CN1127301A

CN1127301A - 核苷对映体的外消旋混合物的拆分方法

Info

Publication number: CN1127301A
Application number: CN95109814A
Authority: CN
Inventors: D·C·廖塔; R·F·施基纳齐; W·-B·崔
Original assignee: Emory University
Current assignee: Emory University
Priority date: 1991-02-22
Filing date: 1995-08-18
Publication date: 1996-07-24
Anticipated expiration: 2012-02-22
Also published as: ATE469147T1; MY114350A; RO119365B1; CZ295074B6; CA2104399A1; PT100151B; DK1439177T3; IE920545A1; NO2005015I1; NZ241625A; CN100396785C; WO1992014743A3; MX9200747A; CN1065065A; HU9302377D0; HU227823B1; NO312399B1; AU1561792A; AU679649B2; FI20030932A

Abstract

本发明公开了核苷对映体的外消旋混合物的拆分方法，包括将外消旋混合物暴露在一种酶中的步骤，该酶优选催化对映体之一的一个反应。

Description

核苷对映体的外消旋混合物的拆分方法

本专利申请是CN92101981.5的分案申请。原申请的申请日为1992年2月22日；原申请的发明名称为2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)，-1，3-氧硫杂茂烷的制备方法。

本发明涉及生物活性的核苷领域，特别是包括含有2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1基)-1，3-氧硫杂茂烷(“FTC”)的抗病毒组合物，其生理学上可接受的衍生物，或其生理学上可接受的盐，和其拆分方法及(-)-β-L和(+)--β-D FTC对映体的用途。

1981年，一种疾病被确定为获得性免疫缺乏综合症(AIDS)，这种疾病严重破坏人体免疫系统，而且几乎没有例外地导致病人死亡。1983年，测定了引起AIDS病因是人类免疫缺乏病毒(HIV)。到1990年12月，世界卫生组织估计全世界感染HIV病人为8百万到1千万，在美国就有1,000,000-1,400,000人。

1985年报导了合成的核苷3’-叠氮-3 ’-脱氧胸苷(AZT)可以抑制人类免疫缺乏病毒的复制。后来证明许多其它合成的核苷，包括2’，3’-二脱氧肌苷(DDI)，2’3’-二脱氧胞苷(DDC)，3’-氟-3’-脱氧胸苷(FLT)，和2’，3’-二脱氧-2’，3’-二脱氢胸苷(D₄T)可以有效地抗HIV。证明其它许多的2’，3’-二脱氧核苷在体外可以抑制多种病毒的生长。很明显，通过细胞激酶将细胞磷酸化为5’-三磷酸盐后，这些合成的核苷并入病毒DNA的生长线，由于没有3’-羟基的存在引起链中止。

各种2’，3’-二脱氧核苷在体内或体外抑制HIV复制的成功导致许多研究者设计和试验核苷，即在核苷的3’-位用杂原子取代碳原子。Norbeck等人公开了(±)-1-[(2β，4β)-2-(羟甲基)-4-(二氧戊环基)]胸腺嘧啶(称为(±)-二氧戊环-T)显示了抗HIV的中等活性(EC₅₀在ATH₈细胞中为20μm)，并且在浓度为200μm对于未感染的对照细胞没有毒性， Tetrahedron Letters30(46)，6246，(1989)。欧洲专利申请公开No0337713和U.S.专利No5,041,449，转让给IAFBiochem International，Inc.，公开了2-取代的-4-取代的-1，3-二氧戊环，它显示了抗病毒活性。

U.S.专利No5,047,407和欧洲专利申请公开No0382526，也转让给IAF Biochem International，Inc。公开了许多2-取代的-5-取代的-1，3-氧硫杂茂烷核苷具有抗病毒活性，特别是报导了2-羟甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷(以下称为(±)-BCH-189)的Cl’-β异构体的外消旋混合物(关于在4’-位)几乎与AZT有相同的抗HIV活性，而且在试验水平没有细胞毒性。已经发现(±)-BCH-189抑制体外从病人身体分离出的AZT-阻抗HIV的复制，该病人用AZT治疗已超过36周。

另一种严重影响人类健康的病毒是肝炎B病毒(以下称为“HBV”)。HBV引起人类癌症仅次于烟草。HBV引起癌症的机理还不清楚，尽管假定它可以直接触发肿瘤的发展，或通过慢性炎症，硬化及与感染有关的细胞再生间接触发肿瘤的发展。

当经过2-6个月培养之后，其中宿主没有感染，HBV感染可能导致急性肝炎和肝损伤，引起腹部疼痛，黄疸，及提高某些酶的血液水平。HBV可能引起暴发性肝炎，且迅速发展，使得肝大部分被破坏，以至常常成为致命的疾病。

一般急性肝炎病人可以痊愈，然而，有些病人其大量的病毒抗原仍留在血液中一个相当长，或不确定的时间，引起慢性感染。慢性感染可以导致慢性持续性肝炎。在发展中国家，感染慢性持续性HBV的病人最普遍。到1991年中期，仅在亚洲，慢性HBV携带者就有近2亿2千500万，全世界几乎有3亿携带者。慢性持续性肝炎可以引起疲劳，肝硬变，肝细胞癌，早期肝癌。

在西方工业国家，相当多的人有染上HBV的危险，包括那些与HBV携带者或他们的血样接触的人。HBV的传播是与获得性免疫缺乏综合症非常相似，这就说明了为什么患AIDS或AIDS相关综合症的病人普遍感染HBV，然而，HBV比HIV更容易接触传染。

用人类血清—衍生疫苗免疫病人对HBV有免疫力已经发展起来。然而现已发现疫苗的有效产生也会带来一些麻烦，因为从慢性携带者得到人类血清供应是有限的，并且纯化过程是费时和昂贵的。进而，由不同血清制备的每批疫苗必须在黑猩猩身上试验以保证安全。通过遗传工程也已经生产出疫苗。已经显示用α-干扰素——一种遗传工程中的蛋白质—进行治疗是有希望的。然而，迄今为止，还没有一种药学试剂可以有效地抑制病毒的复制。

为药学目的销售的核苷，它不仅必须是低毒性，而且必须是低成本生产。大量研究和发展新的、低成本的方法目的在于大规模生产核苷。现行制备2’，3’-二脱氧核苷均通过以下二条路线之一：原核苷的衍生或衍生糖部分与杂环碱缩合。尽管通过变化原核苷获得新核苷类似物的方法有许多缺点，但是这个方法的主要优点是几乎已经自然地建立起了绝对立体化学。然而，这种方法不能用于既含有人工产生的碱又含有人类产生的糖类部分(即不能用原核苷制备)的核苷如1，3-氧硫杂茂烷核苷和1，3-二氧戊环核苷的生产。

当一个糖或一个糖类似部分与一个杂环碱缩合形成一个合成的核苷时，生产出的核苷有两个手性中心(在C1’和C4’位)，因此为二个非对映体对形成存在。每个非对映体以一对对映体形式存在。因此，该产品为四个对映体的混合物。

人们常常发现用人工生产的既在C1’位又在C4’位立体化学结构的核苷其活性低于天然方法得到的立体化学结构相同的核苷。例如，Carter等人报导的在细胞培养中获得的(一)-Car-bovir对映体(2’，3’-二脱氢-2’，3’-二脱氧鸟苷)减少逆转录酶活性50％的浓度(EC₅₀)是0.8μm，而Carbovir(+)对映体的EC₅₀大于60μm。 Antimic robial Agents and Chemotherapy，34：6，1297-1300(1990，6)。

PCT国际公开No W091/11186公开了制备1，3-氧硫杂茂烷核苷可以用高含量非对映体选择性(从C1’-碳到杂环碱具有β构型键的高百分比的核苷)通过小心选择路易斯酸用缩合方法进行。人们发现，当氯化锡用作缩合催化剂时，1，3-氧硫杂茂烷核苷与碱缩合产生几乎全部是β-立体定向结构。其它路易斯酸提供低的(或不)C1’-β选择性或简直不催化反应。

根据以上事实，获得性免疫缺乏综合症，AIDS-相关综合症，及肝炎B病毒已经达到流行全世界的程度，而且在感染病人方面已经具有严重的结果，因此，强烈需要提供一种新的有效的药学试剂来治疗这些病人，而且对宿主是低毒性的。

还需提供一种低成本、商品化制备药学上重要核苷的方法，特别是通过糖类似部分与碱缩合得到在合成核苷的C4’位上的β-立体定向。

因此，本发明目的是提供一种治疗感染HIV病人的方法和组合物。

本发明另一目的是提供一种治疗感染HBV病人或其它宿主动物的方法和组合物。

本发明的再另一个目的是提供对映体富集的1，3-氧硫杂茂烷核苷。

本发明还有一个目的就是提供1，3-氧硫杂茂烷核苷C4’-对映体的拆分方法。

治疗感染HBV和HIV的病人或其它宿主动物的方法和组合物是施用在药学上可接受载体中的有效量的2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷，其药学上可接受的衍生物，包括5’或N⁴烷基化或酰化衍生物，或其药学上可接受的盐。

人们已经发现，2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷(“FTC”)显示出抗人类免疫缺乏病毒有意想不到的高活性。而且对于宿主细胞具有非常低的毒性。人们也已经发现FTC显示出抗HBV有非常高的活性。因此它可以用于治疗患有与HBV感染有关的各种疾病的病人。

毒性和药物代谢动力学研究证实FTC的用途，即作为药物施用的抗病毒剂。FTC和它的对映体对于人骨髓外周细胞浓度高达50μm和其它细胞系浓度高达200μm时是没有毒性的。FTC-TP主要是PBMC和HepG2细胞中的细胞内的代谢产物。用一个多(I)低聚(dC)模板—引物FTC-TP较强地抑制具有0.2μMK₁的HIV-1逆转录酶(RT)。用序列分析，当用HIV-RT(C-终端)时可以说明FTC-TP是一个蛋白质DNA链未端。

用FTC进行慢性治疗对于啮齿动物是没有毒性的，甚至每天口服剂量为85mg/kg至少两个月。对于猕猴FTC的药物代谢动力学显示出高的口服生物药效率(约73±6％)和血浆末端半衰期约为1.34±0.18(口服和I.V.给药的平均值)。

本发明也公开了核苷对映体的外消旋混合物，包括FTC的外消旋混合物的拆分方法，包括把外消旋混合物暴露在酶中的步骤，该酶优选催化对映体之一的反应。该方法可以用于拆分许多核苷，包括在糖部分或碱部分任意被取代的嘧啶和嘌呤核苷。该方法也可以用于拆分在糖部分含有附加杂原子的核苷衍生物，例如，(±)-FTC和(±)-BCH-189。核苷的拆分可以以中等成本大规模地进行。

用这里描述的方法，可以将FTC拆分成它的(+)-β-D和(-)-β-L对映体。对于抗HIV，HBV，和SIV，(一)-(β)-L-对映体似乎比(+)-(β)-D-对映体更有效。对于抗HIV，HBV和SIV，FTC的(+)-对映体也是活性的。

图1是2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷(“FTC”)的化学结构图。

图2是制备2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-硫杂茂烷的方法流程图。

图3是FTC的(+)和(-)的对映体的碱性磷酸酯酶和蛇毒磷酸二酯酶的特性流程图。

图4是说明用酶Amano PS-800^(空白方块)和PLE(空白圆圈加点描绘的)，FTC5’-丁酯的酯酶-催化水解进程与时间的关系图

图5是外消旋的和对映体富集FTC(其制备用实施例4的方法)浓度(μm)效果与感染HIV-1人的PBM细胞抑制百分率的关系曲线图。((黑圈，(±)-FTC)，(空白圈，(-)-FTC)，(黑方块，(+)FTC)。

图6是外消旋和对映体富集FTC(用实施例3方法制备)的浓度(μm)效果与感染HIV-1人的PBM细胞的抑制百分率的关系图。((黑圈，(±)-FTC)，(空白圈，(一)-FTC)，(黑方块，(+)-FTC)。

图7是在人PBM细胞中氚代的(±)-FTC吸收(2个测定的平均值)的时间(小时)与Pmol/(10⁶细胞)的关系图。

图8是测定从人PBM细胞中释出的有放射性标记的(±)-FTC的时间与Pmol/(10⁶细胞)的关系图。

图9说明在含有10μM[³H]-(±)-FTC介质中培育的人HepG-2细胞中(两个测定值的平均值)的[³H]-(±)-FTC和它的磷酸衍生物的存在，以时间对Pmol/(10⁶细胞)测出。

图10是当用10μM[³H]-(±)-FTC(700DPM/Pmol)脉冲细胞24小时后，并在将其除去后，将化合物定浓24小时，在人HepG-2细胞中[³H]-(±)-FTC和其磷酸衍生物的衰减时间与Pmol/(10⁶细胞)关系图。

图11是当用10μM[³H]-(±)-FTC(700DPM/Pmole)培育24小时后，人HepG2细胞中的[³H]-(±)-FTC和其磷酸衍生物的混合浓度的减少的时间与Pmol/(10⁶细胞)的关系图。

图12是FTC对映体对粒细胞—巨噬细胞前体细胞的群体形成的作用图，测量百分存活率与浓度(μM)的关系((一)FTC，空白圈；(+)-FTC，黑圈；AZT，黑方块)。

在这里，术语“对映体富集核苷”是涉及至少含有95％核苷的单个对映体的核苷组合物。

在这里，术语FTC为2-羟甲基-5-(5氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷(外消旋形式或对映体)，也称为2′-脱氧-5-氟-3’-硫杂胞苷。

在这里，术语(±)FTC为(±)-β-D，L-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3氧硫杂茂烷。

在这里，术语(-)-FTC为(-)-β-L-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷。

在这里，术语(+)-FTC为(+)-β-D-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷。

在这里，术语FTC-MP，FTC-DP，和FTC-TP分别为FTC的单磷酸酯，二磷酸酯，和三磷酸酯。

在这里，术语BcH-189为2-羟甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷。

在这里，术语“优选酶催化”是指通过一种酶进行催化，该酶有利于一个被酶作用物而不利于另一个。

在这里，离去基团意思是这样的一个官能团，即当它从连接的分子上离开时形成起始的碳化作用的官能团。

在这里本发明公开了治疗人和其它宿主动物HIV和HBV感染及以类似方式复制的其它病毒的方法和组合物，包括施用有效量的2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷(±)-β-D，L，(-)-β-L或(+)-β-D对映体，药学上(生理学上)可接受的衍生物，包括5’或N⁴分烷基化或酰化衍生物，或其药学上(生理学上)可接受的盐，它们在药学上可接受的载体中。如下所述，本发明化合物既具有抗还原病毒活性，如抗-HIV-1，抗-HIV-2，和抗猴的免疫缺乏病毒(抗-SIV)活性，其本身也代谢为显示抗还原病毒活性的化合物。

FTC和其药物学上可接受的衍生物或含有这些化合物的药学上可接受的制剂用于预防和治疗HIV感染和其它相关疾病如AIDS-相关综合症(ARC)，持续性扩散淋巴结造影术(PGL)，AIDS-相关神经病学疾病，抗-HIV抗体阳性，和HIV-阳性疾病，Kaposi’s肉瘤，血小板减少性紫癜和机会致病菌感染。另外，这些化合物或制剂可以用于预防或延迟某些抗-HIV抗体或HIV-抗原阳性或已受到HIV感染的人的临床疾病的发展。

FTC和其药学上可接受的衍生物或其盐或含有这些化合物的其药学上可接受的制剂也用于预防和治疗HBV感染和其它相关疾病如抗-HBV抗体阳性和HBV-阳性疾病，由HBV引起的慢性肝炎，肝硬变，急性肝炎，突发性肝炎，慢性持续性肝炎及疲劳。这些化合物或制剂也可以用于预防或延迟某些抗-HBV抗体或HBV-抗原阳性或已受到HIV感染的人的临床疾病的发展。

总之，本发明包括下列方面：

(a)(±)-β- D，L-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷和其药学上可接受的衍生物及其盐；

(b)(-)-β- L-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷和其药学可接受的衍生物及其盐；

(c)(+)-β- D-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷和其药学上可接受的衍生物及其盐；

(d)用于医疗例如治疗和预防HIV和HBV感染的(±)-β- D，L-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷，它的(-)和(+)对映体，及其药学上可接受的衍生物和盐；

(e)用(±)-β- D，L-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷，它的(-)和(+)对映体，及其药学上可接受的衍生物和盐于治疗HIV或HBV感染的药物的生产；

(f)含有(±)-β- D，L-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷，它的(-)和(+)对映体，或其药学上可接受的衍生物或其盐和-种药物上可接受的载体的药学制剂；

(g)制备2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷的方法，该方法包括：

(i)任意保护的5-氟胞嘧啶与式A的1，3-氧硫杂茂烷反应，和任意除去任何羟基保护基；

其中R_1a是氢或羟基保护基，包括一个酰基，及L是一个离去基团；

(ii)式B化合物(其中R_1a如上定义，和R_1b是一个氨基保护基)与一个用来在胞嘧啶环的5-位引入一个氟原子的氟化剂反应；

(iii)式C化合物

(其中R_1a如上定义)与一个用来将在尿嘧啶环的4-位氧基转化为氨基的试剂反应；除去任何保留的保护基以产生所需产品。

(h)制备2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷的(-)或(+)对映体的方法包括使(-)和(+)对映体混合物形式的该化合物或其衍生物(例如5’-酯)经过一定条件或与用来分离对映体的试剂反应，如果需要将所得衍生物转化为母体化合物。

关于方法(e)(i)羟基保护基包括如下详细描述的保护基，包括酰基(例如乙酰基)，芳酰基(例如苯甲酰基或取代苯甲酰基)，三苯甲基，或单甲氧基三苯甲基，苄基或取代苄基，三取代甲硅烷基，包括三烷基甲硅烷基(例如二甲基-叔-丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。5-氟胞嘧啶化合物可以任意被三取代甲硅烷基所保护。可以用常规方法除去保护基。离去基团L是在核苷化学领域中已知的那些典型的离去基团，例如卤素如氯或溴，烷氧基如甲氧基或乙氧基，或酰基如乙酰基或苯甲酰基。

方法(c)(i)中的反应可以在有机溶剂(例如1，2-二氯乙烷或乙腈)中，在路易斯酸，优选氯化锡，或三甲基甲硅烷基trflate的存在下进行。

式A化合物(其中L代表一个酰基，例如乙酰基)可以通过如下方法得到，使式D化合物(其中R_1a如上定义)与一个还原剂如氢化铝锂反应，接着为了所需中间体用一个适当的试剂处理，例如为了酰化用一个羧酸酐如乙酸酐，为了卤化用氯化或溴化试剂，或用烷基化试剂。

式D化合物可以通过式E化合物

与HSCH₂CO₂H在升温条件下来制备。

式E化合物可以通过具有式CH₂＝CH-CH₂-OR烯丙醚或烯丙酯或具有式ROCH₂-CH＝CH-CH₂OR的2-丁烯-1，4-二醇的二醚或二酯的臭氧分解来制备，其中R为一个保护基，如烷基，甲硅烷基或酰基。

关于方法e)(ii)，5-氟取代可以用本领域已知方法引入(M.J Robins，等人，在Nucleic Acid Chemistry中，Part 2，L.B.Townsend和R.S.Tipson，编辑，J.Wiley and Sons，New York，895-900(19/8)在此作为参考；R.Duschinsky在Nucleic AcidChemistry中，Part I，L.B.Townsend和R.S.Tipson，编辑，J.Wiley and Sons，New York 43-46(1978)在此作为参考)。氟化试剂可以是，例如氟代三氯甲烷中的三甲基次氟酸。

关于方法e)(iii)式C化合物可以用1，2，4-三唑，及4-氯苯基二氯磷酸酯处理，以形成相应的4-(1，2，4-三唑基)化合物，然后通过与如甲醇反应将该化合物转化为所需4-氨基(胞嘧啶)化合物。

式B和C的起始原料可以如通过适当的(任意保护的)碱与式A化合物用类似方法e)(i)中描述的方法制备。5-氟尿嘧啶和5-氟胞嘧啶可以从Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI53233，USA.买到。

(±)对映体的拆分可以按照下面第III节中的详细说明进行。

FTC可以通过与适当的酯化剂，例如酰基卤或酐反应，转化为药学上可接受的酯。FTC或其药学上可接受的衍生物可以用常规方法例如，用适当的碱处理转化为其药学上可接受的盐。FTC的酯或盐可以转化为FTC，例如用水解。

这里公开的抗病毒活性化合物是2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷(见图1)，它以外消旋或分离的对映体形式存在。

对于受者，活性化合物的施用可以任何衍生物形式，它可以直接或间接提供母体FTC化合物，或显示其本身活性。非跟制性的例子是药学上可接受的盐(或称为“生理学上可接受的盐”)，活性化合物的5和N⁴酰化或烷基化衍生物(或称为“生理学活性衍生物”)。在一个具体实施方案中，酰基是羧酸酯，其中酯基的非羰基部分选自直链的，支链的，或环的烷基，烷氧基烷基包括甲氧基甲基，芳烷基包括苄基，芳氧基烷基如苯氧基甲基，芳基包括任意被卤素，C₁-C₄烷基或C₁-C₄烷氧基取代的苯基，磺酸酯如烷基或芳烷基磺酰基包括甲磺酰基，单，二或三磷酸酯，三苯甲基或单甲氧基三苯甲基，取代苄基，三烷基甲硅烷基(例如二甲基-叔-丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。在酯中的芳基最优为苯基。烷基可以是直链的，支链的，或环的，C₁-C₁₈的基团最佳。

FTC的药学上可接受的衍生物具体例子包括，但不仅限于：

其中R₁和R₂分别选自烷基和酰基，特别是包括，但不仅限于：甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，异丙基，异丁基，仲丁基，叔丁基，异戊基，正戊基，叔戊基，3-甲基丁酰基，氢琥珀酰基，3-氯苯甲酸酯，环戊基，环己基，苯甲酰基，乙酰基，新戊酰，甲磺酰基，丙酰基，丁酰基，戊酰基，己、辛、癸酸的，月桂酸的肉豆寇酸的，棕榈酸的，硬脂酶的，油酸的酰基，氨基酸包括，但不仅限于丙氨酰基，缬氨酰基，亮氨酰基，异亮氨酰基，脯氨酰基，苯丙氨酰基，色氨酰基，甲硫氨酰基，甘氨酰基，丝氨酰基，苏氨酰基，半胱氨酰，酪氨酰基，天冬酰胺酰基，谷氨酰胺酰基，天冬氨酰基，谷氨酰基，赖氨酰基，精氨酰基和组氨酰基，其中R₁和R₂之一可以是H。

FTC或其衍生物可以以其药学上可接受的盐的形式提供。正如这里用的，术语药学上可接受的盐或络合物涉及保留所需母体化合物生物活性的及显示最小的，不期望的毒性效果的FTC的盐和络合物。这些盐的非限制性例子有(a)由无机酸如盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，硝酸等等形成的酸加成盐和由有机酸如乙酸，草酸，酒石酸，琥珀酸，苹果酸，抗坏血酸，苯甲酸，单宁酸，棕榈酸，藻酸，聚谷氨酸，萘磺酸，萘二磺酸和聚半乳糖醛酸形成的盐；(b)由多价金属阳离子如锌，钙，铋，钡，镁，铝，铜，钴，镍，镉，钠，钾等等形成的碱加成盐，或与有机阳离子N，N-二苄基亚乙基-二胺，铵，或1，2-乙二胺形成的碱加成盐；或(c)，(a)和(b)结合的盐，例如单宁酸锌盐等等。

改良的活性化合物，特别是在N⁴和5’-0位的改变，可以影响这些活性物质的代谢生物利用率和代谢率，因此控制了这些活性物质的传递。进一步地，这种改良可以影响化合物的抗病毒活性，在某些情况下，增加了母体化合物的活性。这很容易用这里描述的方法或其它本领域技术人员熟知的方法，通过制备衍生物和测试其抗病毒活性来评价。

FTC的外消旋混合物可以根据在PCT国际公开No WO91/11186，公开日1991年8月8日，及申请人Emory University公开的详细方法或在实施例1中公开的方法制备。总之，该方法包括将具有式CH₂＝CH-CH₂-OR的烯丙醚或酯，或具有式ROCH₂-CH＝CH-CH₂OR的2-丁烯-1，4-二醇的二醚或二酯进行臭氧化以形成具有OHC-CH₂-OR式的乙醇醛，其中R是保护基，如烷基，甲硅烷基或酰基；将巯基乙酸加到乙醇醛中以形成具有式2-(R-氧基)-甲基-5-氧代-1，3-氧硫杂茂烷的内酯；还原内酯得到在氧硫杂茂烷环5-位含有离去基团的各种化合物；将这些化合物在SnCl₄存在下与甲硅烷化的5-氟胞嘧啶偶合，形成FTCβ-异构体；并且任意地除去保护基。实施例1 (±)-β- D，L-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷的制备

FTC外消旋混合物的制备方法已在图2中示出，下面详细描述。2-丁烯-1，4-二醇的保护

在一个干燥的，2L，三颈烧瓶中，在惰性气体中，将100g(93.5ml＝1.135mol＝1.00eq)的2-丁烯-1，4-二醇和15g(约0.1eq.)的DMAP(4-二甲氨基吡啶)溶解在800ml无水吡啶电搅拌同时冷却到0℃。然后将丁酰氯(260ml＝2.2eq)慢慢加入，防止过热，使其搅拌1小时。用少量冰水骤冷反应液。将液体从盐中倾析，并真空蒸发。将余下的盐溶解在水中，并用乙酸乙酯萃取水溶液两次。合并其它几层用饱和CuSO₄洗涤一次，用含有Norit^的饱和NaHCO₃洗涤两次，然后用硅藻土^插塞真空过滤。

将浓的反应混合物溶解在乙醚中，接着用同上述洗涤盐溶液的相同方法洗涤。

合并有机层，用旋转蒸发浓缩，然后在真空下放置。这个反应是一般非常接近于定量的反应。根据需要，可以很容易地增加规模。产品，1，4-二丁酰基-2-丁烯-1，4-二醇是一种无色到淡黄色透明液体。

被保护的二醇的臭氧分解

在一个装有一个大干燥管和一个为引入气体的开口管的，于燥的，5L三颈瓶中将1，4-二丁酰基-2-丁烯-1，4-二醇(1.365mol)溶解在4L无水CH₂Cl₂中。该管最好不是烧结玻璃的，否则气泡管将塞阻暴露出浓溶液。将该溶液搅拌并冷却至-78℃，同时将隋性气体鼓泡通过该溶液。当溶液已经足够冷时立刻关闭进气口，并将烧瓶和搅拌器移至臭氧发生器。将氧气鼓泡通过搅拌着的溶液至少20分钟，同时保持冰浴。对于这个长时间反应，低温冷却利于保持低的温度。然后在8-8.5psi引入臭氧。完成之后，关闭臭氧。在加入3当量Me₂S之前将氧气鼓泡通过溶液约半小时。从冷却浴中移出烧瓶，转移到通风橱中搅拌约2天，以使其完全还原。蒸发溶液并在真空中放置几小时。

这个反应一般产生约95％的被保护的醛(2-丁酰氧乙醛)，无色到黄色的透明液体。用巯基乙酸将乙醛环化

在装有一个Dean Stark-型汽水阀的烧瓶中，将乙醛(1.0当量)溶解在甲苯中，以提供0.80-0.85M的溶液。加入巯基乙酸(1.1当量)，并将混合物加热到回流。将水共沸地经过汽水阀除去。反应在3小时后完成，并使其冷却到室温。用等体积的饱和NaHCO₃水溶液洗涤有机溶液两次，再用水洗一次。用MgSO₄和Norit干燥，在真空蒸发之前用硅藻土真空过滤。反回来再用乙醚萃取第一次NaHCO₃洗液；用水洗醚液一次，用MgSO₄和Norit^干燥，用硅藻土^真空过滤与从甲苯溶液中蒸出另一个有机物质一起蒸发，合并上述物质，真空放置过夜。

这个反应一般提供产率90％的2-(丁酰氧)-甲基-5-氧代-1，3-氧硫杂茂烷。内酯的还原和乙酸酯的转化

在一个装有机械搅拌和保持惰性气体气氛的干燥的三颈烧瓶中，将2-丁酰氧-甲基-5-氧代-1，3-氧硫杂茂烷(1.00当量)溶解在无水THF中，以得到0.23M溶液。在经过套管加入1.1当量的1.0MLi(叔-BuO)₃AlH的THF之前，搅拌溶液并冷却至0℃。用2∶1乙醚/己烷溶剂系统和茴香醛着色剂通过TLC表明还原约3小时完成。

然后加入约10当量新蒸馏的Ac₂O，并使其搅拌2天，得到乙酰化产品。通过加入泡和NaHCO₃使反应骤冷，搅拌过夜。然后蒸发并加另外NaHCO₃一起搅拌该溶液过夜。该溶液用乙醚萃取，用饱和NaHCO₃洗涤(小心地)两次，用水洗涤一次，用MgSO₄和Norit^干燥，用硅藻土^真空过滤并蒸发。产品为暗黄色的透明液体。气相色谱(Init.T-80℃；Init.时间＝5分钟升温率-10°/分钟；最终T＝240℃)表明其纯度一般约为70％。5-氟胞嘧啶的甲硅烷基化

将5-氟胞嘧啶(1.05当量，依据在前面步骤中用GC显示的纯度，基于所获得的乙酰化邻位羟基内醚的量)通过在至少10当量含有催化量的纯硫酸铵(0.05-0.10当量)的六甲基二硅氮烷中回流，在溶液变透明后2小时进行甲硅烷基化。然后密封烧瓶用带有辅助阱的真空泵除去溶剂。产品为白色固体，在真空下放置过夜直至准备用于以下偶合反应。用乙酰化邻位羟基内醚偶合甲硅烷基化的5-氟胞嘧啶

在氮气氛下，在SnCl₄溶液(135.6ml，1molCH₂Cl₂的溶液)中加入甲硅烷基化的5-氟胞嘧啶(33.86g，0.124mol)在室温下将溶液搅拌15分钟。在氮气氛下，在30分钟内，将上述溶液经插管加到乙酸乳酯(38g，0.113mol)的二氯甲烷(400ml)中。将反应溶液搅拌2小时，通过TLC确定反应完成的时刻用二氯甲烷(500ml)稀释反应溶液并用氢氧化铵溶液使其骤冷。慢慢加入氢氧化铵溶液(100ml)使反应温度保持在30℃以下，结果生成一种白色沉淀。

将混合物再搅拌30分钟，然后通过硅胶填充柱(直径7英寸高5英寸)，依次用二氯甲烷(2L)，乙酸乙酯(2L)和乙酸乙酯∶乙醇(9∶1)(4L)洗脱。在乙酸乙酯和乙酸乙酯∶乙醇洗脱液中含有所需产品。合并这些溶液后减压蒸发。然后用无水乙醚(200ml)洗涤剩余粘稠固体，得到一种白色固体(25.35g；71％)，FTC-5’-丁酸酯。

将FTC-5’-丁酸酯(8.74g，0.026mol)溶解在250ml甲醇中。在室温加入甲醇钠(2.85g，0.052mol)。将反应液搅拌1小时，通过TLC确定反应完成时刻。加入NH₄Cl溶液(10ml)以使反应骤冷，然后减压除去溶剂。在硅胶(5g)上吸收残余物，并通过一个小柱子，用乙酸乙酯∶乙醇(9∶1)作为洗脱剂。合并含有产品的分离液，并蒸发得到粘稠固体，用无水乙醚洗涤得到白色固体FTC(6.00g，88％)。(¹ HNMR：(DMSO-d⁶)8.18(1H，d，H₆，J＝8.4Hz)，7.81&7.57(2H，宽，NH₂)，6.12(1H，dd，H₁，J＝5.7&4.2Hz)，5.40(1H，t，OH，J＝5.7H_z)，5.17(1H，t，1H₄，J＝3-6Hz)，3.74(2H，m，2H₅，)，3.41(1H，dd，1H₂′，J＝5.7&11.7Hz，3.11(1H，dd，1H₂′，J＝4.2&11.7Hz)；¹³ CNMR：(DMSO-d⁶)157.85(d，J＝13.4Hz)，153.28，136.12(d，J＝241Hz)，126.01(d，J＝32.6Hz)，86.90，86.84，62.48，37.07；mp195-196℃。

这里提供了一种拆分核苷对映体外消旋混合物的方法，该混合物包括但并不限于FTC的(+)和(-)对映体。该方法也能够用于拆分糖类或类糖部分的外消旋混合物，如1，3-氧硫杂茂烷和1，3-二氧代茂烷的衍生物。该方法涉及使用一种能较好地催化外消旋混合物中一种对映体进行反应的酶。根据其物理结构方面新的差异，该反应对映体可以从未反应对映体中分离。如这里所公开的，本领域的技术人员将能够选择一种对所选择的核苷对映体具有选择性的酶(或对不需要的对映体具有选择性，作为去除它的方法)，该酶可以选自下面讨论的一种酶或系统评价的其它已知酶。如这里所公开，本领域的技术人员也将知道如何改进被酶作用物，以达到希望的拆分目的。通过使用手性NMR位移试剂，旋光测定或手性HPLC，能够测定回收到的酯的旋光富集。

下面实施例进一步说明了在拆分对映体外消旋混合物中酶的用途。其它已知的外消旋混合物的拆分方法可以和这里公开的拆分方法联合使用。所有这些改进均包括在本发明范围内。

在具体实施方案中，该方法包括将核苷外消旋体混合物的C5′-羟基与酰基化合物反应得到其中核苷在酯的甲醇端的C5′-酯。然后，在给定的时间内，用一种能优先分裂或水解一种异构体而对另一异构体不发生作用的酶处理核苷C5’-酯的外消旋混合物。

该方法的一个优点在于它能够用于拆分许多核苷，包括在糖部分或碱基部分被任意取代的嘧啶和嘌呤核苷。该方法也能用于拆分在糖部分含有附加的杂原子的核苷衍生物，例如FTC和BCH-189。该方法广泛的应用性取决于这一事实，即虽然酯的甲醇部分在酶区别异构体的作用中起着一定作用，但这些酶主要的识别位置是在酯的羧酸部分。进一步说，人们能够很好地从一种酶/被酶作用物研究的结果推断另一种看起来相异的系统，只要两种被酶作用物的羧酸部分相同或基本相似。

该方法的另一优点在于它具有区域选择性。典型用于水解酯的酶并不催化分子其它部分的其它反应。例如，脂肪酶催化2-羟基甲基-5-氧-1，3-氧硫杂茂烷酯的水解，但并不水解内酯。这与一般的酯水解化学方法形成鲜明的对比。

该方法进一步的一个优点在于将未水解对映体和已水解对映体从反应混合物中分离出来非常简单。未水解对映体比已水解对映体具有较好的亲脂性，因此可以通过用众多非极性有机溶剂中的一种或其混合物进行简单的萃取将其有效地回收，非极性有机溶剂包括已烷和己烷/乙醚。亲脂性较差，极性较强的水解了的对映体可以通过用一种极性较强的有机溶剂如乙酸乙酯进行萃取或冷冻干燥，然后用乙醇或甲醇萃取而得到。在水解过程中应避免使用醇，因为它能在某种条件下使酶变性。

在酶和被酶作用物的适当配合下，可以建立分离核苷对映体的条件。可以通过用一种能够水解所需对映体的酶处理外消旋混合物(然后用一种极性溶剂萃取极性水解物)或用一种能够水解不需要的对映体的酶处理外消旋混合物(然后用一种非极性溶剂将不需要的对映体除去)的方法分离得到所需要的对映体。

催化酯水解的酶包括酯酶如猪肝酯酶，脂肪酶包括猪胰脂肪酶和Amano PS-800脂肪酶，枯草杆菌蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶。

图3是碱性磷酸酯酶和蛇毒液磷酸二酯酶对FTC的(+)和(-)对映体特性流程图。如表所示，碱性磷酸酯酶将两个对映体的三磷酸酯水解成FTC，因此它不是一种有效的分离方法。磷酸二酯酶I优先将FTC的(+)-异构体水解为其单酯，然后该单酯与5′-核苷酸酶接触得到(+)-FTC。

用于酯化核苷C5′-位的最有效的酰基不需通过用所选择的酶体系对一系列同系物进行评价这些不适当的实验就能确定。例如，当用丁酸酯化1，3-氧硫杂茂烷核苷时，用猪肝酯酶和Amano PS-800进行的拆分可利用其高对映选择性(S4-100％对映体过量)和相对选择性进行。猪肝酯酶优先水解FTC的(+)-对映体，Amano PS-800优先水解FTC的(-)-对映体。表1中报导的对映体过量百分比是留在处理混合物的酶中的纯化丁酸酯.的量(即在PLE中的(-)-FTC丁酸酯和在Amano PS-800中的(+)-FTC丁酸酯)。

用特殊的核苷对映体混合物和特殊的酶能够评价的酰基的非限定性的例子包括烷基羧酸和取代烷基羧基，它们可以是乙酸，丙酸，丁酸和戊酸。对于某些酶，优选使用一种具有强吸电子性的酰基化合物以通过减弱酯键使水解方便地进行。吸电性酰基的例子包括α-卤代酯，如2-氯丙酸，2-氯丁酸和2-氯戊酸。α-卤代酯是极好的脂肪酶被酶作用物。

通常可用催化量的酶在pH值接近于该酶最适宜的pH的缓冲水溶液中完成该酶催化水解。随着该反应的进行，由于释放出羧酸，pH值有所降低，应该加碱水溶液以保持pH接近酶所需的最适值。该反应的进程可以很容易地通过检查pH的变化和保持pH所需的碱量来确定。疏水酯(未水解对映体)和较高极性的醇(水解对映体)能够连续并有选择性地被审慎选择的有机溶剂从溶液中萃取出来。或者，可将要拆分的物质通过一限酶被固定在固体支持物上的柱子。

在多相条件下进行的酶催水解具有很差的可重复性。因此，优选在均相条件下进行水解。醇溶剂不是优选的，因为它们能使酶失活。通过使用非离子表面活性剂如Triton x-100能够得到均相。然而，这些表面活性剂的加入不仅有助于溶解起始物质，还可以提高产品的水溶解性。因此，虽然酶反应在加入非离子表面活性剂时比在多相条件下能更有效地进行，但却使回收的起始物质和产品的分离更加困难。产品可以用合适的层析和化学(如有选择的盐的形式)技术分离。二酰化核苷可以使用，但它们常常具有很好的亲脂性而很难溶于所用介质中。

实施例2：FTC酯的对映选择性脂肪酶催化水解

许多FTC 5′-O-酰基衍生物是通过±)-FTC N-盐酸盐的选择性O-酰化制得的(见表1和图4)。在此已经检查了脂肪酶对这些衍生物水解的效应。如表1所示，猪肝酯酶(PLE)对FTC(+)-对映体酯的水解显示了高水平的选择性，在HPLC-分析的混合物中主要剩下(-)-FTC丁酸酯。相反，PS-800优先水解FTC(-)-对映体的酯，在HPLC-分析的混合物中主要剩下(+)-FTC丁酸酯。同时也发现水解的速度取决于酰基的性质；乙酰基衍生物明显慢于丁酰基衍生物。现已发现FTC丙酸酯的水解速度甚至快于丁酸酯衍生物。回收百分数和对映体过量百分数都可用HPLC确定。尽管当使用PLE时对映选择性非常好(一般为97％e.e.或更高)，但进一步的富集仍能通过连续酶催水解反应完成，在酶催水解反应中从PLE-催化水解中得到的对映体富集丁酸酯用PS-800进行酶催水解。

表1

酯进行酶水解的效果对比被酶作用物回收％ E.E％(s.m) 用PLE水解FTC酯： (-)-FTC

(丁酸酯)乙酸酯 32.68 N.D.丙酸酯 39.87 N.D.丁酸酯 48.00 98丁酸酯 45.71 98.6用PS800水解FTC酯：

(+)-FTC

(丁酸酯)乙酸酯 73.17 N.D.丙酸酯 52.67 N.D.丁酸酯 58.34 N.D.戊酸酯 41.50 94

实施例3：通过FTC丁酸酯的对映选择性脂肪酶催化水解制备(+)和(-)FTC的方法

将(±)-FTC的5′-O-丁酸酯(0.47mmol，149mg)溶解在16ml pH为8的缓冲液：CH₃CN为4∶1的溶液中。将澄清溶液搅拌并用26mg猪肝酯酶(PLE-A)处理。反应进程由HPLC监测(图4)。20小时后(52％转化)，用2×80mlCHCl₃和80ml乙酸乙酯萃取反应混合物。将有机层萃取液合并，用无水MgSO₄干燥，过滤并通过旋转蒸发浓缩。将所得的残余物在2×1000m PTLC盘上用乙酸乙酯洗脱(二次洗脱)，分离后得到53mg(以原料为基，36％)FTC丁酸酯，经HPLC分析确定该丁酸酯具有98％对映体过量(e.e.)。然后将对映体富集丁酸酯依次用1.6ml甲醇和0.38mmol(20mg)甲醇钠处理。将所得混合物在室温下搅拌，并用HPLC监测反应过程。在30分钟内反应完全。通过旋转蒸发将溶剂除去得到白色固体的粗品(76mg)，将其在1000m PTLC上用5∶1的乙酸乙酯∶乙醇洗脱。分离得到(-)-FTC白色固体(33mg，产率82％)。FTC5′-O-乙酸酯衍生物的HPLC分析显示97％e.e.；[α](²⁰，_D)-120.5°(C＝0.88，无水乙醇)。

通过向完成的反应混合物中加HCCl₃(它也可使酶变性)，在真空下汽提溶剂然后用HCCl₃萃取来避免在操作过程中出现乳浊液。

类似地，将1.2mmol(375mg)的(±)-FTC5′-O-丁酸酯溶解在40ml 4∶1 pH8缓冲溶液-CH₃CN中。将澄清溶液搅拌并用58mg猪肝酯酶(PLE-A)处理。反应过程由HPLC监测。90分钟后(38％转化)，将反应混合物加入150mlCHCl₃中。将层分开并将水溶液层冷冻干燥以除去溶剂。将冷冻干燥后得到的白色残余物用3×10ml无水乙醇萃取。将萃取液过滤，合并并真空浓缩得到的179mg油状物粗品。将粗品在45×30mm的硅胶柱上先后用3×75ml乙酸乙酯和5∶1的乙酸乙酯-乙醇洗脱。分离得到(+)-FTC白色固体(109mg，根据起始丁酸酯计算产率为37％)。(+)-FTC的5′-O-乙酸酯衍生物的HPLC分析显示97.4％e.e.；[α](²⁰，_D)+113.4°(C＝2.53；无水乙醇)。

用0.12mmol(37mg)FTC5′-O-丁酸酯和7mg在4.0ml4∶1 pH为8的缓冲液：CH₃CN中的PS-800可以进行类似的反应。该反应显著地比用PLE-A要慢，需要74小时，59％转化。回收的丁酸酯(11.4mg，起始量的31％)通过HPLC显示94％e.e.。

在另一种实施方案中，胞苷-脱氧胞苷脱氨基酶可用于拆分2-羟甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷和其衍生物包括2-羟甲基-5-(5-氟-胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷的外消旋混合物。该酶催化胞嘧啶部分去氨基到尿嘧啶。现在发现，1，3-氧硫杂核苷的一个对映体是胞苷-脱氧胞苷脱氨基酶的较好底物。那个未转化成尿嘧啶衍生物的对映体(并因此仍然是碱性)被一种酸性溶液从溶液中萃取出来。必须很小心以避免强酸溶液(pH低于3.0)因它可使氧硫杂茂烷环裂开。

胞苷-脱氧胞苷脱氨基酶可以从鼠肝或人肝中分离出来，或从原核生物系统如E.CoLi.的重组体序列表达出来。

用胞苷-脱氧胞苷脱氨基酶拆分胞苷核苷对映体的方法能作为单独的拆分方法或与其它方法联合使用，其它的方法包括如上面所述的用酶催水解拆分5′-O-核苷酯。

上面所述用于拆分核苷对映体外消旋混合物的方法可以与其它常规的对映体拆分方法联合使用。以提高最终产品的旋光纯度。

常规的拆分方法包括许多物理和化学技术。通常最简单及最有效的技术是重结晶，它基于这样一条原则即外消旋体比相应的单个对映体更好溶解。重结晶可以在任何步骤包括在酰化化合物或最终对映体阶段进行。如果成功，这种简单的方法可以代表选择方法。

当重结晶不能得到可接受的旋光纯物质时，可以用其它方法。如果核苷是碱性的(例如胞苷)，可以用能形成非对映体混合物的手性酸，此非对映混合物具有明显不同的溶解性。手性酸的非限定性例子包括苹果酸，扁桃酸，二苯甲酰基酒石酸，3-溴樟脑-8-磺酸，10-樟脑磺酸及二-对甲苯酰基酒石酸。类似地，用手性酸衍生物进行的游离羟基的酰化也可导致形成物理性质差别很大因而可以分离开的非对映体混合物。

小量的对映体富集核苷可通过将外消旋混合物通过一根为手性分离设计的HPLC柱而得到或纯化，该柱包括由Rainin公司销售的环糊精键合柱。

实施例4：由HPLC分离核苷外消旋混合物

(±)-FTC C4′-对映体的拆分可以用一根从Rainin公司(Woburn，Ma)得到的手性环糊精键合(环键合AC-I)柱来进行。条件如下：Isocratic 0.5％甲醇水溶液流速1ml/min.，在262nm UV检测。从J.T.Baker(Phillipsburg，NJ)得到HPLC级甲醇。将外消旋混合物注射进去并收集馏分。集中含单一对映体的馏分，冷冻然后冷冻干燥。化合物通过UV光谱及其HPLC保留时间来鉴定。通常，(-)-对映体比(+)-对映体具有较短的保留时间(参见 J.Liquid Chromatography7：353-376，1984)。化合物的浓度由UV光谱测定，用已知浓度(15μM)的标准水溶液进行生物学评价。每种对映体的保留时间列于表2。

表2

FTC对映体的保留时间化合物 R₁(min)(-)-FTC 8.3(+)-FTC 8.7

实施例5 用手性柱分离FTC对映体的另一种方法

用一根环键合I-AC柱(5μm，25cm×4.6mm，Rainin公司，Woburn，MA，类号AST-41049)，流速为0.6ml/min的0.5％恒溶剂成分的甲醇(Fisher Scientific，Inc.HPLC级，类号A-452-4，在水中)，在262nm处进行UV检测，FTC对映体的保留时间分别是12.68分钟((-)-FTC)和13.20分钟((+)-FTC)。

用一根Chiralpak AS柱(10μm，25cm×4.6cm，J.T.Baker，Inc.Phiili sburg，NJ，类号7406-00，序号09-29-10320)，流速为0.8ml/min的异丙醇(HPLC级，fisher Scientific，Inc.，类号A-451-4)，在262nm处进行UV检测，FTC对映体的保留时间分别是5.9分钟((-)-FTC)和9.8分钟((+)-FTC)。

通常，理想的情况是：第一步先筛选大量核苷外消旋混合物以确定哪一个可进一步拆分成对映体富集组分并进行进一步的抗病毒活性评价。核苷抑制HIV的能力可通过许多试验技术来测定。这里所用的技术(下面详细加以描述)能测定对植物血球凝集素(PHA)中病毒复制的抑制作用，其中植物血球凝集素能刺激感染HIV-1(LAV链)的人体外周血液单核(PBM)细胞。产生的病毒量能通过测量病毒编码逆转录酶素确定。所产生的酶的量与产生的病毒量成比例。表3提供了许多(±)-1，3-氧硫杂茂烷和核苷的EC₅₀值(抑制PBM细胞中50％病毒复制的核苷的浓度，估计10％误差率)和IC₅₀值(抑制促细胞分裂剂刺激的未感染人体PBM细胞中的50％生长的核苷浓度)。

实施例6 (±)-1，3-氧硫杂茂烷核苷的抗HIV活性

A、将从肝炎B和HVI-1血消阴性健康供体得到的三天龄植物血球凝集素刺激的PBM细胞(10⁶细胞/ml)感染浓度约为每ml50％组织培养感染剂量(TICD50)100倍的HIV-1(LAV链)，并将其在有或没有各种浓度的抗病毒化合物存在的情况下培养。

B、大约感染1小时后，将介质在有受试化合物(在介质中二倍于最终浓度)或没有的情况下加入烧瓶中(5ml，最终体积10ml)AZT用作阳性对照。

C、将细胞与病毒(约2×10⁵dpm/ml，用逆转录酶分析加以确定)接触并置于CO₂恒温箱中。从Atlanta，Georgia的疾病控制中心得到HIV-1(LAV链)。用于培养PBM细胞，获得病毒和测定逆转录酶活性的方法如McDougal等人( J.Immun.Meth.76，171-183，1985)和Spira等人(J.Clin.Meth.25，97-99，1987)所描述，只是两性霉素B不包括在介质中(参见Schinazi等人著 Antimicrob.Agents Chemother.32，1784-1787(1988)；Id.，34：1061-1067(1990))。

D、第6天，将细胞和上消液转移到15ml试管中并在约900g下离心10分钟。除去5ml上清液并将病毒在40000rpm下离心30分钟(Beckman70.1Ti旋度)而浓缩。将增溶了的病毒丸进行逆转录酶水平的测定。结果用dpm/ml样品上清液表示。来自较小体积上清液(1ml)的病毒在增溶和确定逆转录酶水平前可以离心浓缩。

半数有效(EC₅₀)浓度可用半数有效方法( Antimicrob.Agents Chemother.30，491-498(1986))来确定。简单地说，病毒抑制的百分数(由逆转录酶的测定方法来确定)是相对于化合物微摩尔浓度测定的。EC₅₀是化合物抑制50％的病毒生长的浓度。

E、将促细胞分裂剂刺激的未感染人体PBM细胞(3.8×10⁵个细胞/ml)在有和无药物存在下，在类似于上面描述的用于抗病毒分析的条件下进行培养。6天后，用血球计数器和锥虫蓝排除法计算细胞，如Schinazi等人著 Antimicrobial Agents and Chemotherapy，22(3)，499(1982)所描述。IC₅₀是抑制50％的正常细胞生长的化合物浓度。

表3

人体PBM细胞中1，3-氧硫杂茂烷核苷的

各种类似物的EC₅₀和IC₅₀

抗病毒胞毒性代码 X或Y R EC 50 ，μM IC ₅₀ ，μmDLS-009 X＝0 H ＞100 ＞100DLS-010 X＝0 Me 64.4 ＞100DLS-027 X＝0 F ＞100 ＞100DLS-028 X＝0 Cl 60.8 ＞100DLS-044 X＝0 Br ＞100 ＞100DLS-029 X＝0 I ＞100 ＞100DLS-020 Y＝NH₂ H 0.02 ＞100DLS-011 Y＝NH₂ Me ＞10 ＞100DLS-022 Y＝NH₂ F 0.01 ＞100DLS-023 Y＝NH₂ Cl 38.7 ＞100DLS-021 Y＝NH₂ Br 77.4 ＞100DLS-026 Y＝NH₂ I 0.72 ＞100DLS-058(-) Y＝NH₂ F 0.008 ＞100DLS-059(+) Y＝NH₂ F 0.84 ＞100DLS-053 Y＝NH₂ CF₃ 60.7 ＞100或

如表3所示，通常，取代的胞嘧啶1，3-氧硫杂茂烷核苷比相应的尿嘧啶核苷具有更高的活性。在EC₅₀和IC₅₀的测定中误差约为±10％。

(±)-FTC中的一个化合物(指“DLS-022”，化合物8)不仅具有优越的活性(PBM细胞中约10nm)而且具有相当低的毒性(＞100μM，在PBM，Vero和CEM细胞中)。进一步说，FTC的(-)-对映体(DLS-058)比外消旋混合物具有明显强的活性。

(±)-FTC的IC₅₀大于100μM，它表明该化合物在未感染PBM细胞中浓度达到100μM仍不具有毒性。

实施例7 由HPLC拆分的FTC对映体的抗病毒活性

用实施例4的方法将FTC对映体分离，并用实施例6的方法评价抗病毒活性。结果列于表4中，并在图5中加以说明。

表4

FTC(+)和(-)对映体的抗病毒活性

处理浓度 DPM/ml 抑制％ EC₅₀：μM

μm (修正后)FTC(±) 0.0001 73,755 26.6 0.018

0.005 83,005 16.3

0.01 60,465 41.3

0.05 34,120 70.4

0.1 14,160 92.4

0.5 18,095 88.1

1 7,555 99.7

5 7,940 99.3

10 5,810 101.7FTC(-) 0.001 76,275 23.8 0.02

0.005 58,590 43.3

0.01 75,350 24.8

0.05 28,890 76.2

0.1 13,175 93.5

0.5 9,485 97.6FTC(+) 0.001 94,340 3.8 0.28

0.005 107,430 -10.6

0.01 99,465 -1.8

0.05 87,120 11.8

0.1 86,340 12.7

0.5 33,225 71.4

如表4所示，在该试验中FTC(-)-对映体比(+)-FTC对映体强约一个数量级，与外消旋混合物具有几乎相同的抗-HIV活性。无论是对映体还是外消旋混合物，在人体PBM细胞中如锥虫蓝排除法所测定的那样直到100μM才具有毒性。

实施例8 由实施例3的方法拆分的FTC对映体的抗病毒活性

(±)-FTC的对映体可由实施例3的方法进行拆分，其抗病毒活性由实施例6的方法评价。结果在图6中说明。如图6所示，FTC外消旋混合物的EC₅₀为0.017μM，(-)-FTC的EC₅₀为0.0077μM，(+)-FTC的EC₅₀为0.84μM。

实施例9 人体PBM细胞对(±)-FTC的吸收

用放射标记的FTC进行该研究以追踪细胞内检测到的母体药和代谢物的细胞内模型。所有的研究均以两份进行。将人体外周血液单核细胞(PBM细胞)悬浮在含10％胎牛血清和抗生素的RPMI1640介质中(2×10⁶细胞/ml)每个时间点10ml，并加入10μMFTC进行培养(特殊活性约700dpm/pmol)。细胞与药物接触2，6，12及24小时。在这些时间点，除去介质并用冷的Hank平衡盐溶液洗涤两次。加入0.2ml 60％冷甲醇/水进行萃取并在-70℃储存过夜。第二天早晨，将悬浮液在-70℃，0.5小时内离心并萃取二次。将所有上清液(0.6ml)冷冻于燥至于。将残余物再次悬浮在250μl水中并将50和100μl之间的等分试样进行HPLC分析。由HPLC对细胞内母体药和代谢衍生物定量。由于某些化合物的潜在的酸不稳定性，需使用一种接近于生理pH的缓冲系统以分离代谢物。

图7是在人体PBM细胞中氚化(±)-FTC(两种测定的平均)出现(吸收)的时间(小时)与pmol/10⁶细胞的关系图。吸收情况的研究表明放射标记的FTC很容易被人体淋巴细胞吸收，它可以产生很大量的FTC5′-三磷酸酯衍生物。

实施例10在各种细胞系中FTC的抗逆病毒活性

用与实施例6中相似但并不相同的方法来测定在一系列细胞系中FTC的抗逆病毒活性。细胞系从人供体，AIDS Research和Reference Reagent Program，NIH，Rockville，Maryland，ATCC或红十字得到。CEM胸苷激酶缺乏的细胞可以在5-溴-2′-脱氧尿嘧啶的存在下，由CEM细胞的连续病原体的培育得到。结果列于表5中。

表5在不同的细胞系统中FTC抗逆病毒活性

细胞系统 EC₅₀(μM)

(病毒链) (±)-FTC

HIV-1

PBMC(LAV-1) 0.027

MT2(HTLV_IIIB) 0.89

CEM(LAV-1) 0.08

CEM-TK^(-)(LAV-1) 0.026

CEM(HTLV_JIIIB)NIH 0.09

HIV-2

PBMC(ROD2) 0.0038(±)-FTC

0.0007(-)-FTC

0.026(+)-FTC

SIV

AA-2(SIV251) 4.6

C-8166(SIV251) ＜8.0

FIV

CrFK(61E) ≤1

实施例11：来自人体PBM细胞的(±)-FTC

在介质中与药物培养24小时后，用放射标记的FTC进行该研究以追踪细胞内检测到的母体药和代谢物的细胞内模型，然后除去药物。该研究测定了使细胞内三磷酸酯水平降低所需的时间。该研究重复进行。将未感染的细胞(2×10⁶ml)悬浮在用血清补充(每个时间点10ml)的介质中并在37℃下于5％CO₂的恒温箱中培养。放射标记的FTC的浓度是10μM。将细胞用标记化合物脉冲24小时后，将细胞充分洗涤，然后用新鲜介质在无抗病毒药的存在下填充(0小时)。在0，2，4，6，12，24和48小时(第二次培养时间)时，除去细胞，并立刻用60％冷甲醇/水萃取。离心得到萃取液并除去细胞丸。将萃取液冷冻干燥然后在-70℃下储存。分析前，将物质再次悬浮在250微升HPLC缓冲液中并立即分析。通过HPLC，用粉粒学或HewlettPackard模型1090PHLC系统与一根阴离子交换Partisil 10 SAX柱(Whatman公司)，在1ml/min的流速，1Kpsi压力下，在262nm进行UV检测的情况下进行细胞内母体药和代谢衍生物的定量。流动相包括去离子化水(A)，2mM NaH₂PO₄/16mM NaOAc(pH＝6.6)(B)，15mM NaH₂PO₄/120.2mM NaOAc(pH＝6.6)(C)和100mM NaH₂PO₄/800mM NaOAc(pH＝6.6)(D)。

分离方法：用A isocratic5分钟，再进行15分钟线性梯度变化到100％B，接着进行20分钟线性梯度变化到100％C，接着进行10分钟线性梯度变化到100％D，然后用100％D进行30分钟isocratic。

在人体细胞中的保留时间(分钟)化合物未变单磷酸酯二磷酸酯三磷酸酯(±)-FTC 5.0 39.0 55.0 68.0

图8是药物除去数小时后测得的从人体PBM细胞得到的放射标记的(±)-FTC与浓度(Pmol/10⁶细胞)的关系图。如图中所示，FTC-三磷酸酯的细胞内半衰期约为12小时，它们可以在1-5μM浓度下在细胞外药物除去48小时后很容易地在细胞内检测到，对化合物来说这远高于EC₅₀。进一步说，使用HIVRT，(±)-FTC三磷酸酯的亲和力(K¹)为0.2μM，它低于48小时浓度水平。

实施例12 药物上可接受的(±)-FTC衍生物的抗-HIV活性。

a、使用与实施6中描述的相似方法，可以对由5’和N⁴位衍生制的许多药物上可以接受的(±)-FTC衍生物进行PBM细胞抗-HIV活性的评价，结果如下。(±)-FTC5’-O-丁酸酯的EC₅₀为0.0017。(±)-FTC N⁴-乙酰基衍生物的EC₅₀为0.0028。(±)-FTC5’-O-丁酸酯，N⁴酯的EC₅₀为0.0058。

b、在MT4系统中(±)-FTC5′-O-丁酸酯的抗-HIV活性(EC₅₀)为0.04μM。在同样的分析中，未酰化的(±)-FTC的IC₅₀为0.52μM。在该系统中AZT的IC₅₀为0.09μM。

实施例13 在2.2.15细胞培养中对FTC的(+)和(-)对映体活性的评价

对FTC对映体在2.2.15细胞培养(由肝炎病毒粒子转化成HepG2细胞)中抑制病毒生长的能力在下面详细加以描述。

在该培养体系中对抗病毒效果分析的总结和描述以及对HBV DNA的分析已经有所描述(korba和Milman，1991， Antiviral Res.15：217)。抗病毒的评价在细胞的两个不同病原体培养物中进行。在所有盘上的所有阱中以相同密度同时接种。

由于细胞内和细胞外的HBV DNA水平固有的不同，只有比未处理细胞中HBV DNA体的平均水平降低3.5倍(对HBV病毒粒子DNA)或3倍(对HBV DNA复制中间体)以上才被认为具有统计学意义[P＜0.05]。在每个细胞DNA制备中整合进去的HBV DNA的水平(在这些试验中在每个细胞基础上它保持不变)用于计算细胞内HBV DNA体的水平，以保证在每个样品之间进行等量细胞DNA的比较。

在未处理细胞中外HBV病毒粒子DNA的值在50到150pg/ml培养介质之间(平均值约为76pg/ml)。在未处理细胞中细胞内HBV DNA复制中间体在50到100pg/μg细胞DNA之间(平均值约为74pg/μg细胞DNA)。总的来说，由于用抗病毒化合物处理引起的细胞内HBV DNA水平的下降比HBV病毒粒子DNA水平的下降更不明显且更慢发生(korha和Milman，1991， Antiviral Res.，15：217)。

这些试验的杂化分析显示每个细胞约1.0pg细胞内HBVDNA等价于2-3个染色体复制品，1.0pg/ml细胞外HBV DNA等价于3×10⁵病毒粒子/ml。

进行一些毒性分析以评价是否任何可以观察到的抗病毒效果都是由影响细胞的生活力引起的。这里所用的方法是中性红色染料吸收法，它是一种标准且广泛用于分析各种病毒宿主系统包括HSV和HIV中细胞生活力的方法。毒性分析是在96阱平底组织培养盘中进行。将用于毒性分析的细胞进行培养并用与下面抗病毒评价中所述的相同的程序用参试化合物进行处理。每种化合物在4种浓度下进行试验，每个都在三重培养基中(“A”，“B”和“C”阱)。通过中性红色染料的吸收来确定毒性的相对水平。用内在染料在510nm处的吸收(Asin)作定量分析。用未处理细胞的9个独立培养基中的Asin均值的百分数来表示该值，这些未处理细胞同受试化合物一样保持在同一个96阱盘上。5号盘上9个对照培养基中染料吸收的范围是91.6％到110.4％，6号盘是96.6％到109％。结果列于表6中。

表6

在2.2.15细胞中受试化合物的毒性分析

浓度染料吸收(对照的％)盘号化合物 (μM) 阱A 阱B 阱C5 DMSO 10.0^* 0.7 1.6 0.9

3.3 55.9 68.7 61.7

1.0 91.2 96.4 106.8

0.3 98.7 102.9 93.56 (-)-FTC 300 53.0 51.1 51.5

100 64.1 66.6 77.6

30 98.7 94.3 96.4

10 94.3 94.9 92.26 (+)-FTC 300 43.4 56.7 58.5

100 77.7 66.3 72.1

30 81.1 88.3 88.1

10 90.9 99.4 90.5

*对DMSO，浓度用原料溶液的百分数表示。

如表6所示，在用于抗病毒评价的浓度下没有观察到受试化合物具有明显的毒性(在未处理细胞中观察到的染料吸收水平降低了50％以上)。受试化合物(-)-FTC和(+)-FTC在用于毒性试验的最高浓度下(330μM)都显示出毒性。

在正常变化范围内，未处理细胞中HBV病毒粒子DNA和细胞内HBV复制中间体[HBV RI]的水平在攻击期间保持不变。在1％浓度下，DMSO不影响2.2.15细胞培养基中HBV的复制水平。

如表7所示，(-)-FTC和(+)-FTC在试验水平上都能明显地抑制HBV的复制。如表8所示，(-)-FTC在4，1和0.25μM的浓度下还能明显地抑制HBV病毒粒子DNA和细胞内HBV DNA的合成。

表7

在2.2.15细胞培养基中试验

化合物对HBV生成的影响

HBV病毒粒子DNA^* 细胞内HBV DNA

(pg/ml培养介质) (pg/μg细胞DNA)阱处理情况 0天. 4天 9天 MONO. RI.7A 未处理细胞 59 75 94 2.7 937B 未处理细胞 47 64 88 2.5 938A 未处理细胞 65 100 71 2.2 978B 未处理细胞 77 65 110 2.4 627K DMSO@1.00％ 100 50 48 1.9 957L DMSO@1.00％ 48 96 54 2.8 988K DMSO@1.00％ 93 63 68 2.2 868L DMSO@1.00％ 66 57 59 1.6 979U (-)-FTC@10μM 120 36 1 1.1 149V (-)-FTC@10μM 89 48 1 1.5 1910U (-)-FTC@10μM 58 41 0.1 1.9 1310V (-)-FTC@10μM 110 32 0.1 1.2 169W (+)-FTC@10μM 88 42 0.1 0.8 149X (+)-FTC@10μM 58 57 0.2 0.4 1910W (+)-FTC@10μM 69 55 0.1 0.7 1710X(+)-FTC@10μM 45 39 0.1 0.4 15

*对HBV病毒粒子DNA敏感性中止点是0.1pg/ml。

@将细胞内HBV DNA在处理的第9天进行24小时分析。在每个细胞DNA的制备中整合HBV DNA的水平用于计算游离基因的3.2Kb HBV染色体(MONO.)水平和HBV DNA复制中间体(RI)的水平。

表8

在2.2.15细胞培养基中试验化合物

对HBV生成的影响

HBV病毒粒子DNA^* 细胞内HBV DNA^*

(pg/ml培养介质)(pg/μg细胞DNA)阱处理情况 0天 4天 9天 MONO. RI.81A 未处理细胞 64 54 65 2.8 6531B 未处理细胞 51 54 77 2.0 5332A 未处理细胞 100 76 56 3.5 8132B 未处理细胞 53 97 83 3.1 6835A (-)-FTC@4μM 74 27 ＞0.1 1.4 135B (-)-FTC@4μM 87 28 ＞0.1 0.5 136A (-)-FTC@4μM 120 20 1 0.9 136B (-)-FTC@4μM 59 16 0.2 0.2 235C (-)-FTC@1μM 70 13 ＞0.1 1.7 235D (-)-FTC@1μM 62 15 ＞0.1 1.2 336C (-)-FTC@1μM 60 22 1 1.4 236D (-)-FTC@1μM 89 28 0.3 1.5 435E (-)-FTC@0.25μM 84 15 ＞0.1 1.5 435F (-)-FTC@0.25μM 89 16 4 2.2 436E (-)-FTC@0.25μM 66 13 1 1.8 836F (-)-FTC@0.25μM 49 19 0.1 0.3 9

*对HBV病毒粒子DNA敏感性中止点是0.1pg/ml。

+将细胞内HBV DNA在处理的第9天进行24小时分析。在每个细胞DNA的制备中整合HBV DNA的水平用于计算游离基因的3.2Kb HBV染色体(MONO.)和HBV DNA复制中间体(RI)的水平。

实施例14 人体肝细胞对(±)-FTC的吸收，FTC的HVB活性

用人体肝细胞(HePG2细胞，从ATcc得到)重复实施例9的方法以确定FTC在这些细胞中的吸收和代谢。如图9所示，(±)-FTC被HeP02细胞大量吸收。这些人体肝细胞将大部分(±)-FTC代谢成(±)-FTC三磷酸酯。

这个数据与这里提供的其它数据结合在-起表明：(±)-FTC及其(-)，(+)对映体在肝细胞中被磷酸化。这些细胞可以被肝炎B病毒转化。

实施例15：在人体HepG2细胞中FTC的存在

图10说明了细胞用10μM[³H]-(±)FTC(700DPM/Pmol)脉冲24小时后，[³H]-(±)-FTC和其磷酸化衍生物在人体HepG2中的存在情况，用Pmol/10⁶细胞对时间表示，并评价了除去后24小时内化合物的浓度。

表11说明了用10μM[³H]-(±)-FTC(700DPM/Pmol)培养24小时后，来自人体HePG2细胞中的[³H]-(±)-FTC和其磷酸化衍生物混合浓度的降低情况，用Pmol/10⁶细胞对时间的关系表示。

如表中说明的那样，甚至在48小时时细胞中仍存在1μM以上的活性化合物(对化合物而言这明显高于EC₅₀)。

实施例16 FTC对粒细胞-巨噬细胞前体细胞群体形成的影响

图12是FTC(-)和(+)对映体对粒细胞-巨噬细胞的前体细胞群体形成的影响图，用存活百分数对浓度μM来测定，(-)-FTC为空心圈；(+)-FTC为实心圈；AZT为实心方块。如图所示，在该细胞系中，FTC(-)对映体比(+)-对映体或AZT均具有较小的毒性，即具有较高的IC₅₀。

实施例17给大鼠服用后FTC的代谢物

在10，50和100mg/kg的剂量下给大鼠静脉施用(±)-FTC，并评价血浆药物浓度对时间曲线下的面积(AUC)，总清除率(CL_T)，稳态分布体积(V_ss)，平均保留时间(MRT)和半衰期(t_1/2)。结果列于表9中。

表9

给大鼠静脉注射10，50，100mg/kgFTC后的

药物动力学参数^*剂量 AUC CL_T V_ss MRT t_1/2mg/kg mg h/L L/h/kg L/kg h h10 9.65 0.988 0.758 0.768 0.75750 57.11 0.874 0.699 0.800 0.815100 120.72 0.830 0.663 0.798 0.969

*AUC＝血浆药物浓度对时间曲线下的面积；

CL＝总清除率；

V_ss＝稳态分布体积

MRT＝平均保留时间

t_1/2＝半衰期

实施例18 静脉和口服FTC后FTC的药物动力学参数

给猕猴施用(静脉(I.V.)和口服(P.O))33.3mg/kg(±)-FTC得到模型独立的药物动力学参数。结果列于表10中。值得注意的是，猴子对化合物的平均生物利用率为73％(±6％)。

表10

给猕猴静脉(I.V.)或口服(P.O.)33.3mg/kg

FTC后得到的模型独立的药物动力学参数^*猴 AUC CL_T V_ss MRT t_1/2 K_a mgFh/h/kg

L/kg h h h-1 ％I.V.RUh 19.14 1.74 2.71 1.56 1.28RMi 26.31 1.26 1.97 1.56 1.22RJd 22.51 1.48 2.00 1.36 1.47平均值 22.65 1.49 2.23 1.49 1.32±S.D. 3.59 0.24 0.42 0.12 0.13P.0.RUh 13.21 2.07 1.58 0.48 71RMi 21.11 2.32 1.08 0.43 80RJd 15.29 3.23 1.47 0.31 68平均值 16.54 2.54 1.38 0.41 73.00(±6)±S.D. 4.09 0.61 0.26 0.09 6.24

AUC＝血浆药物浓度对时间曲线下面的面积；

CL＝总清除率；

V_ss＝稳态分布体积；

MRT＝平均保留时间；

t_1/2＝半衰期；

F＝生物利用率；

K_a＝第一吸收速度常数。

表11

处理1小时后FTC及其去氨基代谢物的

CSF/血清比率猴途径 FTC 代谢物(FTU)RUh I.V. 0.076 0.024RMi I.V. 0.062 0.032RJd I.V. 0.162 0.052平均值 0.100 0.036±S.D. 0.054 0.014RUh P.O. 0.048 0.026RMi P.O. 0.039 0.037RJd P.O. 0.117 0.055平均值 0.068 0.039±S.D. 0.043 0.015

实施例19 猕猴中FTC及其代谢物的CSF/血清比率

通过给猕猴服用33.3mg/kg活性化合物并在服药后1小时内测量大脑脊髓液(CSF)和血清中(±)-FTC的量来评价(±)-FTC穿过血脑屏障的能力。结果列于表11中。数字表明在该哺乳动物中大量活性化合物穿过血脑屏障。

患有HIV或HBV感染性疾病的患者可通过服用有效量的(±)-FTC，其(-)或(+)对映体或药物上可接受的衍生物或其盐在有药物上可接受的载体或稀释剂存在下进行治疗。活性物质可通过任何合适的途径以液体或固体的形式施用，例如口服，非肠道，静脉，肌肉，皮下或局部施用。

活性化合物包括药物上可接受的载体或稀释剂，以治疗有效量的化合物提供给患者以抑制病毒在体内的复制，特别是HIV和HBV的复制，同时对服药患者不引起严重的毒性作用。“抑制量”是指发挥抑制作用足够的活性成份的量，该抑制作用例如由这里描述的一种方法来测定。

对上面提到的所有情况，(-)，(+)或(±)-FTC的优选剂量为每天约1到50mg/kg，优选1到20mg/kg体重，更为常用的是每天每千克体重要0.1到约100mg。药物上可接受衍生物的有效剂量范围根据释放出母体核苷的重量来计算。如果衍生物本身具有活性，有效剂量则可用衍生物的重量如上所述那样来估计，或用本领域技术人员公知的其他方法来估计。

该化合物可以以任何合适的剂型单位方便地施用，包括但并不限于每单位剂型含7到3000mg，优选70到1400mg活性组分。50-1000mg的口服剂量是合适的。

理想的情况是，施用的活性组分能达到活性化合物的血浆峰浓度，即从约0.2到70μM，优选约1.0到10μM。这是可以达到的，如通过静脉注射0.1到5％的活性化合物或任意盐溶液，或服用活性组份的大丸药。

药物组合物中活性化合物的浓度依赖于药物的吸收，去活性和排泄速度以及本领域技术人员已知的其它因素。需要注意的是剂量值也随着需缓解状况的严重程度而有所变化。需要进一步理解的是对于特殊的情况，特殊的剂量规定应该按照个人的需要和施用或监督服用该组合物的人的专门判断，通过一定的时间加以调整，并且这里提出的浓度范围仅作示范并不限制权利要求组合物的范围或实施。活性组分可以一次服用，或分成许多较小的剂量在不同的时间间隔内服用。

活性化合物优选的施用方式是口服。口服组合物通常包括一种惰性稀释剂或可食用的载体。可以将它们封闭在胶囊中或压成片剂。为了治疗上口服的目的，活性化合物可以和赋形剂结合并以片剂，锭剂或胶囊的形式使用。药学上可容的凝固剂和/或辅助物质也作为组合物的组成部分。

片剂，丸剂，胶囊，锭剂等等包含下面任何组份或具有相似性质的化合物：凝固剂如微结晶纤维素，黄蓍树胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如藻酸，Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；滑剂如胶体二氧化硅，加甜剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷，水杨酸甲酯或桔味剂。当单位剂型是胶囊时，它除了包含上面各类物质外还包含液体载体如脂肪油。此外，单位剂型可以包含改良单位剂型物理形状的其它物质如糖衣，紫胶片或其它肠剂。

(±)-FTC，其(-)或(+)对映体或其药物上可接受的盐可作为酏剂，悬浮液，糖浆，糯米纸囊剂，口香胶囊等的组份服用。糖浆除了包含活性化合物外还包含蔗糖作为加甜剂和某些防腐剂，染料和着色剂及调味剂。

(±)-FTC，其(-)或(+)对映体或其药物上可接受的衍生物或盐也可以和其它不削弱所需作用的活性物质混合，或与具有增补所需作用的物质混合，如抗生素，抗真菌剂，消炎剂或其它抗病毒剂，包括其它核苷抗HIV化合物。

用于非肠道，肌内，皮下或局部施用的溶液或悬浮液包括下列成份：用于注射的无菌稀释剂如水，盐水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苄基醇或对羟基苯甲酸甲酯，抗氧剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节强度的试剂如氯化钠或右旋糖。非肠道制剂可以密封在由玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多剂量管瓶中。

如果是静脉给药，优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水液(PBS)。

在优选实施方案中，将活性化合物与载体一起制备，这将保护该化合物免子从身体内快速消除，作为可控释放剂型它包括移植物和微囊包封系统。可以使用生物降解，生物相溶聚合物如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚甘醇酸，胶原蛋白，聚原酸酯和聚乙酸。这些剂型的制备方法对本领域技术人员来讲是显而易见的。在商业上这些物质也可以从Alza Corporation和NovaPharmaccuticals，Inc.得到。

脂质体悬浮液(包括脂质体，该脂质体带有相对于病毒抗原的单克隆抗体以对准感染细胞)也是优选的药物学上可接受的载体。它们可以按照本领域技术人员公知的方法制备，例如美国专利4522811中所描述的方法(这里，该专利作为参考，全文加以收编)。例如，脂质体剂型可制备如下：将合适的脂(类)(例如硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，硬脂酰基磷脂酰胆碱，arachadoyl磷脂酰胆碱和胆甾醇)溶解在无机溶剂中，然后将其蒸发，在容器的表面盖一薄层干脂。然后将活性化合物或其单磷酸酯，二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液引入容器中。然后用手使容器旋转直至脂从容器侧面游离且脂聚集体分散为止，这样就形成了脂质体悬浮液。

FTC的单，双及三磷酸酯可按如下所述方法制备。

单磷酸酯可按Imai等人著 J.Org.Chem.，34(6)，1547-1550(1969年6月)的方法制备。例如，在约0℃并搅拌的情况下，将约100mg FTC和约280μl的磷酰氯在约8ml无水乙酸乙酯中反应约4小时。将反应物用冰骤冷。水相在一根活性碳柱上纯化，用在1∶1乙醇和水的混合物中的5％氢氧化铵洗脱。蒸发洗脱剂得到FTC-5′-单磷酸铵。

二磷酸酯可按Davisson等人著 J.Org.Chem.，52(9)，1794-1801(1987)的方法制备。FTC二磷酸酯可由相应的甲苯磺酸酯制得，相应的甲苯磺酸酯可将核苷与甲苯磺酰氯在吡啶中于室温下反应约24小时制得，按常规方法处理产品(即将其洗涤，干燥并结晶)。

三磷酸酯可按Hoard等人著 J.Am.chem Soc.，87(8)，1785-1788(1965)的方法制备。将FTC活化(制成咪唑烷，按本领域技术人员公知的方法)并用在DMF中的三丁基焦磷酸铵处理。该反应主要得到核苷的三磷酸酯，还有一些未反应的单磷酸酯和二磷酸酯。用DEAE柱的阴离子交换层析将其纯化，然后分离出三磷酸酯，例如四钠盐。

本发明已对其优选的具体实施方案做了详述。从本发明前面的详细描述中本领域的技术人员可以很明显地看到本发明的各种变化和改良。所有这些变化和改良都包括在附加的权利要求范围内。

Claims

1.核苷对映体的外消旋混合物的拆分方法，该方法包括将外消旋混合物暴露在一种酶中，该酶优选催化对映体之一的一个反应。

2.权利要求1的方法，其中酶选自酯酶，脂酶，枯草杆菌蛋白酶α-胰凝乳蛋白酶，种胞苷—脱氧胞苷脱氨基酶。

3.权利要求2的方法，其中酯酶是猪肝酯酶。

4.权利要求2的方法，其中脂酶选自猪胰脂肪酶和Amano PS-800脂酶。

5.权利要求1的方法，其中核苷对映体是在C5′-羟基位酰化的。

6.权利要求5的方法，其中对映体在拆分之前是用选自烷基羧酸和取代烷基羧酸酰化的。

7.权利要求6的方法，其中烷基羧酸选自乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，2-氯丙酸，2-氯丁酸，2-氯戊酸。

8.权利要求1的方法，其中将核苷对映体通过一个包括将酶固定在载体上的柱。

9.权利要求1的方法，其中将对映体与酶的溶液混合。

10.权利要求1的方法，进一步包括酶催化的反应是在非离子表面活性剂的存在下进行。

11.权利要求10的方法，其中非离子表面活性剂是Triton X-100。

12.权利要求1的方法，进一步包括将拆分产物暴露在第二种酶中，以增高拆分。

13.权利要求1的方法，进一步包括将拆分产物重结晶。

14.权利要求1的方法，进一步包括用一种手性酸处理拆分产物。

15.权利要求14的方法，其中手性酸选自苹果酸，扁桃酸，二苯甲酰基酒石酸，3-溴樟脑-8-磺酸，10-樟脑磺酸，和二-对-甲苯酰酒石酸。

16.权利要求1的方法，其中外消旋混合物是(±)-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷。

17.权利要求1的方法，其中外消旋混合物是(±)-2-羟基甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂茂烷。