CN108285895A - 一种酯酶EstC11及其编码基因和应用 - Google Patents
一种酯酶EstC11及其编码基因和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108285895A CN108285895A CN201810079306.9A CN201810079306A CN108285895A CN 108285895 A CN108285895 A CN 108285895A CN 201810079306 A CN201810079306 A CN 201810079306A CN 108285895 A CN108285895 A CN 108285895A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- estc11
- esterase
- gene
- methyl phenyl
- phenyl carbinyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 title claims abstract description 137
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 11
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 230000032050 esterification Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 15
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 15
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 13
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 6
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 4
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- NQBWNECTZUOWID-UHFFFAOYSA-N (E)-cinnamyl (E)-cinnamate Natural products C=1C=CC=CC=1C=CC(=O)OCC=CC1=CC=CC=C1 NQBWNECTZUOWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N Isooctane Chemical compound CC(C)CC(C)(C)C NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- NQBWNECTZUOWID-QSYVVUFSSA-N cinnamyl cinnamate Chemical compound C=1C=CC=CC=1\C=C/C(=O)OC\C=C\C1=CC=CC=C1 NQBWNECTZUOWID-QSYVVUFSSA-N 0.000 claims description 2
- JVSWJIKNEAIKJW-UHFFFAOYSA-N dimethyl-hexane Natural products CCCCCC(C)C JVSWJIKNEAIKJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims 1
- -1 (±) methyl phenyl Chemical group 0.000 abstract description 46
- 241000193375 Bacillus alcalophilus Species 0.000 abstract description 9
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 abstract description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 abstract description 2
- 125000003944 tolyl group Chemical group 0.000 abstract 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 39
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 39
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 22
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 20
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 8
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OAAALAOENYBGNI-UHFFFAOYSA-N acetic acid;4-nitrophenol Chemical class CC(O)=O.OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 OAAALAOENYBGNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100036617 Monoacylglycerol lipase ABHD2 Human genes 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Natural products OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QUMXDOLUJCHOAY-UHFFFAOYSA-N 1-Phenylethyl acetate Chemical compound CC(=O)OC(C)C1=CC=CC=C1 QUMXDOLUJCHOAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033426 2.5 gene Proteins 0.000 description 1
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QDRGPQWIVZNJQD-CIUDSAMLSA-N Ala-Arg-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QDRGPQWIVZNJQD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WQVYAWIMAWTGMW-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N WQVYAWIMAWTGMW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BTYTYHBSJKQBQA-GCJQMDKQSA-N Ala-Asp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O BTYTYHBSJKQBQA-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N Ala-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- IYKVSFNGSWTTNZ-GUBZILKMSA-N Ala-Val-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IYKVSFNGSWTTNZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YKZJPIPFKGYHKY-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YKZJPIPFKGYHKY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ADPACBMPYWJJCE-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ADPACBMPYWJJCE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- QDXQWFBLUVTOFL-FXQIFTODSA-N Asn-Met-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N QDXQWFBLUVTOFL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VLDRQOHCMKCXLY-SRVKXCTJSA-N Asn-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O VLDRQOHCMKCXLY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N Asp-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N Asp-Asn-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- WLKVEEODTPQPLI-ACZMJKKPSA-N Asp-Gln-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WLKVEEODTPQPLI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- SNAWMGHSCHKSDK-GUBZILKMSA-N Asp-Gln-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N SNAWMGHSCHKSDK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LKVKODXGSAFOFY-VEVYYDQMSA-N Asp-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LKVKODXGSAFOFY-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- YIDFBWRHIYOYAA-LKXGYXEUSA-N Asp-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O YIDFBWRHIYOYAA-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- BYLPQJAWXJWUCJ-YDHLFZDLSA-N Asp-Tyr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BYLPQJAWXJWUCJ-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- 241001322378 Bacillus paralicheniformis Species 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- LLRJEFPKIIBGJP-DCAQKATOSA-N Gln-Glu-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N LLRJEFPKIIBGJP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PIUPHASDUFSHTF-CIUDSAMLSA-N Gln-Pro-Asn Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O PIUPHASDUFSHTF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N Glu-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- IRDASPPCLZIERZ-XHNCKOQMSA-N Glu-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N IRDASPPCLZIERZ-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VGOFRWOTSXVPAU-SDDRHHMPSA-N Glu-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O VGOFRWOTSXVPAU-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYBKPDHHVADEDA-YUMQZZPRSA-N Gly-His-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AYBKPDHHVADEDA-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HKSNHPVETYYJBK-LAEOZQHASA-N Gly-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN HKSNHPVETYYJBK-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N Gly-Leu-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- WDEHMRNSGHVNOH-VHSXEESVSA-N Gly-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CN)C(=O)O WDEHMRNSGHVNOH-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- CYHWWHKRCKHYGQ-GUBZILKMSA-N His-Cys-Glu Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N CYHWWHKRCKHYGQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HYWZHNUGAYVEEW-KKUMJFAQSA-N His-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N HYWZHNUGAYVEEW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ISQOVWDWRUONJH-YESZJQIVSA-N His-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N)C(=O)O ISQOVWDWRUONJH-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- IDAHFEPYTJJZFD-PEFMBERDSA-N Ile-Asp-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N IDAHFEPYTJJZFD-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- RGSOCXHDOPQREB-ZPFDUUQYSA-N Ile-Asp-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N RGSOCXHDOPQREB-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- BALLIXFZYSECCF-QEWYBTABSA-N Ile-Gln-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N BALLIXFZYSECCF-QEWYBTABSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N L-alanyl-L-prolylglycine zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LAPSXOAUPNOINL-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O LAPSXOAUPNOINL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N Leu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- MJWVXZABPOKJJF-ACRUOGEOSA-N Leu-Phe-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O MJWVXZABPOKJJF-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N Leu-Val-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N Leu-Val-Arg Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N Lys-Gly-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- LUTDBHBIHHREDC-IHRRRGAJSA-N Lys-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O LUTDBHBIHHREDC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- GAELMDJMQDUDLJ-BQBZGAKWSA-N Met-Ala-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O GAELMDJMQDUDLJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- AWGBEIYZPAXXSX-RWMBFGLXSA-N Met-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N AWGBEIYZPAXXSX-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- UNPGTBHYKJOCCZ-DCAQKATOSA-N Met-Lys-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UNPGTBHYKJOCCZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BEZJTLKUMFMITF-AVGNSLFASA-N Met-Lys-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N BEZJTLKUMFMITF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- DPUOLKQSMYLRDR-UBHSHLNASA-N Phe-Arg-Ala Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 DPUOLKQSMYLRDR-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- ZVRJWDUPIDMHDN-ULQDDVLXSA-N Phe-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ZVRJWDUPIDMHDN-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- SVXXJYJCRNKDDE-AVGNSLFASA-N Pro-Pro-His Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CN=CN1 SVXXJYJCRNKDDE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LZHHZYDPMZEMRX-STQMWFEESA-N Pro-Tyr-Gly Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O LZHHZYDPMZEMRX-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N Ser-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- LRZLZIUXQBIWTB-KATARQTJSA-N Ser-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRZLZIUXQBIWTB-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- BUYHXYIUQUBEQP-AVGNSLFASA-N Ser-Phe-Glu Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BUYHXYIUQUBEQP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GNHRVXYZKWSJTF-HJGDQZAQSA-N Thr-Asp-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O GNHRVXYZKWSJTF-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- KBLYJPQSNGTDIU-LOKLDPHHSA-N Thr-Glu-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O KBLYJPQSNGTDIU-LOKLDPHHSA-N 0.000 description 1
- GRIUMVXCJDKVPI-IZPVPAKOSA-N Thr-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O GRIUMVXCJDKVPI-IZPVPAKOSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- SVGAWGVHFIYAEE-JSGCOSHPSA-N Trp-Gly-Gln Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 SVGAWGVHFIYAEE-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- ZRPLVTZTKPPSBT-AVGNSLFASA-N Tyr-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZRPLVTZTKPPSBT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N Tyr-Leu-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 GULIUBBXCYPDJU-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- PQPWEALFTLKSEB-DZKIICNBSA-N Tyr-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PQPWEALFTLKSEB-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- ZTKGDWOUYRRAOQ-ULQDDVLXSA-N Val-His-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O)N ZTKGDWOUYRRAOQ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- NHXZRXLFOBFMDM-AVGNSLFASA-N Val-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)C(C)C NHXZRXLFOBFMDM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- CGALBNGUWXMRIH-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-nitrophenol Chemical class CC(O)=O.OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O CGALBNGUWXMRIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 108010054813 diprotin B Proteins 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 108010066198 glycyl-leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108010035322 rhamnogalacturonan acetylesterase Proteins 0.000 description 1
- 150000008264 rhamnoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- HFQQZARZPUDIFP-UHFFFAOYSA-M sodium;2-dodecylbenzenesulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCC1=CC=CC=C1S([O-])(=O)=O HFQQZARZPUDIFP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I triphosphate(5-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009941 weaving Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种酯酶EstC11及其编码基因和应用。本发明从嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01中克隆得到酯酶基因EstC11，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长为717bp，其编码的酯酶EstC11共包含238个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将酯酶基因EstC11与表达载体pET‑28α(+)连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组酯酶EstC11。酯酶EstC11能催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应，酯酶EstC11作为催化剂通过水解拆分(±)‑乙酸苏合香酯，可制备得到光学纯度为98％，得率为39％的R‑乙酸苏合香酯。
Description
技术领域：
本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种酯酶EstC11及其编码基因和应用。
背景技术：
酯酶广泛存在于动物、植物及微生物中，是一类催化水解或形成酯键的酶，作用的底物通常是脂肪链小于十个碳原子的酯类。酯酶属于α/β折叠水解酶超家族，催化中心一般由丝氨酸、天冬氨酸/谷氨酸和组氨酸组成，保守序列为丝氨酸附近的五肽(GXSXG)序列。酯酶能催化水解、酯化、转酯化等多种化学反应，是一种很重要的工业生物催化剂，被广泛运用于精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、废水处理和饲料工业等领域。从催化特性来看，酯酶具有高度的化学选择性和立体异构选择性，且反应不需要辅酶、反应条件温和、副产物少。在生产应用中的酯酶的另一显著特点是它能在异相系统(即油-水界面)或有机相中作用。在水相中，酯酶通常催化水解反应，而在有机相中，它却能催化酯化和转酯化反应。通过微生物酯酶的生物转化制备新型药物中间体或者去除药物消旋体中的非有效成分，是一种重要的手性技术，有着非常广阔的应用前景，它可以为合成手性药物提供新的平台，为大量制备光学纯化合物提供新的方法。酶法选择性拆分消旋体化合物，具有立体专一性高，副反应少，产率高，产物光学纯度好以及反应条件温和的优点，所以是一种被广泛认可的拆分方法。
发明内容：
本发明的目的是提供一种新的酯酶EstC11及其编码基因和应用。
本发明从一株嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01中开发得到一种酯酶EstC11及其编码基因EstC11，构建了含有酯酶基因EstC11的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得酯酶EstC11，其可应用于拆分(±)-乙酸苏合香酯。
本发明的第一个目的是提供一种酯酶EstC11，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述的酯酶EstC11的酯酶基因EstC11。
所述的酯酶基因EstC11的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种含有所述的酯酶基因EstC11的重组表达载体。所述的表达载体，优选pET-28α(+)载体。
本发明还提供一种含有所述的酯酶基因EstC11的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。
本发明的第三个目的是提供所述的酯酶EstC11在催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应中的应用。
优选，所述的应用为酯酶EstC11在拆分(±)-乙酸苏合香酯制备得到R-乙酸苏合香酯中的应用。
本发明的第四个目的是提供酯酶EstC11在耐受金属离子、表面活性剂或有机溶剂环境下进行催化的应用，所述的金属离子为Mg2+、Na+、Ca2+或Li+；所述的表面活性剂为三聚磷酸钠；所述的有机溶剂为正己烷或异辛烷。
本发明的酯酶基因EstC11来自嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01，保存在中国科学院南海海洋研究所。本发明利用生物信息学分析方法，分析得到一个酯酶基因EstC11。通过PCR的方法，从上述嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01基因组中克隆得到酯酶基因EstC11，全长为717bp(从起始密码子到终止密码子)，编码238个氨基酸。将酯酶基因EstC11与表达载体pET-28α(+)连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组酯酶EstC11。酯酶EstC11能催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应，酯酶EstC11作为催化剂拆分(±)-乙酸苏合香酯，可制备得到R-乙酸苏合香酯。
附图说明：
图1是酯酶EstC11的SDS-PAGE电泳；其中，M为蛋白marker，泳道1为IPTG诱导前的含有pET-28α(+)-EstC11的大肠杆菌BL21(DE3)总蛋白，泳道2为IPTG诱导后的含有pET-28α(+)-EstC11的大肠杆菌BL21(DE3)蛋白上清，泳道3为纯化的酯酶EstC11。
图2是酯酶EstC11对不同侧链长度酰基的对硝基苯酚酯的特异性。
图3是pH对酯酶EstC11活性的影响。
图4是不同pH对酯酶EstC11稳定性的影响。
图5是温度对酯酶EstC11活性的影响。
图6是不同温度对酯酶EstC11稳定性的影响。
图7是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随反应pH的变化曲线。
图8是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随反应温度的变化曲线。
图9是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随底物浓度的变化曲线。
图10是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随酶量的变化曲线。
图11是在酯酶EstC11作用下(±)-乙酸苏合香酯e.e.s和Y随反应时间的变化曲线。
图12是反应前(±)-乙酸苏合香酯气相色谱图，S表示S-乙酸苏合香酯，R表示R-乙酸苏合香酯。
图13是最适反应条件下酯酶EstC11对(±)-乙酸苏合香酯的选择性水解气相色谱图，S表示S-乙酸苏合香酯，R表示R-乙酸苏合香酯，S’表示S-1-苯乙醇，R’表示R-1-苯乙醇。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本发明的酯酶基因EstC11来源于基因组测序的嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01，该菌保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。
实施例1：酯酶基因EstC11开放阅读框边界确定及引物设计
提取嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01的基因组DNA，经全基因组测序后，利用生物信息学手段对基因组进行基因注释，分析其中的酯酶基因，确定了其中酯酶基因EstC11的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长为717bp(从起始密码子到终止密码子)，将其在NCBI中进行blastx比对分析，表明其与来源Bacillus paralicheniformisMDJK30的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(rhamnogalacturonan acetylesterase，WP_003180904.1)有96％的一致性。该鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(共235个氨基酸)只在蛋白质数据库中进行了序列注释并未对其功能进行鉴定(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP_003180904.1)，并且目前没有发现对这个鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶的功能进行相应的鉴定和在手性拆分中的应用的报道。酯酶基因EstC11编码的酯酶EstC11的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共238个氨基酸。根据分析得到的酯酶基因EstC11序列，设计全长扩增引物如下：上游引物：5′-CACGGATCCATGAAACGAACAGACAAAAAGCC-3′(下划线为BamH I酶切位点)；下游引物：5′-CATCTCGAGTTACACGCCGGCACGGAA-3′(下划线为Xho I酶切位点)。
实施例2：酯酶基因EstC11的克隆及载体构建
2.1 PCR扩增
将实施例1设计的引物(上游引物：5′-CACGGATCCATGAAACGAACAGACAAAAAGCC-3′；下游引物：5′-CATCTCGAGTTACACGCCGGCACGGAA-3′)送至上海生物工程有限公司合成，合成的引物使用TE缓冲液溶解成终浓度为10μM，以提取的嗜热芽孢杆菌Bacillus sp.CX01总DNA作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：
表1 PCR反应体系
使用以下PCR扩增程序扩增酯酶基因EstC11：94℃变性5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸2min，进行32个循环；72℃延伸10min，冷却到18℃。
将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观察，回收735bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用30μL无菌水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。
2.2酶切
PCR产物使用以下体系进行酶切，酶切时间1.5h。酶切体系为：BamH I 2μL，Xho I2μL，DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至40μL。酶切后按照胶回收试剂盒方法回收经过双酶切的PCR产物。
质粒pET-28α(+)的双酶切：挑取含有质粒pET-28α(+)的大肠杆菌DH5α单菌落，过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用BamH I和Xho I按以下体系双酶切，酶切时间1.5h。酶切体系为：BamH I 2μL，Xho I 2μL，DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至40μL。酶切后在0.8％琼脂糖凝胶中电泳，按照胶回收试剂盒方法回收经过双酶切的线性pET-28a(+)载体。
上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化回收使用核酸纯化回收试剂盒(Magen，Hipure Gel Pure DNA Micro Kit)，质粒提取试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。
2.3连接
将经过双酶切的PCR产物和双酶切的线性pET-28α(+)载体按以下体系进行连接：双酶切PCR产物5μL，双酶切的线性pET-28α(+)载体1μL，T4连接酶(5U/μL)0.5μL，连接缓冲液(5×)2μL，用去离子水补足10μL，连接温度为20℃，20min。由此得到连接产物。
2.4转化及筛选
取5μL连接产物加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴20～30min，后于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm转速下，孵育培养1h。取一定量的菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mLLB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。
2.5基因核苷酸序列测定
将筛选的阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与酯酶基因EstC11序列进行比对，进一步确认是将酯酶基因EstC11(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)插入到pET-28α(+)质粒中，结果完全正确后确认得到带有酯酶基因EstC11的pET-28α(+)质粒(命名为pET-28α(+)-EstC11)，可用于进行下一步试验。
实施例3：酯酶EstC11在E.coli BL21(DE3)中的高效表达
3.1大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞制备
1.将少量大肠杆菌BL21(DE3)菌种接入5mL LB试管液中，200rpm、37℃过夜培养；
2.按1％体积比的接种量将试管中的菌液接种到200mL LB摇瓶中，200rpm、20℃过夜培养，得到原培养物；
3.将培养好的摇瓶在冰水中迅速冷却至0℃，分装至冰预冷的离心管(50mL)，冰置数分钟；
4. 4℃、4000rpm离心10min回收细胞，弃上清；
5.用冰预冷的10mL 0.1M的CaCl2重悬细胞，4℃、4000rpm离心10～15min回收细胞；
6.重复5，用10mL 0.1M的CaCl2重悬细胞，冰浴30min以上；
7.4℃，4000rpm离心10min回收细胞；
8.每50mL原培养物用5mL含体积分数7.5％DMSO的0.1M CaCl2来重悬，分装于1.5mL离心管，50～100μL每管。-80℃保藏。由此得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
3.2转化
取实施例2中得到的pET-28α(+)-EstC11质粒0.5～1μL与50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm培养1h。培养物离心后涂布50μg/mL的卡那霉素LB平板，培养过夜20h后挑选单菌。由此得到含有pET-28α(+)-EstC11的大肠杆菌BL21(DE3)。
实施例4：酯酶EstC11的表达和纯化
4.1蛋白诱导
将含有pET-28α(+)-EstC11的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中培养至OD600为0.85左右，加IPTG至终浓度0.2mM，22℃培养16h。300mL菌液4000rpm、4℃离心20min，收集菌体，用30mL(50mM，pH 7.4)Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声400w，超4s，停6s，破碎15min分钟，离心，收集上清。将收集的上清于冷冻干燥机中冷冻干燥得到粗酶粉。
4.2酯酶EstC11的纯化与SDS-PAGE电泳
用镍离子亲和层析柱纯化4.1中收集的上清，具体实施方案如下：使用25mM的咪唑洗脱5个柱体积，40mM咪唑洗脱20～30个柱体积，最后使用3.5mL 300mM咪唑洗脱，收集最后的3mL洗脱液。用脱盐柱SephadexG25进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。将纯化的酯酶进行SDS-PAGE凝胶电泳，得到纯化的酯酶EstC11(图1)，纯化的蛋白大小约29kD，符合理论预期。
4.3酯酶EstC11活性测定
酯酶EstC11活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：①用乙腈配制5mM的对硝基苯酚酯溶液；②在0.2mL反应体系中加入188μL Tris-HCl buffer(50mM，pH 8.0)，8μL对硝基苯酚酯溶液(5mM)，4μL酯酶EstC11纯酶液(即纯化的酯酶EstC11，酯酶EstC11纯酶液稀释10倍后的酯酶EstC11浓度为0.7μg/μL，反应体系中酯酶EstC11的终浓度为0.14μg/μL)；③20℃下，反应4min后，加入50μL正丙醇终止反应，于405nm测定吸光度。
酶活力单位定义：1min内水解对硝基苯酚酯，释放1μM对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活力单位。
实施例5：酯酶EstC11的酶学性质
5.1水解不同侧链长度的对硝基苯酚酯
按照4.3的测定条件，比较酯酶EstC11水解不同长度酰基的对硝基苯酚酯C2-C12，结果如图2。说明酯酶EstC11对长链对硝基苯酚酯特异性差，而对于短链长度的对硝基苯酚酯的作用效果较好，最佳的底物是C2，即对硝基苯酚乙酸酯。
5.2最适pH和pH稳定性
配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，如表2所示，其浓度均为50mM。
表2不同pH的缓冲体系
将4.3中测定条件所述的缓冲液(Tris-HCl buffer)按照表2中的缓冲溶液分别进行替换，测定不同pH的缓冲溶液中重组酯酶EstC11的酶活力，底物为对硝基苯酚乙酸酯。pH对重组酯酶EstC11活性的影响结果见图3。在50mM的Tris-HCl pH8.5时，酯酶EstC11的酶活性最高，pH值在7.5-9之间有较高的酶活性。当pH低于7.5时，其活性迅速降低。酯酶EstC1 1在不同pH的缓冲液中的稳定性见图4。pH在7.0-9.0时酶活性较稳定，处理8h后残余活性在80％以上。在pH大于9.0时，酶活性丧失则较为明显。
5.3最适温度和温度稳定性
使用50mM的Tris-HCl pH8.5作为缓冲液，对硝基苯酚乙酸酯作为底物，按照4.3中的反应体系，在不同温度下测定酶活。测得酯酶EstC11催化水解对硝基苯酚乙酸酯的最适温度为25℃(图5)。在10-30℃间的酶活力达80％以上，温度大于35℃时酶活性急剧下降。将酯酶EstC11在不同温度(30-50℃)下，每隔15min取出测酶活力，结果见图6。酯酶EstC 11在低于40℃时，酶活性保持较高，处理90min后残余酶活性仍保持85％以上。随着处理温度的升高，酯酶残余酶活力逐渐下降，当温度高于45℃时酶活性急剧降低，在45℃处理90min后，残余酶活力为20％(图6)，说明酯酶EstC11在低于40℃时稳定性较好。在最适条件下(底物为硝基苯酚乙酸酯、缓冲液为50mM的Tris-HCl pH8.5和反应温度为25℃)，按4.3测定方法测得的酯酶EstC11酶活为124.5U/mg。
5.4金属离子对酯酶EstC11活性的影响
按照表3中的离子种类和浓度处理酯酶EstC11，以未添加任何离子或表面活性剂的反应体系中的酶活力为100％，作为对照，在室温下孵育3h，按4.3测定方法(以对硝基苯酚乙酸酯作为底物)测定相对酶活。金属离子对酶活性的影响见表3。与对照相比，Mn2+、Fe2 +、Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+等金属离子对酯酶EstC11催化对硝基苯酚乙酸酯的活力有强烈的抑制作用。而Na+、Ca2+、Mg2+、Li+、K+等对酯酶EstC11酶活力的影响很小。
表3金属离子对酯酶EstC11活力的影响
5.5表面活性剂对酯酶EstC11活性的影响
按照表4中的表面活性剂的种类和浓度处理酯酶EstC11，以未添加任何离子或表面活性剂的反应体系中的酶活力为100％，作为对照。在室温下孵育3h，按4.3测定方法(以对硝基苯酚乙酸酯作为底物)测定相对酶活。表面活性剂对酶活性的影响见表4。三聚磷酸钠对酶活性具有明显的激活作用，而TritonX-100、Tween-20和Tween-80对酶活性具有不同程度的抑制作用，并且随着浓度增加抑制作用增强。SDS和SDBS对CX-11的酶活具有强抑制性。
表4表面活性剂对酯酶EstC11活性的影响
5.6有机溶剂对酯酶EstC11活性的影响
按照表5中所示有机溶剂种类和终浓度，在反应体系中加入有机溶剂处理酯酶EstC11酶液，处理条件为室温，Tris-HCl(pH8.5)缓冲溶液中孵育3h，以未加入有机溶剂的反应体系中酯酶EstC11活力为100％作为对照，再按照4.3的测定方法(以对硝基苯酚乙酸酯作为底物)测定相对酶活，结果如表5所示。在体积分数10％的浓度下，绝大多数有机溶剂对酯酶EstC11有不同程度的抑制作用。在高浓度(体积分数50％)下，酯酶EstC11在正己烷中保持较高的酶活，残余酶活力为50％以上。以上结果说明该酯酶能够耐有机溶剂。
表5有机溶剂对酯酶EstC11活性的影响
实施例6：酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯
6.1 pH对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响
不同pH(6.0-9.5)的反应体系为0.5mL，包括10mg酯酶EstC11粗酶粉和50mM(±)-乙酸苏合香酯，其余为不同pH(6.0-9.5)缓冲液(见表2)；在37℃下反应2h，气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算底物对映体过量值(Enantionmeric excess，e.e.s)和得率(Yie ld，Y)，结果见图7。从图7可以看出，随着pH的升高e.e.s值不断升高，但得率不断降低，综合考虑，酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的最适pH为9.0。
公式1：公式2：
式中：AR和AS分别表示R-乙酸苏合香酯和S-乙酸苏合香酯的峰面积，A0和A分别表示反应前和反应后R-乙酸苏合香酯的峰面积。
6.2反应温度对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响
反应体系为0.5mL，包括10mg酯酶EstC11粗酶粉和50mM底物(±)-乙酸苏合香酯，其余为Tris-HCl(pH9.0)缓冲液；在不同温度下反应2h，手性气相色谱测定酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的立体选择性，结果见图8。从图8中可以看出，在20℃时e.e.s最高，随着温度的升高，e.e.s不断降低降低，因此酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的最适温度为20℃。
6.3有机溶剂对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响
反应体系为0.5mL，包括10mg酯酶EstC11粗酶粉、50mM底物(±)-乙酸苏合香酯和10％(v/v)有机溶剂，其余为Tris-HCl(pH9.0)缓冲液；以未加有机溶剂为对照；在20℃下反应2h，用气相色谱手性柱检测。从表6可以看出，在10％(v/v)DMSO存在的情况下，e.e.s明显提高，而其他绝大多数有机溶剂的存在都降低了酯酶EstC11的立体选择性。
表6有机溶剂对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响
6.4表面活性剂对酯酶EstC11拆分乙酸苏合香酯的影响
在优化条件下(20℃，pH9.0Tris-HCl缓冲液)，反应体系为0.5mL，包括10mg酯酶EstC11粗酶粉、50mM底物(±)-乙酸苏合香酯和1g/L的表面活性剂(Tween-20、Tween-80、TritonX-100、三聚磷酸钠)，其余为pH9.0Tris-HCl缓冲液；以未加表面活性剂为对照；在20℃下反应2h后，样品用于气相色谱检测，结果见表7。从表7中可以看出，与对照相比，在表面活性剂存在的情况下，e.e.s和Y基本没什么变化。
表7表面活性剂对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响
6.5底物浓度对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响
在优化条件下(20℃，pH9.0Tris-HCl缓冲液)，反应体系为0.5mL，包括10mg酯酶EstC11粗酶粉和20-100mM底物(±)-乙酸苏合香酯，其余为pH9.0Tris-HCl缓冲液；在20℃下反应2h后，样品用于GC检测，结果见图9。从图9中可以看出，底物浓度为40mM时，e.e.s达到93％，得率为37％，而底物浓度为50mM时，e.e.s为91％，得率却达到46％。综合考虑，50mM为酯酶EstC11选择性水解(±)-乙酸苏合香酯的最适底物浓度。
6.6酶量对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响
在优化条件下(20℃，pH9.0Tris-HCl缓冲液)，反应体系为0.5mL，包括10-60mg/mL酯酶EstC11粗酶粉和50mM底物(±)-乙酸苏合香酯，其余为pH9.0Tris-HCl缓冲液；在20℃下反应2h后，样品用于GC检测，结果见图10。当酶量为10mg时，e.e.s达到91％，得率为45％，随酶量的增大，e.e.s基本不变。因此，20mg/mL为酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的最适酶量。
6.7反应时间对酯酶EstC11拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响
在优化条件下(20℃，pH9.0Tris-HCl缓冲液)，反应体系为0.5mL，包括10mg酯酶EstC11粗酶粉和50mM底物(±)-乙酸苏合香酯，其余为pH9.0Tris-HCl缓冲液；在20℃下反应，每隔一段时间取出500μL，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠除水，气相色谱手性柱检测，结果见图11。从图11中可以看出，随着反应时间的延长，e.e.s逐渐升高。反应3h后，e.e.s变化不明显，因此酯酶EstC11催化(±)-乙酸苏合香酯的最适时间是3h，最适反应条件下酯酶EstC11催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到R-乙酸苏合香酯的e.e.s为98％，得率为39％。最适条件下反应前、后的气相色谱图见图12和图13。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种酯酶EstC11及其编码基因和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 717
<212> DNA
<213> 嗜热芽孢杆菌CX01 (Bacillus sp. CX01)
<400> 1
atgaaacgaa cagacaaaaa gccaaaagtg acagtatatt tggccgggga ttcgaccgtc 60
gcagactgtc ccccgcatga agcgccgatg gccggctggg gacagatgct tccgctgttt 120
ttctcagatg aggctgcggt tgtgaatatg gcaaaaggcg gggccagttc gaacagcttc 180
attgatgaag gccggcttga tgacatgacg gatcggcttg cgcctggtga ttatgtgttg 240
atccagttcg gccacaacga tcaaaagccg tacggaacag agccgtatac aacctatcag 300
gagcatcttg tccgctatgt ggaagcggtt cgtgaaaaac aggcgactcc ggttttgatc 360
acttccgcag agcgcagacg ttttgatcaa aacggaaagc ccgccgacac actcggggat 420
tttccgaaag cgatgaaggc gctcgctggc agctttgaag tgccgctgat cgatttatgg 480
tccaaaacaa aagcgctcta tgaatctctc ggaatcgaag gctcaaaagg gctgtttgtc 540
cactttcagc cgaatgaaca ccctcattat ccaaatggaa tcgaagacaa tacccatttt 600
tccgaggcgg gggcccgtca agtcgccagg ctggtaacag aaggaatcag agagctcggt 660
ctgcctttag cggcttatct tcattgtgaa aggagcgatt tccgtgccgg cgtgtaa 717
<210> 2
<211> 238
<212> PRT
<213> 嗜热芽孢杆菌CX01 (Bacillus sp. CX01)
<400> 2
Met Lys Arg Thr Asp Lys Lys Pro Lys Val Thr Val Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Ser Thr Val Ala Asp Cys Pro Pro His Glu Ala Pro Met Ala Gly
20 25 30
Trp Gly Gln Met Leu Pro Leu Phe Phe Ser Asp Glu Ala Ala Val Val
35 40 45
Asn Met Ala Lys Gly Gly Ala Ser Ser Asn Ser Phe Ile Asp Glu Gly
50 55 60
Arg Leu Asp Asp Met Thr Asp Arg Leu Ala Pro Gly Asp Tyr Val Leu
65 70 75 80
Ile Gln Phe Gly His Asn Asp Gln Lys Pro Tyr Gly Thr Glu Pro Tyr
85 90 95
Thr Thr Tyr Gln Glu His Leu Val Arg Tyr Val Glu Ala Val Arg Glu
100 105 110
Lys Gln Ala Thr Pro Val Leu Ile Thr Ser Ala Glu Arg Arg Arg Phe
115 120 125
Asp Gln Asn Gly Lys Pro Ala Asp Thr Leu Gly Asp Phe Pro Lys Ala
130 135 140
Met Lys Ala Leu Ala Gly Ser Phe Glu Val Pro Leu Ile Asp Leu Trp
145 150 155 160
Ser Lys Thr Lys Ala Leu Tyr Glu Ser Leu Gly Ile Glu Gly Ser Lys
165 170 175
Gly Leu Phe Val His Phe Gln Pro Asn Glu His Pro His Tyr Pro Asn
180 185 190
Gly Ile Glu Asp Asn Thr His Phe Ser Glu Ala Gly Ala Arg Gln Val
195 200 205
Ala Arg Leu Val Thr Glu Gly Ile Arg Glu Leu Gly Leu Pro Leu Ala
210 215 220
Ala Tyr Leu His Cys Glu Arg Ser Asp Phe Arg Ala Gly Val
225 230 235
Claims (10)
1.一种酯酶EstC11，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的酯酶EstC11的酯酶基因EstC11。
3.根据权利要求2所述的酯酶基因EstC11，其特征在于，所述的酯酶基因EstC11的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种含有权利要求2所述的酯酶基因EstC11的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pET-28α(+)载体。
6.一种含有权利要求2所述的酯酶基因EstC11的基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.权利要求1所述的酯酶EstC11在催化酯类水解、酯化和/或转酯化反应中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用为酯酶EstC11在拆分(±)-乙酸苏合香酯制备得到R-乙酸苏合香酯中的应用。
10.权利要求1所述的酯酶EstC11在耐受金属离子、表面活性剂或有机溶剂环境下进行催化的应用，所述的金属离子为Mg2+、Na+、Ca2+或Li+；所述的表面活性剂为三聚磷酸钠；所述的有机溶剂为正己烷或异辛烷。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810079306.9A CN108285895B (zh) | 2018-01-26 | 2018-01-26 | 一种酯酶EstC11及其编码基因和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810079306.9A CN108285895B (zh) | 2018-01-26 | 2018-01-26 | 一种酯酶EstC11及其编码基因和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108285895A true CN108285895A (zh) | 2018-07-17 |
| CN108285895B CN108285895B (zh) | 2020-06-23 |
Family
ID=62835843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810079306.9A Expired - Fee Related CN108285895B (zh) | 2018-01-26 | 2018-01-26 | 一种酯酶EstC11及其编码基因和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108285895B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109797144A (zh) * | 2019-01-24 | 2019-05-24 | 中国科学院南海海洋研究所 | 芽孢杆菌dl-2的胞外蛋白酶在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用 |
| CN110699278A (zh) * | 2019-10-11 | 2020-01-17 | 中国科学院南海海洋研究所 | 芽孢杆菌dl-1的全细胞在催化拆分乙酸苏合香酯的应用 |
| CN110699390A (zh) * | 2019-10-11 | 2020-01-17 | 中国科学院南海海洋研究所 | 芽孢杆菌dl-1的胞外蛋白酶在催化拆分乙酸苏合香酯的应用 |
| CN111197036A (zh) * | 2020-01-08 | 2020-05-26 | 中南大学 | 一种酯酶Est-24及其编码基因与用途 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4217506A1 (de) * | 1992-05-27 | 1993-12-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Mikrobielle Esterase zur enantioselektiven Spaltung von 1-Arylalkylestern |
| CN1127301A (zh) * | 1991-02-22 | 1996-07-24 | 埃莫里大学 | 核苷对映体的外消旋混合物的拆分方法 |
| WO2002029113A2 (en) * | 2000-10-06 | 2002-04-11 | Novozymes Biotech, Inc. | Methods for monitoring multiple gene expression |
| WO2008000738A1 (de) * | 2006-06-27 | 2008-01-03 | Basf Se | Proteine mit esterase-aktivität |
| CN104962533A (zh) * | 2015-06-30 | 2015-10-07 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种新型酯酶及其编码基因和在拆分(±)-1-苯乙醇和(±)-乙酸苏合香酯中的应用 |
-
2018
- 2018-01-26 CN CN201810079306.9A patent/CN108285895B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1127301A (zh) * | 1991-02-22 | 1996-07-24 | 埃莫里大学 | 核苷对映体的外消旋混合物的拆分方法 |
| DE4217506A1 (de) * | 1992-05-27 | 1993-12-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Mikrobielle Esterase zur enantioselektiven Spaltung von 1-Arylalkylestern |
| WO1993024648A1 (de) * | 1992-05-27 | 1993-12-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Mikrobielle esterase zur enantioselektiven spaltung von 1-arylalkylestern |
| WO2002029113A2 (en) * | 2000-10-06 | 2002-04-11 | Novozymes Biotech, Inc. | Methods for monitoring multiple gene expression |
| WO2008000738A1 (de) * | 2006-06-27 | 2008-01-03 | Basf Se | Proteine mit esterase-aktivität |
| CN104962533A (zh) * | 2015-06-30 | 2015-10-07 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种新型酯酶及其编码基因和在拆分(±)-1-苯乙醇和(±)-乙酸苏合香酯中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SAKKA,M.等: "Characterization of Xyn30A and Axh43A of Bacillus licheniformis SVD1 identified by its genomic analysis", 《GENBANK DATABASE》 * |
| 邓盾等: "Enantio‐selective preparation of (S)‐1‐phenylethanol by a novel marine GDSL lipase MT6 with reverse stereo‐selectivity", 《催化学报》 * |
| 黄锦龙等: "一种新颖深海微生物羧酸酯酶制备(R)-苯乙醇的研究", 《热带海洋学报》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109797144A (zh) * | 2019-01-24 | 2019-05-24 | 中国科学院南海海洋研究所 | 芽孢杆菌dl-2的胞外蛋白酶在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用 |
| CN110699278A (zh) * | 2019-10-11 | 2020-01-17 | 中国科学院南海海洋研究所 | 芽孢杆菌dl-1的全细胞在催化拆分乙酸苏合香酯的应用 |
| CN110699390A (zh) * | 2019-10-11 | 2020-01-17 | 中国科学院南海海洋研究所 | 芽孢杆菌dl-1的胞外蛋白酶在催化拆分乙酸苏合香酯的应用 |
| CN111197036A (zh) * | 2020-01-08 | 2020-05-26 | 中南大学 | 一种酯酶Est-24及其编码基因与用途 |
| CN111197036B (zh) * | 2020-01-08 | 2022-07-05 | 中南大学 | 一种酯酶Est-24及其编码基因与用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108285895B (zh) | 2020-06-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108285895A (zh) | 一种酯酶EstC11及其编码基因和应用 | |
| CN104774825B (zh) | 腈水解酶突变体及其应用 | |
| CN105543191B (zh) | 一种酯酶phe21及其编码基因和应用 | |
| CN104673810A (zh) | 一种苹果酸脱氢酶基因mimdh1及其重组表达载体 | |
| CN105543190B (zh) | 一种酯酶bse00077及其编码基因和应用 | |
| CN106244569B (zh) | 一种酯酶EstC10及其编码基因和应用 | |
| CN104673809B (zh) | 一种苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体 | |
| CN104745547B (zh) | 一种环氧化物水解酶突变体、工程菌及其应用 | |
| CN114134134B (zh) | L-苏氨酸醛缩酶突变体及其在合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸中的应用 | |
| CN105802935B (zh) | 一种酯酶phe14及其编码基因和应用 | |
| CN106754818B (zh) | 一种耐热酯酶突变体及其制备方法和应用 | |
| CN105296513B (zh) | 一种海洋酯酶及其编码基因e22与应用 | |
| CN105838724B (zh) | 一种苹果酸脱氢酶基因rgmdh1及其重组表达载体 | |
| CN105238769B (zh) | 一种脂肪酶lipase7及其编码基因和应用 | |
| CN106119224B (zh) | 一种酯酶EstP00714及其编码基因和应用 | |
| CN105543192B (zh) | 一种酯酶bse01701及其编码基因和应用 | |
| CN103131659A (zh) | 一种耐有机溶剂脂肪酶、其编码基因、产生菌株及应用 | |
| CN105132394B (zh) | 一种脂肪酶lipase6及其编码基因和应用 | |
| CN105349507B (zh) | 一种脂肪酶LIPDa6及其编码基因和应用 | |
| CN106085985B (zh) | 一种酯酶WDEst9及其编码基因和应用 | |
| CN105296446B (zh) | 一种脂肪酶l-1及其编码基因和应用 | |
| CN101457217B (zh) | 具有α-苯乙醇拆分活性的嗜热脂肪酶、编码基因及其应用 | |
| CN108396016A (zh) | 一种酯酶phe21及其编码基因和在手性乙酸仲丁酯制备中的应用 | |
| CN107475218A (zh) | 一种酯酶Bae02030及其编码基因和应用 | |
| CN105779408B (zh) | 酸性磷酸酶及其相关生物材料在构建溶磷工程菌中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200623 |