变体M164F的SDS-PAGE凝胶电泳图。图中标号：样品槽1为蛋白分子量标准品（kDa），自上而下依次为：71，55,35,26；样品槽2，酵母经甲醇诱导后的2ul培养液（第0天）；样品槽3,4和5：酵母经甲醇诱导后的2ul培养液（第3,4和5天）。

具体实施方式

实施例1、有机磷农药降解酶突变体M164F的制备方法

1、密码子优化后的有机磷农药降解酶基因OP的设计和合成

根据全球公共序列数据库GeneBank记载序列号为AJ605330.1的有机磷农药降解酶的核苷酸序列为模板，分别在成熟有机磷农药降解酶前端加入限制性内切酶Xho I的酶切位点，后端加入限制性内切酶Xba I的酶切位点，并在限制性内切酶Xba I的酶切位点前端连续加入两个终止密码子。Xho I所导致的两个氨基酸（LE）和引入的两个碱性氨基酸（KR）密码子属于毕赤酵母α信号肽，也是毕赤酵母内在酶切位点。按照毕赤酵母的密码子偏好性改变核苷酸序列，将设计好的有机磷农药降解酶cDNA序列（SEQ ID No.1）进行化学合成。此DNA序列在毕赤酵母表达时最前面编码的4个氨基酸属于信号肽而被酶切除去，最后得到有机磷农药降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2、重组质粒构建

有机磷农药降解酶以及突变体基因的重组质粒构建如图1所示。

（1）将化学合成的有机磷农药降解酶基因OP用Xho I和Xba I进行双酶切将含有OP基因的质粒pUC57-OP（上海生物工程有限公司）进行双酶切：20ug质粒DNA，20ul 10X酶切缓冲液，5ul Xho I和5ul Xba I，加水至总体积200ul，37°C，6小时。

（2）将载体质粒pPICZαA用Xho I,Xba I进行双酶切

将pPICZαA进行双酶切：20ug质粒pPICZαA（Invitrogen公司），20ul 10X酶切缓冲液，5ul Xho I和5ul Xba I，加水至总体积200ul，37°C，6小时。

3.用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的有机磷农药降解酶基因和载体质粒进行回收、纯化

称取0.5克琼脂糖粉末加到含有50毫升琼脂糖凝胶电泳缓冲液的三角瓶中，将三角瓶内琼脂糖凝胶电泳缓冲液加热至沸腾并使琼脂糖粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙锭溶液，混合均匀，后倒入琼脂糖制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有琼脂糖凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入10μl的酶切混合物和2μ1DNA分子量标准品,打开电脉仪开关，在电泳仪电压为100伏特时开始电泳。

取1.5ml离心管并称其重量，在全自动紫外与可见分析仪将所需的目的DNA条带，从凝胶上切下，称取1.5ml离心管总量并计算出从凝胶上切下来的凝胶重量。按照“DNA凝胶回收试剂盒”方法（上海生物工程有限公司），回收有机磷农药降解酶基因OP和载体质粒DNA。

4.有机磷农药降解酶基因和载体质粒DNA片段的体外连接

将有机磷农药降解酶基因和载体质粒DNA片段按4:1摩尔数比混合，加入1μl T4 DNA连接酶，在1X T4 DNA连接酶缓冲液中，16°C保育过夜,待作转化。5.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

在7ml试管中加入3ml LB液体培养基和一个大肠杆菌DH5α单菌落，混合均匀，在摇床（转速为180转/分钟，37℃）培养过夜。第二天，在250ml三角瓶中将0.5ml培养过夜的菌液加入到50ml LB液体培养基，在同样条件下培养大约3小时。检测菌液体的0D600值，待菌液的0D600=0.4时，将含有菌液体的三角瓶置于0°C冰水混合物中，放置20分钟，备用。将25ml菌液加入到50ml离心管中，离心5分钟（4000转/分钟，4℃），弃去上清液，加入10ml冰冷的CaCl₂溶液（50mM),混合均匀，4°C保育30分钟。半小时后，离心（4000转/分钟，4°C），去掉上清液，加入新鲜的10ml冰冷的CaCl₂溶液（50mM)。经过第3次离心后，感受态细菌液最终溶解在2ml冰冷的CaCl₂溶液（50mM)。放置过夜后待用。

6.大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化

在1.5ml离心管中加入100μ1大肠杆菌DH5α感受态细胞和8μ1质粒连接混合物，混合均匀，将1.5ml离心管置于冰水混合物中，放置20分钟，后取出将1.5ml离心管置于42°C的水浴锅内，放置90秒，取出，再将1.5ml离心管置于冰水混合物中，放置5分钟后。加入1ml LB液体培养基，混合均匀，37°C摇床温育1小时，3000转/分离心5分钟后，弃去上清液，将管底的菌体涂布于含25μg/ml博莱霉素的LB固体培养基上，放置20分钟，后置于37°C条件下，培养16小时，形成菌落。

7.重组质粒的筛选和鉴定：

选取含有质粒pPICZαA-OP的重组菌落，用上海生物工程有限公司的UNIQ-10柱式质粒抽提试剂盒提取质粒。重组质粒经过双酶切证实后，再送至上海生工生物技术有限公司序列测定，经确认后，继续下面突变工作。

8.有机磷农药降解酶突变体M164F基因的设计和制备

分析比较多种有机磷农药水解酶，选取比较保守并可能属于酶活性中心或者附近的氨基酸残基，将第164的蛋氨酸改变为苯丙氨酸，即M164F。按照碧云天生物技术研究所《基因定点突变试剂盒》的要求，对这些突变位点合成以下所需的引物。5'端引物：5’ccagaaggaatgcaaggaTTCttcaaaatggctcaacaggc 3’；3’端引物：5’gcctgttgagccattttgaaGAAtccttgcattccttctgg 3’。突变后所产生的基因序列如SEQ ID No.5所示，而所产生的重组酶氨基酸序列如SEQ ID No.6。

（1）基因定点突变反应:

去核酸酶水37ul

反应缓冲液(10X)5ul

引物(10μM each)2ul

dNTP混合物(2.5mM each)4ul

待突变模板质粒(0.5ug)1ul

总体积49ul

（2）按照上面的顺序依次加入各种试剂，使总体积为49微升。混匀后,加入1ul Pfu DNA聚合酶混匀。

按照如下参数设置PCR仪:步骤1（最初变性）：循环为1，温度95°C，时间40秒；步骤2（扩增）：循环为18，温度95°C，40秒，变性；60°C 1分钟退火；68°C 1.5分钟/kb延伸；步骤3（延伸和补全）：循环为1，温度95°C，时间40秒；72°C 10分钟；步骤4（暂时存放）：循环为1，温度4°C长时间保持。

（3）Dpn I消化:PCR反应后,直接在PCR反应体系中加入1微升Dpn I,混匀后37°C孵育1小时。Dpn I消化完毕后可以直接用于转化,或者-20℃保存备用。

（4）转化，挑克隆鉴定:根据所使用的感受态细菌,加入尽量多的经过Dpn I消化后的突变产物用于转化。通常每100微升感受态细菌中可以加入5-10微升经过Dpn I消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作,在涂板前通过离心浓缩的办法,把所有被转化后的细菌,全部涂布到含有适当抗生素的平板上,培养过夜。对于得到的克隆,可以先提取少量质粒酶切鉴定，以确认得到的质粒的大小和质粒中插入片断的大小与预期结果是否相符。取3个酶切鉴定正确的克隆去测序,最终确认全部3个克隆都是预期的突变克隆，选取pPICZαA-M164F作进一步工作。

9、毕赤酵母基因工程菌构建

(1)重组质粒的线性化

在1.5ml离心管中加入50μg重组质粒pPICZαA-M164F、10μ1限制性酶切酶Sac I、20μ1的10X限制性酶切酶Sac I缓冲液和170μ1去离子水，混合均匀，置于37℃水浴锅内，放置4小时。加入12μl 5M NaCl，再加入636μl 95%乙醇,-20°C放置15min,离心5min（12000rpm）。用1200μl 75%乙醇洗涤3次,室温晾干后,溶解在20μl的无菌水-20℃保存,待电转化。

(2)酵母菌X-33感受态细胞的制备

在YPDS固体培养基（1%酵母浸出+2%胰蛋白胨+2%右旋葡萄糖+1M山梨醇+2%琼脂）上，接种毕赤酵母X-33（Invitrogen公司），置于30°C条件下培养72小时，观察到白色单个菌落。在10ml离心管中加入3ml的YPDS液体培养基和一个巴斯德毕赤酵母X-33菌的单菌落，混合均匀，30°C条件下培养12小时。在250ml三角瓶中加入0.5ml菌液和50ml YPDS液体培养基,30°C条件下培养3小时，检测菌的OD600值。待OD600=1.5时，在50ml离心管中加入45ml菌液,4°C离心（2500rpm，5分钟），弃上清液，加入45ml去离子水，离心（1500rpm，5分钟），再次用去离子水清洗（共三次）。将菌体溶解在10ml 0°C的D-山梨醇(1M)，4°C离心（1500rpm，5分钟）。最后制得的感受态细胞溶解在1M的D-山梨醇（OD600=1），备用。

(3)酵母阳性重组子的备制及筛选

在4ml离心管中加入10μg线性化的载体质粒和100μ1的毕赤酵母X-33菌感受态细胞（0D600=1），混合均匀。载体质粒含有机磷农药降解酶基因突变体M164F。在0°C条件下，将电击杯放于浓度为70%的乙醇中，浸泡30分钟后，取出，在电击杯内放入105μ1混合液，将电击杯放置5分钟，后将电击杯放到电转化仪内，进行电击，电脉冲为25微法，电压为1.4千伏，电阻为200欧姆，电击时间为0.05秒。电击结束后，取出含有混合液的电击杯，后在电击杯内加入1ml D-山梨醇（1M)，将混合物加到1.5ml离心管中，30°C摇床中，转速为225rpm，培养1小时后，取100μ1培养后的混合物，并将其涂布于含有浓度为25μg/mlZeocin的YPDS固体培养基上，将涂布后的YPDS固体培养基置于30°C培养箱内，培养4天，得到白色单菌落。将以上得到的全部白色单菌落接种到含500μg/ml博莱霉素的YPDS固体培养基上，置于30°C培养箱内，培养3天，观察到单个菌落，即得到的阳性重组子。

10、阳性酵母重组子的诱导表达

（1）摇瓶诱导培养

将表达的有机磷农药降解酶突变体M164F的酵母菌，接种到100ml锥形瓶中的20ml BMGY液体培养基（1%酵母浸出物，2%蛋白胨，100mM磷酸钾PH6.0，1.34%YNB 4×10^-5%生物素，1%甘油），将菌液置于30°C条件下，摇床培养（200转/分钟）至OD600=5时，取8ml菌液离心（4000rpm，3分钟），将菌体转移到100ml锥形瓶中的20ml BMMY培养基(1%酵母浸出物，2%蛋白胨，100mM磷酸钾pH6.0，1.34%YNB 4×10^-5%生物素,0.5%甲醇)，30°C继续培养120小时，在培养过程中每隔12小时添加0.1ml浓度为100%的无水甲醇。培养结束后，取20ml菌液，离心10分钟（12000rpm），得到上清液，即为表达的有机磷农药降解酶突变体M164F。

(2)发酵罐诱导培养

将菌种接种至10ml YPD培养液（1%酵母浸出+2%胰蛋白胨+2%右旋葡萄糖),30°C,240rpm,培养过夜，将将其转入含有新鲜YPD培养液（200ml），同样条件培养过夜。培养液然后转至含有2升基础无机盐培养基的3升发酵罐中继续培养。基础无机盐培养基：85%磷酸26.7ml/L，硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，七水硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，葡萄糖50g/L和4.4ml/L的稀有金属培养基PTM1。PTM1由以下成分组成：五水硫酸铜6.0g/L，碘化钠0.08g/L，一水硫酸锰3.0g/L，二水钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，氯化钴0.5g/L，氯化锌20g/L，七水硫酸亚铁65.0g/L，生物素0.2g/L，硫酸5.0ml/L。

将发酵罐pH设置为5.0，溶氧量>20%，温度为30°C,750rpm。待葡萄糖消耗完毕，以每小时每升36ml加入含有1.2%PTM1的25%葡萄糖溶液，持续6小时，进行葡萄糖培养以增加菌体量。待葡萄糖消耗完毕，进入甲醇诱导培养。首先进行甲醇适应阶段，以每小时每升加入含有11.1%甲醇和12ml/L PTM1的葡萄糖,持续4小时。之后以每小时每升3ml加入含有12ml/L PTM1的甲醇进行诱导培养直至发酵结束。

11、重组有机磷农药降解酶和突变体的分离和纯化。

将经甲醇诱导后的培养液，离心（10000rpm,4°C，10分钟），收集上清液，加入70%饱和度的硫酸铵,4°C,1小时后离心沉淀，使用1mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液透析。纯化后的重组酶经SDS-PAGE电泳分析为均一条带,纯度超过95%。以牛血清白蛋白为标准，计算有机磷农药降解酶突变体M164F的含量达6.8克/升,高于Chu等报道的5.5g/L产量（Chu XY,Wu NF,Deng MJ,Tian J,Yao B,FanYL.2006.Expression of organophosphorus hydrolase OPHC2 in Pichiapastoris:purification and characterization.Protein Expr Purif.49:9-14)。

12、对表达产物有机磷农药降解酶突变体M164L进行聚丙烯酰胺电泳检测

（1）凝胶的配制

取一个干净50ml离心管,按以下成份加入,充分混合

分离胶浓度12%：6.5ml去离子水，4.5ml 40%丙烯酰胺混合液，3.9ml 1.5MTris-HCl pH8.8，150μl 10%十二烷基磺酸钠，9μl TEMED，最后加入150μl 10%过硫酸铵

积层胶浓度5%：2.96ml去离子水，0.5ml 40%丙烯酰胺混合液，0.5ml 1.5M Tris-HCl pH6.8，40μl 10%十二烷基磺酸钠，4μl TEMED，最后加入40μl10%过硫酸铵.

（2）聚丙烯酰胺电泳检测：

1）考马斯亮兰染色液配制

取100mg考马斯亮兰、加入95%乙醇50ml和100ml乙酸，混合均匀，用去离子水稀释至1000ml中，过滤，得到考马斯亮兰染液。

2）取4%的十二烷基磺酸钠、12%的甘油、50mM Tris-HCl、2%的疏基乙醇和0.05%的溴酚蓝，混合均匀，用盐酸将其pH值调至6.8，形成样品缓冲液，备用；

3）取6ul的样品缓冲液和2ul的表达产物有机磷农药降解酶OP或其突变体，混合均匀

4）在凝胶的点样孔中分别加入5μ1的上样液和5μ1蛋白分子量标准品,打开电脉仪开关，在电泳仪电压为100伏特时开始电泳，电泳3小时后关闭电泳仪，后通过考马斯亮兰染液染色30分钟、脱色液脱色，在凝胶成像系统中确认上样液中含有表达产物农药降解酶突变体，其检测分子量为34kDa，与理论值一致。

13、有机磷农药降解酶突变体M164F活性检测

（1）使用甲基对硫磷作底物测试重组降解酶活性。

1)用甲醇配制2ml甲基对硫磷（10mg/ml）

2)配制10ml甲基对硫磷降解反应液：7.5ml去离子水+0.5ml 1MTris-HCl(pH8.0)缓冲液+1ml甲醇+0.1M ZnCl₂（10ul）+10mg/ml甲基对硫磷（50ul）。

3)实验步骤

取各重组有机磷降解酶和突变体10ul,加入到990ul去离子水，配制成10^-2酶液；再取100ul 10^-2酶液加入到900ul去离子水，配制成10^-3酶液。在1.5ml离心管加入900ul甲基对硫磷降解反应液和10^-3酶液（100ul），混匀后加入转移到分光光度计中在412nm波长下，测量光密度。用1.5ml离心管加入900ul甲基对硫磷降解反应液和100ul去离子水作为对照。结果显示：与野生型有机磷降解酶OP相比，突变体M164F的酶比活提高23.6%（(p<0.05)。

（2）使用液相识谱方法，对三唑磷、对氧磷、毒死稗进行了测试，结果表面突变体M164F的酶比活与野生型有机磷农药降解酶比较均超过>20%(p<0.05)。

实施例2有机磷农药降解酶突变体L116M的制备方法

1、密码子优化后的有机磷农药降解酶基因OP的设计和合成

根据全球公共序列数据库GeneBank记载序列号为AJ605330.1的有机磷农药降解酶的核苷酸序列为模板，分别在成熟有机磷农药降解酶前端加入限制性内切酶Xho I的酶切位点，后端加入限制性内切酶Xba I的酶切位点，并在限制性内切酶Xba I的酶切位点前端连续加入两个终止密码子。Xho I所导致的两个氨基酸（LE）和引入的两个碱性氨基酸（KR）密码子属于毕赤酵母α信号肽，也是毕赤酵母内在酶切位点。按照毕赤酵母的密码子偏好性改变核苷酸序列，将设计好的有机磷农药降解酶cDNA序列（SEQ ID No.1）进行化学合成。此DNA序列在毕赤酵母表达时最前面编码的4个氨基酸属于信号肽而被酶切除去，最后得到有机磷农药降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2、重组质粒构建

有机磷农药降解酶以及突变体基因的重组质粒构建如图1所示。

（1）将化学合成的有机磷农药降解酶基因OP用Xho I和Xba I进行双酶切

将含有OP基因的质粒pUC57-OP（上海生物工程有限公司）进行双酶切：20ug质粒DNA，20ul 10X酶切缓冲液，5ul Xho I和5ul Xba I，加水至总体积200ul，37°C，6小时。

（2）将载体质粒pPICZαA用Xho I,Xba I进行双酶切

将pPICZαA进行双酶切：20ug质粒pPICZαA，20ul 10X酶切缓冲液，5ul XhoI和5ul Xba I，加水至总体积200ul，37°C，6小时。

3.用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的有机磷农药降解酶基因和载体质粒进行回收、纯化

称取0.5克琼脂糖粉末加到含有50毫升琼脂糖凝胶电泳缓冲液的三角瓶中，将三角瓶内琼脂糖凝胶电泳缓冲液加热至沸腾并使琼脂糖粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙锭溶液，混合均匀，后倒入琼脂糖制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔，将凝胶放入含有琼脂糖凝胶电泳缓冲液的电泳凝胶盒中，在凝胶的点样孔中分别加入10μl的酶切混合物和2μ1DNA分子量标准品,打开电脉仪开关，在电泳仪电压为100伏特时开始电泳。

取1.5ml离心管并称其重量，在全自动紫外与可见分析仪将所需的目的DNA条带，从凝胶上切下，称取1.5ml离心管总量并计算出从凝胶上切下来的凝胶重量。按照“DNA凝胶回收试剂盒”方法（上海生物工程有限公司），回收有机磷农药降解酶基因OP和载体质粒DNA。

4.有机磷农药降解酶基因和载体质粒DNA片段的体外连接

将有机磷农药降解酶基因和载体质粒DNA片段按4:1摩尔数比混合，加入1μl T4DNA连接酶，在1X T4 DNA连接酶缓冲液中，16°C保育过夜,待作转化。

5.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

在7ml试管中加入3ml LB液体培养基和一个大肠杆菌DH5α单菌落，混合均匀，在摇床（转速为180转/分钟，37°C）培养过夜。第二天，在250ml三角瓶中将0.5ml培养过夜的菌液加入到50ml LB液体培养基，在同样条件下培养大约3小时。检测菌液体的0D600值，待菌液的0D600=0.4时，将含有菌液体的三角瓶置于0°C冰水混合物中，放置20分钟，备用。将25ml菌液加入到50ml离心管中，离心5分钟（4000转/分钟，4°C），弃去上清液，加入10ml冰冷的CaCl₂溶液（50mM),混合均匀，4°C保育30分钟。半小时后，离心（4000转/分钟，4°C），去掉上清液，加入新鲜的10ml冰冷的CaCl₂溶液（50mM)。经过第3次离心后，感受态细菌液最终溶解在2ml冰冷的CaCl₂溶液（50mM)。放置过夜后待用。

6.大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化

在1.5ml离心管中加入100μ1大肠杆菌DH5α感受态细胞和8μ1质粒连接混合物，混合均匀，将1.5ml离心管置于冰水混合物中，放置20分钟，后取出将1.5ml离心管置于42°C的水浴锅内，放置90秒，取出，再将1.5ml离心管置于冰水混合物中，放置5分钟后。加入1ml LB液体培养基，混合均匀，37°C摇床温育1小时，3000转/分离心5分钟后，弃去上清液，将管底的菌体涂布于含25μg/ml博莱霉素的LB固体培养基上，放置20分钟，后置于37°C条件下，培养16小时，形成菌落。

7.重组质粒的筛选和鉴定：

选取重组菌落pPICZαA-OP，用上海生物工程有限公司的UNIQ-10柱式质粒抽提试剂盒提取质粒。重组质粒经过双酶切证实后，再送至上海生工生物技术有限公司序列测定，经确认后，继续下面突变工作。

8.有机磷农药降解酶突变体L116M基因的设计和制备

分析比较多种有机磷农药水解酶，选取比较保守并可能属于酶活性中心或者附近的氨基酸残基，将第116的亮氨酸改变为蛋氨酸，即L116M。按照碧云天生物技术研究所《基因定点突变试剂盒》的要求，对这些突变位点合成以下所需的引物:

5'端引物：5’cacggtcttgctgactcatATGcaccctgatcatgcatgc 3’；3’端引

物：5’gcatgcatgatcagggtgCATatgagtcagcaagaccgtg 3’

突变后所产生的基因序列如SEQ ID No.10所示，而所产生的重组酶氨基酸序列如SEQ ID No.11。

(1)基因定点突变反应:

去核酸酶水37ul

反应缓冲液(10X)5ul

引物(10uM each)2ul

dNTP混合物(2.5mM each)4ul

待突变模板质粒(0.5ug)1ul

总体积49ul

(2)按照上面的顺序依次加入各种试剂，使总体积为49微升。混匀后,加入1ulPfu DNA聚合酶混匀。

按照如下参数设置PCR仪:步骤1（最初变性）：循环为1，温度95°C，时间40秒；步骤2（扩增）：循环为18，温度95°C，40秒，变性；60°C 1分钟退火；68°C 1.5分钟/kb延伸；步骤3（延伸和补全）：循环为1，温度95°C，时间40秒；72°C 10分钟；步骤4（暂时存放）：循环为1，温度4°C长时间保持。

(3)Dpn I消化:PCR反应后,直接在PCR反应体系中加入1微升Dpn I,混匀后37°C孵育1小时。Dpn I消化完毕后可以直接用于转化,或者-20°C保存备用。

(4)转化，挑克隆鉴定:根据所使用的感受态细菌,加入尽量多的经过Dpn I消化后的突变产物用于转化。通常每100微升感受态细菌中可以加入5-10微升经过Dpn I消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作,在涂板前通过离心浓缩的办法,把所有被转化后的细菌,全部涂布到含有适当抗生素的平板上,培养过夜。对于得到的克隆,可以先提取少量质粒酶切鉴定，以确认得到的质粒的大小和质粒中插入片断的大小与预期结果是否相符。取3个酶切鉴定正确的克隆去测序,最终确认2个克隆都是预期的突变克隆，选取pPICZαA-L116M作进一步工作。

9.毕赤酵母基因工程菌构建

(1)重组质粒的线性化

在1.5ml离心管中加入50μg重组质粒pPICZαA-L116M、10μ1限制性酶切酶Sac I、20μ1的10X限制性酶切酶SacI缓冲液和170μ1去离子水，混合均匀，置于37°C水浴锅内，放置4小时。加入12μl 5M NaCl，再加入636μl 95%乙醇,-20°C放置15min,离心5min（12000rpm）。用1200μl 75%乙醇洗涤3次,室温晾干后,溶解在20μl的无菌水-20°C保存,待电转化。

(2)酵母菌X-33感受态细胞的制备

在YPDS固体培养基（1%酵母浸出+2%胰蛋白胨+2%右旋葡萄糖+1M山梨醇+2%琼脂）上，接种毕赤酵母X-33，置于30°C条件下培养72小时，观察到白色单个菌落。在10ml离心管中加入3ml的YPDS液体培养基和一个巴斯德毕赤酵母X-33菌的单菌落，混合均匀，30°C条件下培养12小时。在250ml三角瓶中加入0.5ml菌液和50mlYPDS液体培养基,30°C条件下培养3小时，检测菌的OD600值。待OD600=1.5时，在50ml离心管中加入45ml菌液,4°C离心（2500rpm，5分钟），弃上清液，加入45ml去离子水，离心（1500rpm，5分钟），再次用去离子水清洗（共三次）。将菌体溶解在10ml 0°C的D-山梨醇(1M)，4°C离心（1500rpm，5分钟）。最后制得的感受态细胞溶解在1M的D-山梨醇（OD600=1），备用。

(3)酵母阳性重组子的备制及筛选

在4ml离心管中加入10μg线性化的载体质粒和100μ1的毕赤酵母X-33菌感受态细胞（0D600=1），混合均匀。载体质粒含有机磷农药降解酶基因突变体L116M。在0°C条件下，将电击杯放于浓度为70%的乙醇中，浸泡30分钟后，取出，在电击杯内放入105μ1混合液，将电击杯放置5分钟，后将电击杯放到电转化仪内，进行电击，电脉冲为25微法，电压为1.4千伏，电阻为200欧姆，电击时间为0.05秒。电击结束后，取出含有混合液的电击杯，后在电击杯内加入1ml D-山梨醇（1M)，将混合物加到1.5ml离心管中，30°C摇床中，转速为225rpm，培养1小时后，取100μ1培养后的混合物，并将其涂布于含有浓度为25μg/mlZeocin的YPDS固体培养基上，将涂布后的YPDS固体培养基置于30°C培养箱内，培养4天，得到白色单菌落。将以上得到的全部白色单菌落接种到含500μg/ml博莱霉素的YPDS固体培养基上，置于30°C培养箱内，培养3天，观察到单个菌落，即得到的阳性重组子。

10.阳性酵母重组子的诱导表达

(1)摇瓶诱导培养

将表达的有机磷农药降解酶突变体L116M的酵母菌，接种到100ml锥形瓶中的20ml BMGY液体培养基（1%酵母浸出物，2%蛋白胨，100mM磷酸钾PH6.0，1.34%YNB 4×10^-5%生物素，1%甘油），将菌液置于30℃条件下，摇床培养（200转/分钟）至OD600=5时，取8ml菌液离心（4000rpm，3分钟），将菌体转移到100ml锥形瓶中的20ml BMMY培养基(1%酵母浸出物，2%蛋白胨，100mM磷酸钾pH6.0，1.34%YNB 4×10^-5%生物素,0.5%甲醇)，30℃继续培养120小时，在培养过程中每隔12小时添加0.1ml浓度为100%的无水甲醇。培养结束后，取20ml菌液，离心10分钟（12000rpm），得到上清液，即为表达的有机磷农药降解酶突变体L116M。

(2)发酵罐诱导培养

将菌种接种至10ml YPD培养液（1%酵母浸出+2%胰蛋白胨+2%右旋葡萄糖),30°C,240rpm,培养过夜，将将其转入含有新鲜YPD培养液（200ml），同样条件培养过夜。培养液然后转至含有2升基础无机盐培养基的3升发酵罐中继续培养。基础无机盐培养基：85%磷酸26.7ml/L，硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，七水硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，葡萄糖50g/L和4.4ml/L的稀有金属培养基PTM1。PTM1由以下成分组成：五水硫酸铜6.0g/L，碘化钠0.08g/L，一水硫酸锰3.0g/L，二水钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，氯化钴0.5g/L，氯化锌20g/L，七水硫酸亚铁65.0g/L，生物素0.2g/L，硫酸5.0ml/L。

将发酵罐pH设置为5.0，溶氧量>20%，温度为30°C,750rpm。待葡萄糖消耗完毕，以每小时每升36ml加入含有1.2%PTM1的25%葡萄糖溶液，持续6小时，进行葡萄糖培养以增加菌体量。待葡萄糖消耗完毕，进入甲醇诱导培养。首先进行甲醇适应阶段，以每小时每升加入含有11.1%甲醇和12ml/L PTM1的葡萄糖,持续4小时。之后以每小时每升3ml加入含有12ml/L PTM1的甲醇进行诱导培养直至发酵结束。

11.重组有机磷农药降解酶突变体的分离和纯化。

将经甲醇诱导后的培养液，离心（10000rpm,4°C，10分钟），收集上清液，加入70%饱和度的硫酸铵,4°C,1小时后离心沉淀，使用1mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液透析。纯化后的重组酶经SDS-PAGE电泳分析为均一条带,纯度超过95%。以牛血清白蛋白为标准，计算有机磷农药降解酶突变体L116M的含量达7.2克/升,高于Chu等报道的5.5g/L产量（Chu XY,Wu NF,Deng MJ,Tian J,Yao B,FanYL.2006.Expression of organophosphorus hydrolase OPHC2 in Pichiapastoris:purification and characterization.Protein Expr Purif.49:9-14)。

12.对表达产物有机磷农药降解酶突变体L116M进行聚丙烯酰胺电泳检测

(1)凝胶的配制

取一个干净50ml离心管,按以下成份加入,充分混合.

分离胶浓度12%：6.5ml去离子水，4.5ml 40%丙烯酰胺混合液，3.9ml 1.5MTris-HCl pH8.8，150μl 10%十二烷基磺酸钠，9μl TEMED，最后加入150μl 10%过硫酸铵。

积层胶浓度5%：2.96ml去离子水，0.5ml 40%丙烯酰胺混合液，0.5ml 1.5M Tris-HCl pH6.8，40μl 10%十二烷基磺酸钠，4μl TEMED，最后加入40μl10%过硫酸铵。

（2）聚丙烯酰胺电泳检测：

1）考马斯亮兰染色液配制

取100mg考马斯亮兰、加入95%乙醇50ml和100ml乙酸，混合均匀，用去离子水稀释至1000ml中，过滤，得到考马斯亮兰染液。

2）取4%的十二烷基磺酸钠、12%的甘油、50mM Tris-HCl、2%的疏基乙醇和0.05%的溴酚蓝，混合均匀，用盐酸将其pH值调至6.8，形成样品缓冲液，备用；

3）取6ul的样品缓冲液和2ul的表达产物有机磷农药降解酶OP或其突变体，混合均匀

4）在凝胶的点样孔中分别加入5μ1的上样液和5μ1蛋白分子量标准品,打开电脉仪开关，在电泳仪电压为100伏特时开始电泳，电泳3小时后关闭电泳仪，后通过考马斯亮兰染液染色30分钟、脱色液脱色，在凝胶成像系统中确认上样液中含有表达产物农药降解酶突变体，其检测分子量与理论值一致，为32kDa。

13.有机磷农药降解酶突变体L116M活性检测

(1)使用甲基对硫磷作底物测试重组降解酶活性。

1）用甲醇配制2ml甲基对硫磷（10mg/ml）

2）配制10ml甲基对硫磷降解反应液：7.5ml去离子水+0.5ml 1MTris-HCl(pH8.0)缓冲液+1ml甲醇+0.1M ZnCl₂（10ul）+10mg/ml甲基对硫磷（50ul）。

3）实验步骤

取各重组有机磷降解酶和突变体10ul,加入到990ul去离子水，配制成10^-2酶液；再取100ul 10^-2酶液加入到900ul去离子水，配制成10^-3酶液。在1.5ml离心管加入900ul甲基对硫磷降解反应液和10^-3酶液（100ul），混匀后加入转移到分光光度计中在412nm波长下，测量光密度。用1.5ml离心管加入900ul甲基对硫磷降解反应液和100ul去离子水作为对照。结果显示：与野生型有机磷降解酶OP相比，突变体L116M的酶比活提高13.2%(p<0.05)。

(2)使用液相识谱方法，对三唑磷、对氧磷、毒死稗进行了测试，结果表面突变体L116M的酶比活与野生型有机磷农药降解酶比较均超过>10%(p<0.05)。

Claims (20)

1.一种有机磷农药降解酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如Seq ID No.6所述。

2.编码如权利要求1所述的有机磷农药降解酶突变体蛋白的基因，所述的基因核苷酸序列如Seq ID No.7所述；所述序列Seq ID No.7中第490-492位的核苷酸N₁N₂N₃为编码苯丙氨酸（F）的密码子。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述突变体基因的核苷酸序列如Seq ID No.5所述。

4.携带有如权利要求2或3所述基因序列的载体。

5.根据权利要求4所述的载体，所述的载体选自酵母表达载体pPICZ-α-A、pHIL-D₂、pPIC9或pHIL-S₁，动物细胞表达载体pSVK3或pMSG。

6.根据权利要求5所述的载体，所述的载体为酵母表达载体pPICZ-α-A。

7.一种宿主系统，其由权利要求4所述的载体经转化或转染酵母、哺乳动物细胞或细菌宿主得到。

8.根据权利要求7所述的宿主系统，其为酵母。

9.根据权利要求8所述的宿主系统，其特征在于：所述的酵母菌选自酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌属酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母。

10.根据权利要求9所述的宿主系统，其特征在于：所述的酵母菌为毕赤酵母。

11.一种制备如权利要求1所述有机磷农药降解酶突变体蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）在有机磷农药降解酶突变体基因的两端引入限制性酶切位点，通过酶切操作连接到酵母表达载体上，

（2）将表达载体转化导入酵母菌中，经筛选得到重组基因工程菌；

（3）高密度发酵重组酵母菌，诱导表达后离心收集发酵上清液，经分离纯化获得重组有机磷农药降解酶突变体蛋白。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，在有机磷农药降解酶突变体基因两端引入XhoI/XbaI限制性酶切位点。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，在有机磷农药降解酶突变体基因前端加入限制性内切酶XhoI的酶切位点，后端加入限制性内切酶XbaI的酶切位点，并在限制性内切酶XbaI的酶切位点前端连续加入两个终止密码子。

14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，所述的载体选自酵母表达载体pPICZ-α-A、pHIL-D₂、pPIC9或pHIL-S₁。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，所述的载体为酵母表达载体pPICZ-α-A。

16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（2）中，所述的酵母菌选自酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌属酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（2）中，所述的酵母菌为毕赤酵母。

18.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（3）中，高密度发酵重组酵母菌可分两个阶段，第一阶段主要用于菌体的生长，第二阶段主要用于诱导表达目标产物。

19.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（3）中，分离纯化方法选自盐析、超滤或液相层析技术及这些技术的组合。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（3）中，液相层析为凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水或反相层析技术。

Images