ES2345102T3 - Actividad antiviral y resolucion del 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del enantiómero (-) de cis-4-amino-5-fluoro-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolano-5-il)-(1H)-pirimidin 2-ona, para tratar el VIH en seres humanos o su sal farmacéuticamente aceptable, que carece al menos del 95% del enantiómero (+) correspondiente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para el uso en el tratamiento de una infección por VIH.

Description

Actividad antiviral y resolución del 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

Antecedentes de la invención

Esta invención se encuentra dentro del ámbito de los nucleósidos biológicamente activos, y más específicamente como se establece en las reivindicaciones independientes adjuntas. Esta descripción también se refiere a composiciones antivirales que incluyen 2-hidroximetil-5-(fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolato ("FTC"), sus derivados o sales fisiológicamente aceptables y a un método para la resolución y el uso de los enantiómeros (-)-\beta-L y (+)-\beta-D del
FTC.

En 1981, el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) se identificó como una enfermedad que compromete gravemente el sistema inmune humano y que lleva, prácticamente sin excepción, a la muerte. En 1983, se determinó que la etiología del SIDA era el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En diciembre de 1990, la Organización Mundial de la Salud estimó que entre 8 y 10 millones de personas, en todo el mundo, estaban infectadas por el VIH y, de esta cifra, entre 1.000.000 y 1.400.000 se encontraban en Estados Unidos.

En 1985, se observó que el nucleósido sintético 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT) inhibía la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana. Desde entonces, se ha demostrado que toda una serie de distintos nucleósidos sintéticos, que incluyen 2',3'-didesoxiinosina (DDI), 2',3'-didesoxicitidina (DDC), 3'-fluoro-3'-desoxitimidina (FLT) y 2',3'-didesoxi-2',3'-didehidrotimidina (D4T), son eficaces frente al VIH. Otra serie de 2',3'-didesoxinucleósidos han demostrado inhibir el crecimiento de varios virus in vitro. Parece que, tras su fosforilación celular a 5'-trifosfato por quinasas celulares, estos nucleósidos sintéticos se incorporan en una cadena de ADN viral en crecimiento, ocasionando la terminación de la cadena debido a la ausencia de grupo hidroxilo en 3'.

El éxito de varios 2',3'-didesoxinucleósidos en la inhibición de la replicación del VIH in vivo o in vitro ha llevado a una serie de investigadores a diseñar y ensayar nucleósidos que sustituyen un heteroátomo por el átomo de carbono en el 3'-EPO-DG1 del nucleósido. Norbeck y col. describen que la (\pm)-1-[(2\beta,4\beta)-2-(hidroximetil)-4-dioxolanil]timina (denominada (\pm)-dioxolano-T) presenta una actividad modesta frente al VIH (CE_{50} de 20 \mu en células ATH8), y no es tóxica para células control no infectadas a una concentración de 200 micraM. Tetrahedron Letters 30 (46), 6246, (1989). La Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº 0 337 713 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.041.449, asignada a IAF BioChem International, Inc, describen 2-sustituidos-4-sustituidos-1,3-dioxolanos que presentan actividad antiviral.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.047.407 y la Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº 0 382 526, asignada también a IAF BioChem International, Inc, describen una serie de nucleósidos 2-sustituidos-5-sustituidos-1,3-oxatiolano con actividad antiviral e informan específicamente de que la mezcla racémica (aproximadamente la posición C4') del isómero C1'-\beta del 2-hidroximetil-5-(citosin-1-il)-1,3-oxatiolano (denominado en lo sucesivo (\pm)-BCH-189) tiene aproximadamente la misma actividad frente al VIH que el AZT y no tiene toxicidad celular en los niveles ensayados. Se ha observado también que el (\pm)-BCH-189 inhibe la replicación in vitro de aislados del VIH resistentes a AZT, procedentes de pacientes que se han tratado con AZT durante más de 36 semanas.

Otro virus que causa graves problemas de salud en los seres humanos es el virus de la hepatitis B (denominado en lo sucesivo "VHB"). El VHB es la segunda causa, tras el tabaco, de cáncer en los seres humanos. Se desconoce el mecanismo por el que el VHB induce cáncer, aunque se postula que el VHB podría desencadenar directamente el desarrollo del tumor o bien podría desencadenar indirectamente el desarrollo del tumor a través de la inflamación crónica, la cirrosis y la regeneración celular asociadas a la infección.

Tras un periodo de incubación de dos a seis meses, durante el que el huésped desconoce que está infectado, la infección por VHB puede dar lugar a hepatitis aguda y daño hepático, causando dolor abdominal, ictericia y el aumento en sangre de los niveles de ciertas enzimas. El VHB puede causar hepatitis fulminante, una forma de la enfermedad de progresión rápida, con frecuencia fatal, en la que se destruyen grandes porciones del hígado.

Los pacientes se recuperan, generalmente, de la hepatitis aguda. En algunos pacientes, sin embargo, persisten niveles elevados de antígenos virales en la sangre durante un periodo de tiempo prolongado, o indefinido, ocasionando una infección crónica. Las infecciones crónicas pueden llevar a una hepatitis crónica persistente. Los pacientes con infección crónica persistente por VHB son más frecuentes en países en vías de desarrollo. A mediados de 1991, había aproximadamente 225 millones de portadores crónicos del VHB solamente en Asia y casi 300 millones de portadores en todo el mundo. La hepatitis crónica persistente puede causar fatiga, cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular, un cáncer primario de hígado.

En los países occidentales industrializados, los grupos de alto riesgo para una infección por VHB incluyen las personas que entran en contacto con portadores del VHB o sus muestras de sangre. La epidemiología del VHB es muy similar a la del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida, lo que justifica por qué la infección por VHB es frecuente entre los pacientes con SIDA o complejo relacionado con el SIDA. Sin embargo, el VHB es más contagioso que el VIH.

Se ha desarrollado una vacuna derivada de suero humano para inmunizar a los pacientes frente al VHB. Mientras que se ha visto que es eficaz, la producción de la vacuna es difícil ya que el suministro de suero humano procedente de portadores crónicos es limitado y el proceso de purificación es largo y costoso. Además, cada lote de vacuna preparado a partir de distintos sueros debe ensayarse en chimpancés para asegurar su seguridad. También se han producido vacunas por ingeniería genética. El tratamiento diario con interferón-\alpha, una proteína producida por ingeniería genética, también ha mostrado ser prometedor. Sin embargo, no existe, hasta la fecha, ningún agente farmacéutico conocido que inhiba de forma eficaz la replicación del virus.

Para comercializar un nucleósido para uso farmacéutico, no solamente tiene que ser eficaz y con una toxicidad baja, sino que su fabricación también debe ser rentable. Se ha dirigido una gran cantidad de investigación y desarrollo hacia nuevos procedimientos, de bajo coste, para la producción de nucleósidos a gran escala. En la actualidad, se preparan 2',3'-didesoxinucleósidos por medio de dos vías: derivatización de un nucleósido intacto o condensación de un resto de azúcar derivatizado con una base heterocíclica. Aunque existen numerosas desventajas asociadas con la obtención de nuevos análogos de nucleósidos modificando nucleósidos intactos, una ventaja principal de esta estrategia es que la estereoquímica absoluta adecuada ya ha sido establecida por la naturaleza. Sin embargo, esta estrategia no puede usarse en la producción de nucleósidos que contengan bases de origen natural o restos de carbohidratos de origen no natural (y que, por lo tanto, no se generan a partir de nucleósidos intactos), tales como los nucleósidos 1,3-oxatiolano y los nucleósidos 1,3-dioxolano.

Cuando se condensa un resto carbohidrato o de tipo carbohidrato con una base heterocíclica para formar un nucleósido sintético, se produce un nucleósido con dos centros quirales (en las posiciones C1' y C4'), y por tanto existe como una par diastereomérico. Cada diastereómero existe como una serie de enantiómeros. Por lo tanto, el producto es una mezcla de cuatro enantiómeros.

Se observa a menudo que los nucleósidos con una estereoquímica de origen no natural en la posición C1' o C4', son menos activos que los mismos nucleósidos con la estereoquímica establecida por la naturaleza. Por ejemplo, Cárter y col. han informado de que la concentración del enantiómero (-) del carbovir (2', 3'-didehidro-2', 3'-didesoxiguanosina) requerida en cultivos celulares para disminuir la actividad de la transcriptasa inversa en un 50% (CE_{50}) es de 0,8 \muM, mientras que la CE_{50} para el enantiómero (+) - de carbovir es mayor de 60 \muM. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 34: 6, 1297-1300 (Junio de 1990).

La Publicación Internacional PCT Nº WO 91/11186 describe que los nucleósidos 1,3-oxatiolano pueden prepararse con una elevada diastereoselectividad (alto porcentaje de nucleósidos con una configuración \beta en el puente entre el carbono C1' y la base heterocíclica) mediante una selección cuidadosa del ácido de Lewis usado en el proceso de condensación. Se descubrió que la condensación de un nucleósido 1,3-oxatiolano con una base se da con una \beta-estereoespecificidad casi completa cuando se usa cloruro estánnico como catalizador de la condensación. Otros ácidos de Lewis proporcionan una baja (o ninguna) selectividad \beta en C1' o simplemente no catalizan las reacciones.

Shin-Lian Doong y col., "Inhibition of the replication of hepatitis B virus", Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, vol 88, nº 19, páginas 8495-9, describen un estudio en el que se estudiaron diversos nucleósidos 2',3'-didexoxi-3'-tiapirimidina con respecto a su capacidad para inhibir la replicación del ADN del virus de la hepatitis B (VHB) en una línea celular transfectada con el VHB.

La publicación PCT del documento WO 92 15308 describe "el uso de 1-(2-(hidroximetil)-1,3-oxatiolan-5-il)-5-fluorocitosina o un derivado fisiológicamente funcional de la misma en la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una infección por el virus de la hepatitis B".

En vista del hecho de que el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida, el complejo relacionado con el SIDA y el virus de la hepatitis B han alcanzado niveles epidémicos en todo el mundo y tienen efectos trágicos en el paciente infectado, sigue existiendo una fuerte necesidad de proporcionar nuevos y eficaces agentes farmacéuticos para tratar estas enfermedades, que tengan una toxicidad baja para el huésped.

También existe una necesidad de proporcionar un procedimiento con una buena relación coste-eficacia y que sea comercialmente viable para producir nucleósidos farmacéuticamente importantes y conseguir, específicamente, una \beta-estereoespecificidad en la posición C4' de nucleósidos sintéticos preparados por condensación de un resto de tipo carbohidrato con una base.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento y una composición para el tratamiento de pacientes humanos infectados por el VIH.

Otro de los objetos de la presente invención es proporcionar un procedimiento y una composición para el tratamiento de pacientes humanos u otros huéspedes animales infectados por VHB.

Otro de los objetos de la presente invención es proporcionar nucleósidos 1,3-oxatiolano enriquecidos enantioméricamente.

Otro de los objetos de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la resolución de enantiómeros C4' de nucleósidos 1,3-oxatiolano.

Resumen de la invención

La invención es como se establece en las reivindicaciones adjuntas. Algunas sub-realizaciones de la invención son como se establece en las reivindicaciones dependientes.

Se describe un procedimiento y una composición para el tratamiento de infecciones por el VIH y VHB en seres humanos y otros animales huéspedes que incluye administrar una cantidad eficaz de 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano, un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, que incluye un derivado alquilado o acilado 5' o N^{4} o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se ha descubierto que el 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano ("FTC") presenta, de forma sorprendente, una elevada actividad frente al virus de la inmunodeficiencia humana, con una toxicidad muy baja para las células del huésped. Se ha descubierto también que el FTC presenta una actividad muy significativa frente al VHB y, por lo tanto, puede usarse para tratar pacientes que tienen distintas enfermedades asociadas a la infección por VHB.

Estudios de toxicidad y farmacocinética confirman la utilidad del FTC como agente antiviral para su administración farmacéutica. El FTC y sus enantiómeros no son tóxicos para las células periféricas de la médula ósea humana en concentraciones de hasta 50 \muM y para otras líneas celulares en concentraciones de hasta 200 \muM. El FTC-TP es uno de los metabolitos principales en CMSP y células HepG2. El FTC-TP inhibe competitivamente la transcriptasa inversa (RT) del VIH-1 con una K_{1} de 0,2 \muM usando un molde cebador poli(I)oligo(dC). Mediante un análisis de secuencia, se puede demostrar que el FTC-TP es un potente terminador de la cadena de ADN cuando se usa la VIH-RT (paradas C).

El tratamiento crónico con FTC no es tóxico en roedores, incluso en dosis por vía oral de 85 mg/kg al día durante al menos dos meses. La farmacocinética del FTC en macacos de la india indica una elevada biodisponibilidad por vía oral (aproximadamente 73 \pm 6%) y una semivida plasmática terminal de aproximadamente 1,34 \pm 0,18 (media de la administración por vía oral e I.V.).

También se describe un procedimiento para la resolución de una mezcla racémica de enantiómeros de nucleósidos, incluida la mezcla racémica de FTC, que incluye una etapa de exposición de la mezcla racémica a una enzima que cataliza preferentemente una reacción en uno de los enantiómeros. El procedimiento puede usarse para la resolución de una gran variedad de nucleósidos, incluidos nucleósidos de pirimidina y purina opcionalmente sustituidos en el resto carbohidrato o básico. El procedimiento también se puede usar para la resolución de derivados de nucleósidos que contengan heteroátomos adicionales en el resto carbohidrato, como por ejemplo, (\pm)-FTC y (\pm)-BCH-189. La resolución de nucleósidos se puede llevar a cabo a gran escala a un coste moderado.

Usando los procedimientos descritos en el presente documento, se resolvió el FTC en sus enantiómeros (+)-\beta-D y (-)-\beta-L. El enantiómero (-)-\beta-L parece ser más potente que el enantiómero (+)-\beta-D frente a VIH, VHB y SIV. El enantiómero (+) del FTC también es activo frente a VIH, VHB y SIV.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una ilustración de la estructura química de 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano ("FTC").

La Figura 2 es una ilustración de un procedimiento para la preparación de 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

La Figura 3 es un flujograma de la especificidad de la fosfatasa alcalina y la fosfodiesterasa del veneno de serpiente para los enantiómeros (+) y (-) del FTC.

La Figura 4 es un gráfico que indica el progreso de la hidrólisis catalizada por la lipasa, del éster butirilo-5' del FTC a lo largo del tiempo usando las enzimas Amano PS-800® (-cuadrado en blanco-) y PLE (-círculo en blanco con un punto-).

La Figura 5 es un gráfico del efecto de la concentración (\muM) del FTC enriquecido racémica y enantioméricamente (preparado por el procedimiento del Ejemplo 4) frente al porcentaje de inhibición de células MSP humana infectadas con VIH. ((-círculo relleno-, (\pm)-FTC), (-círculo en blanco, (-)-FTC), (-cuadrado relleno-, (+)-FTC).

La Figura 6 es un gráfico del efecto de la concentración (\muM) de FTC enriquecido racémica y enantioméricamente (preparado por el procedimiento del Ejemplo 3) frente al porcentaje de inhibición de células MSP humana infectadas con VIH. ((-círculo relleno-, (\pm)-FTC), (-círculo en blanco, (-)-FTC), (-cuadrado relleno-, (+)-FTC).

La Figura 7 es un gráfico de la captación de (\pm)-FTC tritiado por células MSP humana (media de dos determinaciones) en tiempo (horas) frente a pmol/10^{6} células.

La Figura 8 es un gráfico de la salida de (\pm)-FTC radiomarcado de células MSP humana, medido en horas frente a pmol/10^{6} células.

La Figura 9 ilustra la presencia de [^{3}H]-(\pm)-FTC y sus derivados fosforilados en células HepG-2 humanas (media de dos determinaciones) incubadas en medio con [^{3}H]-(\pm)-FTC 10 \muM, medidos en pmol/10^{6} células a lo largo del tiempo.

La Figura 10 ilustra la salida de [^{3}H]-(\pm)-FTC y sus derivados fosforilados en células HepG2 humanas, en pmol/10^{6} células a lo largo del tiempo, tras añadir a las células pulsos de [^{3}H]-(\pm)-FTC 10 micraM (700 DPM/pmol) durante 24 horas, y evaluando la concentración del compuesto 24 horas tras su retirada.

La Figura 11 ilustra la disminución en la concentración combinada de [^{5}H]-(\pm)-FTC y sus derivados fosforilados en células HepG2 humanas tras la incubación con [^{3}H]-(\pm)-FTC 10 \muM (700 DPM/pmol) durante 24 horas, en pmol/10^{6} células, a lo largo del tiempo.

La Figura 12 es un gráfico del efecto de los enantiómeros del FTC sobre la formación de colonias de células precursoras de granulocitos-macrófagos, medido como porcentaje de supervivencia frente a concentración en \muM ((-)-FTC, círculo vacío; (+)-FTC, círculo relleno; AZT, cuadrado relleno.)

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Descripción detallada de la invención

La invención es como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "nucleósido enantioméricamente enriquecido" se refiere a una composición de nucleósidos que incluye al menos un 95% de un único enantiómero de ese nucleósido.

Tal como se usa en el presente documento, el término FTC se refiere al 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano (la forma racémica o los enantiómeros), también denominado 2'-desoxi-5-fluoro-3'-tiacitidina.

Tal como se usa en el presente documento, el término (\pm)-FTC se refiere al (\pm)-\beta-D,L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

Tal como se usa en el presente documento, el término (-)-FTC se refiere al (-)-\beta-L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

Tal como se usa en el presente documento, el término (+)-FTC se refiere al (+)-\beta-D-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

Tal como se usan en el presente documento, los términos FTC-MP, FTC-DP y FTC-TP se refieren a monofosfato, difosfato y trifosfato de FTC, respectivamente.

Tal como se usa en el presente documento, el término BCH-189 se refiere a 2-hidroximetil-5-(citosin-1-il)-1,3-oxatiolano.

Tal como se usa en el presente documento, el término "catálisis preferencial enzimática" se refiere a la catálisis por una enzima que favorece un sustrato en detrimento de otro.

Tal como se usa en el presente documento, un grupo saliente significa un grupo funcional que forma una carbonatación incipiente cuando se separa de la molécula a la que está unido.

En este documento se describe un procedimiento y una composición para el tratamiento de infecciones por VIH y VHB y otros virus que se replican de forma similar, en el ser humano u otros animales huéspedes, que incluyen la administración de una cantidad eficaz del enantiómero (\pm)-\beta-D,L, del (-)-\beta-L o (+)-\beta-D del 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano, un derivado farmacéuticamente ("fisiológicamente") aceptable que incluye un derivado alquilatado o acilatado 5' o N^{4} o una sal del mismo farmacéuticamente ("fisiológicamente") aceptable. Tal como se muestra a continuación, los compuestos poseen una actividad antirretroviral, como anti-VIH-1, anti-VIH-2 y actividad frente al virus de la inmunodeficiencia anti-simia (anti-VIS), ellos mismos o se metabolizan por un compuesto que presenta actividad antirretroviral.

El FTC y sus derivados o formulaciones farmacéuticamente aceptables que contienen estos compuestos son útiles para la prevención y el tratamiento de infecciones por VIH y otras afecciones relacionadas como el complejo relacionado con el SIDA (CRS), la linfadenopatía generalizada persistente (PGL), las afecciones neurológicas relacionadas con el SIDA, afecciones de positividad para anticuerpos anti-VIH y positividad para VIH, sarcoma de Kaposi, púrpura trombocitopénica e infecciones oportunistas. Además, estos compuestos o formulaciones se pueden usar de forma profiláctica para prevenir o retrasar la progresión de la enfermedad clínica en individuos que presentan positividad para anticuerpos anti-VIH o para antígenos del VIH o que han sido expuestos al VIH.

El FTC y sus derivados o sales farmacéuticamente aceptables o formulaciones farmacéuticamente aceptables que contienen estos compuestos también son útiles para la prevención y el tratamiento de infecciones por VHB y otras afecciones relacionadas como afecciones de positividad para anticuerpos anti-VHB y para el VHB, inflamación hepática crónica causa por el VHB, cirrosis, hepatitis aguda, hepatitis fulminante, hepatitis crónica persistente y fatiga. Estos compuestos o formulaciones también se pueden usar de forma profiláctica para prevenir o retrasar la progresión de la enfermedad clínica en individuos que presentan positividad para anticuerpos anti-VHB o para antígenos del VHB o que han sido expuestos al VHB.

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En resumen, se describen las siguientes características:

(a)

(\pm)-\beta-D,L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano y derivados y sales farmacéuticamente aceptables del mismo;

(b)

(-)-\beta-L-2-hidroximetil-5-(fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano y derivados y sales farmacéuticamente aceptables de mismo;

(c)

(+)-\beta-D-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano y derivados y sales farmacéuticamente aceptables del mismo;

(d)

(\pm)-\beta-D,L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano, sus enantiómeros (-) y (+) y derivados y sales farmacéuticamente aceptables del mismo para su uso en terapia médica, por ejemplo para el tratamiento o profilaxis de una infección por VHI o VHB;

(e)

el uso de (\pm)-\beta-D,L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano, sus enantiómeros (-) y (+) y derivados y sales farmacéuticamente aceptables del mismo en la fabricación de un medicamento para tratamiento de una infección por VIH o VHB;

(f)

formulaciones farmacéuticas que comprenden (\pm)-\beta-D,L-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano, sus enantiómeros (-) o (+) o un derivado o sal farmacéuticamente aceptable del los mismo junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable;

(g)

un procedimiento para la preparación de 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano que comprende:

(i)

opcionalmente hacer reaccionar 5-fluorocitosina protegida con un 1,3-oxatiolano de fórmula A

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1

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\quad

en la que R_{1a} es hidrógeno o un grupo protector hidroxilo, que incluye un grupo acilo y L es un grupo saliente; y opcionalmente eliminar cualquier grupo protector hidroxilo.

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(ii)

hacer reaccionar un compuesto de fórmula B

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2

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\quad

(en la que R_{1a} es como se ha definido anteriormente y R_{1b} es un grupo protector amino) con un agente de fluoración que sirve para introducir un átomo de flúor en la posición 5 del anillo de la citosina; o

(iii)

hacer reaccionar un compuesto de fórmula C

3

\quad

(en la que R_{1a} es como se ha definido anteriormente) con un agente que sirve para convertir el grupo oxo en la posición 4 del anillo uracilo en un grupo amino; eliminándose cualquiera de los grupos protectores restantes para producir el producto deseado.

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(h)

un procedimiento para la preparación de un enantiómero (-) o (+) del 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano que comprende el sometimiento del compuesto o derivado del mismo (por ejemplo, éster 5') en forma de una mezcla de enantiómeros (-) y (+) a condiciones o reacciones con reactivos que sirven para separar los enantiómeros y, si es necesario, convertir el derivado resultante en el precursor.

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Con respecto al procedimiento e) (i) el grupo protector hidroxi incluye los grupos protectores descritos con detalle más abajo, que incluyen acilo (por ejemplo acetilo), arilacilo (por ejemplo benzoilo o benzoilo sustituido), tritilo o monometroxitrilo, bencilo o bencilo sustituido, sililo trisustituido, incluyendo trialquilsililo (por ejemplo, dimetil-t-butilsililo) o difenilmetilsililo. El compuesto 5-fluorocitosina opcionalmente puede protegerse con grupos sililo trisustituidos. Los grupos protectores pueden eliminarse de una manera convencional. El grupo saliente L es un grupo saliente típico de los conocidos en la técnica de la química de nucleósidos, por ejemplo halógeno tal como cloro o bromo, alcoxi tal como metoxi o etoxi o acilo tal como acetilo o benzoilo.

La reacción en el proceso e) (i) puede llevarse a cabo en un disolvente orgánico (por ejemplo, 1,2-dicloroetano o acetonitrilo) en presencia de un ácido de Lewis, preferiblemente cloruro estánnico o trimetilsilil triflato.

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Los compuestos de fórmula A (en los que L representa un grupo acilo, por ejemplo, un grupo acetilo) pueden obtenerse por reacción de un compuesto de fórmula D

4

(en la que R_{1a} es como se define anteriormente), con un agente reductor, por ejemplo hidruro de litio y aluminio, seguido de tratamiento con el reactivo apropiado convencional para el intermedio deseado, por ejemplo, un anhídrido del ácido carboxílico, por ejemplo, anhídrido acético, para reactivos de acilación, clorinación o brominación para halogenación, o agentes alquilantes.

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El compuesto de fórmula D puede prepararse por reacción de un compuesto de fórmula E

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con HSCH_{2}CO_{2}-H a una temperatura elevada.

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El compuesto de fórmula E puede prepararse por ozonólisis de un éter o éster alilo que tiene la fórmula CH_{2}=CH-CH_{2}-OR o un diéter o diéster de 2-buteno-1,3-diol que tiene la fórmula ROCH_{2}-CH=CH-CH_{2}-OR, en la que R es un grupo protector, tal como un grupo alquilo, sililo o acilo.

Con respecto al procedimiento e) (ii), el sustituyente 5-fluoro puede introducirse por métodos conocidos en la técnica (M.J. Robins y col., en Nucleic Acid Chemistry, Part. 2, L.B. Towsend y R.S. Tipson, editors, J. Wiley y Sons, Nueva York, 895-900 (19/8) y referencias en su interior; R. Duschinsky en Nucleic Acid Chemistry, Part 1, L.B. Townsend y R.S. Tipson editors, J. Wiley y Sons, Nueva York 43-46 (1978) y referencias en su interior). El agente de fluoración puede ser, por ejemplo, trimetilhipofluorito en fluorotriclorometano.

Con respecto al procedimiento e) iii), el compuesto de fórmula C puede tratarse con 1,2,4-triazol, junto con 4-clorofenil diclorofosfato, para formar el compuesto 4-(1,2,4-triazolilo) correspondiente que después se convierte al compuesto 4-amino (citidina) deseado por reacción, por ejemplo, con metanol.

Los materiales de partida de las fórmula B y C pueden prepararse por ejemplo por reacción de una base apropiada (opcionalmente protegida) con un compuesto de fórmula A de una manera análoga a la descrita en el procedimiento e) i). El 5-fluorouracilo y 5-fluorocitosina se encuentran disponibles en el mercado de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI 53233, USA.

La resolución de los enantiómeros (\pm) puede lograrse como se específica con detalle en la Sección III más adelante.

El FTC puede convertirse en un éster farmacéuticamente aceptable por reacción con un agente de esterificación apropiado, por ejemplo, un ácido haluro o anhídrido. El FCT o sus derivados farmacéuticamente aceptables pueden convertirse en una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de una manera convencional, por ejemplo, por tratamiento con una base apropiada. El éster o la sal del FCT pueden convertirse en FCT, por ejemplo, por hidrólisis.

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I. Compuesto Activo, y Derivados y Sales Fisiológicamente Aceptables del Mismo

El compuesto antiviralmente activo descrito en este documento es 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano (véase la Figura 1), en la forma racémica o como un enantiómero aislado.

El compuesto activo puede administrarse como cualquier derivado que después de la administración al receptor, puede proporcionar directamente o indirectamente, el precursor FTC o que muestra propia actividad. Son ejemplos no limitantes las sales farmacéuticamente aceptables (de manera alternativa denominadas "sales fisiológicamente aceptables") y los derivados acilados o alquilados 5' y N^{4} del compuesto activo (de manera alternativa denominados "derivados fisiológica o farmacéuticamente activos"). En una realización, el grupo acilo es un éster del ácido carboxílico en el que el resto no carbonilo del grupo éster seleccionada de alquilo lineal, ramificado o cíclico, alcoxialquilo incluyendo metoximetilo, aralquilo incluyendo bencilo, ariloxialquilo tal como fenoximetilo, arilo incluyendo fenilo opcionalmente sustituido con halógeno, alquilo C_{1} a C_{4} o alcoxi C_{1} a C_{4}, ésteres sulfonato tales como sulfonil alquilo o aralquilo incluyendo metanosulfonilo, ésteres mono, di o trifosfato, tritilo o monometoxitritilo, bencilo sustituido, trialquilsililo (por ejemplo dimetil-t-butilsililo) o definilmetilsililo. Los grupos arilo en los ésteres comprenden de manera óptima un grupo fenilo. El grupo alquilo puede ser lineal, ramificado o cíclico y óptimamente es un grupo C_{1} a C_{18}.

Los ejemplos específicos de derivados farmacéuticamente aceptables del FTC incluyen, pero sin limitación:

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en el que R_{1} y R_{2} se seleccionan independientemente del grupo constituido por alquilo y acilo, específicamente incluyendo pero sin limitación metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, isopentilo, amilo, t-pentilo, 3-metilbutirilo, succinato de hidrógeno, 3-clorobenzoato, ciclopentilo, ciclohexilo, benzoilo, acetilo, pivaloilo, mesilato, propionilo, butirilo, valerilo, caproico, caprílico, cáprico, laurico, mirístico, palmítico, esteárico, oleico. aminoácidos incluyendo pero sin limitación, alanilo, valinilo, leucinilo, isoleucinilo, prolinilo, fenilalaninilo, triptofanilo, metioninilo, glicinilo, serinilo, treonoinilo, cisteinilo, tirosinilo, asparaginilo, glutaminilo, aspartoilo, glutaoilo, Iisinilo, argininilo e histidinilo, y en el que uno de R_{1} y R_{2} puede ser H.

El FTC o sus derivados pueden proporcionarse en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Como se usa en este documento, la expresión sales o complejos farmacéuticamente aceptables se refiere a sales o complejos de FTC que conservan la actividad biológica deseada del precursor y muestra mínimos efectos toxicológicos, si hay alguno, no deseados. Los ejemplos no limitantes de dichas sales son (a) sales de adición de ácidos formadas con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares) y sales formadas con ácido orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánnico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutámico, acidos naftalenosulfónicos, ácidos naftalenodisulfónicos y ácido poligalacturónico; (b) sales de adición de bases formadas con cationes metálicos polivalentes tales como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio y similares, o con un catión orgánico formado de N,N-dibenciletileno-diamina, amonio o etilenodiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b); por ejemplo, una sal de cinc tanato o similar.

Las modificaciones del compuesto activo, específicamente en las posiciones N^{4} y 5'-0, pueden influir en la biodisponibilidad y velocidad del mecanismo de la especie activa, proporcionando de esta manera control sobre el suministro de la especie activa. Adicionalmente, las modificaciones pueden influir en la actividad antiviral del compuesto, en algunos casos aumentando la actividad sobre el precursor. Esto puede ensayarse fácilmente preparando el derivado y ensayando su actividad antiviral de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento, u otro procedimiento conocido por el experto en la técnica.

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II. Preparación de los Compuestos Activos

La mezcla racémica del FTC puede prepararse de acuerdo con el método descrito con detalle en el documento PCT de Publicación Internacional Nº WO 91/11186, publicado el 8 de agosto de 1991 y presentado por Emory University, o por el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. En general, el procedimiento incluye la ozonización de cualquier éter o éster alilo que tiene la fórmula CH_{2}=CH-CH_{2}-OR o un diéter o diéster de 2-buteno-1,3-diol que tiene la fórmula ROCH_{2}-CH=CH-CH_{2}OR, en la que R es un grupo protector, tal como un grupo alquilo, sililo o acilo, para formar un glicoaldehído que tiene la fórmula OHC-CH_{2}-OR; la adición de ácido tioglicólico al glicoaldehído para formar una lactona de la fórmula 2-(R-oxi)-metil-5-oxo-1,3-oxatiolano; reducir la lactona a diversos compuestos que contienen un grupo saliente en la posición 5 del anillo del oxatiolano, el acoplamiento de estos compuestos con 5-fluorocitosina sililada en presencia de SnCl_{4} para formar el \beta-isómero del FTC; y opcionalmente eliminar los grupos protectores.

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Ejemplo 1

Preparación de (\pm)-\beta-D,L-2-Hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano

Se describe con detalle a continuación y se ilustra en la Figura 2, un procedimiento para la preparación de la mezcla racémica del FTC.

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Protección de 2-buteno-1,4-diol

En un matraz de 3 bocas de 2 l, seco, bajo atmósfera inerte, se disolvieron 100 gramos (93,5 ml = 1,135 mol = 1,00 eq,) de 2-buteno-1,4-diol y 15 gramos (aprox. 0,1 eq.) de DMAP (4-dimetilaminopiridina) en 800 ml de piridina seca y se agitó mientras se enfriaba hasta 0ºC. Después se añadió lentamente cloruro de butirilo (260 ml = 2,2 eq) para evitar el sobrecalentamiento y se dejó agitando durante una hora. La reacción se interrumpió con una pequeña cantidad de agua helada. El líquido se decantó de la sal y se evaporó al vacío. La sal restante se disolvió en agua y la solución acuosa se extrajo dos veces con éter etílico. Las otras capas combinadas se lavaron una vez con CuSO_{4} saturado, tres veces con NaHCO_{3} saturado que contenía Norit® y después se filtró al vacío mediante un bloque celite®.

La mezcla de reacción concentrada se disolvió en éter y se lavó siguiendo el mismo procedimiento anterior para la solución salina. Las capas orgánicas combinadas se concentraron por evaporación rotativa, después se colocaron al vacío. Esta reacción es típicamente casi cuantitativa. La escala puede aumentarse fácilmente según sea necesario. El producto 1,4-dibutiril-2-buteno-1,4-diol es un líquido transparente de incoloro a ligeramente amarillo.

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Ozonólisis del diol protegido

Se disolvió 1,4-dibutilril-2-buteno-1,4-diol (1,365 mol) en 4l de CH_{2}Cl_{2} seco en un matraz de tres bocas de 5 l seco provisto de un tubo de secado alargado y un tubo abierto para la introducción de gas. Óptimamente el tubo no es un tubo de burbujeo de gas de vidrio poroso que se taponará durante la exposición a la solución concentrada. La solución se agitó y se enfrió hasta -78ºC mientras que se burbujeó el gas inerte a través de la solución. El gas entrante se selló una vez que la disolución se enfrió suficientemente y el matraz y el aparato de agitación se trasladaron al generador de ozono. El oxígeno se burbujeó a través de la solución agitando durante al menos 20 minutos manteniendo el mismo tiempo el baño helado. Un crioenfriamiento es ideal para mantener baja la temperatura de esta reacción de larga duración. Después, el ozono se introdujo de 8 a 8,5 psi. Tras finalizar, el flujo de ozono se detuvo y el oxígeno se burbujeo a través de la solución durante aproximadamente una media hora y una hora antes de añadir 3 equivalentes de Me_{2}S. El matraz de retiró del baño de enfriamiento y se transportó a una campana donde se agitó durante aproximadamente 2 días para incidir en toda la reducción. La disolución se evaporó y se puso al vacío durante varias horas.

Típicamente esta reacción produce aproximadamente el 95% de aldehído protegido (2-butiriloxiacetaldehído), un líquido transparente de incoloro a amarillo.

Ciclización del Aldehído con Ácido Mercaptoacético

El aldehído (1,0 equivalente) se disolvió en tolueno para proporcionar una disolución 0,80 a 0,85 M en un matraz provisto de un colector de tipo Dean Stark. Después se añadió ácido tioglicólico (1,1 equiv.) y la mezcla se calentó hasta reflujo. El agua se eliminó azeotrópicamente mediante el colector. La reacción se completó en 3 horas y se dejó enfriar hasta temperatura ambiente. La solución orgánica se lavó dos veces con volúmenes iguales de agua saturada con NaHCO_{3} y una vez con agua, se secó sobre MgSO_{4} y Norit y se filtró al vacío a través de celite® antes de evaporarse al vacío. El primer lavado con NaHCO_{3} se extrajo de nuevo una vez con éter, el éter se lavó una vez con agua, se secó sobre MgSO_{4} y Norit®, se filtró al vacío a través de celite® y se evaporó junto con el otro material orgánico de la solución de tolueno. El material combinado se colocó al vacío durante una noche.

La reacción típicamente proporciona un rendimiento del 90% de 2-(butiriloxi)-metil-5-oxo-1,3-oxatiolano.

Reducción de Lactona y Conversión a Acetato

Se disolvió 2-butiloxi-metil-5-oxo-1,3-oxatiolano (1,00 equivalentes) en THF seco para proporcionar una disolución 0,23 M en un matraz de 3 bocas seco provisto de un agitador mecánico y se mantuvo en una atmósfera inerte. La solución se agitó y enfrió a 0ºC antes de añadir 1,1 equivalentes de Li(t-BuO)_{3}AlH 1,0 M en THF mediante una cánula. La reducción se completó en aproximadamente tres horas, como se indica por TLC usando un sistema disolvente éter/hexano 2:1 y una tinción con anisaldehído.

Después, se añadieron aproximadamente 10 equivalentes de Ac_{2}O recién destilado y se dejó agitando durante dos días para proporcionar el producto acetilado. La reacción se interrumpió mediante la adición de NaHCO_{3} saturado, que se agitó durante una noche. Después la disolución se evaporó y se agitó con más solución de NaHCO_{3} durante una noche. Esto se extrajo con éter el cual se lavó (cuidadosamente) dos veces con NaHCO_{3} saturado y una vez con agua, se secó sobre MgSO_{4} y Norit®, se filtró al vacío a través de celite® y se evaporó. El producto es un líquido transparente amarillo oscuro. La cromatografía de gas (T inicial - 80ºC; Tiempo inicial = 5 min; Velocidad prog. - 10º/min; T Final = 240ºC) típicamente indica una pureza de aproximadamente el 70%.

Sililación de 5-fluorocitosina

Se sililó 5-Fluorocitosina (1,05 equivalentes basándose en la cantidad de lactol acetilado obtenido en la etapa anterior usando indicación de pureza por CG) por reflujo en al menos 10 equivalentes de hexametildisilazano que contenía una cantidad catalítica de sulfato de amonio puro (0,05 a 0,10 eq.) durante dos horas después la solución se hizo transparente. A continuación, el matraz se selló herméticamente y el disolvente se eliminó usando una bomba de vacío con un colector auxiliar. El producto, un sólido blanco, se dejó al vacío durante una noche hasta estar listo para el uso en la siguiente reacción de acoplamiento.

Acoplamiento de 5-Fluorocitosina Sililada con Lactol Acetilado

A la 5-fluorocitosina sililada (33,86 g, 0,124 mol) en diclorometano seco (350 ml) se le añadió una solución de SnCl_{4} (135,6 ml, una solución 1 molar en CH_{2}Cl_{2}) en atmósfera de nitrógeno. La disolución se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente. La disolución se pasó a través de una cánula a la solución de lactol acetato (38 g, 0,113 mol) en diclorometano (400 ml) en atmósfera de nitrógeno durante un periodo de 30 minutos.

La solución de la reacción se agitó durante 2 horas, punto en el cual la finalización de la reacción se indicó por TLC. Después, la solución de la reacción se diluyó con diclorometano (500 ml) y se interrumpió con solución de hidróxido de amonio. La solución de hidróxido de amonio (100 ml) se añadió lentamente manteniendo la temperatura de reacción por debajo de 30ºC, dando como resultado la formación de un precipitado blanco.

Se dejó la mezcla agitando durante 30 minutos más y después se pasó a través de una columna de bloque de gel de sílice (7 pulgadas (17,80 cm) de diámetro, 5 pulgadas (12,70 cm) de altura). Se eluyó secuencialmente con diclorometano (2 l), acetato de etilo (2 l) y acetato de etilo: etanol (9:1) (4 l). Los eluentes acetato de etilo y acetato de etilo: etanol contenían el producto deseado. Estas soluciones se combinaron y se evaporaron a presión reducida. Después, el sólido residual adhesivo se lavó con éter seco (200 ml) para dar un sólido blanco (25,35 g; 71%), FTC-5'-butirato.

El FTC-5'-butirato (8,74 g, 0,026 mol) se disolvió en 250 ml de metanol. Se añadió metóxido de sodio (2,85 g, 0,052 g) a temperatura ambiente. La reacción se agitó durante 1 hora, momento en el cual se confirmó la terminación de la reacción por TLC. Se añadió solución de NH_{4}Cl (10 ml) para interrumpir la reacción y después el disolvente se eliminó a presión reducida. El resto se absorbió en gel de sílice (5 g) y se pasó a través de una pequeña columna usando acetato de etilo:etanol como un eluyente (9:1). Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se evaporaron para dar un sólido adhesivo que se lavó con éter seco para dar un sólido blanco de FCT (6,00 g, 88%). (^{1}H RMN: (DMSO-d^{6}) 8,18 (1H, d, H_{6}, J = 8,4 Hz), 7,81 y 7,57 (2H, ancho, NH_{2}), 6,12 (1H, dd, H_{1'}, J = 5,7 y 4,2 Hz), 5,40 (1H, t, OH, J = 5,7 Hz), 5,17 (1H, t, 1H_{4'}, J = 3-6 Hz), 3,74 (2H, m, 2H_{5'}), 3,41 (1H, dd, 1H_{2'}, J = 5,7 y 11,7 Hz), 3,11 (1H, dd, 1H_{2'}, J = 4,2 y 11,7 Hz), ^{13}C RMN: (DMSO-d^{6}) 157,85 (d, J = 13,4 Hz), 153,28, 136,12 (d, J = 241 Hz), 126,01 (d, J = 32,6 Hz), 86,90, 86,84, 62,48, 37,07; mp 195-196ºC.

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III. Resolución de enantiómeros de nucleósidos

En el presente documento se proporciona un procedimiento para la resolución de mezclas racémicas de enantiómeros de nucleósidos, incluyendo pero sin limitación, los enantiómeros (+) y (-) del FTC. El procedimiento también se puede usar para la resolución de mezclas racémicas de restos carbohidratos o de tipo carbohidrato, tales como derivados de 1,3-oxatiolano y de 1,3-dioxolano. El procedimiento implica el uso de una enzima que cataliza preferentemente una reacción de un enantiómero en una mezcla racémica. El enantiómero que ha reaccionado se separa del que no ha reaccionado basándose en la nueva diferencia en cuanto a su estructura física. Dada la descripción en la presente memoria descriptiva, un experto en la materia será capaz de elegir una enzima que sea selectiva para el enantiómero del nucleósido elegido (o selectiva para el enantiómero no deseado, como un procedimiento para eliminarlo), mediante la selección de una de las enzimas mencionadas más abajo o mediante la valoración sistemática de otras enzimas conocidas. Dada esta descripción, un experto en la materia también sabrá cómo modificar el sustrato en la medida necesaria para alcanzar la resolución deseada. Se puede determinar el enriquecimiento óptico del éster recuperado mediante el uso de RMN con reactivos de desplazamientos quirales, polarimetría o HPLC quiral.

Los siguientes ejemplos ilustran además el uso de enzimas para la resolución de mezclas racémicas de enantiómeros. Se pueden usar otros procedimientos conocidos para la resolución de mezclas racémicas junto con el procedimiento de resolución descrito en el presente documento. Para preparar las composiciones o medicamentos pueden usarse todas estas modificaciones.

Resolución basada en la hidrólisis de esteres de nucleósidos-C5'

En una realización, el procedimiento incluye la reacción del grupo hidroxilo C5' de una mezcla de racematos de nucleósidos con un compuesto acilo para formar ésteres C5' en el que el nucleósido se encuentra en el extremo "carbinol" del éster. La mezcla racémica de esteres C5' de nucleósidos se trata entonces con una enzima que preferiblemente escinde, o hidroliza, uno de los enantiómeros y no el otro, en un periodo de tiempo proporcionado.

Una ventaja de este procedimiento es que se puede usar para la resolución de una amplia variedad de nucleósidos, incluidos nucleósidos de pirimidina y purina eventualmente sustituidos en el resto carbohidrato o básico. El procedimiento también se puede usar para la resolución de derivados de nucleósidos que contienen heteroátomos adicionales en el resto carbohidrato, por ejemplo, FTC y BCH-189. La extensa aplicabilidad de este procedimiento reside, en parte, en el hecho de que aunque la parte carbinol del éster desempeña un papel en la capacidad de una enzima para diferenciar enantiómeros, el sitio de reconocimiento principal de estas enzimas se encuentra en la parte del ácido carboxílico del éster. Además, se pueden extrapolar con éxito los resultados de un estudio enzima/sustrato a otro sistema, aparentemente diferente, a condición de que las partes del ácido carboxílico de los dos sustratos sean iguales o sustancialmente similares.

Otra ventaja de este procedimiento es que es regioselectivo. Las enzimas que hidrolizan esteres generalmente no catalizan otras reacciones en otras partes de la molécula. Por ejemplo, la enzima lipasa cataliza la hidrólisis del éster del 2-hidroximetil-5-oxo-1,3-oxatiolano sin hidrolizar la lactona interna. Esto contrasta claramente con los enfoques "químicos" de la hidrólisis de esteres.

Otra ventaja más de este procedimiento es que la separación del enantiómero no hidrolizado y del enantiómero hidrolizado de la mezcla de la reacción es bastante sencilla. El enantiómero no hidrolizado es más lipófilo que el enantiómero hidrolizado y se puede recuperar de forma eficaz por simple extracción con un disolvente orgánico apolar de entre una variedad de los mismos o mezclas de disolventes, incluido hexano y hexano/éter. El enantiómero hidrolizado menos lipófilo, más polar, se puede obtener entonces por extracción con un disolvente orgánico más polar, como por ejemplo, acetato de etilo, o por liofilización, seguido de la extracción con etanol o metanol. Se debería evitar el alcohol durante la hidrólisis porque en determinadas condiciones puede desnaturalizar enzimas.

Enzimas y sustratos

Con la creación de la pareja enzima-sustrato adecuada, se pueden establecer las condiciones para el aislamiento de cada enantiómero del nucleósido. El enantiómero deseado se puede aislar mediante el tratamiento de la mezcla racémica con una enzima que hidroliza el enantiómero deseado (seguido de la extracción del hidrolizado polar con un disolvente polar) o el tratamiento con una enzima que hidroliza el enantiómero no deseado (seguido de la eliminación del enantiómero no deseado con un disolvente apolar).

Las enzimas que catalizan la hidrólisis de esteres incluyen esterasas, por ejemplo la esterasa de hígado de cerdo, lipasas, incluida la lipasa pancreática porcina y la lipasa Amano PS-800, subtilisina y \alpha-quimotripsina.

La Figura 3 es un diagrama de producción de la especificidad de la fosfatasa alcalina y la fosfodiesterasa del veneno de serpiente para los enantiómeros (+) y (-) del FTC. Tal como se indica, la fosfatasa alcalina hidroliza el trifosfato de ambos enantiómeros del FTC y, por lo tanto, no es eficaz como medio de separación. La fosfodiesterasa I hidroliza preferentemente el isómero (+) del FTC a su monoéster, que se puede exponer a 5'-nucleotidasa para proporcionar (+)-FTC.

El grupo acilo más eficaz que se puede usar para esterificar la posición C5' del nucleósido se puede determinar sin una experimentación indebida mediante la valoración de una serie de homólogos usando el sistema enzimático seleccionado. Por ejemplo, cuando se esterifican los nucleósidos 1,3-oxatiolano con ácido butírico, las resoluciones tanto con esterasa de hígado de cerdo como con Amano PS-800 se llevan a cabo con una elevada enantioselectividad (exceso enantiomérico del 94-100%) y una selectividad opuesta. La esterasa de hígado de cerdo hidroliza preferentemente el enantiómero (+) del FTC y la Amano PS-800® hidroliza preferentemente el enantiómero (-) del FTC. El porcentaje de exceso enantiomérico representado en la Tabla 1 es la cantidad de éster butirato purificado en la mezcla tratada con enzima (es decir, el éster butirato del (-)-FTC en el caso de la PLE (esterasa de hígado de cerdo) y el éster butirato del (+)-FTC en el caso de la Amano PS-800®).

Ejemplos no limitantes de grupos acilo que se pueden valorar para su uso con una mezcla enantiomérica concreta de nucleósidos y una enzima concreta incluyen los ácidos alquil-carboxílicos y los ácidos alquil-carboxílicos sustituidos, incluido el ácido acético, el ácido propiónico, el ácido butírico y el ácido pentanoico. Con ciertas enzimas, se puede preferir el uso de un compuesto acilo que sea significativamente aceptor de electrones para facilitar la hidrólisis debilitando el enlace éster. Los ejemplos de grupos acilo aceptores de electrones incluyen \alpha-haloésteres tales como el ácido 2-cloropropiónico, el ácido 2-clorobutírico y el ácido 2-cloropentanoico. Los \alpha-haloésteres son excelentes sustratos para las lipasas.

Condiciones de resolución

Las hidrólisis enzimáticas se llevan generalmente a cabo con una cantidad catalítica de la enzima en un tampón acuoso con un pH cercano al pH óptimo para la enzima en cuestión. A medida que se desarrolla la reacción, el pH desciende como consecuencia del ácido carboxílico liberado. Se debería añadir una base acuosa para mantener el pH cerca del valor óptimo para la enzima. El avance de la reacción se puede determinar fácilmente controlando el cambio de pH y la cantidad de base necesaria para mantener el pH. El éster hidrófobo (el enantiómero no hidrolizado) y el alcohol más polar (el enantiómero hidrolizado) se pueden extraer secuencial y selectivamente de la solución mediante la elección sensata de disolventes orgánicos. De forma alternativa, el material a resolver se puede pasar a través de una columna que contenga la enzima inmovilizada en un soporte sólido.

Las hidrólisis enzimáticas realizadas en condiciones heterogéneas pueden presentar una escasa reproducibilidad. Se prefiere, por lo tanto, realizar la hidrólisis en condiciones homogéneas. No se prefieren los disolventes alcoholes porque pueden desnaturalizar las enzimas. La homogeneidad se puede conseguir mediante el uso tensioactivos no iónicos, como el Tritón X-100. Sin embargo, la adición de estos tensioactivos no sólo ayuda a disolver el material de partida sino que también potencia la solubilidad acuosa del producto. Por lo tanto, aunque la reacción enzimática se puede llevar a cabo de forma más eficaz que en condiciones heterogéneas añadiendo un tensioactivo no iónico, el aislamiento tanto del material de partida recuperado como del producto puede verse dificultado. El producto se puede aislar por técnicas cromatográficas y químicas adecuadas (como por ejemplo, la formación selectiva de sales). Los nucleósidos diacilados se pueden usar pero son, con frecuencia, algo lipófilos y difíciles de disolver en el medio usado.

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Ejemplo 2

Hidrólisis enantioselectiva de esteres de FTC catalizada por lipasa

Se prepararon una serie de derivados 5'-O-acilo del FTC por O-acilación selectiva de la sal N-clorhidrato (véanse la Tabla 1 y la Figura 4) del (\pm)-FTC. Se investigó la eficacia de la hidrólisis de los derivados por lipasas. Tal como se muestra en la Tabla 1, la esterasa de hígado de cerdo (PLE) muestra un elevado nivel de selectividad hacia la hidrólisis del éster del enantiómero (+) del FTC, dejando predominantemente el butirato del (-)-FTC en la mezcla analizada por HPLC. Por el contrario, la PS-800 hidroliza preferentemente el éster del enantiómero (-) del FTC, dejando predominantemente el butirato del (+)-FTC en la mezcla analizada por HPLC. También se observó que la tasa de hidrólisis dependía de la naturaleza del grupo acilo; el derivado acetilo era significativamente más lento que el derivado butirilo. Se ha descubierto ahora que la tasa de hidrólisis del éster del ácido propiónico del FTC es incluso más rápida que la que se observa con el derivado butirato. Se determinó tanto el porcentaje de recuperación como el porcentaje de exceso enantiomérico por HPLC. Aunque la enantioselectividad es excelente cuando se emplea la PLE (generalmente un e.e. del 97% o mayor), se puede llevar a cabo un enriquecimiento adicional por reacciones secuenciales de hidrólisis enzimática en las que el butirato enantioméricamente enriquecido procedente de la hidrólisis catalizada por PLE de somete a hidrólisis enzimática por PS-800.

TABLA 1 Comparación del efecto del éster sobre la hidrólisis enzimática

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Ejemplo 3

Procedimiento para la preparación de (+)- y (-)-FTC mediante la hidrólisis enantioselectiva de butirato de FTC catalizada por lipasa

Se disolvió 5'-O-butirato de (\pm)-FTC (0,47 mmol, 149 mg) en 16 ml de una solución tampón: CH_{3}CN 4:1 pH 8. La solución transparente se agitó y se trató con 26 mg de esterasa de hígado de cerdo (PLE-A). El progreso de la reacción se controló por HPLC (Figura 4). Tras 20 horas (conversión del 52%), la mezcla de la reacción se extrajo con 2x80 ml de CHCL_{3} y 80 ml de acetato de etilo. Los extractos de la capa orgánica se combinaron, se secaron sobre MgSO_{4} anhidro, se filtraron y se concentraron por evaporación rotatoria. El residuo resultante se eluyó en 2 placas pTLC 1000 m usando acetato de etilo como eluyente (doble elución) para dar, tras su aislamiento, 53 mg (36% basándose en el material de partida) de butirato de FTC que se determinó tenía un exceso enantiomérico (e.e.) del 98% mediante el análisis por HPLC. El butirato enantioméricamente enriquecido se trató entonces con 1,6 ml de metanol seguido de 0,38 mmol (20 mg) de metóxido de sodio. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente y el progreso de la reacción se controló por HPLC. La reacción se había completado al cabo de 30 minutos. El disolvente se eliminó por evaporación rotatoria para dar un sólido blanco bruto (76 mg) que se eluyó en una pTLC 1000 m usando acetato de etilo: etanol 5:1. El (-)-FTC se aisló en forma de sólido blanco (33 mg; rendimiento 82%). El análisis por HPLC del FTC, en forma de su derivado O-acetato-5', mostró un e.e. del 97%; [\alpha] (^{20}, _{D}) -120,5º (c = 0,88; etanol abs.).

Se pueden evitar las emulsiones en la etapa de tratamiento añadiendo HCCl_{3} a la mezcla de la reacción tras la finalización de la misma (lo que también sirve para desnaturalizar la enzima), los disolventes se eliminan al vacío y se realiza la extracción con HCCl_{3}.

De forma similar, se disolvieron 1,2 mmol (375 mg) de O-butirato-5' de (\pm)-FTC en 40 ml de tampón -CH_{3}CN 4:1 pH 8. La solución transparente se agitó y se trató con 58 mg de esterasa de hígado de cerdo (PLE-A). El progreso de la reacción se controló por HPLC. Tras 90 minutos (conversión del 38%), la mezcla de la reacción se añadió a 150 ml de CHCl_{3}. Las capas se separaron y la capa acuosa se liofilizó para eliminar el disolvente. El residuo blanco de la liofilización se extrajo con 3 x 10 ml de etanol absoluto. Los extractos se filtraron, se combinaron y se concentraron al vacío para producir 179 mg de aceite bruto. El material bruto se eluyó en una columna 45 x 30 mm de gel de sílice usando 3 x 75 ml de acetato de etilo seguido de acetato de etilo: etanol 5:1. El (+)-FTC se aisló como un sólido blanco (109 mg; 37% basándose en el butirato de partida). El análisis por HPLC del (+)-FTC, en forma de su derivado 5'-O-acetato, mostró un e.e. del 97,4%; [a] O(^{20}, _{D}) +113,4º (c = 2,53; etanol absoluto).

Se llevó a cabo una reacción similar usando 0,12 mmol (37 mg) de 5'-O-butirato de FTC y 7 mg de PS-800 en 4,0 ml de tampón: CH_{3}CN 4:1 pH 8. La reacción fue considerablemente más lenta que la que se llevó a cabo con PLE-A y requirió 74 horas para una conversión del 59%. Se vio que el butirato recuperado (11,4 mg; 31% de la cantidad inicial) presentaba un e.e. del 94% por HPLC.

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Resolución de enantiómeros de nucleósidos con citidina-desoxicitidina desaminasa

En una realización alternativa, se usa citidina-desoxicitidina desaminasa para la resolución de mezclas racémicas de 2-hidroximetil-5-(citosin-1-il)-1,3-oxatiolano y sus derivados, incluido el 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano. La enzima cataliza la desaminación del resto citosina a un uracilo. Se ha descubierto que uno de los enantiómeros de los nucleósidos 1,3-oxatiolano es un sustrato preferido por la citidina-desoxicitidina desaminasa. El enantiómero que no se convierte en un derivado uracilo (y que, por lo tanto, aún es básico) se extrae de la solución con una solución acida. Se debe tener cuidado de evitar las soluciones muy acidas (pH por debajo de 3,0), que pueden provocar la escisión del anillo oxatiolano.

La citidina-desoxicitidina desaminasa se puede aislar a partir de hígado de rata o hígado humano, o se puede expresar a partir de secuencias recombinantes en un sistema procariota como E. coli.

El procedimiento de resolución de enantiómeros de nucleósidos de citidina usando la citidina-desoxicitidina desaminasa se puede usar como procedimiento único de resolución o se puede usar junto con otros procedimientos, incluida la resolución por hidrólisis enzimática de esteres de 5'-O-nucleósidos tal como se describe anteriormente.

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Combinación de la resolución enzimática con procedimientos clásicos de resolución

El procedimiento descrito anteriormente para la resolución de mezclas racémicas de enantiómeros de nucleósidos se puede combinar con otros procedimientos clásicos de resolución enantiomérica para incrementar la pureza óptica del producto final.

Los procedimientos clásicos de resolución incluyen varias técnicas físicas y químicas. Con frecuencia la técnica más simple y eficaz es la recristalización, basada en el principio de que los racematos son con frecuencia más solubles que los enantiómeros individuales correspondientes. La recristalización se puede llevar a cabo en cualquier etapa, incluido sobre los compuestos acilados o el producto enantiomérico final. Si tiene éxito, este sencillo enfoque representa un procedimiento de elección.

Cuando la recristalización no consigue proporcionar un material con una pureza óptica aceptable, se pueden valorar otros procedimientos. Si el nucleósido es básico (por ejemplo, una citidina) se pueden usar ácidos quirales que forman mezclas de diastereoisómeros que pueden poseer propiedades de solubilidad significativamente diferentes. Ejemplos no limitativos de ácidos quirales incluyen el ácido málico, el ácido mandélico, el ácido dibenzoil tartárico, el ácido 3-bromocanfor-8-sulfónico, el ácido 10-canforsulfónico y el ácido di-p-toluiltartárico. De forma similar, la acilación del grupo hidroxilo libre con el derivado de un ácido quiral también da como resultado la formación de mezclas de diastereoisómeros cuyas propiedades físicas pueden ser suficientemente diferentes como para permitir su
separación.

Se pueden obtener o purificar pequeñas cantidades de nucleósidos enantioméricamente enriquecidos pasando la mezcla racémica a través de una columna de HPLC diseñada para separaciones quirales, incluidas las columnas unidas a ciclodextrina comercializadas por Rainin Corporation.

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Ejemplo 4

Separación de mezclas racémicas de nucleósidos por HPLC

La resolución de los enantiómeros C4' del (\pm)-FTC se llevó a cabo usando una columna quiral unida a ciclodextrina (cyclobond AC-I) procedente de la Rainin Corporation (Woburn, MA). Las condiciones fueron las siguientes: sistema isocrático; metanol 0,5% en agua; caudal 1 ml/min, detección UV a 262 nm. El metanol con calidad HPLC se adquirió en J.T. Baker (Phillipsburg, NJ). Las mezclas racémicas se inyectaron y las fracciones se recogieron. Las fracciones que contenían cada uno de los enantiómeros se juntaron, se congelaron y se liofilizaron. Los compuestos se caracterizaron por espectroscopia UV y por sus tiempos de retención en la HPLC. En general, los enantiómeros (-) tienen tiempos de retención menores que los enantiómeros (+) (véase Liquid Chromatography 7: 353-376, 1984). Las concentraciones de los compuestos se determinaron por espectroscopia UV, usando una solución madre de concentración conocida (15 \muM) preparada en agua para valoración biológica. Los tiempos de retención (R_{t}) para los enantiómeros separados se proporcionan en la Tabla 2.

TABLA 2 Tiempos de retención de los enantiómeros del FTC

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Ejemplo 5

Procedimientos alternativos para separar enantiómeros del FTC usando una columna quiral

Usando una columna Cyclobond I-Ac (5 \mum, 25 cm x 4,6 mm, Rainin Corporation, Woburn, MA, número de catálogo AST-41049), con un caudal de 0,6 ml/min de metanol isocrático al 0,5% (Fisher Scientific, Inc. calidad HPLC, número de catálogo A-452-4 en agua) y detección UV a 262 nm, los enantiómeros del FTC presentaron tiempos de retención de 12,68 minutos ((-)-FTC) y 13,20 minutos ((+)-FTC).

Usando una columna Chiralpak AS (10 \mum, 25 cm x 4,6 mm, J.T. Baker Inc., Phillisburg, NJ, número de catálogo 7406-00, número de serie 09-29-10320) con un caudal de 0,8 ml/min de alcohol isopropilo (calidad HPLC, Fisher Scientific, Inc., número de catálogo A-451-4) y detección UV a 262 nm, los enantiómeros del FTC presentaron tiempos de retención de 5,9 minutos ((-)-FTC) y 9,8 minutos ((+)-FTC).

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IV. Capacidad del 2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano ("FTC") para inhibir la replicación del VIH

Con frecuencia es deseable seleccionar diversas mezclas racémicas de nucleósidos como una etapa preliminar para determinar cuáles garantizan una resolución adicional en componentes enantioméricamente enriquecidos y la evaluación adicional de la actividad antiviral. La capacidad de los nucleósidos para inhibir el VIH se puede medir mediante varias técnicas experimentales. La técnica usada en el presente documento y descrita con detalle a continuación, mide la inhibición de la replicación viral en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana infectadas por VIH-1 (cepa LAV) y estimuladas con fitohemaglutinina (PHA). La cantidad de virus producido se determina midiendo la enzima transcriptasa inversa codificada por el virus. La cantidad de enzima producida es proporcional a la cantidad de virus producido. La Tabla 3 proporciona los valores de CE_{50} (concentración de nucleósido que inhibe la replicación del virus en un 50% en células MSP, con un factor de error estimado del 10%) y los valores de CI_{50} (concentración de nucleósido que inhibe al 50% el crecimiento de células MSP humana no infectadas y estimuladas con mitógeno) de una serie de (\pm)-1,3-oxatiolanos y nucleósidos.

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Ejemplo 6

Actividad anti-VIH de los nucleósidos (\pm)-1,3-oxatiolano

A. Células MSP tres días estimuladas con fitohemaglutinina (10^{6} células/ml), procedentes de donantes sanos seronegativos para la hepatitis B y el VIH-1, se infectaron con VIH-1 (cepa LAV) a una concentración de aproximadamente 100 la dosis infecciosa en cultivo de tejidos 50% (DITC 50) por ml y se cultivaron en presencia y ausencia de varias concentraciones de compuestos antivirales.

B. Aproximadamente una hora tras la infección, el medio con el compuesto a ensayar (2 veces la concentración final en el medio) o sin el compuesto se añadió a los matraces (5 ml; volumen final 10 ml). Se usó AZT como un control positivo.

C. Las células se expusieron al virus (aproximadamente 2 x 10^{5} dpm/ml, tal como se determinó por el ensayo de la transcriptasa inversa) y se pusieron en un incubador de CO_{2}. El VIH-1 (cepa LAV) se adquirió en el Center for Disease Control, Atlanta, Georgia. Los procedimientos usados para cultivar las células MSP, recoger los virus y determinar la actividad transcriptasa inversa son los descritos por McDougak y col. (J. Immun. Meth. 76, 171-183, 1985) y Spira y col. (J. Clin. Meth. 25, 97-99, 1987) salvo que no se añadió fungizona al medio (véase Schinazi y col., Antimicrob. Agents Chemother. 32, 1784-1787 (1988); Id., 34: 1061-1067 (1990)).

D. El día 6, las células y el sobrenadante se transfirieron a un tubo de 15 ml y se centrifugaron aproximadamente a 900 g durante 10 minutos. Se recogieron cinco ml de sobrenadante y el virus se concentró por centrifugación a 40.000 rpm durante 30 minutos (Beckman 70.1 Ti rotor). El sedimento de virus solubilizado se procesó para la determinación de los niveles de transcriptasa inversa. Los resultados están expresados en dpm/ml de sobrenadante de muestra. También se pueden concentrar virus procedentes de volúmenes menores de sobrenadante (1 ml) por centrifugación previa a la solubilización y determinación de los niveles de transcriptasa inversa.

La mediana de la concentración eficaz (CE_{50}) se determinó por el método de la mediana (Antimicrob. Agents Chemother. 30,491-498 (1986). Resumiendo, el porcentaje de inhibición del virus, determinado a partir de mediciones de transcriptasa inversa, se representa en un gráfico frente a la concentración micromolar de compuesto. La CE_{50} es la concentración de compuesto a la que hay una inhibición del crecimiento viral del 50%.

E. Se cultivaron células MSP humana no infectadas y estimuladas con un mitógeno (3,8 x 10^{5} células/ml) en presencia y ausencia de medicamento en condiciones similares a las que se usaron para el ensayo antiviral descrito más arriba. Las células se contaron tras 6 días usando un hemacitómetro y el procedimiento de exclusión con azul tripán, como describieron Schinazi y col., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 22(3), 499 (1982). La CI_{50} es la concentración de compuesto que inhibe el crecimiento de células normales en un 50%.

TABLA 3 CE_{50} y CI_{50} de diversos análogos de nucleósidos 1,3-oxatiolano en células MSP humana

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Tal como se indica en la Tabla 3, en general, los nucleósidos 1,3-oxatiolano citosina sustituidos son más activos que los nucleósidos uracilo correspondientes. El error en las mediciones de CE_{50} e CI_{50} se estima en \pm 10%.

Uno de los compuestos, (\pm)-FTC, (denominado en lo sucesivo "DLS-022", compuesto 8) no sólo presenta una excepcional actividad (aproximadamente 10 nM en células MSP) sino que también presenta una toxicidad bastante baja (>100 \muM en células MSP, Vero y CEM).

La CI_{50} del (\pm)-FTC estaba por encima de 100 \muM, indicando que el compuesto no era tóxico en células MSP no infectadas, evaluada hasta 100 \muM.

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Ejemplo 7

Actividad antiviral de los enantiómeros del FTC resueltos por HPLC

Los enantiómeros del FTC se aislaron por el procedimiento del Ejemplo 4, y la actividad antiviral se evaluó mediante el procedimiento del Ejemplo 6. Los resultados se proporcionan en la Tabla 4 y se ilustran en la Figura 5.

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TABLA 4 Actividad antiviral de los enantiómeros (+) y (-) del FTC

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Tal como se indica en la Tabla 4, en este experimento el enantiómero (-) del FTC parece ser aproximadamente un orden de magnitud más potente que el enantiómero (+) del FTC y tiene aproximadamente la misma actividad anti-VIH que la mezcla racémica. Ni los enantiómeros ni la mezcla racémica son tóxicos hasta 100 \muM, tal como se ha determinado mediante el procedimiento de exclusión con azul de tripano en células MSP humana.

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Ejemplo 8

Actividad antiviral de los enantiómeros del FTC resueltos por el procedimiento del Ejemplo 3

Los enantiómeros del (\pm)-FTC se resolvieron también por el procedimiento del Ejemplo 3 y la actividad antiviral se evaluó mediante el procedimiento del Ejemplo 6. Los resultados se ilustran en la Figura 6. Tal como se indica en la Figura 6, la CE_{50} de la mezcla racémica del FTC fue de 0,017 \muM, la CE_{50} del (-)-FTC fue de 0,0077 \muM y la CE_{50} del (+)-FTC fue de 0,84 \muM.

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Ejemplo 9

Captación de (\pm)-FTC por células MSP humana

Los estudios se emprendieron usando FTC radiomarcado para hacer un seguimiento de los perfiles intracelulares del medicamento parental y los metabolitos detectados en el interior de la célula. Todos los estudios se llevaron a cabo por duplicado. Se resuspendieron células mononucleares de sangre periférica (células MSP) humana en medio RPMI 1640 que contenía un 10% de suero de ternera fetal y antibióticos (2 x 10^{6} células/ml), 10 ml por momento) y se incubaron tras añadir FTC 10 \muM (actividad específica aproximadamente 700 dpm/pmol). Las células se expusieron al medicamento durante 2, 6, 12 y 24 horas. A estos momentos, el medio se retiró y las células se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hank fría. La extracción se llevó a cabo añadiendo 0,2 ml de metanol frío al 60%/agua y almacenando la mezcla durante una noche a -70ºC. A la mañana siguiente, las suspensiones se centrifugaron y las extracciones se repitieron dos veces durante 0,5 horas a -70ºC. Los sobrenadantes totales (0,6 mi) se liofilizaron. Los residuos se resuspendieron en 250 \mul de agua y se analizaron alícuotas de entre 50 y 100 \mul por HPLC. Se llevaron a cabo cuantificaciones del medicamento parental y sus derivados metabólicos intracelulares por HPLC. Debido a la posible labilidad ácida de algunos compuestos, se usó un sistema tampón con un pH cercano al fisiológico para la separación de los metabolitos.

La Figura 7 es un gráfico de la presencia (captación) de (\pm)-FTC tritiado en células MSP humana (media de dos determinaciones) en tiempo (horas) frente a pmol/10^{6} células. Los estudios de captación indican que el FTC radiomarcado es fácilmente captado por los linfocitos humanos, que producen cantidades muy grandes del derivado 5'-trifosfato del FTC.

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Ejemplo 10

Actividad antirretroviral del FTC en diversas líneas celulares

Se midió la actividad antirretroviral del FTC en varias líneas celulares usando procedimientos similares, pero no idénticos, a los que se han expuesto en el Ejemplo 6. Las líneas celulares se obtuvieron tanto de donantes humanos, como del AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH, Rockville, Maryland, la ATCC o la Red Cross. Las células CEM deficientes en timidina quinasa se prepararon pasando las células CEM de forma secuencial en presencia de 5-bromo-2'-desoxiuridina. Los resultados se proporcionan en la Tabla 5.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5 Actividad antirretroviral del FTC en distintos sistemas celulares

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Ejemplo 11

Salida de (\pm)-FTC de células MSP humana

Los estudios se llevaron a cabo usando FTC radiomarcado para hacer el seguimiento de los perfiles intracelulares del medicamento parental y los metabolitos detectados en el interior de la célula tras la incubación en medio con el medicamento durante 24 horas y la posterior retirada del medicamento. Este estudio mide el tiempo necesario para disminuir los niveles intracelulares de trifosfatos. Los estudios se llevaron a cabo por duplicado. Las células no infectadas (2 x 10^{6} ml) se resuspendieron en el medio adecuado complementado con suero (10 ml por momento) y se incubaron a 37ºC en un incubador con un 5% de CO_{2}. La concentración de FTC radiomarcado era 10 \muM. Tras añadir el compuesto radiomarcado en pulsos a las células durante 24 horas, las células se lavaron minuciosamente y después se les suministró medio reciente sin los medicamentos antivirales (0 h). A las 0, 2, 4, 6, 12, 24 y 48 horas (segundo tiempo de incubación), las células se recogieron y se extrajeron inmediatamente con metanol frío al 60%/agua. El extracto se obtuvo por centrifugación y eliminación del sedimento de células. Los extractos se liofilizaron y se almacenaron a continuación a -70ºC. Antes del análisis, el material se resuspendió en 250 microlitros de tampón HPLC y se analizó inmediatamente. La cuantificación del medicamento parental y los derivados metabólicos intracelulares se llevó a cabo por HPLC, usando un sistema de HPLC de Micromeritics o de Hewlett-Packard modelo 1090 con una columna Partisil 10 SAX de intercambio aniónico (Whatman, Inc.), con un caudal de 1 ml/min, una presión de 1 kpsi, y detección UV a 262 nm. La fase móvil consistía en agua desionizada (A), NaH_{2}PO_{4} 2 mM/NaOAc 16 mM (pH = 6,6) (B), NaH_{2}PO_{4} 15 mM/NaOAc 120,2 mM (pH = 6,6) (C) y NaH_{2}PO_{4} 100 mM/NaOAc 800 mM (pH = 6,6) (D).

Procedimiento de separación: sistema isocrático durante 5 minutos con A, seguido de un gradiente lineal de 15 minutos hasta un 100% de B, seguido de un gradiente lineal de 20 minutos hasta un 100% de C, seguido de un gradiente lineal de 10 minutos hasta un 100% de D, seguido de un sistema isocrático durante 30 minutos con 100%
de D.

Tiempos de retención (minutos) en células humanas

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La Figura 8 es un gráfico de la salida de (\pm)-FTC radiomarcado de células MSP humana, medido en horas tras la retirada del medicamento frente a la concentración (pmol/10^{6} células). Tal como se indica en la Figura, el FTC-trifosfato tiene una semivida intracelular de aproximadamente 12 horas y se puede detectar fácilmente a nivel intracelular en concentraciones de 1-5 \muM, 48 horas tras la retirada del medicamento extracelular, lo que está muy por encima de la CE_{50} del compuesto. Además, la afinidad (K^{1}) por el trifosfato de (\pm)-FTC cuando se usa la RT del VIH es de 0,2 \muM, lo que está por debajo del nivel de concentración a las 48 horas.

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Ejemplo 12

Actividad anti-VIH de los derivados farmacéuticamente aceptables del (\pm)-FTC

a. Se evaluaron varios derivados farmacéuticamente aceptables del (\pm)-FTC, preparados derivando las posiciones 5' y N^{4}, para su actividad anti-VIH en células MSP usando un procedimiento similar al que se ha descrito en el Ejemplo 6. Los resultados son los siguientes. El éster O-butirato-5' del (+)-FTC presentó una CE_{50} de 0,0017. El derivado N^{4}-acetilo del (\pm)-FTC presentó una CE_{50} de 0,0028. El O-butirato-5', N^{4}-éster del (\pm)-FTC presentó una CE_{50} = 0,0058.

b. La actividad anti-VIH del éster O-butirato-5' del (\pm)-FTC en el sistema MT4 (CE_{50}) fue 0,04 \muM. En el mismo ensayo, el (\pm)-FTC no acilado presentó una CI_{50} de 0,52 \muM. La CI_{50} del AZT en este sistema fue de 0,09 \muM.

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V. Capacidad del FTC para inhibir la replicación del VHB

Ejemplo 13

Evaluación de la actividad de los enantiómeros (+) y (-) del FTC en cultivos celulares 2.2.15

La capacidad de los enantiómeros del FTC para inhibir el crecimiento de virus en cultivos celulares 2.2.15 (células HepG2 transformadas con un virión de la hepatitis) se describe con detalle a continuación.

Se ha elaborado un resumen y una descripción del ensayo de los efectos antivirales en este sistema de cultivo y del análisis de ADN del VHB (Korba and Milman, 1991, Antiviral Res., 15: 217). Las evaluaciones antivirales se realizaron en dos pases distintos de células. Todos los pocillos, de todas las placas, se sembraron a la misma densidad y al mismo tiempo.

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Parámetros de ensayo

Debido a las variaciones intrínsecas en los niveles tanto intracelulares como extracelulares de ADN del VHB, solamente se consideraron estadísticamente significativos (P<0,05) disminuciones 3,5 veces (para el ADN del virión del VHB) o 3,0 veces (para productos intermedios de la replicación de ADN del VHB) mayores que los niveles medios de estas formas de ADN del VHB en células no tratadas. Los niveles de ADN del VHB integrado en cada preparación de ADN celular (que se mantienen constantes por célula en estos experimentos) se usaron para calcular los niveles de formas intracelulares de ADN del VHB, asegurando de este modo que se comparaban cantidades iguales de ADN celular entre distintas muestras.

Los valores típicos de ADN extracelular del virión del VHB en células no tratadas varían entre 50 y 150 pg/ml de medio de cultivo (media de aproximadamente 76 pg/ml). Los productos intermedios intracelulares de replicación del ADN del VHB en células no tratadas varían entre 50 y 100 pg/\mug de ADN celular (media de aproximadamente 74 pg/\mug de ADN celular). En general, las disminuciones de los niveles de ADN intracelular del VHB debidas al tratamiento con compuestos antivirales son menos pronunciadas y ocurren más despacio que las disminuciones de los niveles de ADN del virión del VHB (Korba y Milman, 1991, Antiviral Res., 15: 217).

La forma en que se realizaron los análisis de hibridación para estos experimentos dio como resultado una equivalencia de aproximadamente 1,0 pg de ADN intracelular del VHB para 2-3 copias genómicas por célula y 1,0 pg/ml de ADN extracelular del VHB para 3 x 10^{5} partículas virales/ml.

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Análisis de toxicidad

Los análisis de toxicidad se realizaron para evaluar si cualquier efecto antiviral observado se debía a un efecto general sobre la viabilidad celular. El procedimiento usado en el presente documento fue la medición de la captación de colorante rojo neutro, un ensayo convencional y de uso extendido para la viabilidad celular en una diversidad de sistemas virus-huésped, incluidos VSH y VIH. Los análisis de toxicidad se realizaron en placas de 96 pocillos con fondo plano para cultivos tisulares. Las células para los análisis de toxicidad se cultivaron y trataron con los compuestos ensayados siguiendo el mismo programa que se describe para las evaluaciones antivirales más abajo. Cada compuesto se ensayó a 4 concentraciones, cada uno en cultivos por triplicado (pocillos "A", "B" y "C"). La captación de colorante rojo neutro se usó para determinar el nivel de toxicidad relativo. La absorbancia del colorante internalizado a 510 nm (A_{sin}) se usó para el análisis cuantitativo. Los valores se presentan como porcentaje de los valores A_{sin} medios en 9 cultivos separados de células no tratadas mantenidos en la misma placa de 96 pocillos que los compuestos a ensayar. La captación de colorante en los 9 cultivos control en la placa 5 varió entre 91,6% y 110,4%, en la placa 6 entre 96,6% y 109%. Los resultados se proporcionan en la Tabla 6.

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TABLA 6 Análisis de toxicidad de los compuestos ensayados en células 2.2.15

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Evaluación de la toxicidad

Tal como se indica en la Tabla 6, no se observó una toxicidad significativa (disminución mayor del 50% con respecto a los niveles de captación de colorante observado en células no tratadas) con los compuestos ensayados a las concentraciones usadas para las evaluaciones antivirales. Ambos compuestos ensayados, (-)-FTC y (+)-FTC, parecieron ser tóxicos a las concentraciones más elevadas usadas en los análisis de toxicidad (330 \muM).

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Evaluaciones antivirales Controles

Dentro de las variaciones normales, los niveles de ADN del virión de VHB y los productos intermedios intracelulares de replicación del VHB [VHB RI] permanecieron constantes en las células no tratadas durante el periodo de exposición. El DMSO, a una concentración del 1%, no afectó a los niveles de replicación del VHB en cultivos celulares 2.2.15.

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Compuestos ensayados

Tal como se indica en la Tabla 7, tanto el (-)-FTC como el (+)-FTC inhibían significativamente la replicación del VHB en los niveles ensayados. Tal como se indica en la Tabla 8, el (-)-FTC aún inhibe de forma significativa la síntesis de ADN del virión del VHB y el ADN intracelular del VHB a concentraciones de 4, 1 y 0,25 \muM.

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TABLA 7 Efecto de los compuestos ensayados sobre la producción de VHB en cultivos celulares 2.2.15

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TABLA 8 Efectos de los compuestos ensayados sobre la producción de VHB en cultivos celulares 2.2.15

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Ejemplo 14

Captación de (\pm)-FTC en células hepáticas humanas; Actividad del FTC frente al VHB

Se repitió el procedimiento del Ejemplo 9 con células hepáticas humanas (células HepG2, disponibles en la ATCC) para determinar la captación y el metabolismo del FTC en estas células. Tal como se muestra en la Figura 9, las células HepG2 captan (\pm)-FTC en grandes cantidades. Estas células hepáticas humanas metabolizan un alto porcentaje del (\pm)-FTC a trifostato de (\pm)-FTC.

Estos datos, junto con los demás datos proporcionados en el presente documento, indican que el (\pm)-FTC, así como sus enantiómeros (-) y (+), se fosforilan en células hepáticas. Estas células se pueden transformar con el virus de la hepatitis B.

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Ejemplo 15

Salida de FTC en células HepG2 humanas

La Figura 10 ilustra la salida de [^{3}H]-(\pm)-FTC y sus derivados fosforilados de células HepG2 humanas en pmol/10^{6} células a lo largo del tiempo tras añadir a las células pulsos de 10 \muM [^{3}H]-(\pm)-FTC (700 DPM/pmol) durante 24 horas, y evaluar la concentración del compuesto 24 horas tras su retirada.

La Figura 11 ilustra la disminución de la concentración combinada de [^{3}H]-(\pm)-FTC y sus derivados fosforilados de células HepG2 humanas tras la incubación con 10 \muM de [^{3}H]-(\pm)-FTC (700 DPM/pmol) durante 24 horas, en pmol/10^{6} células, a lo largo del tiempo.

Tal como se ilustra, incluso a las 48 horas, aún está presente en las células más de 1 \muM de compuesto activo (lo que es significativamente mayor a la CE_{50} para el compuesto).

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V. Toxicidad en células precursoras de granulocitos-macrófagos

Ejemplo 16

Efecto del FTC sobre la formación de colonias de células precursoras de granulocitos-macrófagos

La Figura 12 es un gráfico del efecto de los enantiómeros (-) y (+) del FTC sobre la formación de colonias de células precursoras de granulocitos-macrófagos, medido en porcentaje de supervivencia frente a concentración en \muM ((-)-FTC, círculo vacío; (+)-FTC, círculo relleno; AZT, cuadrado relleno. Tal como se indica, el enantiómero (-) del FTC parece ser menos tóxico, es decir, tiene una mayor CI_{50}, que tanto el enantiómero (+) como el AZT en esta línea celular.

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VI. Farmacocinética del FTC

Ejemplo 17

Metabolismo del FTC en administración a ratas

Se administró (\pm)-FTC por vía intravenosa en dosis de 10, 50 y 100 mg/kg en ratas y se evaluó el área bajo la concentración plasmática del medicamento frente a tiempo (AUC), el aclaramiento total (CL_{T}), el volumen de distribución en el estado de equilibrio estacionario (V_{ss}), el tiempo medio de residencia (MRT) y la semivida (t_{1/2}). Los resultados se proporcionan en la Tabla 9.

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TABLA 9 Parámetros farmacocinéticos de FTC tras la administración intravenosa de 10, 50 y 100 mg/kg en ratas*

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Ejemplo 18

Parámetros farmacocinéticos del FTC tras la administración vía intravenosa y oral de FTC

Se obtuvieron los parámetros farmacocinéticos modelo-independientes para el (\pm)-FTC mediante la administración (intravenosa (I.V.) y oral (P.O.)) de 33,3 mg/kg en macacos de la india. Los resultados se proporcionan en la Tabla 10. Cabe destacar, que la biodisponibilidad media del compuesto en los monos fue del 73% (\pm 6%).

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TABLA 10 Parámetros Farmacocinéticos Modelo-Independientes Obtenidos para el FTC después de la Administración Intravenosa (I.V.) y Oral (P.O.) de 33,3 mg/kg en Macacos de la India*

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TABLA 11 Relación LCR/Suero del FTC y su Metabolito Desaminado 1 hora después del Tratamiento

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Ejemplo 19

Relación LCR/Suero de FTC y sus Metabolitos en Macacos de la India

La capacidad del (\pm)-FTC para atravesar la barrera hematoencefálica se evaluó administrando 33,3 mg/kg del compuesto activo en macacos de la india y midiendo la cantidad (\pm)-FTC en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y suero sanguíneo una hora después de la administración. Los resultados se proporcionan en la Tabla 11. Los datos indican que una cantidad significativa del compuesto activo atraviesa la barrera hematoencefálica en estos mamíferos.

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III. Preparación de Composiciones Farmacéuticas

Los seres humanos que padecen de enfermedades provocadas por la infección por el VIH o VHB pueden tratarse administrando al paciente una cantidad eficaz de (\pm)-FCT o sus enantiómeros (-) o (+) o un derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo en presencia de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los materiales activos pueden administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, por vía parenteral, por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía subcutánea o por vía tópica en forma líquida o sólida.

El compuesto activo se incluye en el vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para suministrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto para inhibir la replicación viral in vivo, especialmente la replicación del VIH y VHB, sin causar efectos graves tóxicos en el paciente tratado. Por "cantidad inhibitoria" se refiere a una cantidad del ingrediente activo lo suficiente para ejercer un efecto inhibitorio como se mide, por ejemplo, en un ensayo tal como uno de los descritos en este documento.

Una dosis preferida de (-), (+), o (\pm)-FTC para todos las afecciones anteriormente mencionadas estarán en el intervalo de aproximadamente 1 a 50 mg/kg, preferiblemente de 1 a 20 mg/kg, de peso corporal por día, más generalmente de 0,1 a aproximadamente 100 por kg de peso corporal del receptor por día. El intervalo de dosificación eficaz de los derivados farmacéuticamente aceptables puede calcularse basándose en el peso del nucleósido parental a suministrar. Si el derivado en sí presenta actividad, la dosificación eficaz puede estimarse como se ha indicado anteriormente usando el peso del derivado, o por otros medios conocidos por los expertos en la técnica.

El compuesto se administra convenientemente en cualquier forma farmacéutica unitaria adecuada, incluyendo pero sin limitación una que contiene de 7 a 3000 mg, preferiblemente de 70 a 1400 mg del ingrediente activo por forma farmacéutica unitaria. Una dosificación oral de 50-1000 mg es usualmente conveniente.

Idealmente el ingrediente activo debe administrarse para conseguir las concentraciones plasmáticas máximas del compuesto de aproximadamente 0,2 a 70 \muM, preferiblemente de aproximadamente 1,0 a 10 \muM. Esto puede conseguirse, por ejemplo, por la inyección intravenosa de una solución de 0,1 al 5% del ingrediente activo, opcionalmente en solución salina o administrarse con un embolado del ingrediente activo.

La concentración del compuesto activo en la composición farmacéutica dependerá de la velocidad de absorción, inactivación y excreción del medicamento así como de otros factores conocidos por los expertos en la materia. Debe observarse que los valores de dosificación también variarán con la gravedad de la afección a aliviar. Debe entenderse además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional del administrador o supervisor de la administración de las composiciones y que los intervalos de concentración indicados en este documento son únicamente ejemplares y no pretenden limitar el ámbito o la práctica de la composición reivindicada. El ingrediente activo puede administrarse a la vez, o puede dividirse en varias dosis más pequeñas para administrarse a diversos intervalos de
tiempo.

Un modo de administración preferido del compuesto activo es por vía oral. Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Estos pueden incluirse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para los propósitos de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Los agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición.

Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener uno de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un emoliente tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; un agente saporífero tal como menta, salicilato de metilo o saporífero naranja. Cuando la forma farmacéutica unitaria es una cápsula, esta puede contener, además el material de tipo indicado anteriormente, un vehículo líquido tal como un ácido graso. Además, las formas farmacéuticas unitarias pueden contener otros materiales diversos que modifican la forma física de la unidad de dosificación, por ejemplo, recubrimientos de azúcar, goma laca u otros agentes entéricos.

El (\pm)-FTC o sus enantiómeros (-) o (+) o derivados o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos pueden administrarse como un componente de un elixir, suspensión, jarabe, oblea, chicle o similar. Un jarabe puede contener, además de los compuestos activos, sacarosa como un agente edulcorante y determinados conservantes, tintes, colorantes y saporíferos.

El (\pm)-FTC o sus enantiómeros (-) o (+), o derivados o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos también pueden mezclarse con otros materiales activos que no modifican la acción deseada o con materiales que complementan la acción deseada tales como antibióticos, antifúngicos, anti-inflamatorios u otros antivirales incluyendo otros compuestos nucleósidos anti-VIH.

Las soluciones o suspensiones usadas para la administración parenteral, intradérmica, subcutánea o tópica pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede introducirse en ampollas, jeringas desechables o viales multidosis fabricados de vidrio o plástico.

Si se realiza la administración intravenosa, los vehículos preferidos son la solución salina fisiológica o la solución salina tamponada con fosfato (PBS).

En una realización preferida, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del organismo tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulado. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de dichas formulaciones serán obvios para los expertos en la materia. Los materiales también pueden obtenerse en el mercado de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc.

Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infecciosas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también se prefieren como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estas pueden prepararse de acuerdo con los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.522.811 (que se incorpora en este documento por referencia en su totalidad). Por ejemplo, las formulaciones en liposomas pueden prepararse disolviendo un lípido (o lípidos) apropiado (tal como un estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidil colina, aracadoil fosfatidil colina y colesterol) en un disolvente inorgánico que después se evapora, dejando detrás una fina película de lípido seco sobre la superficie del recipiente. Después se introduce en el envase una solución acuosa del compuesto activo o sus derivados monofosfato, difosfato y/o trifosfato. El envase después se agita manualmente para liberar el material lipídico de los laterales del envase y para dispersar los agregados lipídicos, formando así la suspensión liposomal.

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IV. Preparación de Derivados Fosfato del FTC

Pueden prepararse mono, di y derivados trifosfato del FTC como se describe a continuación.

El monofosfato puede prepararse de acuerdo con el procedimiento de Imai y col., J. Org. Chem., 34(6), 1547-1550 (junio de 1969). Por ejemplo, aproximadamente 100 mg de FTC y aproximadamente 280 \mul de cloruro de fosforilo se hace reaccionar agitando con aproximadamente 8 ml de acetato de etilo seco a aproximadamente 0ºC durante aproximadamente cuatro horas. La reacción se interrumpe con hielo. La fase acuosa se purifica sobre una columna de carbón vegetal activada, eluyendo con hidróxido amonio al 5% en una mezcla 1:1 de etanol y agua. La evaporación del eluyente da amonio FTC-5'-monofosfato.

El difosfato puede prepararse de acuerdo con el procedimiento de Davisson y col., J. Org. Chem., 52(9), 1794-1801 (1987). El FTC difosfato puede prepararse a partir del tosilado correspondiente, que puede prepararse, por ejemplo, mediante la reacción del nucléosido con cloruro de tosilo en piridina a temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas, tratando el producto de la manera habitual (por ejemplo, lavando, secando y cristalizándole).

El trifosfato puede prepararse de acuerdo con el procedimiento de Hoard y col., J. Am. Chem. Soc., 87(8), 1785-1788 (1965). Para el FCT se activa (preparando una imidazolida, de acuerdo con los procedimientos conocidos por los expertos en la materia) y tratando con tributil amonio pirofosfato en DMF. La reacción proporciona en primer lugar el trifosfato del nucleósido, con algún monofosfato que no reaccionado y algún difosfato. La purificación por cromatografía de intercambio aniónico de una columna de DEAE se continúa por el aislamiento del trifosfato, por ejemplo como una sal tetrasodio.

Claims (15)

1. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del enantiómero (-) de cis-4-amino-5-fluoro-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolano-5-il)-(1H)-pirimidin 2-ona, para tratar el VIH en seres humanos o su sal farmacéuticamente aceptable, que carece al menos del 95% del enantiómero (+) correspondiente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para el uso en el tratamiento de una infección por VIH.

2. El uso de una cantidad eficaz del enantiómero (-) de cis-4-amino-5-fluoro-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolano-5-il)-(1H)-pirimidin 2-ona, o su sal farmacéuticamente aceptable, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección por VIH, en el que el medicamento carece al menos del 95% del enantiómero (+) correspondiente.

3. La composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 1, o el uso de la reivindicación 2, en el que el compuesto es el enantiómero (-) de cis-4-amino-5-fluoro-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolano-5-il)-(1H)-pirimidin 2-ona.

4. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un derivado 5'-O-alquilo, un derivado 5'-O-alquilC(O), un monofosfato, un difosfato o un trifosfato del enantiómero (-) de cis-4-amino-5-fluoro-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolano-5-il)-(1H)-pirimidin 2-ona, para tratar el VIH en seres humanos, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para el uso en el tratamiento de una infección por VIH.

5. El uso de una cantidad eficaz de un derivado 5'-O-alquilo, un derivado 5'-O-alquilC(O), un monofosfato, un difosfato o un trifosfato del enantiómero (-) de cis-4-amino-5-fluoro-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolano-5-il)-(1H)-pirimidin 2-ona, para tratar el VIH en seres humanos, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección por VIH.

6. La composición farmacéutica como se reivindica en la reivindica en la reivindicación 4, o el uso de la reivindicación 5, en la que el compuesto es el derivado 5'-O-alquilo del enantiómero (-) de cis-4-amino-5-fluoro-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolano-5-il)-(1H)-pirimidin-2-ona.

7. La composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 4, o el uso de la reivindicación 5, en la que compuesto es el derivado 5'-O-alquil C(O) del enantiómero (-) de cis-4-amino-5-fluoro-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolano-5-il)-(1H)-pirimidin-2-ona.

8. La composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 4, o el uso de la reivindicación 5, en la que el compuesto es el monofosfato, difosfato o trifosfato del enantiómero (-) de cis-4-amino-5-fluoro-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolano-5-il)-(1H)-pirimidin-2-ona.

9. La composición farmacéutica o el uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5 en la que la composición o medicamento está en una forma para la administración oral.

10. La composición farmacéutica o uso como se reivindica en la reivindicación 9, en la que la composición o medicamento está en forma de comprimido.

11. La composición farmacéutica o uso como se reivindica en la reivindicación 9, en la que la composición o medicamento está en forma de cápsula.

12. La composición farmacéutica o uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5 en la que la composición o medicamento es un líquido.

13. La composición farmacéutica o uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5 en la que la composición o medicamento está en una forma para la administración intravenosa.

14. La composición farmacéutica o uso como se reivindica en la reivindicación 13, en la que el vehículo comprende un diluyente estéril para inyección.

15. La composición farmacéutica o uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5 en la que la composición o medicamento está en una forma para la administración tópica.