JPH05507403A - ペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチドの製造方法 発明の応用分野 本発明は、保護基を分離した後に活性物質または活性物質の中間体として働くこ とのできるペプチドの製造法に関する。

先行技術の説明 ペプチド製造には様々な有機化学的方法を用いることができる（総括文献：　１ ｕｎｓｃｈ、　Ｅ、　（１９７４）　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆＰｅｐｔｉｄｅ ｓ、　Ｈｏｕｂｅｎ−ｆｅｙｌ、　Ｖｏｌ、　１５．１／２．１ｌｅｔｈｏｄｅ ｎ　ｄｅｒｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ（有機化学の方法）、　ｉ［ ｕｌｌｅｒ、　Ｅ、（編）Ｇｅｏｒｇ　Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｓｔｕ ｔｔｇａｒｔ参照）。化学的ペプチド合成の過程において、収率を下げそして困 難かつ長時にわたる精製手順を必要とする望ましくない副反応がしばしばみられ る。従来方法の特に重大な欠点は、特に化学的カップリング方法を用いたセグメ ント縮合に関係して生じるラセミ化という未解決の課題である。立体異性体を相 互から完全に分離することは極めて困難であり、そして合成生成物の光学的純度 は生物活性に必要な前提要件であるから、有機化学的方法によるペプチドの工業 的合成は実質的欠点を有する。そらに、副反応の危険の故に、アミノ酸構築ブロ ックの第三官能部を、ペプチド合成のためのすべての化学的操作において可逆的 にブロックしなければならない。ペプチドカップリング工程の触媒へのバイオ触 媒の使用は、前述の問題を回避する手段を提供する（総括文献：　Ｊａｋｕｂｋ ｅ、　［１，−Ｄ、、およびＫｕｈｌ。

Ｐ、　（１９８２）　Ｐｈａｒ■ａｚｉｅ　３７８９；Ｆｒｕｔｏｎ、　Ｊ、　 Ｓ、　（１９８２）。

＾、　１ｌｅｉｓｔｅｒ：　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｍｏｌ、　Ｒｅ１ａｔ、　Ａ ｒｅａｓ　ｌ１ｏ１．　Ｂｉｏｌ。

５３．２３９；　Ｊａｋｕｂｋｅ、　Ｈ，−Ｄ、、　Ｋｕｈｌ、　Ｐ、およびＫ Ｑｎｎｅｃｋｅ。

＾、（１９８５）　Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅｗ、９７．　７９（参照）。バイオ触媒 として用いられるプロテアーゼの立体特異性の結果として、キラール完全性が保 存され、また反応が高度にコントロールされるため、概ね、第三官能部を保護せ ずにすませることが可能となる。反応の速度コントロールは酵素触媒ペプチド合 成の枠内において重要な役割を果す。この方法におけるペプチド生成物形成に関 与するアシル酵素中間体の加水分解は、ペプチド生成物収率が限られたものとな ってしまうので、多くの合成反応にとって問題と本発明の目的は、従来から用い られた方法に比べ、アシル酵素中間体の加水分解を大きく低下させて、キラール 的に均一なペプチドを製造することにある。

発明の詳細な説明 本発明の基本的目的は、Ｎ−アシルアミノ酸のアルキルエステルをプロテアーゼ の存在下にアミノ成分としての非保護Ｎ−末端α−アミノ基を有するアミノ酸、 アミノ酸誘導体またはペプチドと反応させることにある。

本発明によれば、ペプチドは保護α−アミノ基を有するアミノ酸または保護α− アミノ基を有するペプチドであってその反応にあずかるカルボキシル基がエステ ルとして存在するものから、そして、その反応にあずかるアミノ基がブロックさ れていないアミノ酸、アミノ酸誘導体またはペプチドから、所望により有機溶媒 成分および／または緩衝物質を含有する凍結水性溶液中、プロテアーゼの存在下 に製造される。ペプチドは高収率で形成され、そして適切なりロフトグラフィ法 または抽出法により分離調製される。プロテアーゼを用いる既知のペプチド合成 とは対照的に、本発明に従って反応混合物を凍結することによって一般に高収率 のペプチドが得られる。

凍結水性系でのペプチドクラスの化合物の酵素触媒合成が記述されたのはこれが 初めてである。収率の低下は本質的に副生成物の形成により起こるが一般的には 温度の低下、それによる反応速度の遅速化と関連があるため、本発明の効果は驚 （べきことである。意外にも、好ましくは一つの、すなわち目的とする、生成物 が高収率で得られる。

表　１ けるプロテアーゼ触媒ペプチド合成の収率比較（カルボキシル成分）＝２１１菫 、（アミン成分）　＝　５０ｍＭ１１ａｌ−Ｐｈｅ−＾１ａ−ＯＥｔＣｊ！　Ｈ −＾１ａ−Ａｌａ−ＯＥＩ　パパイン　４２７９実施例 実施例中、アミノ酸は国際的に有効な規則に従って略記される。加えて、以下の 略号を用いる：Ｚ　ベンジルオキシカルボニル Ｍａｌ　マレイル ＯＭｅ　メチルエステル ０ＥｔＣ／　モノクロロエチルエステル特に断らない限り、光学活性中心を有す るアミノ酸およびアミノ酸残基はＬ配置を有する。

実施例　１ 璽ａｌ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｏｆｌの合成２　ｍＭ　Ｍａｌ−Ｐ ｈｅ−Ａｌａ−ＯＥｔＣＡ！１５０１Ｍ　Ｈ−＾１ａ−＾１ａ−ＯＨ，２５＋ａ ＭＮａＯ■および０．１５Ｂ／ｍ／パパインを含有する０、　２ｍｌの水性溶液 を凍結する（　ｄｅｅｐ−ｆｒｏｚｅｎ）。次いで、その反応混合物をＭａｌ− Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＯＥｔＣＡ’が消費されるまで一２５℃に保つ。

融解後、収率をｌ？Ｐ−ＨＰＬＣにより分析測定したところ、理論の７９％に達 する。

実施例　２ Ｚ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ａｌａ−ＯＨの合成２　ａｌｌ　Ｚ−Ｇｌｕ−０１１ｅ、 　５０ｍＭ　Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＢ、　２５ｍＭ　Ｎａ０口および５諺ｇ／ ｍ／エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃを含有する０、２ｍｌの水性溶液を凍結す る。次いでその反応混合物をＺ−Ｇｌｕ−ＯＭｅが消費されるまで一２５℃に保 つ。融解後、収率をＲＰ−１１ＰＬＣにより分析測定したところ、理論の７６％ に達する。

実施例　３ Ｍａｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−＾１ａ−ＯＨの合成２　ｄ　ｉｌａＬ−Ｔｙｒ−ＯＭ ｅ、　５０ｍＭ　Ｂ−Ａｌａ−Ａｌａ−０■、２５ａｌｌ　ＮａＯＨおよび０． ３Ｍ　α−キモトリプシンを含有する０、２ｍｌの水性溶液を凍結する。次いで 、その反応混合物をＭａｌ−Ｔｙｒ−ＯＭｅが消費されるまで一２５℃に保つ。

融解後、収率をｌ？Ｐ−［ＩＰＬＣにより分析測定したところ、理論の９４％に 達する。

実施例　４ Ｍａｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＮＨ，の合成実施例３と同様であるがアミノ成分 として５Ｑｍｌｌ　１ｌ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＮＨ２を用いる。収率は理論の７３％。

実施例　５ Ｍａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＯＨの合成 実施例３と同様であるがアミノ成分として５０■Ｍ　Ｈ−Ｌｙｓ−０■を用いる 。収率は理論の４４％。

実施例　６ １１ａｌ−Ｔｙｒ−β−＾１ａ−Ｇｌｙ−ＯＨの合成実施例３と同様であるがア ミノ成分として５０ｍＭ　Ｈ−β−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＢを用いる。収率は理論 の７９％。

要　約　書 ペプチド、ペプチド合成、酵素、アシル転移酵素、セリンプロテアーゼ、合成生 成物。本発明はキラール的に均一なペプチドの製造方法に関する。本発明の目的 はタンパク質加水分解酵素を用いてキラール的に均一なペプチドを提供すること にある。課題はＮ−アシルアミノ酸アルキルエステルをアミノ酸、アミノ酸誘導 体またはペプチドと、プロテアーゼの存在下に反応させることである。その課題 は、Ｎ−アシルアミノ酸エステルを、非保護Ｎ−末端α−アミノ基を有する適当 なアミノ酸誘導体またはペプチド誘導体と、凍結水性溶液中でセリンプロテアー ゼまたはシスティンプロテアーゼの触媒により反応させることにより解決される 。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．α−アミノ保護基でブロックされそしてその反応にあずかるカルボニル官能 基がエステル基を有しているアミノ酸または相当するペプチドから非保護α−ア ミノ官能基を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体またはペプチドとの反応によりペ プチドを製造する方法であって、その反応が、所望により有機溶媒成分および／ または緩衝物質を含有する凍結水性溶液中で、酵素による触媒を用いて行われ、 そしてカップリング完了および後処理後に保護基が一部または全部除去されるこ とを特徴とするペプチドの製造方法。
2. ２．セリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼ例えばα−キモトリプシ ン、エンドプロティナーゼＧｌｕ−Ｃ、パパインなどが酵素として用いられる請 求項１記載の方法。
3. ３．酵素触媒反応が−１℃〜−４０℃の温度範囲で行われる請求項１または２記 載の方法。
4. ４．緩衝物質に代えて、反応にあずかる非保護アミノ基の緩衝能が用いられる請 求項１または２記載の方法。
5. ５．酵素が担体に結合される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。