KR100339786B1 - 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체의 분리 방법 - Google Patents

라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체의 분리 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100339786B1
KR100339786B1 KR1019990011563A KR19990011563A KR100339786B1 KR 100339786 B1 KR100339786 B1 KR 100339786B1 KR 1019990011563 A KR1019990011563 A KR 1019990011563A KR 19990011563 A KR19990011563 A KR 19990011563A KR 100339786 B1 KR100339786 B1 KR 100339786B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleosides
present
enantiomers
lipase
racemic mixture
Prior art date
Application number
KR1019990011563A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20000065352A (ko
Inventor
안용현
Original Assignee
안용현
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 안용현 filed Critical 안용현
Priority to KR1019990011563A priority Critical patent/KR100339786B1/ko
Publication of KR20000065352A publication Critical patent/KR20000065352A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100339786B1 publication Critical patent/KR100339786B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/38—Nucleosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체를 고순도 및 고수율로서 분리하는 방법 및 이러한 분리에 사용되는 효소에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드를 n-부탄올 및 인산염 완충액으로 구성된 용매 중에서 22℃ 내지 28℃의 온도 및 6 내지 8의 pH에서 리파아제 AK를 사용하여 반응시키는 것을 포함한다.

Description

라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체의 분리 방법{Method for isolating enantiomers from nucleosides being racemic mixture}
본 발명은 라세미 혼합물로부터 거울상 이성질체로 분리하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체를 고순도 및 고수율로서 분리하는 방법 및 이러한 분리에 사용되는 효소에 관한 것이다.
광학적으로 순수한 약제의 개발은 현재 의약 산업에서 중요한 과제로 대두되고 있다. 광학적으로 순수한 화합물을 얻기 위하여, 다음과 같은 3가지의 방법이 이용되고 있다. 첫 번째 방법은 천연물질의 구조를 이용하여 광학활성 화합물을 제조하는 것이고, 두 번째 방법은 크로마토그래피 또는 결정화를 이용하여 광학 활성 화합물을 분리하는 것이고, 그리고 세번째 방법은 생물학적 방법을 이용하는 것이다. 이러한 생물학적 방법은 효소를 이용하여 라세미 화합물로부터 광학적으로 순수한 중간체 또는 최종 화합물로 분리하는 것이다. 이와 같이 효소를 이용하는 생물학적 방법은 그 응용성이 날로증가하고 있는 생명공학이며, 공업적 규모에 사용할 수 있도록 광학 활성 화합물을 대량 생산하는 효소의 종류도 크게 증가하고 있다.
광학적으로 순수한 약제의 개발은 생체 반응에 관여한 효소의 특징에서 그 중요성을 찾을 수 있다. 생체내 효소는 3차원인식 기능을 가지고 있기 때문에 D- 또는 L- 이성체중 한가지만의 것과 선택적으로 반응하며 다른 이성체와는 반응하지 않는다. 일반적으로 라세미 결정은 단일 거울상 이성질체와 비교할 때 다른 제형화 문제(formulation problem)를 나타낼수 있다. 즉, 용해속도, 녹는점, 분말 흐름 특성 및 용해도 등이 라세미 혼합물과 다르며 지방 또는 단백질 분자의 결합과정도 다르게 나타난다. 따라서, 높은 친화성과 선택성을 얻기 위하여, 광학적으로 순수한 에난시오머의 분리가 필수적이다. 또한, 한 거울상 이성질체가 다른 거울상 이성질체의 효과를 반감하는 경우가 있거나, 또는 다른 광학 이성질체의 생체내 이용효율을 억제하는 경우도 있기 때문에 이러한 라세미 혼합물은 거울상 이성질체로 반드시 분리되어야 한다.
또한, 이러한 거울상 이성질체로의 라세미 혼합물의 분리에 사용되는 효소는 비교적 값비싸기 때문에 재사용이 가능하고 활동도가 장기간 지속되는 효소가 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 광학적으로 활성이 높은 거울상 이성질체를 고수율로서 분리하는 방법을 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 광학적으로 활성이 높은 거울상 이성질체를 분리하는데 있어서 재사용이 가능하고 장기간 지속되는 활동도를 가지는 효소를 제공함에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제 1 측면으로서,
라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드를, 용매로서 알콜중에서 22 내지 28℃의 온도 및 6 내지 8의 pH에서 리파아제를 사용하여 반응시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체의 분리 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 제 2 측면으로서,
폴리아크릴아미드에 의해 고정화된 리파아제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체의 분리에 사용되는 효소를 제공함에 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드'는 대한민국 공개특허 제97-27099호(출원번호제96-51536호; 출원일 1996년 11월 1일)에 설명되고 청구된 화합물 및 이와 유사한 화학적 구조를 가지는 것으로서 라세미 혼합물 상태로 존재하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 공개특허의 개시내용은 본원에 참조로 인용된다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 'Lipase AK'는 상품명으로서 일본국에 소재한 Amano사로부터 구입한 리파아제를 의미한다.
본 발명에 따라 에난시오머로의 뉴클레오시드의 분리에 사용되는 용매로서 알콜이 사용되는데, n-부탄올이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따라 뉴클레오시드를 에난시오머로 분리하는데 있어서 22 내지 28℃의 온도가 사용되는데, 이는 이러한온도 범위를 벗어나는 온도에서는 효소의 활동도가 저하되기 때문이다.
그리고, 본 발명에 따른 분리에 있어서 사용되는 반응 매질의 pH는 6 내지 8 인데, 이는 이러한 범위를 벗어나는 pH에서는 효소의 활동도가 저하되기 때문이다.
그리고, 본 발명에 따라 뉴클레오시드를 에난시오머로 분리하는데 사용되는 효소로는 Lipase AK를 사용하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 실시예를 설명한다.
실시예 1 : 거울상 이성질체로의 뉴클레오시드의 분리.
라세미 혼합물 상태로 존재하는 디아세틸화된 뉴클레오시드(4g)를, 26℃의 온도 및 pH7에서 용매로서 0.1N 인산염 완충액 30 ml과n-부탄올 10 ml의 혼합용액에서, 효소로서 Lipase AK(5g)를 사용하여 반응시켜서 43% 수율의 디아세틸화된 뉴클레오시드와 41% 수율의 모노아세틸화된 뉴클레오시드로 분리하였다. 그후, 상기 분리된 화합물들을 메톡시화나트륨으로 탈아세틸화시켜서 거울상이성질체인 (+)뉴클레오시드와 (-)뉴클레오시드를 얻었다. 이와같이 얻어진 거울상 이성질체의 광학활성을 측정한 결과, (+)뉴클레오시드는 +41.0, 92.3%ee였고, (-)뉴클레오시드는 -40.5, 91.2%ee였다.
실시예 2 : 고정화된 Lipase AK 효소의 반복적인 재사용 가능성에 대한 평가.
0.1M 인산염 완충액과 25%아크릴아미드 단량체(85% 아크릴아미드 및 15% N,N'-메틸렌비스아크릴아미드로 이루어짐)로 이루어진 용액(80ml)에 Lipase AK(6g)을 가했다. 그런다음, 상기 혼합물에 5% N'-테트라메틸에틸렌디아민(3ml)과 0.5% 황산암모늄(25ml)을 질소 분위기하에서 가하고, 5℃에서 50분간 아크릴아미드의 중합반응을 진행하여, 폴리아크릴아미드 매트릭스안에 Lipase AK를 고정화시겼다. 이와같이 고정화된 Lipase AK를 1.5×1cm의 크기로 절단하였다.
상기의 고정화된 Lipase AK를 상기의 실시예 1에서 기술한 바와같은 과에 효소로서 5회에 걸쳐 반복사용하여, Lipase AK의 사용 회수에 따른 분리된 에난시오머의 수율 및 광학 순도의 측정값을 다음 표1에 나타내었다.
*: 모노아세틸화된 뉴클레오시드
**: 디아세틸화된 뉴클레오시드
상기의 표 1의 결과로부터, 폴리아크릴아미드에 의해 고정화된 Lipase AK는, 5회째 사용시에도 1회째 사용시와 비교하여수율 및 광학 순도에 별로 차이가 없기 때문에, 거울상이성질체로의 뉴클레오시드의 분리에 5회이상 사용될 수 있음을 알 수 있다.
또한, 상기와 같이 폴리아크릴아미드에 의해 고정화된 Lipase AK의 활동도 유지 기간을 측정한 결과, Lipase AK의 활동도는 4주 이상 지속되는 것으로 나타났다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로 부터 거울상 이성질체의 분리방법은 90%이상의 높은 광학 순도를 각각 가지는 (+)뉴클레오시드와 (-)뉴클레오시드를 40%이상의 높은 수율로서 얻는 것을 가능하게 한다.
또한, 본 발명에 따른 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체의 분리에 사용되는 효소는 5회이상 재사용이 가능함으로써원가 절감에 크게 기여한다. 그리고, 본 발명에 따른 효소는 폴리아크릴아미드에 의해 고정화됨으로써 반응 용액으로부터쉽게 분리할 수 있을 뿐만 아니라 작업 과정중에 효소로 인한 에멀션의 형성을 근본적으로 방지하는 효과가 있다.
이상에서 본 발명은 바람직한 실시예를 기준으로 설명하였지만 이 분야에서 통상의 지식을 갖는 당업자는 동봉한 특허청구범위 내에서 다양한 변경 또는 수정이 가능함을 알 수 있다.

Claims (3)

  1. 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드를 n-부탄올 및 인산염 완충액으로 구성된 용매 중에서 22℃ 내지 28℃의 온도 및 6 내지 8의 pH에서 리파아제 AK를 사용하여 반응시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체의 분리 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
KR1019990011563A 1999-04-02 1999-04-02 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체의 분리 방법 KR100339786B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019990011563A KR100339786B1 (ko) 1999-04-02 1999-04-02 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체의 분리 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019990011563A KR100339786B1 (ko) 1999-04-02 1999-04-02 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체의 분리 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20000065352A KR20000065352A (ko) 2000-11-15
KR100339786B1 true KR100339786B1 (ko) 2002-06-07

Family

ID=19578606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019990011563A KR100339786B1 (ko) 1999-04-02 1999-04-02 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체의 분리 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100339786B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5728575A (en) * 1990-02-01 1998-03-17 Emory University Method of resolution of 1,3-oxathiolane nucleoside enantiomers
KR0172590B1 (ko) * 1991-02-22 1999-02-01 빈센트 라테르자 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 항비루스 활성 및 그것의 분해방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5728575A (en) * 1990-02-01 1998-03-17 Emory University Method of resolution of 1,3-oxathiolane nucleoside enantiomers
KR0172590B1 (ko) * 1991-02-22 1999-02-01 빈센트 라테르자 2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란의 항비루스 활성 및 그것의 분해방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20000065352A (ko) 2000-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4322310A (en) Chiral supports for resolution of racemates
CA1179326A (en) Nondenaturing zwitterionic detergents for membrane biochemistry
FR2623498B1 (fr) Nouveaux composes enantiomeres derives d'amino-acides, leur procede de preparation et leurs applications therapeutiques
EP0521941A1 (de) Cmp-aktivierte fluoreszierende sialinsäuren sowie verfahren zu ihrer herstellung
CY1105206T1 (el) Διαδικασια για την εκχυλιση και χρησιμοποιηση υγρου επωασης απο σολομο του ατλαντικου
EP0003786B1 (de) Stereoselektive Spaltung von Phenylglycinderivaten und 4-Hydroxyphenylglycinderivaten mit Enzymharzen
EP0326063A2 (de) Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Cyanhydrinen
KR100339786B1 (ko) 라세미 혼합물 상태로 존재하는 뉴클레오시드로부터 거울상 이성질체의 분리 방법
EP0492497A2 (de) Verfahren zur Acylierung von Alkoholen mit einem immobilisierten Pseudomonas-Lipase
EP1264815B1 (en) Separating agent for enantiomeric isomers
SU1232148A3 (ru) Способ получени инсулина человека
JPH0768207B2 (ja) スルホニウム化合物
Tsushima et al. Fluorine-containing amino acids and their derivatives. 9. Synthesis and biological activities of difluoromethylhomocysteine
US6187582B1 (en) Process for producing optically active amines
JP2000501292A (ja) 光学活性アミン類の製造方法
JPH0632787A (ja) プロピオン酸誘導体の製造法
JPH0558629B2 (ko)
EP0812363A1 (de) Verfahren zur herstellung von optisch aktiven aminen
CA2244917A1 (en) Method of producing optically active amines
US7579482B2 (en) Structure of camphor-derived chiral auxiliary and method for forming the same
JPS63501507A (ja) 光学活性試薬および対掌体アミン化合物の測定法
ES2073370A1 (es) Procedimiento para la preparacion del compuesto bis-(1,3-dihidroxi-propilamida) del acido l-5-(2-acetoxi-propionilamino)-2,4,6-triyodo-isoftalico.
JPH0253498A (ja) ３‐メルカプト‐２‐アルキル‐プロピオン酸のラセミエステル誘導体の光学異性体の酵素分割法
JP2000297103A (ja) キチン誘導体の製造方法
JPH05507403A (ja) ペプチドの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee