CN104894081B - 一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1及其基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1，其氨基酸序列为以下序列之一：(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个氨基酸的序列。本发明还公开了编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的基因EstD1，其核苷酸序列为以下序列之一：(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸的序列；(3)在严格条件下，与(1)或(2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(4)由于遗传密码子的简并性区别于(1)、(2)、(3)的核苷酸序列的核苷酸序列。本发明的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1可用于7‑ACA的脱乙酰化。

Description

一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1及其基因

技术领域

本发明涉及一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1，及其编码基因，以及在7-ACA脱乙酰化中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

SGNH家族酯酶(esterase,EC 3.1.1.1)是一类具有广泛底物特异性的水解酶，包含脂肪酶、蛋白酶、硫酯酶、芳香酯酶、溶血磷脂酶、碳水化合物酯酶、酰基转移酶活性。该家族大约在1995年被鉴定，但是其成员仍然很少被定性，它们不同于大部分含有典型的GxSxG的保守序列的α/β水解酶超家族酯酶，而是含有独特的GDSL的保守序列，是一类新家族的酯酶。GDSL家族的酯酶含有5段保守序列区(five consensus sequence blocks I-V)，在5段保守序列区中含有4个较保守的催化位点Ser，Gly，Asn和His，因此又可以分为SGNH亚家族酯酶。SGNH家族酯酶参与细菌毒力，植物发育和形态发生以及植物防御机制(Asler IL,etal.,Chembiochem.2010,11:2158–2167)，本发明的酯酶EstD1属于微生物来源的GDSL酯酶家族中SGNH亚家族酯酶。

脱乙酰化的头孢菌素是工业上合成β-内酰胺类抗生素的重要原料，而脱乙酰化的头孢菌素通常由头孢菌素C和7-ACA经化学途径或酶途径脱乙酰化作用得到，酶法因其反应较温和，产量较高而且伴有较少的副反应而得到重视(Irene Martínez-Martínez,et al.,Analytical Biochemistry.2007,369:210–217)。因此寻找能够将头孢菌素高效脱乙酰化的酯酶具有重要的工业价值。

然而，天然菌株发酵周期长，产酶量低，纯化困难，生产成本高，难以大量生产，限制了其推广应用。利用分子生物学手段构建高效生物反应器，可以提高SGNH家族酯酶的表达量，实现其大规模工业化生产。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1，及其编码基因，以及含有该基因的重组表达载体、重组菌株，以及EstD1在7-ACA脱乙酰化中的应用。本发明从嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1基因组中克隆SGNH家族酯酶基因EstD1，与表达载体pEASY^TM-E2连接后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并对EstD1酶学性质及其对7-ACA脱乙酰化进行了初步研究，本发明对了解微生物来源的SGNH酯酶家族的特性具有重要意义。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1，其氨基酸序列为以下序列之一：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个氨基酸的序列。

一种编码上述碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的基因EstD1，其核苷酸序列为以下序列之一：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸的序列；

(3)在严格条件下，与(1)或(2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

(4)由于遗传密码子的简并性区别于(1)、(2)、(3)的核苷酸序列的核苷酸序列。

一种重组载体，其含上述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的基因EstD1的完整编码阅读框序列。

上述重组载体，载体优选pEASY^TM-E2。

一种重组菌株，其含上述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的基因EstD1或上述重组载体。

上述重组菌株的受体菌为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。受体菌内含有上述的重组载体，编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的核苷酸序列被可操作地连接于受体细胞中引起碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1充分表达的启动子，从而赋予了受体菌产生碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的能力。

一种利用上述重组菌株生产碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的方法：培养发酵重组菌株，诱导SGNH家族酯酶EstD1表达，收集菌体，分离纯化得到SGNH家族酯酶EstD1。

上述碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1在7-ACA脱乙酰化中的应用。具体应用时，按以下方法进行：取100μL纯化的SGNH家族酯酶EstD1加入到含有浓度为4.5g/L7-ACA的1/15mol/L、pH7.3的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为400μL，25℃反应，对7-ACA进行降解。

本发明的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1可得自嗜热脂环芽孢杆菌(thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504)。本发明的SGNH家族酯酶EstD1总共含有215个氨基酸，理论分子量为25.31kDa，理论等电点为6.68。以乙酸-4-硝基苯酯(pNPC₂)为底物：最适温度65℃；最适pH 8.5；终浓度1mM的金属离子Hg²⁺、Mg²⁺和Cu²⁺及化学试剂SDS、Tween-80、β-巯基乙醇对酶有较强的激活作用，K⁺、Al³⁺、Ni²⁺、EDTA等对酶有抑制作用；在37℃下保温60min，酶活基本保持稳定，在50℃和65℃下保温60min后，酶活均保持在50％以上；经pH4.0至pH11.0的缓冲液在37℃下处理60min后，均保持50％以上的活性；同时还可以水解α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、丁酸-4-硝基苯酯。

本发明通过PCR方法克隆了SGNH家族酯酶EstD1的编码基因EstD1，其全长648bp，起始密码为ATG，终止密码为TAG。经BLAST在GeneBank(http://www.Ncbi.Nlm.Nih.gov)数据库进行比对分析，该SGNH家族酯酶的基因EstD1编码的氨基酸序列与GeneBank中Alicyclobacillus hesperidum来源的GDSL家族脂酶(WP_006447773)具有98％序列一致性(2013-5-29)；与Alicyclobacillus acidocaldarius来源的GDSL家族脂酶(WP_012811841)具有68％的序列一致性(2013-5-26)，但二者至今均未被鉴定。

本发明的SGNH家族酯酶基因来源于嗜热脂环芽孢杆菌(thermophilicAlicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504)，通过在大肠杆菌中进行异源表达，用IPTG诱导就可以获得大量可溶性蛋白，经Nickel-NTA Agarose纯化即可获得较纯蛋白。虽然与已申请专利的枯草芽孢杆菌SHSO133来源的头孢菌素乙酰水解酶(光岛健二，龙本明生，八木兹雄，园山高康，1998，由头孢菌素乙酰水解酶基因编码的酶的制备方法，CN98103932)相比该酶对7-ACA脱乙酰化的活力较低，应用到工业上还需要进一步的发酵工艺上的优化，如使用大规模培养装置，在适当的培养条件下培养本发明中的重组菌株增加该酶的产量。但培养周期短、易于获得纯蛋白，并具有优良的酶学性质，而且除头孢菌素乙酰水解酶外，用于水解7-ACA的其他酶类鲜被报道，因此本发明为工业上生产β-内酰胺类药物提供了新思路。此外，由于SGNH家族酯酶的成员被定性的很少，所以该家族还没有被完全了解，本发明对了解微生物来源的SGNH酯酶家族的特性具有重要意义。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组SGNH家族酯酶EstD1的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：BL21(DE3)/pEASY^TM-E2诱导后表达的总蛋白；2：BL21(DE3)/EstD1诱导后表达的总蛋白；3：纯化的重组SGNH家族酯酶EstD1。

图2：重组SGNH家族酯酶EstD1的最适温度示意图。

图3：重组SGNH家族酯酶EstD1的热稳定性示意图。

图4：重组SGNH家族酯酶EstD1的最适pH示意图。

图5：重组SGNH家族酯酶EstD1的pH稳定性示意图。

图6：1mM金属离子及部分化学试剂对重组SGNH家族酯酶EstD1活性的影响。

图7：重组SGNH家族酯酶EstD1以pNPC₂为底物时,1/[S]与1/V的关系。

图8：重组SGNH家族酯酶EstD1以pNPC₄为底物时,1/[S]与1/V的关系。

图9：重组SGNH家族酯酶EstD1以α-乙酸萘酯为底物时,1/[S]与1/V的关系。

图10：重组SGNH家族酯酶EstD1以β-乙酸萘酯为底物时,1/[S]与1/V的关系。

图11：重组SGNH家族酯酶EstD1对7-ACA降解产物的质谱图，其中，(a)为实验组；(b)为对照组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实验材料和试剂

1、菌株及载体：

嗜热脂环芽孢杆菌(thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrainCGMCC1504)为实验室筛选菌株；(该菌株与授权公告号为CN102787107B中涉及的嗜热脂环酸芽孢杆菌为同一菌株)。

大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)购于Novagen公司；

表达载体pEASYTM-E2购于全式金生物有限(TransGen)公司。

2、酶类及其它生化试剂：DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；其它试剂均购自国药集团。坚固蓝B、α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯(pNPC2)、丁酸-4-硝基苯酯(pNPC4)、7-氨基头孢烷酸(7-ACA)购自Sigma公司；其它试剂均购自国药集团。

3、培养基：

LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，pH自然(约为7.0)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：SGNH家族酯酶基因EstD1的克隆

提取嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1基因组DNA：CTAB裂解法，具体步骤为：将液体培养12h的新鲜菌液离心取菌体，加入800μL溶液Ⅰ(20mM Tris,pH8.0,2mM Na₂-EDTA,终浓度20mg/mL溶菌酶)，37℃保温30min，加100μL 10％SDS上下颠倒混匀，再加10μL 10mg/mL的蛋白酶K，37℃保温30min，加150μL 5M NaCl和150μL 10％CTAB溶液上下颠倒混匀，65℃保温20min，分装成600μL每管，再加入600μL酚/氯仿/异丙醇(体积比25：24：1)进行抽提，在4℃下12000rpm离心10min，取上清300μL于300μL氯仿/异丙醇(体积比24：1)中再次抽提除去杂蛋白，4℃下12000rpm离心10min，再取上清并加入2倍体积无水乙醇和1/10体积的pH5.23MNaAc，-70℃沉淀1h，4℃下13500rpm离心20min，弃上清，再用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1全基因组测序及基因注释分析SGNH家族酯酶基因EstD1并设计表达引物EstF和EstR：

上游引物EstF:5’-CGCTTAGAAGCAAACAGCAAAC-3’；

下游引物EstR:5’-GCATTGCGAGCCAATTTCGC-3’；

上游引物T7:5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；

下游引物T7ter:5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’；为PCR检测阳性克隆子引物。

以嗜热脂环酸芽孢杆菌D-1基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃预变性5min；然后95℃变性30sec；57℃退火(每个循环降0.5℃)30sec；72℃延伸1min；30个循环后95℃变性30sec；43℃退火30sec；72℃延伸1min；7个循环后72℃保温10min。取4μLPCR产物与1μL表达载体pEASY^TM-E2进行T-A连接，25℃连接10min，连接产物全部转入Trans-I感受态细胞中，37℃温箱过夜培养。从转化板上挑取几株单菌落，使用引物EstF和T7ter进行菌落PCR扩增筛选正向连接的阳性克隆子。对菌落PCR验证正确的克隆子采用T7和T7ter引物测序，由北京华大基因测序完成。测序正确的阳性克隆子接种提取质粒pEASY^TM-E2-EstD1，取0.1uL pEASY^TM-E2-EstD1质粒转化到100μL BL21(DE3)表达感受态细胞中，涂布于含Amp^r的LB固体平板上，37℃温箱过夜培养，从转化板上挑取几株单菌落，进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/EstD1。

实施例2：重组SGNH家族酯酶EstD1的制备

取含有重组质粒pEASY^TM-E2-EstD1的BL21(DE3)菌株和只含有pEASY^TM-E2的空质粒BL21(DE3)菌株，以0.1％的接种量接种于LB(含100μg/mL Amp^r)培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100μg/mL Amp^r)培养液中，快速振荡培养约2–3h(OD₆₀₀达到0.4-0.6)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h。12000rpm离心10min，收集菌体。用适量的pH7.0柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组SGNH家族酯酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。

实施例3：纯化的重组SGNH家族酯酶EstD1的性质测定

(1)重组SGNH家族酯酶EstD1的活性分析

纯化的重组SGNH家族酯酶EstD1采用对硝基苯酚法(p-nitrophenol)进行活性测定：取4只1.5mL离心管，分别编号1、2、3、4，其中1、2、3号试管为实验组(3个重复)，4号为对照组。向四只离心管中分别加入420μL pH8.0的50mM Tris-HCL缓冲液和30μL 10mM底物pNPC₂，37℃预热5min后，每隔10s分别向1、2和3号管中加入50μL稀释适当倍数的酶液，4号对照管加等量水，37℃反应5min后每隔10s向1、2、3实验管中加入50μL 0.1M Na₂CO₃终止反应，4号对照管同样加入等体积终止液后立即将4只离心管插到冰上，酶标仪405nm读取OD值。1个酶活单位(U/mL)定义为一定条件下，每分钟分解底物pNPC₂生成1μmoL对硝基苯酚所需要的酶量。以pNPC₄为底物测定方法及酶活力计算同pNPC₂。

(2)重组SGNH家族酯酶EstD1的最适温度和热稳定性的测定

酶的最适温度测定：将SGNH家族酯酶EstD1在50mM pH8.5的Tris-HCL缓冲液条件下，分别在20℃、30℃、37℃、40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃下进行酶促反应。温度稳定性的测定：将SGNH家族酯酶EstD1在50mM pH8.5的Tris-HCL缓冲液条件下，在37℃、50℃和65℃三个温度下分别保温5min、10min、20min、30min和60min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPC₂为底物，反应5min，测定纯化SGNH家族酯酶EstD1的酶学性质。结果表明：EstD1的最适温度65℃(图2)；在37℃下保温60min，基本保持稳定，在50℃和65℃下保温60min后，酶活均保持在50％以上(图3)，说明重组SGNH家族酯酶EstD1最有很强的热稳定性。

(3)重组SGNH家族酯酶EstD1的最适pH和pH稳定性的测定

酶的最适pH的测定：将SGNH家族酯酶EstD1在37℃，分别在0.1M柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液不同pH6.0、7.0、8.0；50mM Tris-HCL缓冲液不同pH8.0、8.5、9.0、9.5；50mM硼砂-NaOH缓冲液不同pH9.5、10.0、11.0、12.0条件下进行酶促反应。pH稳定性的测定：将SGNH家族酯酶EstD1在37℃，pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的0.1M柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液；pH8.0、8.5、9.0、9.5的50mM Tris-HCL缓冲液；pH9.5、10.0、11.0、12.0的50mM硼砂-NaOH缓冲液中耐受60min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPC₂为底物，反应5min，测定纯化SGNH家族酯酶EstD1的酶学性质。结果表明：EstD1的最适pH为8.5(图4)；经pH4.0至pH11.0的缓冲液在37℃下处理60min后，均保持50％以上的活性(图5)，说明重组SGNH家族酯酶EstD1具有很好的pH稳定性。

(4)不同金属离子及化学试剂对重组SGNH家族酯酶EstD1活性的影响

在酶促反应体系中加入终浓度1mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。以pNPC₂为底物，在65℃，pH8.5条件下，反应5min，测定纯化SGNH家族酯酶EstD1的酶活力。结果表明，终浓度1mM的金属离子Hg²⁺、Mg²⁺和Cu²⁺及化学试剂SDS、Tween-80、β-巯基乙醇对酶有较强的激活作用，K⁺、Al³⁺、Ni²⁺、EDTA等有抑制作用(图6)。

(5)重组SGNH家族酯酶EstD1以pNPC₂为底物时的动力学参数的测定

在65℃，pH8.5条件下，以pNPC₂为底物，依次在酶促反应的1-12min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.1mM-1.1mM的pNPC₂为底物([S])，在65℃，pH8.5和一级反应时间下测定酶活，计算出相应的反应速度(ν)，如图7，根据Lineweaver-Burk方法测定Km和Vmax。经测定，在65℃，pH8.5条件下，重组SGNH家族酯酶EstD1对pNPC₂的Km和Vmax分别为0.3188mM和144.9275U/mg。

(6)重组SGNH家族酯酶EstD1以pNPC₄为底物时的动力学参数的测定

在65℃，pH8.5条件下，重组SGNH家族酯酶EstD1以pNPC₄为底物时的动力学参数的测定方法同5所述，结果如图8，根据Lineweaver-Burk方法测定Km和Vmax。经测定，在65℃，pH8.5条件下，重组SGNH家族酯酶EstD1对pNPC₄的Km和Vmax分别为0.1525mM和2.6709U/mg。

(7)重组SGNH家族酯酶EstD1以α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯为底物时的动力学参数的测定

在37℃，pH7.3条件下(由于底物α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯在高温高碱条件下不稳定)，重组SGNH家族酯酶EstD1以α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯为底物时的动力学参数的测定方法同5所述，结果如图9(该酶对α-乙酸萘酯的双倒数曲线)、图10(该酶对β-乙酸萘酯的双倒数曲线)，根据Lineweaver-Burk方法测定Km和Vmax。经测定，在37℃，pH7.3条件下，重组SGNH家族酯酶EstD1对α-乙酸萘酯的Km和Vmax分别为0.4417mM和83.3333U/mg；对β-乙酸萘酯的Km和Vmax分别为0.2525mM和101.0101U/mg

实施例4：重组SGNH家族酯酶EstD1在7-ACA脱乙酰化中的应用

取100μL纯化的SGNH家族酯酶EstD1加入到含有浓度为4.5g/L7-ACA的1/15mol/L、pH7.3的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为400μL，25℃反应10min后，质谱检测到反应液中有分子量为230(正谱图加Na⁺，显示为253)的产物生成，而对照组(用缓冲液代替酶液)没有此物质产生(图11)，而脱乙酰化的7-ACA(D-7-ACA)分子量为230.24，表明该酶对7-ACA具有脱乙酰化作用。进一步进行定量实验，取反应液100μL严格按照乙酸试剂盒(Megazyme International Ireland 2011)说明书进行定量分析，测得10min内有0.18g/L的乙酸释放，即重组SGNH家族酯酶EstD1对7-ACA的比活力为2.706U/mg。

Claims (10)

1.一种碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的基因，其特征在于：其核苷酸序列为以下序列之一：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸的序列；

(3)在严格条件下，与(1)或(2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

(4)由于遗传密码子的简并性区别于(1)、(2)、(3)的核苷酸序列的核苷酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于：其含权利要求2所述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的基因的完整编码阅读框序列。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体的空白载体选自pEASY^TM-E2。

5.一种重组菌株，其特征在于：其含权利要求2所述的编码碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的基因或权利要求3或4所述的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株的受体菌为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株的受体菌为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。

8.利用权利要求5或6或7所述的重组菌株生产碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1的方法，其特征在于：培养发酵重组菌株，诱导SGNH家族酯酶EstD1表达，收集菌体，分离纯化得到SGNH家族酯酶EstD1。

9.权利要求1所述的碱性热稳定SGNH家族酯酶EstD1在7-ACA脱乙酰化中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：具体应用时，按以下方法进行：取100μL纯化的SGNH家族酯酶EstD1加入到含有浓度为4.5g/L7-ACA的1/15mol/L、pH7.3的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，总反应体系为400μL，25℃反应，对7-ACA进行降解；

纯化的SGNH家族酯酶EstD1的比活力为2.706U/mg。