PT100151B - 2-hidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano e seus derivados com actividade anti-viral e processo para a sua preparacao - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de Emory University, norte-americana, estabelecida em 1380 South Oxford Road, AtLan ta, Georgia 30322, Estados Unidos da América (inventores: Dennis C. Liotta, Raymond. F. Schinazi e Woo-Baeg Choi, residentes nos Estados Unidos da América), para ”2-HIDR0XI-METIIf -5- ( g-FLUORO-CITOSIN-l-íl· )-l, 3-0XATI0M0 E SEUS DERIVADOS

COM ACTIVIDADE ANTI-VIRAI E PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO”»

M.A.

Antecedentes da invenção

A presente invenção enquadra-se na área dos nucleosidos biologicamente activos e espeeificamente refere-se a composições anti-virais que incorporam o composto 2-bidroxi -metil-5-(5-fluoro-cytosin-l-il)-l,3-oxatiolano (”FTC”), seus derivados fisiologicamente aceitávda ou seus sais fisiológica mente aceitáveis e refere-se também um método para a resolução e para a utilização dos enantiómeros (-)-ji-L e (+)-^-D do composto FTC.

Em 1981 identifieou-se o síndroma da imunodeficiencia adquirida (SIDA) como sendo uma doença que afecta gra

- 1 . f A

vemente o sistema imunológico humano e a qual praticamente sem exeepção conduz á morte. Em 1983 determinou-se que a causa etiológica do SIDÁ era o vírus da imunodeficiência humana (VIH). Em Dezembro de 1990 a Organização Mundial de Saúde anunciou uma estimativa segundo a qual haveria entre 8 e 10 mi Ihões de pessoas em todo o mundo infectadas com o VIH admitin do-se que aproximadamente entre 1000000 e 1400000 eram cidadãos Norte-Americanos.

Em 1985 foi anunciado pela primeira vez que o nucleósido sintético 3’-azido-3’-desoxi-timidina (AZT) inibe a replicação do vírus da imunodeficiencia humana. Desde essa da ta têm sido investigados outros,nuçleósidos sintéticos incluin do 2’,3’-didesoxi-inosina (DDI), 2*,3’-didesoxi-cytidina (DDC), 3’-fluoro-3’-didesoxi-timidina (EDT) e 2’-3’-didesoxi-2*,3’-didesidro-timidina (D4T).os quais demonstraram ser eficazes contra o VIH. Outros 2’,3’-didesoxi-nucleósidos demonstraram ser capazes de inibir o crescimento de diversos vírus in vitro. Admite-ee que após fosforilação celular provocada pelas quinases celulares originando 5*-tniíosfato, esses nucleósidos sintéticos sejam incorporados num cordão de ADN virai em desenvolvimento provocando a terminação da cadeia devido à au senoia do grupo 3’-hidroxilo.

sucesso obtido com diversos 2’-3’-didesoxi-nu-cleósidos no sentido da inibição da replicação do VIH in vivo ou in vitro liga diversos pesquisadores a conceber e a tes, ter nuçleósidos nos quais se substitui o átomo de carbono por um heteroátomo na posição 3’ do nucleósido. Norbeek e seus co, laboradores revelaram que õ composto (+ )-!-/( 2 $,4^ )-2-(hidroxi-metil)-4-dioxolanil_7timina (designadas por (t)-dioxola no-T) exibe uma actividade modesta contra o VIH (valor ΟΕ^θ correspondente a 20 gM nas células ATH8) e revelaram também que esse composto não é tóxico para as células de controlo não infectadas para valores de concentração da ordem de 200 jpM

- 2 ί Λ

(Tetrahedron Letters 30 (46), 6246 (1989)). Α publicação do pedido de patente Europeia ns 0337713 e a patente Norte-Ameri cana n² 5041449, atribuídas a IAF Biochem International, Inc.”, revelam, 2-substituido-4-substituido-l,3-dioxolanos que exibem actividade anti-virai.

A patente Norte-Americana n^s 5047407 e a publicação do pedido de patente Europeia n^s 0382526, também atribuídas a IA? Biochem International, Inc. revelam diversos 2-subs tituido-5-substituido-l,3-oxatiolano-nucleósidos com activida de anti-viral e referem especificamente que a mistura racémica (próximo da posição 04’) do isómero 01’-^ do 2-hidroxi-me til-5-(citosin-l-il)-l,3-oxatiolano (adiante designado por (+)-B0H-189) possui uma actividade contra o VIH prátieamente igual à do composto AZT não exibindo toxicidade celular para os níveis de dosagem testados. Descobriu-se também que o composto (+)®CH-189 inibe a replicação dos VIH resistentes aõ composto AZT quando isolados in vitro obtidos a partir de pacientes que tenham sido tratados com o composto AZT durante um período de tempo superior a 6 semanas.

Outro vírus que constitui um grave problema para a saúde humana é o vírus da hepatite B (adiante designado ape nas por ”VHB”). Depois do tabaco o VHB constitui o segundo factor mais importante que origina cancro em seres humanos. 0 mecanismo segundo o qual o VHB induz o cancro não é conhecido embora se admita que possa despoletar directamente o desenvol vimento tumoral ou possa accionar indirectamente o desenvolvi mento tumoral através de inflamaçao crónica, cirrose e regene ração celular associada à infecção.

Apos decorrido um período de 2 a 6 meses de incubação durante o qual o hospedeiro não se apercebe da infecção, pode subsequentemente essa infecção de VHB originar hepatite aguda e lesões no fígado com as consequentes dores abdominais, iterícia e elevados níveis sanguíneos de algumas enzimas. 0

VHB pode provocar a hepatite fulminante, que é uma forma de doença rapidamente progressiva, frequentemente fatal, na qual são destruídas secções maciças de fígado.

Normalmente os pacientes recuperam da hepatite aguda. Todavia, em alguns pacientes, persistem no sangue níveis elevados de antígeno virai durante um período de tempo prolongado ou indefinido originando uma infecção crónica. As infecçoes crónicas podem provocar hepatite persistente crónica. Os pacientes infectados com o VHB de forma persistente e crónica eneontram-se frequentemente nos países em desenvolvimento. Por volta de meados de 1991 existiam aproximadamente 225 milhões de portadores crónicos de VHB só na Ásia e espalha dos por todo 0 mundo existiam cerca de 300 milhões de portado res. A hepatite persistente crónica pode provocar fadiga, cir rose de fígado e carcinoma hepatocelular que é uma forma primitiva de cancro do fígado.

Nos países Ocidentais industrializados os grupos de alto risco para as infecçoes com VHB englobam os grupos que estão em contacto com os portadores de VHB ou com as suas amostras de sangue. A epidemiologia do VHB é bastante idêntica à do síndroma da imunodeficiência adquirida 0 que constitui uma das razões pelas quais a infecção com VHB seja comum entre pacientes com SIDA ou com o complexo associado à SIDA. Contudo, 0 VHB é mais contagioso do que 0 VIH.

Ibi desenvolvida uma vacina derivada de soro de seres humanos com 0 objectivo de imunizar pacientes contra 0 VHB. Embora essa vacina seja eficaz, a produção dessa vacina e problemática uma vez que é limitado 0 fornecimento de soro humano proveniente de portadores crónicos e 0 procedimento de purificação é moroso e dispendioso. Alem disso, e necessário que cada lote da vacinas preparadas a partir de um soro diferente seja testado em chipanzes para garantir a sua segurança. Essas vacinas também tem sido produzidas recorrendo às tecniΛ.

eas da engenharia genética. Os tratamentos diários com o inter ferão-0(, que é uma proteína preparada por técnicas da engenharia genética, têm proporcionado também resultados promisso res. No entanto, até à data presente não é conhecido qualquer agente farmacêutico que iniba eficientemente a replicação do vírus.

Para se introduzir no mercado um nucleósido com objectivos farmacêuticos, ele deve ser eficaz não só no que diz respeito à sua fraca toxicidade como deve também estar as soeiado a baixos custos de produção. Intensas e profundas pes quisas e investigações têm incidido sobre novos e poucos dispendiosos processos para a produção de nucleósidos em grande escala. Os compostos 2’,3’-didesoxinucleósidos são actualmente preparados de acordo com qualquer um dos processos seguintes: transformação do nucleósido intacto ou condensação de um radieal açúcar transformado com uma base heterocíclica. Embora existam diversas desvantagens associadas à obtenção de novos análogos de nucleósidos através da modificação de nucleósidos intactos, existe uma vantagem essencial nesta abordagem que reside no facto de a estereoquímica absoluta adequada ter sido já estabelecida pela natureza. Todavia esta abordagem não pode ser utilizada na produção de nucleósidos que contenham eventualmente bases que ocorram de forma não natural ou que contenham radicais de hidratos de carbono que ocorram de forma não natural (e os quais por essa razão não foram preparados a partir de nucleósidos intactos) tais como os nuoleósi dos derivados de 1,3-oxatiolano e os nucleósidos derivados de

1,3-dioxolano.

Quando se efectua a condensação de um hidrato de carbono ou de um radical do tipo hidrato de carbono com uma base heterocíclica para proporcionar um nucleósido sintético, obtém-se um nucleósido que possui dois centros quiral (nas jao sições Cl’ e C4’) e que por essa razão existe sob a forma de um par diastereomérico. Cada diastereómero existe como eonjun

to de enantiómeros. Por essa razão, o produto e uma mistura de quatro enantiómeros.

Verifica-se frequentemente que os nucleósidos com esteredquímica que ocorre de forma não natural eventualmente nas posições 01’ ou 04·’ são menos activos do que os mesmos nu cleósidos cuja estereoquímica é estabelecida pela natureza. Por exemplo, Oarter e seus colaboradores revelaram que a concentração do enantiómero (-) do composto carbovir (2’,3’-dide sidro-2’,3’-didesoxi-guanosina) numa cultura celular necessária para reduzir a actividade da transcriptase inversa em 50% (ΟΕ^θ) é de 0.8 μΜ ao passo que o valor ΟΕ^θ para o enantióme ro (+) do composto carbovir é superior a 60 jaM. Antimicrobial Agents e Chemotherapy,34-s6. 1297-1300 (Junho de 1990).

A publicação Internacional PCT n^s WO 91/11186 des creve que é possível preparar nucleósidos derivados de 1,3-oxa tiolano com elevada diastereosselectividade (alta percentagem de nucleósido com uma configuração da junção do carbono da posição Cl’ à base heterocíclica)por selecção cuidadosa do ácido de Lewis utilizada no processo de condensação. Descobriu -se que a condensação de um nucleósido derivado de 1,3-oxatio lano com uma base ocorre com estereospecificidade β quase com pleta sempre que se utiliza como catalizador de condensação cloreto de estanho. Outros ácidos de lewis proporcionam fraca (ou mesmo nenhuma) selectividade em Cl’ ou simplesmente não conseguem catalizar as reacções.

Tendo em consideração o facto de o síndroma da imunodeficiência adquirida, o complexo associado à SIDA e o ví rus da hepatite B terem atingido níveis epidémicós em todo o mundo e tendo em consideração o facto de originarem efeitos trágicos no paciente infectado, concluiu-se que existe uma fortíssima necessidade de proporcionar novos agentes farmaceu ticos eficazes para o tratamento dessas doenças e os quais possuam fraca toxicidade para o hospedeiro.

Também é necessário proporcionar um método comercialmente viável, de baixo custo, para produzir nucleosidos farmaceuticamente importantes e que especificamente consigam estereospecificidade β na posição 04’ dos nucleosidos sintéti eos preparados por condensação de um radical do tipo hidrato de carbono com uma base.

Deste modo, constitui um objectivo da presente in venção proporcionar um método e uma composição para o tratamento de pacientes humanos infectados com o VIH.

Constitui outro objectivo da presente invenção proporcionar um método e uma composição para o tratamento de pacientes humanos ou de outros hospedeiros animais infectados com o VHB.

Constitui ainda outro objectivo da presente inven ção proporcionar nucleosidos derivados de 1,3-oxatiolano enri quecidos enantioméricamente.

Finalmente, constitui também objectivo da presente invenção proporcionar um método para a resolução dos enantiomeros em 04’ dos nucleosidos derivados de 1,3-oxatiolano.

Sumário da invenção

A invenção descreve um método e uma composição pa ra o tratamento de infecções provocadas pelo VIH e pelo VHB em seres humanos e noutros hospedeiros animais, o qual consis te em administrar uma quantidade eficaz de 2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-citosin-il)-l,3-oxatiolano, de um seu derivado far maceuticamente aceitável, incluindo um derivado alquilado ou acilado em 5’ ou em ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, conjuntamente com um veículo aceitável do ponto de vis ta farmacêutico.

Descobriu-se que o composto 2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-citosin-l-il)-l,3-oxatiolano (ETC”) exibe surpreenden temente uma elevada actividade contra o vírus da imunodeficiência humana com muito fraca toxicidade para as células do hospedeiro. Descobriu-se também que o composto ETC exibe uma actividade bastante significativa contra o VHB pelo que pode ser utilizado para tratar pacientes que tenham diversas doenças associadas a uma infecção de VHB.

A toxicidade e os estudos farmacocinéticos confir mam a utilidade do composto ETC como agente anti-viral para administração farmacêutica. O composto FTC e os seus enantiómeros são não tóxicos para as células da medula óssea periférica dos seres humanos segundo valores de concentração da ordem dos 5θ pM e também são não tóxicos para outras linhas celulares segundo o valor de concentração da ordem 200 pM. 0 FTG-TP constitui um metabolito intracelular essencial em CMOP e em células HepG2. 0 FTC-TP inibe competitivamente a transcriptase inversa (TI) do VIH-1 com um valor correspondente a 0.2 μΜ utilizando um percursor da matriz poli(I)oligo(dC). Recorrendo à análise de sequenciação é possível demonstrar que o FTC-TP é um poderoso terminador da cadeia do ADN sempre que se utiliza TI-VIH (terminação em 0).

tratamento crónico com ETC não e tóxico para os roedores, mesmo para doses orais correspondentes a 85 mg/kg por dia, durante pelo menos 2 meses. A farmacocinética do HG em macacos ”Resus^H sugere uma elevada biodisponibilidade oral (aproximadamente 73 + 6%) e um período de meia vida terminal no plasma de aproximadamente 1.34 +.0,18 (médias obtidas por administração oral e por administração I.V.).

Descreve-se também um processo para a resolução de uma mistura racémica de enantiómeros dos nucleósidos, e por uma mistura racémica de FTC, incluindo esse processo o

passo de exposição da mistura racémica a uma enzima que catalisa preferencialmente uma reacção num dos enantiómeros. Esse processo pode ser utilizado para a resolução de uma ampla variedade de nucleósidos, incluindo os nucleósidos pirimidina e purina os quais são facultativamente substituídos no radical hidrato de carbono ou no radical alcalino. Esse processo também pode ser utilizado para a resolução de derivados de nu cleósidos que contenham heteroátomos adicionais no radical hi drato de carbono, por exemplo, (+)-ETC e (+)-BCH-189· A resolução dos nucleósidos pode ser efeotuada em grande escala a custos reduzidos.

Utilizando os métodos agora descritos efectuou-se a resolução do ETC nos seus enantiómeros (+)-^-D e (-)-β-Ε. Admite-se que o enantiómero (-)-β-Ε seja mais poderoso do que o enantiómero -D contra VIH, VHB e VIS. O enantióme ro (+) também é activo contra os VIH, VHB e VIS.

Breve descrição das figuras

A figura 1 representa uma ilustração da estrutura química d.o composto 2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-cytosin-l-il2 -1,3-oxatiolano (”ETC ”).

A figura 2 representa uma ilustração de um método para a preparação de 2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-citosin-l-ilJ -1,3-o xatio lano.

A figura 3 representa um fluxograma da especifici dade da fosfatase alcalina e da fosfadiesterase do veneno de serpentes para os enantiómeros (+) e (-) do ETC.

A figura 4 representa um gráfico onde se indioa a produção da hidrólise catalisada pela lipase do éster 5’-buti rílico do ETC ao longo do tempo utilizando as enzimas ”Amano

- 9 Ρδ-δΟυ®*· (símbolo do quadrado) e PLE (símbolo do circulo com um ponto no interior).

X figura 5 é um gráfico representativo do efeito da concentração (μΜ) de ETC racemico e de ETC enriquecido enan tiomericamente (preparado em conformidade com o método descri to no Exemplo 4) em função da percentagem da inibição das células MOP humanas infectadas.com o VIH-1. ((-circulo negro-, (+)-FTC), (-circulo simples-, (-)-ETC), (-quadrado negro-, (U -MC).

A figura 6 é um gráfico representativo do efeito da concentração (μΜ) do ETC racémico e do FTC enriquecido enantiomerieamente (preparado em conformidade com o método deis crito no Exemplo 3) sobre a percentagem de inibição das células MOP humanas infectadas com o VIH-1. ((-circulo negro-, (+)-ETG), (-circulo simples-, (-)-ETC), (-quadrado negro-, (+·)-ETC).

A figura 7 é um gráfico representativo da absorção de (+)-FTC tritiado em células MOP humanas (média de duas determinações) em função do tempo (horas) em presença de uma *

concentração correspondente a pmol/lO^D células.

A figura 8 é um gráfico representativo de egresso do (i)-ETC identificado raoactivamente a partir de células MOP humanas, medido em horas em presença de uma concentração correspondente a pmol/10^ células.

A figura 9 ilustra a presença de θ dos seus derivados fosforilados em células HepG-2 humanas (Me dia de duas determinações) cuja incubação foi efectuada em meio contendo uma concentração correspondente a 10 μΜ de _7“(+)-ETC, cuja medição foi feita em pmol/10^ células ao longo do tempo.

A figura 10 ilustra o egresso de 2”%_7-(+)-ντθ e dos seus derivados fosforilados em células HepG-2 humanas, cu3a medição foi efectuada em pmol/10 células ao longo do tempo, após induzir a emissão celular de impulsos com uma concentração 10 pM de /”^Ι-Ι_7-(+)-FTC (700 DPM/pmole) durante 24 horas e avaliando a concentração do composto decorridas 24 horas após a remoção.

A figura 11 ilustra a diminuição na concentração da mistura de Γ³η_7-(ι) -FTO e seus derivados fosforilados ob tida a partir de células HepG2 humanas após incubação com uma concentração correspondente a 10 juM de Γ³η_7-(ι) -ETC (700 DPM/pmole)durante 24 horas, medida em pmol/10^ células ao lon go do tempo.

A figura 12 é um gráfico representativo do efeito dos enantiómeros do ETC sobre a formação de colónias de células precursoras de nacrófagos-granolócitos, medido em termos de percentagem de sobrevivência em função da concentração em uM ((-)-FTC, circulo simplesj (+)-FTC, circulo negro; AZT, quadrado negro.

Descrição pormenorizada da invenção termo agora utilizado nucleósido enriquecido enantiomerieamente refere-se a uma composição de nucleósidos a qual incorpora pelo menos 95% de um unico enantiómero desse nucleósido.

termo ETC agora utilizado refere-se ao composs to 2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-eitosin-l-il)-l,3-oxatiolano (forma racémica ou seus enantiómeros), também designado por 2’-desoxi-5-fluoro-3’-tiacitidina.

termo (+)-FTG agora utilizado refere-se aos com posto (+)- ^-P_tl-2-hidroxi-metil-5- (5-fluoro-citosin-l-ll)»

-1,3-oxatiolano.

termo (-)-ETC agora utilizado refere-se ao composto (-)-β-L-2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-citosin-l-il)-1,3-oxatiolano.

O termo (+)-FTC agora utilizado refere-se ao composto (+)-β -D-2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-citosin-1-11)-1,3-oxatiolano.

Os termos FTC-MP, ETC-DP e FTG-TP agora utilizados referem-se respectivamente ao monofosfato, ao difosfato e ao trifosfato de ETC.

O termo BCH-189 agora utilizado refere-se ao composto 2-hidroxi-metil-5-(citosin-l-il)-l,3-oxatiolano.

O termo catalise enzimática preferencial” agora utilizado refere-se à catalise provocada por uma enzima que favorece um substrato relativamente ao outro.

O termo grupo removível agora utilizado signifi ca um grupo funcional que forma uma carbonação incipiente quando se separa da molécula à qual está ligado.

A invenção agora descrita refere-se a um método e a uma composição para o tratamento de infecções provocadas pe los VIH e VHB e também por outros vírus cuja replicação se processa de forma idêntica, em seres humanas ou outros hospedeiros animais, consistindo esse método em administrar uma quaa tidade eficaz de enantiómeros (+)- B de (-)-fi-L ou de (Ό-β-D do composto 2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-citosin-l-il)-1,3-oxatiolano, de um seu derivado farmaceuticamente (fisiologicamente) aceitável, incluindo um derivado alquila do qu acilado em 5’ ou N^, ou um seu sal farmaceuticamente (fisiologicamente) aceitável, em conjunto com um veículo

farmaceuticamente aceitável. Conforme se demonstra a seguir, os compostos da presente invenção possuem actividade anti-rec troviral tal como a actividade anti-VIH-1, anti-VIH-2 e anti-vírus da imunodeficiência dos símios (anti-VIS) por si próprios ou são metabolizados de modo a proporcionarem um compos, to que iniba a actividade anti-rectroviral. O composto ETC e os seus derivados farmaceuticamente aceitáveis ou as formulações farmaceuticamente aceitáveis que contenham esses compostos são úteis para a prevenção e para o tratamento de infecções provocadas por VIH e para outros estados afins tais como o complexo associado ao SIM (CAS), linfadenopatia generaliza da persistente (LGP), estados neurológicos associados ao SIM, estados positivos de anti-corpos anti-VIH e estados positivos de VIH, sarcoma de kaposi, trombocitopenia purpurea e infecções oportunísticas. Além disso, esses compostos ou essas com posições podem ser utilizados profilacticamente para evitar ou para retardar a progressão de estados de doença em indivíduos caracterizados por uma determinação positiva de anti-cor pos anti-VIH ou por uma determinação positiva de antígenos do VIH ou que tenham estado expostos ao VIH.

composto ITG e os seus derivados ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou as formulações farmaceuticamente aceitáveis que incorporam esses compostos também são úteis para a prevenção e para o tratamento de infecções provocadas pe lo VHB e ainda para outros estados afins tais como os estados de indivíduos caracterizados por uma determinação positiva de anticorpos anti-VHB e caracterizados por uma determinação positiva de VHB, em situações de inflamação crónica do fígado provocada pelo VHB, cirrose, hepatite aguda, hepatite fulminante, hepatite persistente crónica e fadiga. Esses compostos ou formulações também podem ser utilizados profilaticamente para evitar ou para retardar a progressão de situações de doenças em indivíduos caracterizados por uma determinação positi va de anticorpos anti-VHB ou por uma determinação positiva de

antígenos do VHB ou que tenham estado expostos ao VHB.

Resumindo, a presente invenção abrange as variantes:

(a) (+)- β -D, It-2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-citosin-l-il )-1.3-oxatiolano e seus derivados e seus sais farmaceuticamente aceitáveis;

(b) (- )- β -L-2-hidroxi-metil-5- (5-fluoro-citosin-l-il)-l, 3-oxatiolano e seus derivados e seus sais farmaceuticamente aceitáveis;

(c) (+)-^-D-2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-citosin-l-il)-1,3-oxatiolano e seus derivados e seus sais farmaceuticamente aceitáveis;

(d) (+)-β -DjJj- 2-hidroxi-me til- 5- (5-fluoro-c itosin-l-il)-1,3-oxatiolano, seus enantiomeros (-) e (+) e correspondentes djs rivados e sais farmaceuticamente aceitáveis para utilização em terapia médica, por exemplo, para o tratamento ou para a profilaxia de uma infecção de VIH ou de VHB;

(e) utilização de (+)- β -B, L-2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-cito sin-l-il)-l,3-oxatiolano, seus enantiomeros (-) e (+) e corres pondentes derivados e sais farmaceuticamente aceitáveis para a preparação do medicamento para o tratamento de infecções de VIH ou de VHB;

(f) formulações farmacêuticas que incorporam (j-)-B-B,L-2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-citosin-l-il)-l,3-oxatiolano seus enantiomeros (-) ou (+) ou um correspondente derivado ou sal farmaceuticamente aceitável em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável;

(g) processo para a preparação de 2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro -citosin-l-il)-l,3-oxatiolano caracterizado pelo facto de:

(i) se fazer reagir o composto 5-fluoro-citosina, eventualmen te produzido, com um composto 1,3-oxatiolano de formula geral A

em que o símbolo R_la representa um átomo de hidrogénio ou representa um grupo de protecção hidroxilo, incluindo um grupo acilo, e o símbolo L representa um grupo removível; e por facultativamente se remover qualquer grupo de protecção hidroxilo;

(ii) se fazer reagir um composto de formula geral B,

(em que o símbolo possui as significações definidas e o símbolo R-^ representa um grupo de protecção amino) com um agente de fluoração que serve para introduzir um átomo de flúor na posição 5 do anel da citosina; ou (iii) se fazer reagir um composto de fórmula geral G

Θ

(em que o símbolo R^_a possui as significações antes) com um agente que serve para converter definidas o grupo oxo na posição 4 do anel uracllo num grupo amino; removendo-se quaisquer grupos de protecção remanescentes para proporcionar o produto desejado.

h) processo para a preparação de um enantiómero (-) ou (+) de 2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-citosin-l-il)-l,5-oxatiolano caracterizado pelo facto de se submeter o composto ou um seu de rivado (por exemplo, um éster em 5’) sob a forma de uma mistu ra de enantiomeros (-) e (+) a determinadas condições ou a reaeções com reagentes que sirvam para separar os enantiómeros e se necessário proceder-se-á à conversão do derivado resultante para proporcionar o composto original.

No que diz respeito ao processo e) (i), os grupos de protecção hidroxi abrangem grupos de protecção adiante des critos com mais pormenor tais como os grupos acilo (por exemplo, o grupo acetilo), aril-acilo (por exemplo, o grupo benzoilo ou o grupo benzoilo substituido), tritilo ou monometoxi -tritilo, benzilo ou benzilo substituido, sililo tri-substituido, incluindo os grupos trialquil-sililo (por exemplo, o grupo dimetil-t-butil-sililo) ou difenil-metil-sililo« 0 com posto 5-fluoro-citosina pode ser facultativamente protegido —

com um grupo sililo tri-substituido. Os grupos de protecção podem ser removidos por um processo convencional. 0 grupo L removível é um grupo tipicamente conhecido na especialidade da química dos nucleósidos, por exemplo, um átomo de halogéneo tal como os átomos de cloro ou bromo ou um grupo alcoxi tal como os grupos metoxi ou etoxi, ou um grupo acilo tal como os grupos acetilo ou benzoilo.

No processo e) (i) a reacção efectua-se num solvente orgânico (por exemplo, 1,2-dicloro-etano ou acetonitrilo) em presença de um ácido de Lewis, de preferencia o cloreto de estanho, ou em presença de triflato de trimetil-sililo.

Os compostos de fórmula geral A (em que o símbolo

L representa um grupo acilo tal como por exemplo um grupo ace tilo) podem ser obtidos fazendo reagir um composto de fórmula geral S

com um agente redutor, por exemplo, hidreto de alumínio e lítio, seguindo-se o tratamento com um reagente convencional adequado para proporcionar o intermediário desejado, por exemplo, um anidrido de um ácido carboxílico, por exemplo, o anidrido acético, para se efectuar uma acilação, ou utiliza-se reagentes de cloração ou de bromação para efectuar uma haloge nação, ou utiliza-se reagentes de alquilação.

Ê possível preparar um composto de fórmula geral B fazendo reagir um composto de fórmula geral E

eom HSCEI^COgH a uma temperatura elevada.

Ê possível preparar um composto de fórmula geral E por ozonólise de um éter ou de um éster alílico possuindo a fórmula geral CHgeCH-CE^-OR. ou de um diéter ou diester de 2-buteno-l,3-diol possuindo a formula geral ROCH„-CH=CH-CH OR, em que o radical R representa um grupo de protecção tal como um grupo alquilo, sililo ou acilo.

No que diz respeito ao processo e) (ii), é possível introduzir o substituinte flúor na posição 5 recorrendo a métodos conhecidos na especialidade (M. J. Robins, et al., em Nucleic Acid Chemistry, Part 2, I. B. Townsend e R. S. Tipson, editors, J. Wiley e Sons, New York, 895-900 (19/8) e referencias ali contidas; R. Duschinsky em Nucleic Acid Chemistry, Part 1, L. B. Townsend and R. S. Tipson, editors, J. Wiley and Sons, New York 43-46 (1978) e referencias ali conti das). 0 agente de fluoração pode ser eventualmente, por exemplo, hipofluorito de trimetilo em fluoro-trieloro-metano.

No que diz respeito ao processo e) (iii), é possí vel tratar um composto de fórmula geral 0 com 1,2,4-triazol conjuntamente com dicloro-fosfato de 4-cloro-fenilo para proporcionar o correspondente composto do grupo 4-(l,2,4-triazolilo) o qual é depois convertido no desejado composto do grupo 4-amino(citidina) por reacção, por exemplo, com metanol.

Os materiais de partida de fórmula gerais B e C podem ser preparados, por exemplo, fazendo reagir uma base adequada (eventualmente protegida) com um composto de fórmula geral A por um processo análogo ao descrito no processo e)

(i). Os compostos 5-fluoro-uracilo e 5-fluoro-citosina encontram-se comercialmente disponíveis e podem ser obtidos em Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI 53233, USA.

A resolução dos enantiomeros (+) pode ser efectua da conforme especificado pormenorizadamente na secção III, mais adiante.

Ê possível converter o composto ETC num éster far maceuticamente aceitável por reacção com um agente de esterificação adequado, por exemplo, um aleto ou um anidrido de ácido. 0 composto ETC ou o seu derivado, farmaceuticamente acei tável pode ser convertido num correspondente sal farmaceuticamente aceitável por um processo convencional, por exemplo, por tratamento com uma base adequada. 0 éster ou o sal do ETC pode ser convertido em ETC, por exemplo, por hidrólise.

I. Composto Activo e seus Sais e Derivados Eisiologicamente Aceitáveis.

O composto activo anti-viral agora revelado é o composto 2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-citosin-l-il)-l,3-oxati£ lano (veja-se a figura 1) na sua forma racémica ou como enan tiómero isolado.

composto activo pode ser administrado sob a for ma de qualquer seu derivado que depois de administrado ao paciente seja susceptivel de proporcionar directa ou indirectamente o composto ETC original, ou que por si só exiba actividade. Como exemplos não limitativos refere-se os sais farmaceuticamente aceitáveis (designados também por ”sais fisiologicamente aceitáveis”) e os derivados do composto aetivo acilados ou alquilados na posição 5* e em / (designados também por “derivados fisiologicamente activos”). De acordo com uma variante, o grupo acilo é um éster de um ácido carboxílico no qual o radical carbonilo do grupo éster e seleccionado entre

grupos de cadeia linear ou ramificada ou grupos cíclicos tai como os grupos alquilo, alcoxi-alquilo incluindo o grupo meto xi-metilo, aralquilo incluindo o grupo benzilo, aril-oxi-al quilo tal como o grupo fenoxi-metilo, arilo incluindo o grupo fenilo facultativamente substituído com átomos de halogéneo, alquilo(C^-C^) ou alcoxi(C^-C^), ésteres sulfonato incluindo os ésteres mono-, di- ou tri-fosfato de alquil- ou aralquil

-sulfonilo tal como metano-sulfonílo, tritilo ou monometoxi

-tritilo, benzilo substituído, trialquil-sililo (por exemplo, dimetil-t-butil-sililo) ou difenil-metil-sililo. Os grupos arilo existentes nos ésteres são preferencialmente grupos feni lo . 0 grupo alquilo pode ser de cadeia linear ou ramificada ou pode ser cíclico e preferencialmente é um grupo possuindo entre 1 e 18 átomos de carbono.

Como exemplos específicos de derivados de FTG far maceuticamente aceitáveis refere-se, sem que isso constitua qualquer limitação:

em que os radicais e Rg ^s^° seleccionados independentemente entre grupos alquilo e acilo, referindo-se especificamente, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os grupos metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, isopentilo, amilo, t-pentilo, 3— 20 —

-metil-butirilo, hidrogeno-succinato, 3-cloro-benzoato, ciclo -pentilo, ciclo-hexilo, benzoilo, acetilo, pivaloilo, mesilato propionilo, butirilo, valerilo, ácido capróico, ácido capríli oo, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, aminoácidos, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os grupos alanilo, valinilo, leucinilo, isoleucinilo, prolinilo, fenil-ala ninilo, tr ip to f anilo, metioninilo, glicinilo, serinilo, treoninilo, cisteinilo, tirosinilo, asparaginilo, glutaminilo, as partoilo, glutaoilo, lisinilo, argininilo e histidinilo e em que um dos radicais R^ e P°de representar o átomo de hidro génio.

composto FTC ou os seus derivados podem ser for necidos sob a forma dos correspondentes sais farmaceuticamente aceitáveis. 0 termo ”sais ou complexos farmaceuticamente acei táveis” agora utilizado refere-se aos sais ou aos complexos de FTO que manifestam a desejada actividade biológica do composto original e que não exibem praticamente nenhuns ou poucos efeitos toxicológicos indesejados. Como exemplos não limi tativos desses sais refere-se (a) os sais por adição de ácidos formados com ácidos inorgânicos (por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e semelhantes), e sais formados com ácidos orgânicos tais como o ácido acético, o ácido oxálico, o ácido tartárico, o ácido succínico, o ácido málico, o ácido ascórbico, o ácido benzóico, o ácido tânico, o ácido panóico, o ácido algínico, o ácido poliglutâmico, os ácidos naftaleno-sulfónicos, os áci dos naftalene-dissulfónicos e o ácido poligalacturónico; (b) os sais por adição de bases formados com catiões de metais po livalentes tais como o zinco, o cálcio, o bismuto, o bário, o magnésio, o alumínio, o cobre, o cobalto, o níquel, o cádnio, o sódio, o potássio e semelhantes, ou com um catião orgânico formado a partir de Ν,Ν-dibenzil-etileno-diamina, amónio ou etileno-diamina; ou (c) combinações de (a) e (b)j por exemplo, um sal tanato de zinco ou semelhantes.

As modificações do composto activo, especificamen te nas posições e 5’-0, podem afectar a biodisponibilidade e a velocidade do metabolismo das espécies activas proporcionando assim controlo sobre o fornecimento dessas espécies activas. Por outro lado essas modificações podem afectar a acti vidade anti-virai do composto, eventualmente aumentando em al guns casos a actividade em relação ao composto original. Isto avalia-se facilmente preparando o derivado e testando a sua actividade anti-viral em conformidade com métodos adiante des critos ou recorrendo a outros métodos conhecidos pelos especialistas na matéria.

II· Preparação dos compostos activos

Ê possível preparar a mistura racémica de ETC em conformidade com o método descrito pormenorizadamente no doeu mento ”PCT Internatioual Publication No. WO 91/11186” publica do em 8 de Agosto de 1991 em nome da ”Emory University”, ou recorrendo ao método descrito no Exemplo 1. Be uma forma geral esse método consiste em ozonar alternativamente o éter ou éster alílico possuindo a fórmula geral CH₂=CH-CH₂-0R ou um diéter ou um diester de 2-buteno-l,3-diol possuindo a fórmula geral ROOHg-CHeCH-CHgOR em que o radical R representa um grupo de protecção, tal como um grupo alquilo, sililo ou acilo, para proporcionar um glicoaldeido que possua a fórmula geral OHC-CH^-OR; adicionar depois ácido tioglicólico ao glicoaldei do para proporcionar uma lactona de fórmula geral 2-(R-oxi)-metil-5-oxo-l,3-oxatiolano; reduzir depois essa lactona para proporcionar diversos compostos que contenham um grupo removi vel na posição 5 do anel oxatiolano; acoplar depois esses com postos com 5-fluoro-citosina sililada em presença de SnCl^ pa ra proporcionar o isómero B do composto ETC; e depois remover facultativamente os grupos de protecção.

Exemplo 1 Preparação de (+)-p-B_iL-2-hidroxi-metil-5-(5-fluo ro-citosin-1-11)-1,3-oxatio lano

Na figura 2 ilustra-se o método para a preparação de uma mistura racémica de ETC o qual se descreve a seguir pormenorizadamente.

Protecção de 2-buteno-l,4-diol

Utilizou-se um balão de 3 gargalos, seco e com a capacidade de 2L, sob uma atmosfera inerte, no qual se introduziu 100 gramas (93,5 ml = 1.135 mol = 1.00 eq.) de 2-buteno -1,4-diol e 15 g (aproximadamente 0.1 equivalentes) de DMAP (4-dimetil-amino-piridina) dissolvidos em 800 ml de piridina seca e manteve-se sob agitação enquanto se arrefecia para a temperatura de 0°C. Depois adicionou-se lentamente cloreto de butirilo (260 ml « 2.2 eq) para evitar o sobreaquecimento e deixou-se em agitação durante 1 hora. Temperou-se a mistura de reacção com uma pequena quantidade de gelo/água. Decantou-se o líquid© separando o sal e evaporou-se no vácuo. Dissolveu-se em água o sal remanescente e extraiu-se a solução aquo sa 2 vezes com eter etílico. As outras camadas combinadas foram submetidas a lavagem uma vez com uma solução saturada de CuSO,, duas vezes com uma solução saturada de NaHCCL contendo Norit^e depois filtrou-se no vacuo através de uma almofada de Oelite®.

Dissolveu-se em eter a mistura de reacçao concentrada e lavou-se em conformidade com o mesmo procedimento anteriormente descrito para a solução do sal referido. Concentrou-se por evaporação rotativa as camadas orgânicas combinadas e colocou-se o concentrado no vácuo. Esta reacção é tipicamente do tipo bastante adequado para a produção em quantida de. Ê possível aumentar a escala facilmente conforme necessário. 0 produto obtido, l,4-dibutiril-2-buteno-l,4-diol, é um líquido límpido variando entre incolor e ligeiramente amarela do.

Ozonolise do diol protegido

Dissolveu-se l,4-dibutiril-2-buteno-l,4-diol (1.365 mol) em 4 1 de OHgC^ seco num balão de 3 gargalos com a capacidade de 51, seco, equipado com um grande tubo de seca gem e com um tubo para introdução de gás. De preferência o tuto é do tipo não frito para fazer borbulhar gás e ficará obstrui do quando for exposto à solução concentrada. Agitou-se a solu çao e arrefeceu-se para a temperatura de -48 C ao mesmo tempo que se fazia borbulhar gás inerte através da solução. A entra da do gás foi vedada logo que a solução arrefeceu suficientemente e a seguir colocou-se © balão e o aparelho agitador sob a acção do gerador de ozono. Fez-se borbulhar oxigénio através da solução agitada durante pelo menos 20 minutos mantendo -se o banho de gelo. Um aparelho criogénico do tipo ••Cryocool” é ideal para manter a baixa temperatura necessária para esta reacção demorada. Depois introduziu-se o ozono a uma pressão

4. 4 compreendida entre 5,5x10 e 6.0x10 Pa. Depois de completado este procedimento interrompeu-se o fluxo de ozono e fez-se borbulhar oxigénio através da solução durante cerca de meia hora antes de se lhe adicionar 3 equivalentes de Me^S. Removeu-se o balão do banho de arrefecimento e transportou-se para uma campânula onde se efectuou a agitação durante 2 dias até à redução completa. Evaporou-se a solução e submeteu-se à acção do vácuo durante várias horas.

Esta reacção proporciona tipicamente cerca de 95% de aldeído protegido (2-butiril-oxi-acetâLdeido ) que é um líquido límpido variando entre incolor e amarelo.

Oiolização do aldeido com ácido mercapto-acético

Dissolveu-se o aldeido (1.0 equivalentes) em tolueno para proporcionar uma solução variando entre 0.80 e Q85

M, contida num balão equipado, com cifão do tipo Dean-Stark.

Adicionou-se depois ácido tioglicólico (1.1 equivalentes) e a queceu-se a mistura ao refluxo. Removeu-se a água azitotropicamente através do cifão. A reacção ficou completa em 3 horas e deixou-se arrefecer para a temperatura ambiente, lavou-se a solução orgânica duas vezes com volumes iguais de uma solução aquosa saturada de NaHCO^ e lavou-se uma vez com água, secou-se sobre MgSO. e Norit e depois filtrou-se por vácuo através de celite antes de se submeter a evaporaçao no vacuo. 0 primeiro produto de lavagem com a solução saturada de NaHGO^ foi novamente extraído uma vez com éter; o produto de lavagem com éter foi lavado uma vez com água e depois secou-se sobre MgSO. e Norit®, filtrou-se por vácuo através de celite®e ' A evaporou-se conjuntamente com outro produto orgânico proveniente da solução de tolueno. As substâncias combinadas foram deixadas sob acção do vácuo durante a noite.

Esta reacção proporciona tipicamente um rendimento de 90% obtendo-se o composto 2-(butiril-oxi)-metil-5-oxo-1,3-oxatiolano.

Redução da lactona e conversão em acetato

Dissolveu-se 2-butiril-oxi-metil-5-oxo-l,3-oxatÍ£ lano (1.00 equivalentes) em THJ? seco para proporcionar uma so lução 0.2JM contida num balão de 3 gargalos, seco, equipado com agitador mecânico e mantido sob uma atmosfera inerte. Agi tou-se a solução e arrefeceu-se para a temperatura 0°G antes de se adicionar com uma cânula uma solução de 1.1 equivalentes de Di(t-BuO)^AlH 1.0M em THF. A redução ficou completa em cerca de 3 horas conforme confirmado por CGF (cromatografia de camada fina) utilizando como sistema solvente uma mistura 2:1 constituída por éter/hexano e um indicador de cor anisaldeído.

Depois adicionou-se cerca de 10 equivalentes de

Ac£O recentemente destilado e deixou-se sob agitação durante

dias para proporcionar o produto acetilado. Temperou-se a mistura de reacção por adição de uma solução aquosa saturada de NaHCO^, mantendo-se sob agitação durante a noite. Depois evaporou-se a solução e agitou-se conguntamente com mais solu ção de NaHCO^, durante a noite. A seguir extraiu-se com éter e lavou-se o extraoto cuidadosamente duas vezes com uma solução saturada de NaHGO, e uma vez com água, secou-se sobre (Th 3 , , ®

MgSO^ e Norit , filtrou-se por vacuo através de celite e evaporou-se. Obteve-se como produto um líquido límpido amarelo escuro. A cromatografia em gás (temperatura inicial = 8O°G; tempo inicial = 5 minutos; acréscimo térmico = 10^uC/minuto; temperatura final = 240°C) indica tipicamente uma pureza de a proximadamente 70%·

Sililação de 5-fluoro-oitosina

Efectuou-se a sililação de 5-fluoro-citosina (1.05 equivalentes tomando como base a quantidade de lacto1 acetilado obtido no passo anterior e recorrendo à cromatografia em gás (CG) para determinação da pureza) efectuando o pro cessamento ao refluxo em pelo menos 10 equivalentes de hexame til-dissilazano contendo uma quantidade catalítica do sulfato de amónio puro (0.05 a 0.10 equivalentes) durante 2 horas após a solução ter ficado límpida. Depois vedou-se o frasco hermeticamente e removeu-se o solvente recorrendo a uma bomba de vácuo com cifão auxiliar. Obteve-se um produto no estado sólido e de cor branca o qual ficou em repouso no vácuo duran te a noite até se considerar pronto para utilização na reacção do acoplamento seguinte.

Acoplamento de 5-fluoro-citosina sililada com lactol acetilado

A uma solução de 5-fluoro-citosina sililada (33·86 g; 0.124 mol) em dicloro-metano seco (35θ ml) adicionou-se u26 -

ma solução de SnGl^ (135.6 ml, uma solução 1M em GHgClg) sob uma atmosfera de azoto. Agitou-se a solução durante 15 minutos à temperatura ambiente. Com o auxílio de uma cânula adicionou-se esta solução à solução de acetato de lactol (38 g» 0.113 mol) em dicloro-metano (400 ml) sob uma atmosfera de azoto durante um período de 30 minutos.

Agitou-se a solução resultante da reacção durante 2 horas verificando-se que a reacção estava completa por CGF. Depois diluiu-se a solução resultante da reacção com dicloro-metano (500 ml) e temperou-se com uma solução de hidróxido de amónio. Adicionou-se essa solução de hidróxido de amónio (100 ml) lentamente mantendo-se sempre a temperatura de reacΛ* O çao inferior a 30 0 tendo-se obtido deste modo um precipitado branco.

Deixou-se a mistura em agitação durante mais 30 minutos e depois fez-se passar através de uma coluna carregeda de gel de silica (17*5 cm de diâmetro e 12.5 cm de altura). Efectuou-se a eluição sequencialmente com dicloro-metano (2 L), com acetato de etilo (2 1) e com uma mistura de acetato de etilosetanol (9:1) (4 L), Os eluentes acetato de etilo e mistu ra de acetato de etilosetanol continham o produto desejado. Procedeu-se à combinação dessas duas soluções e evaporou-se sob pressão reduzida. 0 solido residual viscoso foi depois la vado com éter seco (200 ml) para proporcionar um sólido branco (25.35 gí 71%), FTC-5’-butirato.

Dissolveu-se 0 FTC-5*-butirato (8.74 g; 0.026 mol) em 25O ml de metanol. Depois adicionou-se metóxido de sódio (2.85 g; 0.052 mol) à temperatura ambiente. Agitou-se a mistu ra de reacção durante 1 hora e decorrido esse tempo verificou se por CGF que a reacção estava eompleta. Adicionou-se uma so_ lução de NH.C1 (10 ml) para temperar a reacção e depois removeu-se 0 solvente sob pressão reduzida. Fez-se absorver o resíduo sobre gel de silica (5 g) e fez-se passar através de u- 27 -

ma pequena coluna utilizando como eluente uma mistura de acetato de etiloíetanol (9:1). Procedeu-se à combinação das frac ções que continham o produto e evaporou-se para proporcionar um sólido viscoso que foi lavado com éter seco para se obter PTG no estado sólido e de cor branca (6.00 g, 88%). (ΕΜΝ-^Η: (DMSO-d⁶) 8.18 (1H, d, Hg, J=8.4 Hz), 7.81 & 7.57 (2H, largo, NHg), 6.12 (1H, dd, Hp, J=5.7 & 4.2 Hz), 5.40 (1H, t, OH, J=5.7 Hz), 5.17 (1H, t, IH^, J=3-6 Hz), 3.74 (2H, m, 2H₅,), 3.41 (1H, dd, IHg,, J=5.7 & 11.7 Hz), 3.11 (1H, dd, 1H₂,, J=4.2 & 11.7 Hz); RMN-¹³Cí (MSO-d⁶) 157.85 (d, J=sl3.4 Hz), 153.28, 136.12 (d, J=241 H2), 126.01 (d, J=32.6 Hz), 86.90, 86.84, 62.48, 37.07; p.f. 195-196°C.

III. Resolução dos enantiómeros do nucleósido

Proporciona-se agora um método para a resolução de misturas racemicas dos enantiómeros dos nucleósidos incliin do, sem que isso constitua qualquer limitação, os enantiómeros (+) e (-) do composto FTG. Esse método também pode ser utilizado para a resolução de misturas racemicas de hidratos de carbono ou de radicais do tipo hidrato de carbono tais como os derivados de 1,3-oxatiolano e 1,3-dioxolano, 0 método implica a utilização de uma enzima que catalisa preferencialmente uma reacção de um enantiómero numa mistura racémica. 0 enantiómero que reage e separado do enantiómero que nao reage recorrendo às novas diferenças de estrutura física. Tendo em consideração o texto da descrição agora apresentada, qualquer especialista na matéria será capaz de seleccionar uma enzima que seja selectiva para o enantiómero do nucleósido pretendido (ou que seja selectiva para o enantiómero não desejado, co mo método para o eliminar), escolhendo uma das enzimas adiante enumeradas ou procedendo a uma avaliação sistemática de ou tras enzimas conhecidas. Tendo em consideração a presente memória descritiva, qualquer especialista na matéria será capaz de descobrir a forma de modificar o substrato conforme for ne

cessário para conseguir a resolução desejada. Através da utilização alternativa de reagentes de desvio de RMN quiral, pola rimetria ou CLER quiral é possível determinar o enriquecimento óptico do éster recuperado.

Os exemplos adiante descritos ilustram melhor a utilização de enzimas para a resolução de misturas racémieas de enantiómeros. Ê possível utilizar outros métodos de resolu ção de misturas racémieas em combinação com o método de resolução agora descrito. Todas as modificações possíveis são con sideradas englobadas no âmbito da presente invenção.

Resolução com base na hidrólise de esteres de nuoleésidos em C5’

De acordo com uma variante, o método consiste em fazer reagir o grupo hidroxilo em 05’ de uma mistura de racematos de nucleósidos com um composto de radical acilo para proporcionar ésteres em 05’ nos quais o nucleósido se situa na extremidade carbinol do éster. Depois trata-se a mistura racémica dos ésteres em 05’ dos nucleósidos com uma enzima que clive preferencialmente ou hidrólise um dos enantiómeros e não afecte o outro, num determinado período de tempo.

Uma vantagem deste método reside no facto de um poder ser utilizado para a resolução de uma ampla variedade de nucleósidos, incluindo os nucleósidos pirimldina e pirina que são facultativamente substituídos no radical hidrato de carbono ou no radical alcalino. Esse método também pode ser utilizado para a resolução de derivados dos nucleósidos que contenham heteroátomos adicionais no radical hidrato de carbo no, por exemplo, FTG e BGH-189· A ampla aplicabilidade deste método reside parcialmente no facto de embora o radical carbi nol do éster desempenhe uma função associada à capacidade de uma enzima para diferenciar enantiómeros, ou sítio principal

de reconhecimento para essas enzimas se situar no radical áci do carboxílico do éster. Além disso, qualquer especialista po de extrapolar adequadamente os resultados de um estudo relati vo a uma enzima/substrato para outra situação idêntica, num sistema aparentemente diferente, desde que os radicais ácido carboxílico dos dois substratos sejam idênticos ou bastante semelhantes.

Outra vantagem deste método reside no facto de ser regiosseleetivo. As enzimas que hidrolisam ésteres tipiea mente não catalisam reacções indesejadas noutros radicais da molécula. Por exemplo, a enzima lipase catalisa a hidrólise do éster de 2-hidroxi-metil-5-oxo-l,3--oxatiolano sem hidrolisar a lactona interna. Isto contrasta notavelmente com as abordagens químicas” à hidrólise de ésteres.

Existe ainda outra vantagem deste método que resi de no facto de a separação do enantiómero não hidrolisado e do enantiómero hidrolisado a partir da mistura de reacção ser bastante simples. 0 enantiómero não hidrolisado é mais lipofí lico do que o enantiómero hidrolisado e pode ser eficazmente recuperado por extração simples utilizando um solvente seleccionado entre uma ampla variedade de solventes orgânicos monoi polares ou utilizando misturas solventes, incluindo’ o hexano e a mistura de hexano/éter. O enantiómero menos lipofílico hi drolisado de maior polaridade pode ser então obtido por extracção com um solvente orgânico de maior polaridade, por exemplo, com acetato de etilo, ou por liofilização, seguindo-se a extracção com etanol ou com metanol. Deve evitar-se o álcool durante a hidrólise uma vez que pode desnaturar as enzimas em determinadas condições.

Enzimas e substratos

Havendo uma selecção e adaptação adequadas da en50

zima e do substrato é possível especificar condições para iso lar qualquer dos enantiómeros dos nucleósidos. 0 enantiómero desejado por ser isolado por tratamento da mistura racémica com uma enzima que hidrólise o enantiómero desejado (seguindo -se a extração do hidrolisato polar com um solvente polar) ou por tratamento com uma enzima que hidrólise o enantiómero não desejado (seguindo-se a remoção do enantiómero não desejado com um solvente não polar).

As enzimas que catalisam a hidrólise de ésteres englobam as esterases, por exemplo, a esterase do fígado do porco, as lipases incluindo a lipase pancreática porcina e a lipase Amano PS-800, substilisina e (X-quimotripsina.

A figura 3 representa um fluxograma da especifici dade da fosfatase alcalina e da fosfodiesterase do veneno de serpente para os enantiómeros (+) e (-) do composto ETC. Tal como se indica, a fosfatase alcalina hidrolisa o trifosfato dos dois enantiómeros do composto ETC e por isso não é eficaz como meio de separação. A fosfodiesterase I hidrolisa preferencialmente o isómero (+) do composto ETC originando o seu monoéster o qual pode ser depois exposto à acção da 5’-núcleo tidase para proporcionar o composto (+)-ETC.

grupo acilo mais eficaz que deve ser utilizado para esterificar a posição 05’ do nucleósido pode ser determi nado sem recurso a experimentação excessiva avaliando diversos homólogos recorrendo à utilização do sistema enzimático seleccionado. Por exemplo, no caso de os nucleósidos de 1,3-oxatiolano serem esterificados com ácido butírico, as resolu ções com a esterase do fígado do porco e com Amano PS 800 decorrem com elevada enantiosselectividade (excesso enantioméri eo entre 94 e 100%) e com selectividade oposta. A esterase do fígado do porco (EEP) hidrolisa preferencialmente o enantióme ro (+) do composto FTC e Amano PS-800 hidrolisa preferencialmente o enantiómero (-) do composto ETC. 0 valor percentual

do excesso enantiomérico referido no quadro 1 é a quantidade de éster butirato purificado remanescente na mistura tratada com a enzima (isto e, é o éster butirato de (-)-DTG no caso da esterase do fígado do porco (EEP) e é o éster butirato de (+)_ -ETC no caso da enzima Amano PS-800.

Como exemplos não limitativos de grupos acilo que é possível seleccionar para utilização com uma mistura enantiomérica nucleosídica particular e com uma enzima particular refere-se os ácidos alqu.il-carboxílicos e os ácidos alquil-carboxílicos substituídos, ineluhdo o ácido aeetiço, o ácido propiónico, o ácido butírico e o ácido pentanóico. Com algumas enzimas é eventualmente preferível utilizar um composto do grupo acilo que seja significativamente capaz de remover elec troes para facilitar a hidrólise por via do enfraquecimento da ligação éster. Como exemplos de grupos aoilo eom capacidade para remover electrões refere-se os Ol-halo és teres tais como o ácido 2-cloro-propiónico, o ácido 2-cloro-butírico e o ácido 2-cloro-pentanóico. Os <X-haloésteres constituem substratos excelentes para as lipases.

CondigÕes de resolução

As hidrólises enzimáticas são tipicamente efectua das com uma quantidade catalítica da enzima contida num tampao aquoso cujo valor de pH seja proximo do valor optimo de pH para a enzima em questão. À medida que a reacção se desenvolve o valor do pH vai caindo como resultado do ácido carboxílico libertado. Deve adicionar-se uma base em solução aquosa para manter o valor do pH próximo do valor óptimo para a refe rida enzima. A progressão da reacção pode ser determinada facilmente verificando as variações no valor do pH e verificando a quantidade de base necessária para manter o valor do pH pretendido. O éster hidrofóbico (o enantiómero não hidrolisado) e o álcool de maior polaridade (o enantiómero hidrolisado) podem ser sequencial e selectivamente extraídos da solu- 32 -

ção seleccionando criteriosamente os solventes orgânicos. Em alternativa faz-se passar o material cuja resolução se preten de efectuar através de uma coluna que cotenha a enzima imobilizada num suporte sólido. De uma forma geral considera-se fraca a capacidade de reproduzir as hidrólises enzimáticas efectuadas sob condições heterogéneas. Por essa razão é preferível que a hidrólise seja efectuada sob condições homogéneas. Nao se dá preferencia aos solventes alcoólicos uma vez que po, dem desnaturar as enzimas. Ê possível conseguir homogeneidade recorrendo à utilização de agentes tenso-activos do tipo não iónico tais como o “triton X-100. No entanto, a adição desses agentes tenso-activos não só auxilia a dissolução do mate rial de partida como melhora também a solubilidade do produto como meio aquoso. Por esse motivo, embora a recção enzimática possa evoluir mais eficazmente com a adição de um agente tenso-activo do tipo não iónico do que sob condições heterogéneas, pode ser que venha a ser mais difícil isolar o material de partida recuperado e o produto pretendido. 0 produto pode ser isolado recorrendo a técnicas cromatográficas e químicas adequadas (por formação selectiva de sal). Os nucleósidos dia cilados podem ser utilizados mas frequentemente são bastante lipofílicos sendo difícil dissolve-los no meio utilizado.

Exemplo 2s Hidrólise de esteres de ETC catalisada pela lipase enant iosselectiva.

Procedeu-se à preparação de diversos derivados de radical 5’-O-acilo do composto ETC por O-acilaçao selectiva do sal N-cloridrato (ver o Quadro 1 e a Eigura 4) de (+)-ETC. Investigou-se a eficácia da hidrólise dos derivados efectuada por lipases. Conforme se mostra no Quadro 1, a esterase do fí gado do porco (EEP) exibe um elevado nível de selectividade para a hidrólise do ester do enantiómero (+) do composto ETC deixando predominantemente o butirato de (-)-ETC na mistura analisada por cromatografia em líquido de elevado rendimento

(CLER). Em contraste, o PS-800 hidrolisa o éster do enantióme ro (-) ETC preferencialmente, proporcionando predominantemente o butirato de (-)-FTC na mistura analisada por cromatografia em líquido de elevado rendimento (CLER). Verificou-se tam bém que a velocidade da hidrólise dependia da natureza do gru po acilo: no caso do derivado aeetilico era significativamente mais lenta do que no caso do derivado butirílico. Descobriu-se agora que a velocidade da hidrólise de éster do ácido propionico do ETC é ainda mais rápida do que aquela que se ob serva com o derivado butirato. A percentagem de recuperação e a percentagem de excesso enantiomerico foram determinadas por CLER. Embora a enantiosselectividade seja excelente quando se utiliza a enzima do fígado do porco (EEP) (tipicamente 97% e. e. ou superior), é possível proceder a um enriquecimento adicional praticando reacções de hidrólise enzimática sequenciais nas quais o butirato enriquecido enantioméricamente pro veniente de uma hidrólise calatisada pela enzima do fígado do porco (EEP) é submetido a hidrólise enzimática com a enzima PS-800.

Quadro 1

Comparação do efeito do ester sobre a hidrólise enzimática

Substrato % de recuperação % E.E.

(s.m.)

Esteres de ETC com EEP:

(-)-FTC (butirato)

acetato	32.68	N.D.
propionato	39.87	N .D.
butirato	48.00	98
butirato	45.71	98.6

- 34 Ésteres de ETC com PS-800:

acetato		75.17	N.D.
propionato		52.67	N.D.
butirato		58.34	N.D.
valerato		41.50	94
Exemplo 3:	Procedimento para a preparação	dos compostos (+) e
	(-)-FTC através	da hidrólise do	butirato de ETC ca

talisada pela lipase enantiosselectiva.

Dissolveu-se uma quantidade de 5’-O-butirato de (+)-FTO (0,47 mmol, 149 mg) em 16 ml de uma solução de tampão; CH^ON, 4:1, PH 8. Agitou-se a solução límpida obtida e tratou -se com 26 mg de esterase do fígado do porco (EFP-A). A evolu ção da reacção foi verificada por cromatografia em líquido e elevado rendimento (CLER) (figura 4). Decorridas 20 horas (52% de conversão) extraiu-se a mistura de reacção utilizando 2 x 80 ml de CHC1, e 80 ml de acetato de etilo. Procedeu-se à combinação dos extractos da camada organica e a sua secagem sobre MgSO^, anidro, filtrou-se e concentrou-se por evaporação rotativa. Efectuou-se a eluição do resíduo sobre placas 2 x lOOOm pTKJ utilizando como eluente acetato de etilo (elui ção dupla) para proporcionar após o isolamento uma quantidade de 53 mg (rendimento de 36% tomando como base o material de partida) de butirato de ETC para o qual se determinou um excesso enantiomérieo correspondente a 98% (e.e.) por análise de cromatografia em líquido de elevado rendimento (CLER). Esse butirato enriquecido enantioméricamente foi depois tratado com uma quantidade de 1.6 ml de metanol seguindo-se a adição de 0,38 mmol (20 g) de metóxido de sódio. Agitou-se a mistura resultante à temperatura ambiente e verificou-se a progressão da reacção por cromatografia em líquido de elevado rendimento (CLER). A reacção ficou completa decorridos 30 minutos. Remo- 35 -

veu-se o solvente por evaporação rotativa para proporcionar um sólido branco impuro (76 mg) cuja eluição foi efectuada so bre uma placa lOOOm pTLG utilizando como eluente uma mistura 5:1 de acetato de etilo:etanol. Isolou-se o composto (-)-FTC no estado sólido e de cór branca (33 mg; 82% de rendimento). A análise por cromatografia em líquido de elevado rendimento (GLER) do composto ETC sob a forma do seu derivado 5’-0-aceta to correspondeu a um valor de 97% e.e. ; r«_7(^2O._D) - 120.5° (c s 0.88; etanol absoluto).

As emulsões do passo de processamento podem ser evitadas adicionando HCGl^ à mistura de reacção em acabamento (o qual serve também para desnaturar a enzima), removendo os solventes no vácuo e procedendo à extração com HCGl^.

De modo idêntico dissolveu-se uma quantidade de

1.2 mmol (375 mg) do 5’-0-butirato de (+)-FTG em 40 ml de tam pão; GH^CN, 4:1, pH 8. Agitou-se a solução límpida obtida e tratou-se com 58 mg de esterase de fígado do porco (EEP-A). A progressão da reacção foi verificada por cromatografia em lí quido de elevado rendimento (GLER). Decorridos 90 minutos (38% de conversão) adicionou-se a mistura de reacção a uma quantidade de 150 ml de CHCl^. Procedeu-se à separação das ca madas e liofilizou-se a camada aquosa para remover o solvente. Extraiu-se o resíduo branco proveniente da liofilização utili zando 3 x 10 ml de etanol absoluto. Procedeu-se à filtração dos extratos, combinou-se e concentrou-se no vácúo para proporcionar uma quantidade de 179 mg de um óleo impuro. Efectuou-se a eluição desse material impuro numa coluna de 45 x mm carregada com gel de silica utilizando como eluente 3 x 75 ml de acetato de etilo seguindo-se depois uma mistura 5:1 do acetato de etilos etanol. Isolou-se o composto (+)-FTC no estado sólido e de cór branca (109 mg; rendimento de 37% tomando como base o butirato de partida). A análise por cromato grafia em líquido de elevado rendimento (GDER) do composto

(+)-FTO sob a forma do seu derivado 5’-0-acetato correspondeu a um valor de 97.4% e.e.; /“a_7o(^2G',_D) +113.4° (c » 2.53; e tano 1 abso luto ).

Praticou-se uma reacção idêntica utilizando uma quantidade do 0.12 mmol (37 mg) do 5’-0-butirato de ETC e 7 mg de PS-800 em 4.0 ml de tampãoí CH^CN, 4:1, pH 8. A velocidade de reacção foi consideravelmente mais lenta do que no ca so em que utilizou EEP-A e foram necessárias 74 horas para se conseguir 59% de conversão. Verificou-se que o butirato recuperado (11.4 mg; 31% da quantidade inicial) correspondia a um valor de 94% e.e. por cromatografia em líquido de elevado ren dimento (CLER).

Resolução dos enantiómeros do nucleóaido com eitidina-desoxi-citidina desaminase

Em conformidade com uma variante alternativa utilizou-se citidina-desoxicitidina-desaminase para efectuar a resolução de misturas racémieas de 2-hidroxi-metil-5-(citosin -l-il)-l,3-oxatiolano e seus derivados, incluindo o composto 2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-citosin-l-il)-l,3-oxatiolano. Essa enzima catalisa a desaminação do radical citosina proporcionando um radical uracilo. Descobriu-se que um dos enantiómeros dos nucleósidos de 1,3-oxatiolano constitui um substrato preferencial para a citisina-desoxicitidina-desaminase. 0 enantiómero que não é convertido num derivado de radical uracilo (e por essa razão permanece alcalino) é extraído da solu ção recorrendo-se a uma solução ácida. Ê necessário tomar pre cauções para evitar soluções fortemente ácidas (de valor pH inferior a 3.0) o que pode originar a clivagem do anel oxatio lano.

A enzima citidina-desoxicitidina-desaminase pode ser isolada a partir do fígado do rato ou a partir do fígado

dos seres humanos ou pode ser expressada a partir de sequências recombinantes num sistema procariótico tal como o sistema da E. Goli. 0 método de resolução dos enantiómeros dos nucleósidos da citidina utilizando a enzima citidina-desoxiciti dina-desaminase pode ser utilizado como método único de resolução ou pode ser utilizado em combinação com outros métodos de resolução, incluindo a resolução por hidrólise enzimática dos ésteres de 5’-0-nucleósido conforme descrito antes.

Combinação da resolução enzimática com métodos da resolução clássicos processo anteriormente descrito para a resolução de misturas racemicas de enantiómeros dos nucleósidos pode ser combinado com outros métodos clássicos de resolução enantiomérica para aumentar a pureza óptica do produto final.

Esses métodos clássicos de resolução englobam uma diversidade de técnicas físicas e químicas. Erequentemente a técnica mais simples e mais eficaz é a técnica de recristaliza ção baseando-se no princípio de que os racematos são frequentemente mais solúveis do que os correspondentes enantiómeros individuais. A recristalização pode ser efectuada em qualquer passo, eventualmente sobre os compostos acilados ou sobre o produto enantiomérico final. Havendo êxito, esta abordagem simples representa um método excelente.

No caso de a recristalização não permitir obter material com uma pureza óptica aceitável é possível recorrer a outros métodos. Se o nucleósido for alcalino (por exemplo, uma citidina) é possível utilizar ácidos do tipo quiral que formem misturas diastereomericas que eventualmente possuam propriedades de solubilidade significativamente diferentes. Como exemplos não limitativos de ácidos do tipo quiral refer£ -se o ácido málico, o ácido mandélico, o ácido dibenzoil-tar38 -

tárico, ο ácido 3-bromo-canfor-8-sulfónico, o ácido 10-canfor -sulfónico e o ácido di-p-toluoil-tartárico. De forma idêntica, a acilação do grupo hidroxilo livre com um derivado de um acido do tipe quiral proporciona também a formação de misturas diastereoméricas cujas propriedades físicas sejam suficientemente diferentes de modo a permitirem a separação.

É possível obter ou purificar pequenas quantidades de nucleósidos enriquecidos enantioméricamente fazendo pas sar a mistura racémica por uma coluna de cromatografia em líquido de elevado rendimento (CLER) que tenha sido conseguida para a separação de moléculas de simetria quiral incluindo as colunas de ciclodextrina comercializadas por Rainin Gorporation.

Exemplo 4: Separação de misturas racémicas de nucleósidos por cromatografia em líquido de elevado rendimento (CRER)

As resoluções dos enantiómeros em C4* de (+)-FTC foram efectuadas utilizando uma coluna ligada a ciclodextrina de simetria quiral (cyclobond AC-I) obtida na Rainin Corpo ration (Woburn, MA). As condições utilizadas foram as seguin tes: metanol isocrático a 0.5% em água; débito 1 ml/minuto, detecção de UV a 262 nm. 0 metanol de qualidade para CLER foi obtido em J. T. Baker (Phillipsburg, NJ”). Erocedeu-se à injecção das misturas racémicas e à recolha das fracçoes. Juntou-se as fracçoes que continham cada um dos enantiómeros, ezfec tuou-se a congelação e depois efectuou-se a liofilização. A caracterização dos compostos foi efectuada por espectroscopia de UV e pelos seus tempos de retenção em CIiER. De um modo geral os enantiómeros (-) possuem tempos de retenção inferiores aos dos enantiómeros (+) (veja-se J. Liquid Chromatography 7:353-376, 1984). As concentrações dos compostos foram determinadas por espectroscopia de UV utilizando uma solução de re

Tempos

Composto (- )-FTC (+)-FTG

Exemplo 5 serva de concentração conhecida (15 μΜ) preparada em água para avaliação biológica. Os tempos de retenção para os enantió meros separados estão indicados no Quadro 2.

Quadro 2 de retenção dos enantiómeros do ETC

R (m

8.3

8.7

Métodos alternativos para a separação dos enantió meros de FTC utilizando uma coluna de simetria quiral.

Utilizando uma coluna Cyclobond I-Ae” (5 μιη, 25 cm x 4.6 mm, Rainin Corporation, Woburn, MA, catalogo no. AST-41049), com um débito de 0.6 ml/min. de metanol isocrático a 0.5% (Fisher Seientific, Inc., qualidade para CLER, cat. no. A-452-4 em água) e recorrendo à detecção por UV a 262 nm foi possível determinar que os enantiómeros de ETC exibem tem pos de retenção correspondentes a 12.68 minutos ((-)-FTC) e 13 »20 minutos ((+)-FTC).

Utilizando uma coluna Chiralpak AS (10 pm, 25 cm x 4»6 mm, J. I. Baker Inc., Phillisburg, NJ, catalogo nV 7406-00, série nS 09-29-10320) com um débito de 0.8 ml/minuto de álcool isopropílico (qualidade CLER, Fisher Seientific, Inc., cat n2 A-451-4) e com detecção por UV a 262 nm foi possível determinar que os enantiómeros do composto FTC exibiam tempos de retenção de 5«9 minutos ((-)-FTC) e de 9»8 minutos ((+)-FTC).

IV. Capacidade do composto 2-hidroxi-metil-5-(5-fluoro-cito- 40 -

sin-l-il)-l,3-oxatiolano (FTC) para inibir a replicação do VIH.

Ê frequentemente desejável proceder ao rastreio de diversas misturas racémicas de nucleósidos como passo preliminar para determinar quais as necessidades de melhor resolução proporcionando componentes enriquecidos enantioméricamente e para possibilitar melhor avaliação da actividade anti -virai. É possível medir a capacidade dos nucleósidos para inibir o VIH recorrendo a diversas técnicas experimentais. A técnica agora utilizada e mais adiante descrita em pormenor mede a inibição da replicação virai em células mononucleares do sangue periférico (MSP) humanas estimuladas com fito-hemaglutimina (PHA) infectadas com o VIH-1 (estirpe VAIi). Determi na-se a quantidade produzida de vírus medindo a quantidade de enzima transcriptase inversa codificada pelo vírus. A quantidade produzida de enzima é proporcional à quantidade produzida de virus. 0 Quadro 3 proporciona valores ΟΕ^θ (concentração de nucleósidos que inibe a replicação do virus em 50% nas células MSP com o factor de erro admissível correspondente a 10%) e também os valores ΟΙ^θ (concentração de nucleósido que inibe em 50% o crescimento de células MSP humanas não infecta das estimuladas por mitogenos) para diversos derivados de (+)-1,3-oxatiolano e nucleósidos.

Exemplo 6: Actividade dos derivados de (+)-1,3-oxatiolano e dos nucleósidos anti-VIH

A. Utilizou-se células MSP (10 celulas/ml) decorri- dos 3 dias após terem sido estimuladas com fito-hemaglutinina, provenientes de doadores saudáveis seronegativos relativamente à hepatite B e relativamente ao VIH-1 as quais foram infec tadas com VIH-1 (estirpe VAL) para valores de concentração correspondentes a cerca de 100 vezes o valor correspondente a 50% da dose infecciosa da cultura tecidual (DICT 50) por mili — 41 —

litro e desenvolveu-se a cultura na presença e na ausência de diversas concentrações de compostos anti-virais.

B. Decorrida aproximadamente 1 hora após a infecção adicionou-se um meio que se pretendia testar em presença do composto (2 vezes a concentração final no meio) ou na ausência do composto, a diversos balões (5 ml; volume final correspondente a 10 ml). Utilizou-se o composto A2T como controlo posi tivo.

C. As células foram expostas ao virus (cerca de 2 χ 10 ⁷ dpm/ /ml, conforme determinado pelo ensaio com a transcriptase inversa) e depois foram colocadas numa incubadora em atmosfera de 00₂· 0 VIH-1 (estirpe VAI) foi obtido na instituição 'JCenter for Disease Control, Atlanta, Georgia”. Os métodos utilizados para efectuar a cultura das células MSP, colheita dos virus e determinação da actividade da transcriptase inversa são os que foram descritos por McDougal et al. (J. Immun.

Meth. 76, 171-183, 1985) e Spira et al. (J. Olin. Meth. 25, 97-99, 1987), com a exoepção de se não ter incorporado fungizona no meio (veja-se Schinazi, et al., Antimicrob. Agents Ohemother. 32, 1784-1787 (1988); ld., 34:1061-1067 (1990)).

D. Ao sexto dia as células e o sobrenadante foram transferidos para um tubo de 15 ml que foi submetido a centri fugação segundo um regime de aproximadamente 900 g durante 10 minutos. Procedeu-se a remoção de 5 ml de sobrenadante e concentrou-se o virus por centrifugação a 40000 rpm durante 30 minutos (rotor Beckman 70.1 Ti). 0 granulado de virus solubilizado foi submetido a processamento para a determinação dos níveis de transcriptase inversa. Os resultados são expressados em dpm/ml de sobrenadante do qual se obteve a amostra. Os virus provenientes de menores volumes de sobrenadante (1 ml) também podem ser concentrados por centrifugação antes da solu bilização e da determinação dos níveis da transcriptase inver

Determinou-se o valor d.a concentração eficaz média (ΟΕ^θ) recorrendo ao método do efeito médio (Antimicrob. Agents Chemother. JO, 491-498 (1986). Resumidamente, traça-se um gráfico de valor percentual de inibição do virus, conforme determinado a partir das medições da transcriptase inversa, em função da concentração micromolar de composto. 0 valor ΟΕ^θ é a concentração do composto para a qual ocorre 50% de inibição do desenvolvimento virai.

E. Efectuou-se uma cultura de células MSP humanas nao infectadas (3.8 x 10 células/ ml) estimuladas com mitoge nos em presença e na ausência de fármaco sob condições identi cas às que foram utilizadas para o ensaio anti-viral anterior mente descrito. Procedeu-se à contagem das células decorridos 6 dias utilizando um hemacitómetro e recorrendo ao método de exclusão do azul de tripano, conforme descrito por Schinazi et al., Antimicrobial Agents and Ghemoterapy, 22(3), 499 (1982). 0 valor ΟΙ^θ ou a concentração do composto que inibe 50% de desenvolvimento celular normal.

QUADRO 3

Valores ΟΕ^θ e ΟΙ^θ para diversos análogos dos nucleósidos de 1,3-oxatiolano em células MSP humanas

Codigo	X	ou I	R	Actividade	Citotoxicidade
				Antiviral	CI50, PM
				..KM
DLS-009	X	= 0	H	> 100	> 100
DLS-010	X	= 0	Me	64.4	> 100
DLS-027	X	= 0	F	> 100	> 100
DLS-028	X	= 0	Cl	60.8	> 100
DLS-044	X	= 0	Br	> 100	> 100
DLS-029	X	= 0	I	>100	>100

D1S-020	Y = nh2	H	0.02	> 100
KDS-011	y = nh2	Me	>10	> 100
DIiS-022	Y = NH2	F	0.01	> 100
ULS-023	y = nh2	01	38.7	> 100
D1S-021	y = nh2	Br	77.4	> 100
DES-026	Y -	I	0.72	> 100
DLS-058(-)	Y = NH2	p	0.008	> 100
DbS-O59(+)	Ϊ = NHg	P	0.84	> 100
DLS-053	y = nh2	aj?3	60.7	> 100

Conforme se indica no Quadro 3, os nucleósidos de

1,3-oxatiolano substituídos por citosina são de uma forma geral mais activos do que os correspondentes nucleósidos de uracilo. Estimou-se o erro da determinação dos valores ΟΕ^θ e ^CI50 ^em aproximadamente + 10%.

Um dos compostos, (+)-FTC, (identificado pela designação '’DIiS-022”, composto 8) não só exibe uma actividade excepcional (aproximadamente 10 nM em células MSP) mas exibe também uma toxicidade bastante fraca ( ) 100 jiM em células MSP, Vero e CEM). Além disso, 0 enantiómero (-) de ETC (DLS-058) exibe uma actividade significativamente superior à da mistura racémica.

valor ΟΙ^θ correspondente a (+)-FTC foi superior a 100 μΜ indicando que o composto não é tóxico para as células MSP não infectadas para o valor de concentração até 100 uM.

Exemplo 7: Actividade anti-virai dos enantiómeros do ETC cuja resolução foi feita por GLER

Os enantiómeros do ETC foram isolados em conformi dade com o método descrito no Exemplo 4 e avaliou-se a sua ac tividade anti-viral em conformidade com o método descrito no Exemplo 6. Os resultados obtidos estão indicados no Quadro 4 e ilustrados na Figura 5·

Quadro 4

Actividade anti-viral dos enantiómeros (+) e (-) do FTO

Concentração de trata- DPM/ml % de inibição CE-,

mento (pM)

(valores corrigidos )

0.018

FTG (+) 0.0001	73,755	26.6
0.005	83,005	16.3
0.01	60,465	41.3
0.05	34,120	70.4
0.1	14.160	92.4
0.5	18,095	88.1
1	7,555	99.7
5	7,940	99.3
10	5,810	101.7
ETC (-) 0.001	76,275	23.8
0.005	58,590	43.3
0.01	75,350	24.8
0.05	28,890	76.2
0.1	13,175	93.5
0.5	9,485	97.6

0.02

FTC (+) 0.001	94,340	3.8	0.28
0.005	107,430	-10.6
0.01	99,465	—1*8
0.05	87,120	11.8
0.1	86,340	12.7
0.5	33,225	71.4

A partir do quadro 4 é admissível concluir que nesta experiência o enantiómero (-) do ETC seja aproximadamen te uma ordem de grandeza mais potente do que o enantiómero (+) do FTC e que possua aproximadamente a mesma quantidade an ti-VIH da mistura racémica. Nem os enantiómeros nem a mistura racémica são tóxicos até à concentração correspondente a 100 μΜ conforme medido pelo método de exclusão ao azul de tripano em células MSP humanas.

Exemplo 8í Actividade anti-virai do enantiómeros do ETC cuja resolução foi efectuada em conformidade com o meto do dp Exemplo 3.

Bfectuou-se também a resolução dos enantiómeros de (±) -ETC em conformidade com o método do Exemplo 3 e avaliou -se a sua actividade anti-viral em conformidade oom o método descrito no Exemplo 6. Os resultados obtidos estão ilustrados na Figura 6. Conforme se indica na Figura 6, o valor CE^_Q para a mistura racémica de FTC foi de 0.017 μΜ, o valor ΟΕ^θ do composto (-)-FTC foi de 0.0077 pM θ o valor do composto (+)-FTC foi de 0.84 pM.

Exemplo 9í Absorção de (+)-FTC em células MSP humanas

Foram efectuados estudos utilizando FTC marcado radioactivamente para efectuar o acompanhamento dos perfis in tracelulares do fármaco original e dos metabolitos detectados no interior da células. Todos os- estudos foram efectuados em

- 46 duplicado. Utilizando células mononucleares do sangue periférico humano (células MSP) preparou-se uma suspensão em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro de vitela fetal e antibióticos (2 x 10 celulas/ml, 10 ml para cada ponto de observação) e procedeu-se à sua incubação com adição de 10 μ,Μ de FTC (actividade específica de cerca de 700 dpm/pmol). As células foram expostas ao farmaco durante 2, 6, 12 e 24 horas. Nesses momen tos de observação removeu-se o meio e procedeu-se à lavagem das células por duas vezes utilizando uma solução salina de Hank equilibrada e arrefecida. Efectuou-se a extração por adi ção de 0,2 ml de uma mistura fria constituída por 60% de meta nol/água e armazenou-se durante a noite à temperatura de -70°

C. Na manhã seguinte procedeu-se ã centrifugação das suspensões e repetiu-se as extrações por duas vezes durante 0.5 horas à temperatura de -70°0. Iiiofilízou-se a quantidade total de sobrenadantes (0,6 ml) até à secagem. Com os resíduos obti dos preparou-se nova suspensão em 250 μΐ de água e procedeu-se à análise de aliquotas compreendidas entre 50 e 100 pl por cromatografia em líquido de elevado rendimento (CIER). A quantificação do fármaco original intracelular e dos derivados metabólicos foram efectuadas por cromatografia em líquido de elevado rendimento (CLER). Bevido à potencial instabilidade de alguns compostos em presença de ácidos utilizou-se um sistje ma tampão com um valor de pH próximo dos valores fisiológicos para a separação dos metabolitos.

A Figura 7 representa um gráfico da presença (absorção) de (+)-FTC tritiado em células MSP humanas (média de 2 determinações) em função do tempo (hora) com um valor de pmol/10^ células. Esses estudos de absorção indicam que o com posto FTC marcado radioactivamente é facilmente absorvido pelos linfócitos humanos, havendo uma produção de quantidades muito grandes do derivado 5‘-trifosfato de FTC.

Exemplo 10: Actividade anti-retrovirai do FTC em diversas linhas celulares

Mediu-se a actividade anti-retroviral do ETC em diversas linhas celulares recorrendo a procedimentos semelhan tes, mas não idênticos, ao procedimento especificado no Exemplo 6. Essas linhas celulares foram obtidas a partir de doado res humanos através da instituição “AIDS Researoh and Referen ce Reagent Program, NIH, Rockville, Maryland ATCC” ou através da Cruz Vermelha. As células CEM deficientes em quinase da ti midina foram preparadas por passagem sequencial das células CEM em presença de 5-bromo-2’-desoxiuridina. Os resultados ob tidos estão indicados no Quadro 5.

Quadro 5

Actividade antiretroviral do ETC em diferentes sistemas celulares

Sistema celular (estirpe de virus)	CB50 (μΜ) (+)-MC
VIH-1
CMSP (VAL-1)	0.027
MT2	0.89
CEM (VAL-1)	0.08
CEM-TK^) (VAL-1)	0.026
CEM (VLTHiiib) NIH	0.09
VIH-2
CMSP (R0D2)	0.0038 (+)-FTC

0.0007 (-)-ETC

0.026 (+)-ETC

VIS

AA-2 (VIS251) 4.6

C-8166 (VIS251) <8.0

- 48 VIJ?

Cr ΕΚ (61E)

Exemplo 115 Egresso de (+)-ET(J a partir de células MSP humanas

Foram efectuados estudos utilizando ETC marcado ra dioactivamente para a acompanhamento dos perfis intracelulares do fármaco original e dos metabolitos detectados no interior da células após incubação em meio contendo 0 fármaco durante 24 horas e depois procedeu-se à remoção do fármaco. Este estu do permite medir 0 tempo necessário para que ocorra 0 declínio dos níveis intracelulares dos trifosfatos. Os estudos foram e fectuados em duplicado. Com células não infectadas (2 x 10 ml) preparou-se uma suspensão em meio adequado enriquecido com soro (10 ml por tempo de observação) e efectuou-se a incu bação à temperatura de 37°0 numa incubadora em atmosfera contendo 5% de 00^. A concentração do ETC marcado radioactivamen te foi de 10 μΜ. Após tratamento das células com 0 composto marcado radioactivamente durante 24 horas procedeu-se a uma lavagem completa das células e depois adicionou-se-lhes meio recente sem fármacos anti-virais (0 horas). Decorridas 0, 2, 4, 6, 12, 24 e 48 horas (segunda série de períodos de incubação ) procedeu-se à remoção das células e efectuou-se imediata mente a extração utilizando uma mistura arrefecida constituída por 60% de metanol/água. O extrato foi obtido por centrifu gação e remoção do granulado celular. Efectuou-se a liofiliza ção dos extractos e 0 produto assim obtido foi armazenado à temperatura de -70°C. Antes da análise preparou-se nova suspensão do material em 250 microlitros de tampão para CLER e analisou-se imediatamente. A quantificação do fármaco original intracelular e de derivados metabólicos foi efectuada por CIiER recorrendo a um sistema Micromeritics ou Hewlett-Packard, modelo 1090 J?HLCí” em coluna de permuta de aniões Partisil 10 SAX (V/hatman, Inc.) com um débito de 1 ml/minuto à pressão a

** proximada de 7 x 10 Pa, com detecção por UV a 262 nm. A fase móvel ara constituída por água desionizada (A), 2 mM NaHgPO^/ /16 mM laOic (pH « 6.6) (B), 15 mM M₂P0₄/120.2 mM NaOAc (pH = 6.6) (0), e 100 mM NaH₂P0₄/800 mM NaOAc (pH = 6.6) (D).

Método de separação; regime isocrático durante 5 minutos com A, seguindo-se durante 5 minutos a aplicação de um gradiente linear até 100% de B e depois mais 20 minutos de aplicação de um gradiente linear até 100% de 0 seguindo-se 10 minutos de aplicação de um gradiente linear até 100% de B e finalmente regime isocrático com 100% de D durante 30 minutos.

Tempos de retenção (minutos) em células humanas:

Oomposto Invariável Monofosfato Bifosfato Trifosfato (+)-FTC 5.0 39.0 55.0 68.0

A Figura 8 representa um gráfico do egresso do composto (+)-FTC marcado radioactivamente a partir de células MSP humanas, medido em horas após a remoção do fármaco em fun ção da concentração (pmol/10^ células). Conforme se indica na Figura, o trifosfato de FTC possui um período de meia vida in tracelular de aproximadamente 12 horas e pode ser facilmente detectado intracelularmente para valores de concentração compreendidos entre 1 e 5 J1M decorridas 48 horas após a remoção do fármaco extracelular cujo valor está bastante acima do cor respondente valor CE,-^ para o composto. Por outro lado, a cons tante de afinidade (X¹) para o trifosfato de (+)-FTG utilizan do o tempo de retenção (RT) do VIH corresponde a 0.2 jiM o qual é um valor inferior ao nível de concentração decorridas 48 horas.

Exemplo 12: Actividade anti-ΉΗ dos derivados de (+)-FTC farmaceuticamente aceitáveis

Procedeu-se à avaliação da actividade anti-VIH de

diversos derivados do (±) -ETG farmaceuticamente aceitáveis preparados por modificações nas posições 5’ e / em células

MSP recorrendo a um procedimento semelhante aos descrito no

Exemplo 6. Os resultados obtidos são os que a seguir se indica. 0 éster 5'-0-butirato de (+) respondente a 0.0017. 0 derivado

-ETC exibiu um valor CE™ cor z 50N -acetílico de (+)-ETG exia 0.0028. 0 éster 5’-0-buti» exibiu um valor CE™ corres50 biu um valor CE^₀ correspondente rato modificado em N^ de (+)-ETC pondente a 0.0058.

b. A actividade anti-VIH do éster 5’-0-butirato de (+)-ETC no sistema MT4 (ΟΕ^θ) foi de 0.04 μΜ. No mesmo ensaio, o composto (+)-FTC não acilado exibiu um valor ΟΙ^θ correspondente a 0.52 pM. 0 valor ΟΙ^θ P^{ara 0} composto AZT nesse sistema foi de 0.09 uM.

V. Capacidade do composto ETC para inibir a replicação do VHB

Exemplo 13í Avaliação da actividade dos enantiómeros (+) e (-) de ETC em culturas celulares 2.2.15

Seguidamente descreve-se em pormenor a capacidade dos enantiómeros de ETC para inibir o desenvolvimento de virus em culturas celulares 2.2.15 (células HepG2 transformadas com o virião da hepatite).

Existe um resumo e uma descrição do ensaio relati vos aos efeitos anti-virais neste sistema de cultura e relati vos à análise do ADN do VHB (Korba and Milman, 1991, Antiviral Res., 15:217). As estimativas anti-virais foram efectuadas recorrendo a duas passagens celulares separadas. Todas as cavi dades de todas as placas foram inoculadas segundo o mesmo valor de densidade e no mesmo instante.

Parâmetros de ensaio

Devido às variações inerentes nos níveis do ADN do — 51 *·

VHB intracelular e extracelular apenas se considera estatisti camente significativas /”^<θ·θ5_7 as depressões superiores a

3.5 (no caso do ADN do virião do VHB) ou superiores a 3.0 vezes (no caso dos intermediários para a replicação do ADN do VHB) relativamente aos níveis médios dessas formas de ADN do VHB em células não tratadas. Foram utilizados os níveis de ADN do VHB integrado em cada preparação de ADN celular (os quais permanecem constantes nessas experiências tomando como base a concentração celular) para calcular os níveis das formas de ADN do VHB intracelular, garantindo-se deste modo que foram comparadas quantidades iguais de ADN celular entre amos tras independentes.

Os valores típicos para o ADN do virião VHB extra celular em células não tratadas variam entre 50 e 150 pg/ml de meio de cultura (valor médio correspondente aproximadamente a 76 pg/ml). Os valores típicos para os intermediários de replicação do ADN do VHB intracelular em células não tratadas criaram aproximadamente entre 50 e 100 pg/pg de ADN celular (valor médio correspondente a aproximadamente a 74 pg/pg de ADN celular). De uma forma geral, as depressões nos níveis do ADN do VHB intracelular devidas ao tratamento com compostos anti-virais são menos pronunciadas e ocorrem mais lentamente do que as depressões nos níveis do ADN do virião VHB (Korba and Milman, 1991, Antiviral Res., 15:217).

O processo segundo o qual foram efectuadas as aná lises de hibridação para essas experiências proporcionou uma equivalência de aproximadamente 1.0 pg de ADN do VHB intracelular para 2-3 copias genómicas por célula e 1.0 pg/ml do ADN do VHB extracelular para 3 x 10⁵ partículas virais/ml.

Análise de toxicidade

Foram efectuadas análises de toxicidade para se

determinar se quaisquer efeitos antivirais observados poderiam ser consequência de um efeito geral sobre a viabilidade celular. 0 método utilizado consistiu em medir a absorção de corante vermelho neutro que é um ensaio normalizado e amplamente utilizado para a determinação de viabilidade celular numa ampla variedade de sistemas virus-hospedeiro incluindo o VHS e o VIH. As análises de toxicidade foram efectuadas em placas de cultura tecidual de fundo plano com 96 cavidades. As células para as análises de toxicidade foram cultivadas e tratadas com os compostos de ensaio em conformidade com o mesmo ca lendário estipulado para as avaliações anti-virais adiante in dicadas. Cada composto foi testado segundo quatro valores de concentração e cada um deles em culturas em triplicado (cavidades A, ”B” e C”), Recorreu-se à absorção do corante vermelho e neutro para determinar o nível relativo de toxicidade. Utilizou-se o valor da absorvência do corante internalizado a 510 nm (A_q^_n ) para uma análise quantitativa. Os valores obtidas são apresentados sob a forma de percentagem dos valores médios ^sin ^em 9 culturas independentes de células não tratadas mantidas na mesma placa de 96 cavidades dos compostos de ensaio. A absorção de corante nas 9 culturas de controlo na placa 5 variou entre 91.6% e 110.4% e na placa 6 variou entre 96.6% e 109%. Os resultados obtidos estão agrupados no Quadro 6.

- 53 Análise de toxicidade dos compostos de ensaio em células

2.2.15

Quadro 6

Placa	Composto	Cone. (pM)	Absorção de corante (% de contro-
Cavidade A	lo) Cavidade B Cavidade C
5	DMSO	10.0*	0.7	1.6	0.9
		3.3	55.9	68.7	61.7
		1.0	91.2	96.4	106.8
		0.3	98.7	102.9	93.5
6	(- )-PTC	300	53.0	51.1	51.5
		100	64.1	66.6	77.6
		30	98.7	94.3	96.4
		10	94.3	94.9	92.2
6	(+)-FTC	300	43.4	56.7	58.5
		100	77.7	66.3	72.1
		30	81.1	88.3	88.1
		10	90.9	99.4	90.5

X Para o DMSO, as concentrações sao apresentadas em valor percentual da solução de reserva original.

Avaliaçao da toxicidade

Conforme se indica no Quadro 6 não foi observada toxicidade significativa (superior a 50% de depressão dos níveis de absorção de corante observados em células não tratadas) com os compostos de ensaio para os valores de concentração utilizados para as estimativas anti-virais. Ambos os compostos (-)-FTC e (+)-FTC manifestaram toxicidade para os valores de

concentração mais elevados utilizados nos ensaios de toxicida de (330 jaM).

Estimativas anti-virais

Controlos

Dentro dos limites de variação normais os níveis de ADN do virião do VHB e dos intermediários de replicação dos VHB intracelulares /“iH VHB_7 permaneceram constantes nas células não tratadas durante o período de aplicação de estímu lo. 0 composto DMSO, para o valor de concentração correspondente a 1%, não afectou os níveis de replicação dos VHB em culturas de células 2.2.15.

Compostos de ensaio

Conforme se indica no Quadro 7 ambos os compostos (-)-ETC e (+)-FTC inibem significativamente a replicação dos VHB para os níveis testados. Conforme se indica no Quadro 8 o com posto (-)-ETC também inibe significativamente a síntese do ADN do virião VHB e do ADN dos VHB intracelulares para valores de concentração correspondentes a 4, 1 e 0,25 μΜ.

- 55 HW»

Quadro 7

Efeito dos compostos de ensaio sobre a produção de VHB em culturas de células 2.2.15

ADN do virião do VHB* ABN do VHB (pg/ml intracelumeio de cultura) lar (pg/pg de

Oavi- ADN celular)

dade	Tratamento	DIA 0	42 DIA 92 DIA MONO.	IR
7A	Células	não tratadas	59	75	94	2.7	93
7B	Células	não tratadas	47	64	88	2.5	93
8A	células	não tratadas	65	100	71	2.2	97
8B	Células	não tratadas	77	65	110	2.4	62
7K	DMSO @	1.00%	100	50	48	1.9	95
71	DMSO @	1.00%	48	96	54	2.8	98
8X	DMSO @	1.00%	93	63	68	2.2	86
8L	DMSO @	1.00%	66	57	59	1.6	97
9U	(-)-FTC	@ 10 pM	120	36	1	1.1	14
9V	II	@ 10 pM	89	48	1	1.5	19
10U	n	@ 10 pM	58	41	0.1	1.9	13
10V	π	@ 10 pM	110	32	0.1	1.2	16
9W	(+)-FTC	§ 10 pM	88	42	0.1	0.8	14
9X	II	§ 10 pM	58	57	0.2	0.4	19
10W	II	@ 10 pM	69	55	0.1	0.7	17
10X	II	@ 10 pM	45	39	0.1	0.4	15

* 0 valor de transição da sensibilidade para o ADN do virião do VHB foi de 0.1 pg/ml.

Ç Analisou-se o ADN do VHB intracelular decorridas 24 horas após o 9² dia de tratamento. Os níveis de ADN de VHB integrado em cada preparação de ADN celular foram utilizados pa

ra calcular os níveis dos genomas do VHB de 3.2 Kb epissomais (MONO) e dos intermediários de replicação do ADN do VHB (IR)

Quadro 8

Efeito dos compostos de ensaio sobre a produção de VHB em culturas de células 2.2.15

ADN do virião do VHB* ADN do VHB* (pg/ml meio de cultura)

Caviintracelular (pg/pg de ADN celular)

dade	Tratamento	DIA 0	42 DIA	92 DIA	MONO.	IR
31A	Células não tratadas	64	54	65	2.8	65
31B	II	51	54	77	2.0	53
32A	1!	100	76	56	3.5	81
32B	II	53	97	83	3.1	68
35A	(-)-FTO @ 4 jaM	74	27	> 0.1	1.4	1
55B	II	87	28	> 0.1	0.5	1
36A	II	120	20	1	0.9	1
36B	II	59	16	0.2	0.2	2
350	(-)-FTC @ 1 μΜ	70	15	> 0.1	1.7	2
35D	II	62	15	> 0.1	1.2	3
360	II	60	22	1	1.4	2
36D	II	89	28	0.3	1.5	4
35E	(-)-PTC @ 0.25 uM	84	15	> 0.1	1.5	4
35?	II	89	16	4	2.2	4
36E	II	66	13	1	1.8	8
36F	tl	49	19	0.1	0.3	9

* 0 valor de transição da sensibilidade para o ADN do virião

βώπ

do VHB foi de 0.1 pg/ml.

(3 Analisou-ae o ADN do VHB intracelular decorridas 24 horas após o 9^S dia de tratamento. Os níveis de ADN de VHB integrado em cada preparação de ADN celular foram utilizados pa ra calcular os níveis dos genomas do VHB de 3.2 Zb epissomais (MONO) e dos intermediários de replicação do ADN do VHB (IR).

Exemplo 14: Absorção de (+)-FTC nas células do fígado de seres humanos; actividade do composto ETC sobre o VHB

Repetiu-se o procedimento do Exemplo 9 com células do fígado de seres humanos (células HepG2 disponíveis em ATOO) para determinação da absorção e do metabolismo do composto FTG nessas células. Conforme se indica na Figura 9, os compostos (+)-ITC são absorvidos pelas células HepG-2 em grandes quantidades. Essas células do fígado de seres humanos metabolizam uma grande percentagem dos compostos (+)~FTC propor cionando trifosfatos de (+)-ETG.

Este resultado conjuntamente com outros resultados agora obtidos indicam que a mistura de compostos (jh)-FTC e bem assim os seus enantiómeros (-) e (+) são fosforilados nas células do fígado. Essas células podem ser transformadas com o virus da hepatite B.

Exemplo 15: Egresso do composto FTC em células HepG2 de seres humanos.

A Figura 10 ilustra o egresso de /~^H_7-(+)”FTG e dos seus derivados fosforilados em células HepG2 de seres humanos para valores de concentração correspondentes a pmol/10^ células em função do tempo após tratamento dessas células com 10 de Z“⁵h7-(±)-FTG (700 DFM/pmole) durante 24 horas e

procedendo à avaliação da concentração do composto decorridas 24 horas após a remoção.

A Figura 11 ilustra 0 decréscimo dos valores das concentrações combinadas de /~^H__7“(+)-ETC e dos seus derivados fosforilados observado em células Hep&2 de seres humanos após incubação com 10 pM de /”^JL7-(í)-FTC (700 DPM/pmole) du rante 24 horas para 0 valor de concentração do pmol/lO^ células em função do tempo.

Conforme se encontra ilustrado, mesmo decorridas 48 horas continua a existir nas células mais de 1 pM do compos to activo (0 que é significativamente superior ao valor ΟΕ^θ para 0 composto).

V. Toxicidade em células precursoras de granolócitos-macrófagos

Exemplo 16: Efeito do composto FTC sobre a formação de colónias em células precursoras de granolócitos-macró fagos.

A Figura 12 representa um gráfico do efeito dos enantiómeros (-) e (+) do composto FTC sobre a formação de co lónias de células precursoras de granolócitos-macrófagos, medindo-se esse efeito em valor percentual de sobrevivência em função da concentração em pM ((-)-FTC, círculo simples; em (+)-FTG, círculo enegrecido; AZT, quadrado enegrecido. Confor me se indica, 0 enantiómero (-) do composto FTC parece ser me nos tóxico, isto é, possui um valor ΟΙ^θ superior relativamen te ao enantiómero (+) ou relativamente ao composto AZT nesta linha celular.

VI. Farmacocinética do composto FTC

Exemplo 17: Metabolismo do composto FTC quando administrado

aos ratos

Administrou-se (+)-ETC intravenosamente aos ratos segundos doses correspondentes a 10, 50 e 100 mg/kg e procedeu-se à avaliação da área limitada pela curva representativa da concentração do fármaco no plasma em função do tempo (ASC), eliminação total (EL·^), volume estacionário de distribuição (Ved), tempo médio de resideneia (TMR) e período de meio dia (ty₂)· resultados obtidos estão resumidos no Quadro 9.

Quadro 9

Parâmetros farmacocinéticos tração intravenosa em ratos mg/kg * do composto ETC após adminissegundo dose de 10, 50 e 100

Dose	ASC	EI^	Ved	TMR	^2
mg/kg	mg h/L	L/h/kg	L/kg	h	h
10	9.65	0.988	0.758	0.768	0.757
50	57.11	0.874	0.699	0.800	0.815
100	120.72	0.830	0.663	0.798	0.969

ASC = área sob a curva de concentração do fármaco no plasma em função do tempo; EI^ = eliminação total; Ved » volume estacionário de distribuição; TMR = tempo médio de resi dência; e ty₂ = período de meia-vida.

Exemplo 18í Parâmetros farmacocinéticos para o composto ETC após a administração intravenosa e oral de ETC libram determinados parâmetros farmacocinéticos in dependentes do modelo para a mistura (+J-ETC por administração (intravenosa (I.V.) e oral (P.O.)) de 33·3 mg/kg a macacos Rhesus. Os resultados estão agrupados no Quadro 10. Eaz60 -

-se observar que a biodisponibilidade média do composto nos macacos foi de 73% (+ 6%).

Quadro 10

Parâmetros farmacocinéticos independentes do modelo obti dos para o composto FTC após administração intravenosa (IV) ou oral (P.O) de 33«3 mg/kg aos macacos Rhesus*

Macaco	ASO mg/h/l·	ELt Ved L/h/kg L/kg	TMR h	t3/2 h	K a^ h-	F 1
RUh	19.14	1.74	2.71	1.56	1.28
RMi	26.31	1.26	1.97	1.56	1.22
RJd	22.51	1.48	2.00	1.36	1.47
Media	22.65	1.49	2.23	1.49	1.32
+ D.P.	3.59	0.24	0.42	0.12	0.13
P.O.
RUh	13*21			2.07	1.58	0.48	71
RMi	21.11			2.32	1.08	0.43	80
RJd	15.29			3.23	1.47	0.31	68
Media	16.54			2.54	1.38	0.41	73.00 (+6)
± £·£·	4.09			0.61	0.26	0.09	6.24
* ASO :	» área sob a curva de	concentração do	fármaco	no pias-

ma em função do tempo; EL. a eliminação total; Ved = volu< *v Z me estacionário de distribuição; TMR = tempo medio de resideneia; e ty₂ = período de meia-vida; F = biodisponibilidade; e constante do regime de absorção de primeira orcl dem.

Quadro 11

Razão entre o ETC do FEC/SS e correspondentes valores para o seu metabolito desaminado 1 hora após o tratamento

Macaco	Via	FTG	Metabolito (FTU)
RUh	I.V.	0.076	0.024
RMi	I.V.	0.062	0.032
RJd	I.V.	0.162	0.052
Media		0.100	0.036
		0. Οδ-Ι-	0.014
RUh	P.O.	ο. 048	0.026
RMi	P.O.	0.039	0.037
RJd	P.O.	0.117	0.055
Media		0.068	0.039
+ D.P.		0.043	0.015
Exemplo 19:	Razão entre o	ETC do FEC/SS	e correspondentes va-

lores para os seus metabolitos em macacos Rhesus.

Avaliou-se a capacidade da mistura (+)-FTC para atravessar a barreira sangue/cérebro por administração do com posto activo segundo uma dose de 33*3 mg/kg a macacos Rhesus e medindo a quantidade de (+)-FTC no fluido espinal cerebral (FEG) e no soro sanguíneo (SS) decorrida 1 hora após a administração. Os resultados estão resumidos no Quadro 11. Esses resultados indicam que uma quantidade significativa de eompos. to activo passa através da barreira sangue/cérebro neste mamí fero.

III. Preparação de composições farmacêuticas

Os seres humanos que sofrem de doenças provocadas

por infecções de VIH ou de VHB podem ser tratados administran do-lhes uma quantidade eficaz de (+)-FTC ou dos seus enantiómeros (-) ou (+) ou um seu sal ou derivado farmaceuticamente aceitável em conjunto com um veículo ou diluente farmacêutica mente aceitável. As substâncias activas podem ser administradas por qualquer via adequada, por exemplo, por via oral, parentérica, intravenosa, intradermal, subcutânea ou por via té pica, em composições no estado líquido ou no estado sólido.

ingrediente activo é incorporado no veículo ou no diluente farmaceuticamente aceitável numa quantidade suficiente para fornecer a um paciente uma quantidade terapêutica mente eficaz do composto destinado a inibir a replicação virai ⁱⁿ vivo» especialmente a replicação do VIH e do VHB, sem provocar efeitos tóxicos graves ao paciente tratado. O termo quantidade inibidora significa uma quantidade de ingrediente activo suficiente para exercer um efeito inibidor que é possível medir, por exemplo, em conformidade com um ensaio idântico aos que foram descritos.

Considera-se uma dose preferencial dos compostos (-), (♦) ou (+)-FTC para todas as situações anteriormente referidas aquela que corresponde a valores compreendidos aproxi madamente entre 1 e 50 mg/kg, de preferência entre 1 e 20 mg/ /kg de massa corporal por dia, mais geralmente entre 0.1 e 100 mg aproximadamente por quilograma de massa corporal do pa ciente por dia. 0 intervalo de dosagem eficaz dos derivados farmaceuticamente aceitáveis pode ser calculado tomando como base a massa do nucleósido original que se pretende fornecer. No caso de o derivado exibir actividade por si próprio é possível avaliar a dose eficaz conforme descrito antes relativamente à massa do derivado, ou recorrendo a quaisquer outros ¹ meios conhecidos pelos especialistas na matéria.

Os compostos são administrados convenientemente

em formas de dosagem unitárias adequadas, eventualmente conten do entre 7 e 3000 mg e de preferência entre 70 e 1400 mg de ingrediente activo por forma de dosagem unitária, sem que isso constitua qualquer limitação. Normalmente considera-se con veniente uma dose oral compreendida entre 50 e 1000 mg.

De uma forma ideal o ingrediente activo deve ser administrado de modo a proporcionar concentrações de pico plásmicas do composto activo variáveis aproximadamente entre 0.2 e 70 e de preferência compreendidas entre 1.0 e 10 jiM. Ê possível conseguir estes valores, por exemplo, por injecção intravenosa de uma solução variando entre 0.1 e 5% de ingrediente activo, facultativamente em soro fisiológico, ou por administração de uma ampola de ingrediente activo.

A concentração do composto activo na composição do fármaco dependerá das taxas de absorção, de inactivação e de excreção do fármaco e também de outros factores conhecidos pelos especialistas na matéria. Faz-se observar que os valores de dosagem variarão também com a gravidade do estado que se pretende tratar. Salienta-se ainda que para qualquer paciente particular os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo em conformidade com as necessidades individuais e em conformidade com a opinião pessoal da pessoa que administra ou que supervisiona a administração das composições, chamando-se a atenção para o facto de os interva los de concentração agora especificados serem apenas exemplificativos e não pretenderem limitar o âmbito ou a prática de utilização da composição reivindicada. 0 ingrediente activo pode ser administrado de uma só vez ou a sua administração po. de ser efectuada de uma forma dividida em diversas doses meno res que são administradas em intervalos de tempo variáveis.

A via oral constitui um modo preferencial de admi nistração do composto activo. As composições para administração incorporarão geralmente um diluente inerte ou um veículo — 64 —

comestível. Podem estar encerradas em cápsulas de gelatina ou comprimidas em pastilhas. Para efeitos de administração terapêutica oral o ingrediente activo pode ser incorporado com ex oipientes e utilizado sob a forma de comprimidos, pastilhas ou capsulas. Os agentes de ligaçao farmaceuticamente compatíveis e/ou os materiais adjuvantes farmaceuticamente compatíveis po dem ser incorporados como parte da composição.

Os comprimidos, pílulas, cápsulas, pastilhas e se melhantes podem conter quaisquer dos ingredientes ou compostos de natureza semelhante a seguir indicados: um ligante tal como a celulose microcristalina, a goma alcantira ou a gelatina; o excipiente tal como o amido ou a lactose, um agente desint£ grador tal como o ácido algínieo, Primogel ou amido de milho; um agente lubrificante tal como o estearato de magnésio; um agente deslizante tal como o dióxido de silício colóidal; o agente edulcorante tal como a sacarose ou a sacarina; ou ainda um agente aromatizante tal como a hortelã-pimenta, o salicilato de metilo ou aroma de laranja. No caso de a forma unitária de dosagem ser uma cápsula ela pode conter para além dos materiais do tipo anterior um veículo líquido tal como um óleo gordo. Além disso, as formas unitárias de dosagem podem conter diversos materiais que modifiquem a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar, goma laca ou outros agentes entéricos.

A mistura de compostos (*)-ETC ou os seus enantió meros (-) ou (+) ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis po dem ser administrados como componentes de elixir, suspensão, xaropes, bolachas, goma de mascar ou semelhantes. 0 xarope po de conter, para além dos compostos activos, o agente edulcorante tal como a sacarose e alguns conservantes, matizantes e corantes e aromas.

A mistura de compostos (+)-FTC ou os seus enantió

meros (-) ou (+) ou os seus sais ou os seus derivados farmaceuticamente aceitáveis também podem ser misturados eom outras substâncias activas que não deteriorem a acção desejada, ou com substâncias que melhorem a acção desejada tais como antibióticos, agentes anti-fúngicos, agentes anti-inflamatórios ou outros agentes anti-virais, incluindo outros nucleósidos de compostos anti-VIH.

As soluções ou suspensões utilizadas para aplicação parentérica, intradermal, subcutânea ou tópica podem incorporar os componentes seguintes: um diluente estéril tal co mo a água para injecções, solução salina fisiológica, óleos estáveis, polietileno-glicóis, glicerina, propileno-glicol ou outros solventes sintéticos; agentes anti-bacterianos tais co mo o álcool benzílico ou o metil-parabeno; agentes anti-oxidantes tais como o ácido ascórbico ou o bissulfito de sódio; agentes quelíferos tais como o ácido etileno-diamino-tetraacético; agentes tampão tais como os acetatos, os citratos ou os fosfatos e agentes para ajustar a tonicidade tais como o cloreto de sódio ou a dextrose. A preparação parentérica pode ser encerrada em ampolas, em seringas descartáveis ou em fras cos de doses múltiplas feitos de vidro ou de plástico. No caso de a administração se fazer por via intravenosa os veículos preferenciais são a solução salina fisiológica ou a solução salina tamponada com fosfato (PBS).

De acordo com uma variante preferencial os compo_s tos activos são preparados eom veículos que protejam esses compostos contra a sua rápida eliminação do corpo, tais como as formulações de libertação controlada, incluindo os implantes nos sistemas de fornecimento microencapsulados. Ê possível utilizar polímeros biodegradáveis e biocompatíveis tais como o acetato de etileno e vinilo, os polianidridos, o ácido poliglicólico, o colagéneo, os poliortoésteres e o ácido poli láctico. Os métodos para a preparação dessas formulações são

evidentes para os especialistas na matéria. Esses materiais também podem ser obtidos comercialmente na ”Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.”,

As suspensões lipossómicas (incluindo os lipossomas dirigidos para células infectadas com anticorpos monoclonais que visam antígenos virais) também são preferenciais como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Essas suspensões po dem ser preparadas em conformidade com métodos conhecidos pelos especialistas na matéria, por exemplo, conforme descrito na patente Norte Americana n^s 4522811 (cujo conteúdo se consi dera aqui incorporado como referência). Por exemplo, é possível preparar formulações lipossómicas dissolvendo lípidos ade quados (tais como estearoil-fosfatidil-etanolamina, estearoil -fosfatidil-colina, aracadoil-fosfatidil-colina e colesterol) num solvente inorgânico que é depois evaporado deixando uma película fina de lípido seco sobre a superfície do recipiente. Depois introduz-se nesse recipiente uma solução aquosa do com posto activo ou dos seus derivados monofosfato, difosfato e/ /ou trifosfato. O recipiente é depois agitado manualmente para libertar o material lipídico das paredes do recipiente e para dispersar os agregados lipídicos proporcionando assim a formação da suspensão lipossómica.

IV. Preparação de derivados fosfatados de FIO

Os derivados mono-, di- e tri-fosfato do ETC podem ser preparados conforme adiante descrito.

Ê possível preparar o monofosfato em conformidade com o procedimento de Imai et al., J. Org. Chem,, 34(6), 1547 -1550 (Junho, 1969). Por exemplo, faz-se reagir cerca de 100 mg de ETC e cerca de 280 jil de cloreto de fosforilo sob agita ção numa quantidade aproximada de 8 ml de acetato de etilo anidro à temperatura aproximada de 0°C durante cerca de 4 horas. Depois tempera-se a reacção com gelo. Purifica-se a fase

aquosa em coluna de carvão activado fazendo a eluição com uma solução de hidróxido de amónio a 5% numa mistura de etanol e água 1:1. A evaporação do eluente proporciona o composto ETC-5’-monofosfato de amónio.

Ê possível preparar o difosfato em conformidade, com o procedimento de Davisson et al., J. Org. Chem.,52(9). 1794-1801 (1987). É possível preparar o difosfato de ETC a partir do correspondente tosilato o qual pode ser preparado, por exemplo, fazendo reagir o nucleósido com cloreto de tosilo em piridina à temperatura ambiente durante cerca de 24 horas e efectuando o processamento do produto pela forma habitual (por exemplo, lavando, secando e cristalizando).

Ê possível preparar o trifosfato em conformidade com o procedimento de Hoard et al., J. Am. Chem. Soc., 87(8), 1785-1788 (1965). Procede-se à activação do composto ETC (pr£ parando um imidazoleto em conformidade com métodos conhecidos pelos especialistas na matéria) e trata-se com pirofosfato de tributil-amónio em DMF. A reacção proporciona primeiramente o trifosfato de nucleósido havendo algum monofosfato e algum di fosfato que não reagem. Após purificação por cromatografia de permuta de aniões em coluna DEAE procede-se ao isolamento do trifosfato, por exemplo, sob a forma do correspondente sal de tetra-sódio.

A presente invenção foi descrita tomando como referência os seus aspectos preferenciais. As variações e modificações da presente invenção são evidentes para os especialis tas na matéria a partir do texto descritivo anteriormente apresentado. Eaz-se observar que todas essas variações e modificações se consideram abrangidas no âmbito das reivindicações anexas.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - lâ - (+)- ^-D,L-2-hidroxi-metil-5-(5-fluoroeitosin-l-il)-l,3-oxatiolano, ou um seu derivado fisiologicamente acei tável, ou um seu sal fisiologicamente aceitável.

   - 2â - (-)- £-J^2-hidroxi-metil-5- (5-Íluorocitosin-l-ilJ -1,3-oxatiolano, ou um seu derivado fisiologicamente aceitável, ou um seu sal fisiologicamente aceitável, (+)- β -D-2-hidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin-l-il_2 -1,3-oxatiolano, ou um seu derivado fisiologicamente aceitável, ou um seu sal fisiologicamente aceitável.

   - 4a _

   Composto de acordo com a reivindicação 1 possuindo a fórmula estrutural!

   NHRp — 69 — caracterizado pelo facto de os radicais R^ e Rg representarem independentemente um grupo alquilo; um ester de um ácido carboxilico em que o radical não carbonilo do grupo ester é seleccionado entre grupos alquilo; alcoxi-alquilo; aralquilo; aril-oxi-alquilo; arilo de cadeia linear, ramificada ou cícli cos, incluindo o grupo fenilo facultativamente substituído com átomos de halogéneo ou com grupos alquilo(C^-C^) ou alcoxi ester sulfonato; alquil- ou aralquil-sulfonilo; um éster mono-, di- ou tri-fosfato, ou um ester de um aminoácido e um desses radicais R^ ou R₂ poder representar o átomo de hi dro génio.

   - 5â Composto de acordo com a reivindicação 2 de fórmu la estrutural;

   ^m2 caracterizado pelo facto de os radicais R-^ e R₂ representarem independentemente um grupo alquilo; um ester de um ácido carboxílico no qual o radical não carbonilo do grupo ester é seleccionado entre grupos alquilo; alcoxi-alquilo; aralquilo; aril-oxi-alquilo; arilo de cadeia linear, ramificada ou cícli cos, incluindo o grupo fenilo facultativamente substituído com átomos de halogéneo ou com grupos alquilo (C-^-G^) ou alco70 - )· ester sulfonato; alquil- ou aralquil-sulfonilo; um xi(C^-C ester mono-, di- ou tri-fosfato, ou um éster de um aminoácido, e um desses radicais R^ ou R₂ P°der representar o átomo de hi drogénio.

   - 6a Composto de acordo com a reivindicação 2 possuindo a fórmula estrutural:

   caracterizado pelo facto de os radicais R^ e R₂ representarem indepenâentemente um grupo alquilo; um ester de um ácido carboxílico no qual o radical não carbonilo do grupo ester é seleccionado entre grupos alquilo; alcoxi-alquilo; aralquilo; aril-oxi-alquilo; arilo de cadeia linear, ramificada ou cícli cos, incluindo o grupo fenilo facultativamente substitiâdo com átomos de halogéneo ou com grupos alquilo ou alcoxi(G1-C4); ester sulfonato; alquil- ou aralquil-sulfonilo; um ester mono-, di- ou tri-fosfato, ou um ester de um aminoácido, e um desses radicais R^ ou R₂ poder representar 0 átomo de hi drogénio.

   _ ya _

   Composto de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado pelo facto de os radicais R-^ e R₂ serem seleccionados independentemente entre o grupo constituído por metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, isopentilo, amilo, t-pentilo, 3-metil-buti rilo, ácido succinico, 3-cloro-benzoato, ciclo-pentilo, ciclo -hexilo, benzoilo, acetilo, pivaloilo, mesilato, propionilo, butirilo, valerilo, ácidos capróico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, oleico, aminoácidos in cluindo, sem que isso constitua uma limitação, alanilo, valinilo, leucinilo, isoleucinilo, prolinilo, fenil-alaninilo, triptofanilo, metioninilo, glicinilo, serinilo, treoninilo, cisteinilo, tirosinilo, asparaginilo, glutaminílo, aspartoilo, glutãoilo, lisinilo, argininilo e histidinilo, e um dos radicais R^ e R₂ poder representar o átomo de hidrogénio.

   - Composto de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo facto de os radicais R^ e R^ serem seleccionados independentemente entre o grupo constituído por metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, isopentilo, amilo, t-pentilo, 3-metil-buti rilo, ácido succinico, 3-cloro-benzoato, ciclo-pentilo, ciclo -hexilo, benzoilo, acetilo, pivaloilo, mesilato, propionilo, butirilo, valerilo, ácidos capróico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmitico, esteárico, oleico, aminoácidos in cluindo, sem que isso constitua uma limitação, alanilo, valinilo, leucinilo,isoleucinilo, prolinilo, fenil-alaninilo, triptofanilo, metioninilo, glicinilo, serinilo, treoninilo, cisteinilo, tirosinilo, asparaginilo, glutaminílo, aspartoilo, glutaoilo, lisinilo, argininilo e histidinilo, e um dos radicais R^ e Rg poder representar o átomo de hidrogénio.

   - Composto de acordo com a reivindicação 6, caracte

   - 72 '<

   rizado pelo facto de os radicais R e R₂ serem seleccionados independentemente entre o grupo constituído por metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, isopentilo, amilo, t-pentilo, 3-metil-buti rilo, ácido succínico, 3-cloro-benzoato, ciclo-pentilo, ciclo -hexilo, benzoilo, acetilo, pivaloilo, mesilato, propionilo, butirilo, valerilo, ácidos capróico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmitico, esteárico, oleico, aminoácidos in eluindo, sem que isso constitua uma limitação, alanilo, valinilo, leucinilo, isoleucinilo, prolinilo, fenil-alaninilo, triptofanilo, metioninilo, glicinilo, serinilo, treoninilo, cisteinilo, tirosinilo, asparaginilo, glutaminilo, aspartoilo, glutaoilo, lisinilo, argininilo e histidinilo, e um dos radicais R^ e Rg poder representar o átomo de hidrogénio.

   - 10 a Composto da reivindicação 7 caracterizado pelo facto de o radical R·^ representar o grupo n-butilo e o radical R₂ representar o átomo de hidrogénio.

   - llâ Composto d.a reivindicação 8 caracterizado pelo facto de o radical representar o grupo n-butilo e o radical Rg representar o átomo de hidrogénio.

   - 12 a -

   Composto da reivindicação 9 caracterizado pelo facto de o radical R-^ representar o grupo n-butilo e o radical Rg representar o átomo de hidrogénio.

   - 13â Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de conter uma quantidade eficaz, para tratar infecções provocadas pelos vírus HIV ou HBV em seres humanos, do composto 2-hidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin-l-il)-l,3-oxatiolano, na forma racémica, ou um seu derivado fisiologicamente aceitável ou um seu sal fisiologicamente aceitável, num veículo farmaceuticamente aceitável.

   - 14- Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de conter uma quantidade eficaz, para tratar infecções provocados pelos vírus HIV ou HBV em seres humanos, do composto (-)- p-L-2-hidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin-l-il)-l,3-oxatiolano, na forma racémica, ou um seu derivado fisiologicamente aceitável ou um seu sal fisiologicamente aceitável, num veícu lo farmaceuticamente aceitável.

   - 15- -

   Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de conter uma quantidade eficaz, para tratar infecções provocados pelos vírus HIV ou HBV em seres humanos, do composto (+)- p-D-2-hidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin-l-il)-l, 3-oxatiolano, na forma racémica, ou um seu derivado fisiologicamente aceitável ou um seu sal fisiologicamente aceitável, num veícu lo farmaceuticamente aceitável.

   - i$â -

   Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo facto de o derivado fisiologicamente aceitável possuir a formula estrutural:

   em que os radicais R^ ^e ^2 ^s^° ^seleccj-^onados independentemente entre grupos alquilo; esteres de ácidos carboxílicos no qual o radical não carbonilo do grupo ester é seleccionado en tre grupos alquilo; alcoxi-alquilo; aralquilo; aril-oxi-alqui lo; arilo de cadeia linear, ramificada ou cíclicos, incluindo o grupo fenilo facultativamente substituído com átomos de halogéneo ou com grupos alquilo(C^-C^) ou alcoxi(C^-C^); um ester sulfonato; alquil- ou aralquil-sulfonilo; um éster mono-, di- ou tri-fosfato, ou um ester de um aminoácido, e um desses radicais R^ ou Rg P^0(ie representar o átomo de hidrogénio.

   - 17^â Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo facto de o derivado fisiologicamente aceitável possuir a formula estrutural:

   em que os radicais R^ e R₂ são seleccionados independentemente entre grupos alquilo; esteres de ácidos carboxílicos no qual o radical não carbonilo do grupo ester é seleccionado en tre grupos alquilo; alcoxi-alquilo; aralquilo; aril-oxi-alqui lo; arilo de cadeia linear, ramificada ou cíclicos, incluindo o grupo fenilo faeultativamente substituído com átomos de halogéneo ou com grupos alquilo (G^-C^) ou alcoxiíC-^-C^); um éster sulfonato; alquil- ou aralquilo-sulfonilo; um ester mono-, di- ou tri-fosfato, ou um ester de um aminoácido, e um desses radicais R-^ ^{ou R}2 ?^0(ie representar o átomo de hidrogénio.

   - 18§ Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo facto de o derivado fisiologicamente aceitável possuir a fórmula estrutural:

   em que os radicais R-^ e Rg são seleccionados independentemente entre grupos alquilo; esteres de ácidos carboxílicos no qual o radical não carbonilo do grupo ester é seleccionado entre grupos alquilo; alcoxi-alquilo; aralquilo; aril-oxi-alquilo; arilo de cadeia linear, ramificada ou cíclicos, incluindo o grupo fenilo facultativamente substituído com átomos de halogéneo ou com grupos alquilo(C^-C^) ou alcoxi(C^-C^); um ester sulfonato; alquil- ou aralquil-sulfonilo; um.ester mono-, diou tri-fosfato, ou um ester de um aminoácido, e um desses radicais ^ou Ng pode representar o átomo de hidrogénio.

   - 19 & Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo facto de os radicais R^ e R^ serem seleccionados independentemente entre 0 grupo constituído por metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, isopentilo, amilo, t-pen tilo, 3-metil-butirilo, ácido succínico, 3-clorobenzoato, ciclo-pentilo, ciclo-hexilo, benzoilo, acetilo, pivaloilo, mesi lato, propionilo, butirilo, valerilo, ácidos caprõico, caprílico, cáprico, láurico, miristico, palmítico, esteárico, o lei co, aminoácidos incluindo, sem que isso constitua uma limita77 À 't ção, alanilo, valinilo, leucinilo, isoleucinilo, prolinilo, fenil-alaninilo, triptofanilo, metioninilo, glicinilo, serini lo, treoninilo, cisteinilo, tirosinilo, asparaginilo, glutami nilo, aspartoilo, glutaoilo, lisinilo, argininilo e histidini lo, e um dos radicais e EL, poder representar o átomo de hi drogénio.

   - 2Oâ -

   Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo facto de os radicais e R₂ serem seleccionadQ.s independentemente entre o grupo constituído por metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, isopropi lo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, isopentilo, amilo, t-pen tilo, 3-metil-butirilo, ácido succínico, 3-clorobenzoato, ciclo-pentilo, ciclo-hexilo, benzoilo, acetilo, pivaloilo, mesi lato, propionilo, butirilo, valerilo, ácidos capróico, capríli co, cáprico, láurieo, miristico, palmítico, esteárico, oleico, aminoácidos incluindo, sem que isso constitua uma limitação, alanilo, valinilo, leucinilo, isoleucinilo, propinilo, fenil-alaninilo, triptofanilo, metioninilo, glicinilo serinilo, treoninilo, cisteinilo, tirosinilo, asparginilo, glutaminilo, aspartoilo, glutaoilo, lisinilo, argininilo e histidinilo, e um dos radicais R^ e R₂ poder representar o átomo de hidrogénio .

   - 2ia -

   Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo facto de os radicais R-^ e R₂ serem seleccionados independentemente entre o grupo constituido por metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, isopropi lo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, isopentilo, amilo, t-pen tilo, 3-metil-butirilo, ácido succínico, 3-clorobenzoato, ciclo-pentilo, ciclo-hexilo, benzoilo, acetilo, pivaloilo, mesi lato, propionilo, butirilo, valerilo, ácidos capróico, caprí- 78 - lico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, olei co, aminoácidos incluindo, sem que isso constitua uma limitação, alanilo, valinilo, leucinilo, isoleucinilo, prolinilo, fenil-alaninilo, triptofanilo, metioninilo, glicinilo, serini lo, treoninilo, cisteinilo, tirosinilo, asparaginilo, glutami nilo, aspartoilo, glutaoilo, lisinilo, argininilo e histidini lo, e um dos radicais R^ e R₂ poder representar o átomo de hi drogénio.

   - 22â Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo facto de o radical R-^ representar o grupo n-butilo e o radical R₂ representar o átomo de hi drogénio.

   - 23§ -

   Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo facto de 0 radical R^ representar 0 grupo n-butilo e o radical Rg representar o átomo de hi drogénio.

   - 24^ -

   Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo facto de 0 radical R representar 0 grupo n-butilo e 0 radical R₂ representar o^átomo de hi drogénio.

   - 25^ Método para 0 tratamento de infecções provocadas pelo vírus HIV, em seres humanos, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz do composto (+)- β-Β,Ι- 79 -

   -2-hidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin- 1-11)-1,3-oxatiolano, ou um seu derivado fisiologicamente aceitável ou um seu sal fisiologicamente aceitável, num veículo farmaceuticamente aceitável.

   - 26a -

   Método para o tratamento de infecções provocadas pelo vírus HIV, em seres humanos, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz do composto (-)-^-1-2-hidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin-l-il)-l,3-oxatiolano, ou um seu derivado fisiologicamente aceitável ou um seu sal fisiolo gicamente aceitável, num veículo farmaceuticamente aceitável.

   - 27 a -

   Método para o tratamento de infecções provocadas pelo vírus HIV, em seres humanos, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz do composto (+)-p-D-2-hidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin-l-il)-l,3-oxatiolano, ou um seu derivado fisiologicamente aceitável ou um seu sal fisiologt camente aceitável, num veículo farmaceuticamente aceitável.

   - 28â -

   Método para 0 tratamento de infecções provocadas pelo vírus HBV, em seres humanos ou em qualquer outro animal hospedeiro, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz do composto (+)-p-D,l-2-hidroxi-metil-5-(5·-fluorocitosin-l-il)-l,3-oxatiolano, ou um seu derivado fisio logicamente aceitável ou um seu sal fisiologicamente aceitável, num veículo farmaceuticamente aceitável.

   - 29§ -

   Método para 0 tratamento de infecções provocadas pelo vírus HBV, em seres humanos ou em qualquer outro animal hospedeiro, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz do composto (-)-$-L-2-hidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin-l-il)-l,3-oxatiolano, ou um seu derivado fisio logicamente aceitável ou um seu sal fisiologicamente aceitável, num veículo farmaceuticamente aceitável.

   - 30& -

   Método para 0 tratamento de infecções provocadas pelo vírus HBV, em seres humanos ou em qualquer outro animal hospedeiro, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz do composto (+)- ^>-D-2-hidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin-l-il)-l,3-oxatiolano, ou um seu derivado fisio logicamente aceitável ou um seu sal fisiologicamente aceitável, num veículo farmaceuticamente aceitável.

   Método de acordo com qualquer das reivindicações 25, 26, 27, 28, 29, ou 30, caracterizado pelo facto de 0 veículo ser adequado para administração oral.

   -32S -

   Método de acordo com qualquer das reivindicações 25, 26, 27, 28, 29 ou 3θ, caracterizado pelo facto de 0 veícu lo ser constituído por uma cápsula.

   Método de acordo com qualquer das reivindicações 25, 26, 27, 28, 29 ou 30, caracterizado pelo facto de o veícu lo ser um comprimido.

   — 81 —

   - 34- Método de acordo com qualquer das reivindicações

   25, 26, 27, 28, 29 ou 30, caracterizado pelo facto de 0 administração se efectuar por via parentérica.

   - 35a _

   Processo para a preparação de 2-hidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin-l-il)-l,3-oxatiolano caracterizado pelo fac to de se fazer reagir 5-fluorocitosina facultativamente prote gida com 1,3-oxatiolano de fórmula estrutural:

   em que o radical representa o átomo de hidrogénio ou representa um grupo de protecção hidroxilo, incluindo um grupo acilo, e o símbolo L representa um grupo removível, removendo -se facultativamente qualquer grupo de protecção hidroxilo.

   - 36- Processo para a preparação de 2-hidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin-l-il)-l,3-oxatiolano caracterizado pelo fac to de se fazer reagir um composto de fórmula estrutural;

   em que o radical R^_a representa um grupo de protecção hidroxi lo e o radical R^ representa um grupo de protecção amino, com um agente de fluoração que introduza um átomo de fluor na posição 5 do anel da citosina, removendo-se facultativamente os grupos de protecção.

   - 37 a _

   Processo para a preparação de 2-hidroxi-metil-S-(5-fluorocitosin-l-il)-l,3-oxatiolano caracterizado pelo fac to de se fazer reagir um composto de fórmula estrutural:

   em que o radical R^_a representa um grupo de protecção hidroxi lo, com um agente que converta 0 grupo oxo na posição 4 do a- 83 V nel uracilo num grupo amino, removendo-se depois os grupos de protecção.

   - 38â Processo de acordo com a reivindicação 35 caracte rizado também pelo facto de se preparar o composto 1,3-oxatio lano do modo seguinte;

   (i) ozonando um composto de fórmula CHg-CH-QHg-OR. ou ROCHg-GHaCH-CHgOS., em que o radical R representa um grupo de protecção para proporcionar um composto de fórmula estrutural;

   H (ii) fazendo reagir o produto do passo (i) com ácido mercapto-acético para proporcionar um composto de fórmu la estrutural:

   (iii) e fazendo a redução do produto do passo (ii) e fazen do depois reagir o composto obtido com um anidrido de um ácido carboxilico, com um agente de alquilação ou com um agente de balogenação para proporcionar um composto de fórmula estrutural:

   em que o símbolo L representa um grupo removível.

   - 39a -

   Método de acordo com a reivindicação 38 caracteriza do pelo facto de o anidrido de ácido carboxílico ser 0 anidri do acético.

   - 40& -

   Método para a resolução de uma mistura racémica de enantiómeros nucleósidos, caracterizado pelo passo que con siste em expor essa mistura racémica a uma enzima que catalisa preferencialmente uma reacção num dos enantiómeros.

   - 41â -

   Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de a enzima ser seleccionada entre o grupo constituído por uma esterase, uma lipase, substilisina, a-qui motripsina, e citidina-desoxi-citidina-desaminase.

   - 42^ -

   Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de a esterase ser esterase do fígado de por co.

   - 43^a Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de a lipase ser seleccionada entre 0 grupo constituído por lipase panereátiea de origem porcina e lipase âmano PS-800.

   - 44& Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de os enantiómeros nucleósidos serem acilados na posição 05’ do grupo hidroxilo.

   - 45^ _

   Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo facto de os enantiómeros serem acilados antes da resolução com um composto seleccionado entre o grupo constituído por ácidos alquil-carboxílicos e ácidos alquil-carboxílicos substituídos.

   - 46a _

   Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo facto de o ácido alquil-carboxílico ser o grupo constituído por ácido acético, ácido propiónico, ácido butíri co, ácido pentanóico, ácido 2-cloro-propiónico, ácido 2-cloro -butírico, e áeido 2-cloro-pentanóico.

   - 47a _

   Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de os enantiómeros nucleósidos serem forçados a passar através de uma coluna que contem a enzima imobilizada num suporte.

   - 48a -

   Método de acordo com a reivindicação 40, caracte- 86 - rizado pelo facto de os enantiómeros serem misturados com a enzima numa solução.

   -49a _

   Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado também pelo facto de se efectuar a reacção enzimática em presença de um agente tenso-activo não iónico.

   -50â -

   Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo facto de 0 agente tenso-activo não iónico é o Triton X-100”.

   -51^ -

   Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de existir ainda um passo que consiste em expor o produto de resolução a uma segunda enzima que aumenta a resolução.

   - 52â -

   Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado ainda por se efectuar a reoristalização do produto de resolução.

   - 53a -

   Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado ainda pelo facto de se tratar 0 produto de resolução com um ácido quiral.

   - 54- Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo facto de o ácido quiral ser seleccionado entre o grupo constituído por ácido málico, ácido mandélico, ácido di benzoil-tartárico, ácido 3-bromo-canfor-8-sulfónico, ácido 10 -canfor-sulfónico e ácido di-p-toluoil-tartárico.

   - 55^& Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de a mistura racémica ser constituída pelos compostos (+.)-2-hidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin-l-il)-l,3-oxatiolano.

   - 56â -

   Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de a mistura racémica ser constituída pelos compostos (+)-2-hidroxi-metil-5-(ciiosin-l-il)-l,3-oxatiolano.

   - 57^â -

   Compostos (t)- ^-D,L-2-iiidroxi-metil-5-(5-fluorocitosin-l-il)-l,3-oxatiolano, seus enantiómeros (-) e (+) e seus derivados e correspondentes sais farmaceuticamente aceitáveis para utilização em terapia medicinal, por exemplo, para o tratamento ou para a profilaxia de infecçoes provocadas pelo vírus HIV ou HBV.

   - 58^ Utilização dos compostos (+)-^-D,L-2-tDdroxi-metil-5_(5_.fluorocitosin-l-il)-l,3-oxatiolano, dos seus enantió meros (-) e (+) e dos seus derivados e correspondentes sais farmaceuticamente aceitáveis para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção provocada pelos vírus HIV ou HBV.

   A requerente reivindica as prioridades dos pedidos norte-americanos apresentados em 22 de Fevereiro de 1991, 26 de Julho de 1991 e 12 de Fevereiro de 1992 sob os n^s 07/659,760, 07/736,089 e 07/831,153, respectivamente.