CN102965355B - 一种羧酸酯酶及其在农药马拉硫磷和西维因降解中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种羧酸酯酶D-1CarE3、基因D-1CarE3及羧酸酯酶D-1CarE3在农药马拉硫磷和西维因的降解上的应用。羧酸酯酶D-1CarE3，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，羧酸酯酶的编码基因D-1CarE3核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，以及羧酸酯酶基因D-1CarE3的重组载体和羧酸酯酶基因D-1CarE3的重组菌株。本发明还提供了羧酸酯酶D-1CarE3在农药马拉硫磷和西维因的降解中的应用。本发明具有培养周期短、易于获得纯蛋白以及高效降解马拉硫磷的优点，比已报道昆虫来源的羧酸酯酶对农药马拉硫磷和西维因的降解效率提高。在农药污染治理方面具有重要意义。

Description

一种羧酸酯酶及其在农药马拉硫磷和西维因降解中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地说是一种羧酸酯酶D-1CarE3及其在农药马拉硫磷和西维因降解中的应用。

背景技术

    羧酸酯酶（Carboxylesterases, E C3.1.1.1）是一类能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶，与脂肪酶同属于α/β水解酶家族成员，其氨基酸序列含有Ser-Asp -His三联体结构，Ser，Asp，His构成了羧酸脂酶的催化活性中心（Nardini, M, et al., Current Opinion in Structural Biology. 1999, 9(6):732-737.）。

羧酸脂酶广泛存在于动物、植物、微生物中(Melloney J., et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2005, 32:261-270.)，其中微生物来源的羧酸酯酶是一种重要的工业酶类，在催化酯水解、酯合成、酯交换等上有重要应用价值，具有良好的区域选择性和立体选择性（Ramos Tombo, et al., Agricultural and Biological Chemistry. 1987, 51:1833-1838.）。这些独特性质使羧酸酯酶在食品、化工、制药、能源开发和环境保护等领域具有广阔的应用前景（Jaeger K.E., et al., Trends in Biotechnology. 1998, 16(9):396-403.）。

当前农业生产中，70%使用的农药是有机磷农药，而70%的有机磷农药又是高毒农药，这些农药的使用很容易在农产品中残留，进而影响到人的健康。本文研究的羧酸酯酶是一种重要的农药降解酶，其对含有羧酸酯键的有机磷化合物，如马拉硫磷，羧酸酯酶靠活性中心丝氨酸的可逆酰化作用来完成降解。这个酰化作用释放出一个醇部分和一个对应的共价酰化酶。这个酰化的中间体由于水的亲核作用释放出对应的羧酸部分和有活性的酶，它可以重新来催化新一轮的降解反应。

利用微生物降解农药残留大多数是依靠胞内酶的酶解作用，但由于野生菌株产酶能力有限、发酵周期长、纯化复杂、难以大量生产，生产成本高，限制了其推广应用。利用分子生物学手段构建高效生物反应器，可以提高羧酸酯酶的表达量，实现其大规模工业化生产。本文从嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1基因组中克隆羧酸脂酶基因D-1CarE3与表达载体pET28a(+)连接后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并对羧酸酯酶酶学性质及羧酸酯酶对农药马拉硫磷和西维因的降解活性进行了初步研究，为进一步探索羧酸酯酶的应用奠定了理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种羧酸酯酶D-1CarE3。

本发明的再一目的是提供编码上述羧酸酯酶的基因D-1CarE3。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的最后一个目的是提供上述羧酸酯酶D-1CarE3在马拉硫磷和西维因的降解中的应用。

本发明所述羧酸酯酶D-1CarE3可得自嗜热脂环芽孢杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504）。D-1CarE3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的羧酸酯酶D-1CarE3总共含有513个氨基酸，理论分子量为56.01 kDa，理论等电点为5.69。以β-乙酸萘酯为底物：该酶作用的最适温度65 ℃；最适pH7.0；终浓度1 mM的金属离子K⁺和Pb²⁺对酶有激活作用，Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Hg²⁺和Mn²⁺等有抑制作用； 在温度37 ℃保温50 min，仍能保持70%以上的活性；经1/15 mol/L pH7.0缓冲液下处理50 min，仍能保持50%以上的活性；酶液在室温（23 ℃）放置5 d，仍有27%以上的活性。

本发明提供了编码上述羧酸酯酶的基因D-1CarE3，该基因序列如SEQ ID NO.2。

本发明通过PCR的方法克隆了羧酸酯酶D-1CarE3的编码基因D-1CarE3，其全长1542 bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。经BLAST 在GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行比对分析，该羧酸酯酶基因D-1CarE3编码的氨基酸序列与GeneBank中Alicyclobacillus acidocaldarius subsp来源的潜在羧酸脂酶（ZP_10955244.1）具有最高一致性，为98%（2012-11-8）。

本发明还提供了包含上述羧酸酯酶基因D-1CarE3的重组载体，优选为pET-D-1CarE3。将本发明的羧酸酯酶基因插入到表达载体合适的限制性内切酶位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的羧酸酯酶基因插入到质粒pET-28a(+)上的BamHⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒pET-D-1CarE3。

本发明还提供了包含上述羧酸酯酶基因D-1CarE3的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/ D-1CarE3。

本发明制备羧酸酯酶D-1CarE3的方法按以下步骤进行：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组羧酸酯酶表达；

3）回收并纯化所表达的羧酸酯酶D-1CarE3。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/ D-1CarE3。

本发明提供了一个羧酸酯酶基因，其编码的羧酸酯酶以β-乙酸萘酯为底物：最适温度65 ℃；最适pH7.0；终浓度1 mM的金属离子K⁺和Pb²⁺对酶有激活作用，Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Hg²⁺和Mn²⁺等有抑制作用； 在温度37 ℃保温50 min，仍能保持70%以上的活性；经1/15 mol/L pH7.0缓冲液下处理50 min，仍能保持50%以上的活性；酶液在室温（23 ℃）放置5 d，仍有27%以上的活性；同时也能够水解α-乙酸萘酯。

本发明的羧酸酯酶D-1CarE3在降解农药马拉硫磷和西维因上的应用。

1）取1 mL稀释100倍的纯化重组羧酸酯酶D-1CarE3加入到含有浓度为5 mg/L农药马拉硫磷的1/15 mol/L、 pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为3 mL，37 ℃震荡反应，对农药马拉硫磷进行降解。

2）取1 mL稀释10倍的纯化重组羧酸酯酶D-1CarE3加入到含有浓度为100 m g/L农药西维因的1/15 mol/L、 pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为3 mL，37 ℃震荡反应，对农药西维因进行降解。

取抽提液于气相色谱上定量分析，100 min内分别有68%的马拉硫磷和57%的西维因被降解。

本发明羧酸酯酶基因来源于嗜热脂环芽孢杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504），通过构建原核表达系统，与已报道降解农药马拉硫磷的原始菌株Lysinibacillus sp.（Baljinder Singh, Jagdeep Kaur, Kashmir Singh. Biotechnol Lett, 2012, 34: 863-867）相比，具有培养周期短、易于获得纯蛋白以及高效降解马拉硫磷的优点，比已报道昆虫来源的羧酸酯酶（Wensheng Lan, Jian Chong, Hong Jiang, et al. Biotechnol Lett, 2005, 27: 1141-1146）对农药马拉硫磷和西维因的降解效率提高。在农药污染治理方面具有重要意义。此外，关于微生物来源的羧酸酯酶工程菌的构建及对农药降解的研究少见报道，本发明对开发微生物来源的羧酸酯酶对农药降解的应用具有重要意义。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组羧酸酯酶D-1CarE3的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化的重组羧酸酯酶D-1CarE3。

图2：重组羧酸酯酶D-1CarE3的最适温度。

图3：重组羧酸酯酶D-1CarE3的热稳定性。

图4：重组羧酸酯酶D-1CarE3的室温下的稳定性。

图5：重组羧酸酯酶D-1CarE3的最适pH。

图6：重组羧酸酯酶D-1CarE3的pH稳定性。

图7：不同金属离子及化学试剂对重组羧酸酯酶D-1CarE3活性的影响。

图8：重组羧酸酯酶D-1CarE3 1/[S]与1/V的关系。

图9：农药马拉硫磷的标准曲线。

图10：重组羧酸酯酶D-1CarE3对马拉硫磷的降解曲线。

图11：农药西维因的标准曲线。

图12：重组羧酸酯酶D-1CarE3对西维因的降解曲线。

具体实施方式

实验材料和试剂

1、菌株及载体：嗜热脂环芽孢杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504）为保藏菌株；大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）和表达载体pET-28a（+）可购于Novagen公司。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；T4连接酶购自Promega公司；坚固蓝B、色谱纯正己烷、马拉硫磷和西维因购自Sigma公司；其它试剂均购自国药集团。

3、培养基：

LB培养基：蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，氯化钠1%，pH自然（约为7.0）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：羧酸酯酶基因D-1CarE3的克隆

提取嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1基因组DNA：CTAB裂解法，具体步骤为：将液体培养12 h的新鲜菌液离心取菌体，加入800 μL溶液Ⅰ（ 20 mM Tris, pH8.0, 2 mM Na₂-EDTA, 终浓度20 mg/mL溶菌酶），37 ℃保温30 min，加100 μL 10% SDS上下颠倒混匀，再加10 μL 10 mg/mL的蛋白酶K，37 ℃保温30 min，加150 μL 5 M NaCl和150 μL 10% CTAB溶液上下颠倒混匀，65 ℃保温20 min，分装成600 μL每管，再加入600 μL酚/氯仿/异丙醇（体积比25：24：1）进行抽提，在4 ℃下12000 rpm离心10 min，取上清300 μL于300 μL氯仿/异丙醇（体积比24：1）中再次抽提除去杂蛋白，4 ℃下12000 rpm离心10 min，再取上清并加入2倍体积无水乙醇和1/10体积的pH5.2 3M NaAc，-70℃沉淀1h，4 ℃下13500 rpm离心20 min，弃上清，再用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20 ℃备用。

根据嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1全基因组测序及基因注释分析羧酸酯酶基因D-1CarE3并设计表达引物CarF和CarR：

上游引物CarF: 5’ CGCGGATCCATGAACGTTAACTTGAACCGCGTG 3’（划线部分为BamHⅠ酶切位点）

下游引物CarR: 5’ CCGCTCGAGGCCCCGAAGGCCCGGCCACT 3’ （划线部分为XhoⅠ酶切位点）

上游引物T7: 5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’

下游引物T7ter: 5’TGCTAGTTATTGCTCAGCGG 3’为PCR检测阳性克隆子引物。

     以嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 sec；48 ℃退火30 sec；72 ℃延伸1 min30 sec；30个循环后72 ℃保温5 min。 PCR纯化产物经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收目的片段，再与经过同样酶切处理过的表达载体pET-28a(+)连接构建质粒pET-D-1CarE3，4 ℃过夜。取10 μl连接产物pET-D-1CarE3转化到100 μl Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含Kan的LB固体平板上，37 ℃温箱培养13 h，从转化板上挑取几株单菌落，使用引物（T7，T7ter）进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/D-1CarE3。

    实施例2：重组羧酸酯酶D-1CarE3的制备

取含有重组质粒pET-D-1CarE3的Escherichia coli BL21(DE3)菌株和只含有pET-28a(+)的空质粒Escherichia coli BL21(DE3)菌株，以0.1%的接种量接种于LB（含50 μg/mL Kan）培养液中，37 ℃快速振荡16 h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含50 μg/mL Kan）培养液中，快速振荡培养约2–3 h（OD₆₀₀达到0.6–1.0）后，加入终浓度0.7 mM的IPTG进行诱导，于20 ℃继续振荡培养约20 h或26 ℃振荡培养约8 h。12000 rpm离心5 min，收集菌体。用适量的pH7.0 Tris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13,000 rpm离心10 min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果（图1）表明，重组羧酸酯酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。

纯化的重组羧酸酯酶D-1CarE3的性质测定

1、重组羧酸酯酶D-1CarE3的活性分析

实施例2纯化的重组羧酸酯酶D-1CarE3的活性测定方法采用β-萘酚法：取三支10 ml试管，分别编号1、2、3，1号和2号试管为实验组，3号为对照组。分别向1号和2号试管中加入2.5 ml 1/15mol/L pH为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，向3号试管中加入3 ml 1/15mol/L pH为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。向三支试管中加入30 μl底物β-乙酸萘酯醇溶液，置于37 ℃水浴锅中预热5 min，然后向1号和2号试管中加入0.5 ml适当稀释的酶液，反应5 min后，将三支试管取出，在冰浴条件下每支试管加入0.5 ml显色剂（1%坚固蓝B盐水溶液和5% SDS使用前2：5混合）溶液，充分摇匀后，静置5 -10 min后，在分光光度计550 nm下测定其吸光度值。1个酶活单位（U/mL）定义为一定条件下，每分钟分解底物β-乙酸萘酯生成1 μmoL β-萘酚所需要的酶量。以α-乙酸萘酯为底物测定方法及酶活力计算同β-乙酸萘酯，吸光度值在595 nm下读取。

2、重组羧酸酯酶D-1CarE3的最适温度和热稳定性的测定：

    酶的最适温度的测定：将羧酸酯酶D-1CarE3在1/15 mol/L pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液条件下，分别在6 ℃、15 ℃、22 ℃、30 ℃、37 ℃、45 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃下进行酶促反应。温度稳定性的测定：将羧酸酯酶D-1CarE3在1/15 mol/L pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液条件下，在37 ℃、65 ℃和75 ℃三个温度下分别保温10 min、20 min、30 min、40 min和50 min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。室温稳定性的测定：将羧酸酯酶D-1CarE3室温（23 ℃）放置5 d，在1/15 mol/L pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液和最适反应温度下每天测定残余酶活。以β-乙酸萘酯为底物，反应5 min，测定纯化羧酸酯酶D-1CarE3的酶学性质。结果表明：D-1CarE3的最适温度65 ℃（图2）；37 ℃保温50 min，仍能保持70%以上的活性（图3）；酶液在室温（23 ℃）放置5 d，仍有27%以上的活性（图4）。

3、重组羧酸酯酶D-1CarE3的最适pH和 pH稳定性的测定：

酶的最适pH的测定：将羧酸酯酶D-1CarE3在最适温度65 ℃，分别在1/15 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液不同pH4.8、5.4、6.0、6.5、7.0、7.3、7.5和8.0条件下酶促反应。pH稳定性的测定：将羧酸酯酶D-1CarE3在最适温度65℃，在pH5.4、pH7.0和pH8.0下分别耐受10 min、20 min、30 min、40 min和50 min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以β-乙酸萘酯为底物，反应5 min，测定纯化羧酸酯酶D-1CarE3的酶学性质。结果表明：D-1CarE3的最适pH7.0（图5）；经1/15 mol/L pH7.0缓冲液下处理50 min，仍能保持50%以上的活性（图6）。

    4、不同金属离子及化学试剂对重组羧酸酯酶D-1CarE3活性的影响：

在酶促反应体系中加入终浓度1 mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。以β-乙酸萘酯为底物，在65 ℃、pH7.0条件下，反应5 min，测定纯化羧酸酯酶D-1CarE3的酶活力。结果（图7）表明，终浓度1 mM的金属离子K⁺和Pb²⁺对酶有激活作用，Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Hg²⁺和Mn²⁺等有较强的抑制作用。

5、重组羧酸酯酶D-1CarE3的动力学参数的测定：

在65 ℃、pH7.0条件下，以0.6 M β-乙酸萘酯为底物，依次在酶促反应的 1-30 min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.1-0.95 mM β-乙酸萘酯为底物（[S]），在65 ℃、pH7.0和一级反应时间下测定酶活，计算出相应的反应速度（ν），如图8，根据Lineweaver-Burk方法测定Km和Vmax。经测定，在65 ℃、pH7.0条件下，重组羧酸酯酶D-1CarE3对β-乙酸萘酯的Km和Vmax分别为0.7524mM和3.1817 U/mg。

6、重组羧酸酯酶D-1CarE3对底物α-乙酸萘酯的水解：

在40 ℃、pH6.5条件下，重组羧酸酯酶D-1CarE3对0.6 mol/L α-乙酸萘酯的比活力为68.415 U/mg。

实施例3：

纯化的重组羧酸酯酶D-1CarE3在农药马拉硫磷和西维因的降解中的应用

1、重组羧酸酯酶D-1CarE3对农药马拉硫磷的降解作用：

取1 mL稀释100倍的纯化重组羧酸酯酶D-1CarE3加入到含有浓度为5 mg/L农药马拉硫磷的1/15 mol/L 、pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为3 mL，37 ℃震荡反应；对照组不加酶液，以1 mL 、pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液代替酶液，每20 min取出0.5 mL反应液与等体积正己烷混合震荡，12000 rpm离心2 min，取上层抽提液加入0.2 g无水硫酸钠除水，12000 rpm离心30 sec，取抽提液于气相色谱上定量分析。

色谱分析所用仪器为Agilent GC7890-MS5975型气相色谱（美国），检测器为FID，柱子为Agilent DB-17（30 m×0.32 mm×0.25 μm），操作条件：进样量1 μl，不分流，进样口温度250 ℃，He压力16.363 psi，柱流量1 mL/min，离子源230 ℃，MS四级杆150 ℃；柱箱程序升温：205 ℃（保持2.5 min），以10 ℃/min的速度上升至220 ℃，保持2 min，总时间6 min。

分别配制不同浓度梯度的农药马拉硫磷标准品，根据以上色谱分析方法分析，积分计算不同浓度下的峰面积，每个浓度重复3次，计算峰面积平均值，以农药马拉硫磷浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标做马拉硫磷标准曲线（图9）。并测定和计算其检测限为0.1 mg/L，方法回收率为84%-92%。

羧酸酯酶D-1CarE3对农药马拉硫磷的降解结果（图10）表明，在上述条件下，100 min内有68%的马拉硫磷被降解。

2、重组羧酸酯酶D-1CarE3对农药西维因的降解作用：

取1 mL稀释10倍的纯化重组羧酸酯酶D-1CarE3加入到含有浓度为100 m g/L农药西维因的1/15 mol/L 、pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为3 mL，37 ℃震荡反应，对照组不加酶液，以1 mL 、pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液代替酶液，每20 min取出0.5 mL反应液与等体积二氯甲烷混合震荡，12000 rpm离心2 min，取上层抽提液加入0.2 g无水硫酸钠除水，12000 rpm离心30 sec，取抽提液于气相色谱上定量分析。

色谱分析所用仪器为Agilent GC7890-MS5975型气相色谱（美国），检测器为FID，柱子为Agilent DB-17（30m×0.32mm×0.25μm），操作条件：进样量1 μl，分流比20：1，进样口温度270 ℃，柱流量1 mL/min， He压力14.993 psi，离子源230 ℃，MS四级杆150 ℃；柱箱程序升温：180 ℃（保持1 min），以10 ℃/min的速度上升至220 ℃，保持3 min，总时间8 min。

分别配制不同浓度梯度的农药西维因标准品，根据以上色谱分析方法分析，积分计算不同浓度下的峰面积，每个浓度重复3次，计算峰面积平均值，以农药西维因浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标做西维因标准曲线（图11）。并测定和计算其检测限为0.01 mg/L，方法回收率为87%-92.5%。

羧酸酯酶D-1CarE3对农药西维因的降解结果（图12）表明，在上述条件下，100 min内有57%的西维因被降解。

SEQ ID NO.1：

Met Asn Val Asn Leu Asn Arg Val Ala Asp Ala Pro Val Val Ser Thr Arg Tyr Gly Lys

1             5               10               15              20

Val Gln Gly Ile Trp Gln Asp Gly Gly Ser Ala Ala Tyr Leu Gly Ile Pro Tyr Ala Ala

             25               30               35              40

Pro Pro Val Gly Lys Leu Arg Phe Phe Pro Pro His Pro Pro Glu Pro Trp Glu Gly Ile

             45                50              55               60  

Arg Thr Ala Ala Glu Tyr Gly Pro Thr Pro Gln Arg Arg Pro Phe Gly Asp Val Thr Thr

              65               70               75               80 

Ile Pro Glu Pro Ser Ile Pro Gly Asp Asp Val Leu Asn Leu Asn Val Phe Thr Pro Ala

             85              90                95              100

Pro Arg Asp Arg Leu Ala Lys Leu Pro Val Leu Val Trp Ile His Gly Gly Gly Tyr Phe

             105               110             115             120

Ala Gly Ser Pro Ala Ser Pro Trp Tyr Asn Gly Arg Ser Phe Asn His His Gly Val Val

             125             130              135              140

Phe Val Thr Leu Ser Tyr Arg Leu Gly Phe Asp Gly Phe Gly Trp Met Glu Gly Ala Pro

145              150               155              160

Leu Asn Arg Gly Leu Leu Asp Gln Ile Ala Ala Leu Arg Trp Val Lys Asp Asn Ile Arg

              165              170              175             180

Glu Phe Gly Gly Asp Pro Asp Arg Val Thr Ile Ala Gly Gln Ser Ala Gly Gly Gly Ser

              185              190             195              200  

Val Leu Ser Leu Leu Ala Ser Pro Lys Ala Asp Gly Leu Phe Gln Ser Ala Ile Ala Val

             205              210               215             220

Ser Ser Ala Phe Gly Trp Pro Thr Ala Asn Asp Val Ala Glu Val Gly Arg Gly Met Ala

             225              230              235              240

Glu His Phe Gly Ile Asp Pro Thr Ile Glu Ala Trp Arg Thr Ile Pro His Glu Arg Ile

             245             250             255              260

Leu Asp Val Glu Arg Glu Trp Asn His Leu Pro Gly Ser Pro Ser Ser Ala Ser Val Asp

             265               270             275             280

Glu Leu Leu Thr Ala Met Arg Thr Gly Leu Asp Arg Ala Thr Gly Leu Ala Phe Arg Pro

              285              290               295              300

Val Leu Asp Gly Asp Val Leu Val His Ala Leu Asp His Pro Thr Thr Gln Gln Arg Ile

              305             310              315              320

Ala His Ile Pro Ile Ile Ile Gly Ser Thr Arg Asn Glu Phe Ser Phe Pro Ser Leu Ala

            325            330              335              340

Asp Ala Pro Gly Leu Asp Glu Ile Cys Glu Ile Leu Ala Arg His Gly Val Ala Asp Ala

              345              350             355              360  

Ala Ile Glu Arg Phe Ala His Asp Thr Trp Arg Ile Gly Glu Glu Arg Ala Leu Gly Gln

             365              370             375               380  

Phe Met Thr Ser Phe Met Phe Arg Asn Gly Ile Ala Arg Phe Ala Glu Leu Arg Asn Arg

              385              390              395              400

Ala Gly Ala Gly Thr Arg Thr Trp Leu Tyr Asp Phe Ala Glu Leu Ala Ala Asn Ala Gln

              405              410              415              420

Gly Ser Phe His Cys Leu Asp Leu Pro Tyr Phe Phe Asp Gln Leu Asp Ala Pro Asn Val

             425               430              435               440 

Asp Lys Val Leu Gly Pro Asn Pro Ser Gln Pro Leu Ala Asp Ala Met His Gly Thr Trp

              445              450              455              460 

Val Glu Phe Leu Lys His Gly Arg Leu Pro Tyr Pro Ser Thr Glu Asp Asn Pro Cys Gly

             465               470             475              480

Ala Ile His Phe Gln Gly Gly Ala Glu Phe Arg Pro Asp Ala Tyr Phe Phe Glu Arg Glu

             485              490              495              500

Leu Leu Ala Ala Val Gly Gln Trp Pro Gly Leu Arg Gly

              505             510        

 

SEQ ID NO.2：

1      atgaacgtta  acttgaaccg  cgtggctgac  gcacccgtcg  tctcgacacg  ctatggaaaa   

61     gttcaaggta  tatggcagga  cggcggttct  gccgcgtacc  ttggcattcc  ttacgcggct   

121    ccgcccgttg  gtaagctacg  ttttttccca  ccgcatcccc  ccgagccatg  ggagggcatc    

181    cgaacagccg  ccgaatatgg  gccgacacct  cagcggcggc  catttggcga  tgtgacgacg   

241    atccccgagc  cgtccatacc  cggagatgac  gtcttgaatc  tgaatgtatt  cacacctgcc   

301    ccgcgtgatc  gtctcgcaaa  actccctgtc  ttggtgtgga  ttcacggcgg  cggctacttc   

361    gctggatcac  ccgcttcgcc  atggtataac  ggccgctctt  ttaatcatca  tggggtcgtt   

421    tttgtcacgc  tgtcgtaccg  cctcggcttt  gacggattcg  gctggatgga  aggcgcacca   

481    ttgaaccgcg  ggttgttgga  tcaaatcgcc  gcactccgtt  gggtcaaaga  caacattcgc   

541    gaattcgggg  gcgatcctga  tcgcgtcacg  attgctggcc  aatcggctgg  gggaggttcc   

601    gtgttgtcac  ttctcgcttc  accgaaggcg  gacggactgt  tccagtcggc  gatagccgtt   

661    tctagtgcat  ttggctggcc  aacggccaac  gacgtggccg  aagtcggacg  aggcatggcg   

721    gagcattttg  gcatcgatcc  gaccattgaa  gcgtggcgca  ccattcctca  cgagcgtatc   

781    ctggatgtcg  aacgagaatg  gaatcacctg  ccgggcagtc  cttcatcggc  ttctgtcgat   

841    gaactcttga  cagccatgcg  gacgggatta  gatcgagcga  caggcctagc  gttccgccct   

901    gtgctggacg  gagacgtact  ggtgcatgct  ctcgatcatc  caacaactca  acagcggatc   

961    gctcacattc  ctatcatcat  cggcagtaca  cgcaatgagt  tttcattccc  gtcgctggcg   

1021   gatgctcccg  gccttgatga  aatttgcgag  atactcgctc  gccacggtgt  ggccgatgct   

1081   gccatcgaac  ggtttgccca  cgatacatgg  cggattggcg  aggaacgtgc  attgggacag   

1141   ttcatgacca  gtttcatgtt  ccgcaatggg  attgcccgct  ttgcagaatt  gcgcaatcgg   

1201   gcaggagcag  gaacgcggac  ttggctgtac  gatttcgccg  agcttgccgc  gaatgcccag   

1261   ggatcgttcc  attgtctcga  cctgccctat  ttctttgacc  aactcgacgc  accaaacgta   

1321   gacaaagtac  tgggtcccaa  tccctcgcaa  ccactcgcgg  atgctatgca  cggaacatgg   

1381   gtcgagtttc  tcaaacatgg  aaggctgccg  tacccctcca  ccgaggacaa  cccgtgtggt   

1441   gcaattcact  ttcagggcgg  ggctgaattc  cgaccggatg  cttatttctt  cgaacgagaa   

1501   ctgctcgctg  ccgtcggcca  gtggccgggc  cttcggggct  ga 

Claims (1)

1.一种羧酸酯酶D-1CarE3在农药西维因降解中的应用，其特征在于按以下方法进行：取1 mL稀释10倍的纯化重组羧酸酯酶D-1CarE3加入到含有浓度为100 m g/L农药西维因的1/15 mol/L、 pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为3 mL，37 ℃震荡反应，对农药西维因进行降解，D-1CarE3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

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