JPS63169993A - 酵素によるペプチド結合の生成反応 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素によるジペプチドの合成法は周知である。

即ち米国特許第４，１６５，３１１号、同第４，４３６
，９２５号及び同第４，２５８，８３６号には水性媒質
中で不溶性の付加化合物、例えば１モルのフェニルアラ
ニンメチルエステルと１モルのＮ原子を保護されたアス
パルチルフェニルアラニンメチルエステルとの付加化合
物を合成する方法が記載されている。米国特許第４．２
８４，７２１号には、Ｎ原子を保護されたアスパラギン
酸とフェニルアラニンの低級アルキルエステルとを水と
混合しない溶媒の存在下において酵素的に結合させる方
法が記載されている。この溶媒は水と混合し得る共溶媒
を含むことができるが、水と混合し得る溶媒の量は酵素
を不活性化または抑制することを避けるために一定限度
に制限しなければならない、米国特許第４．１１６，７
６８号及び同第４，１１９，４９３号においては、水性
媒質中の共溶媒として水と混合し得る溶媒を使用するこ
とが記載されている。同様にアンゲヴアンテ・ヘミ−・
インターナショナル・エディジョン、英語版（＾ｎｇｅ
ｗ、　Ｃｈｅｍ、　Ｉｎｔ、　Ｅｄ、　Ｅｎｇｌ、）　
２４巻、（１９８５年）、第２号、８７頁には、水と混
合し得る溶媒を水と混合して共溶媒として使用すること
ができるが、プロテアーゼ酵素の触媒活性は共溶媒の濃
度が増加するにつれて減少し、５０％以上では、酵素と
してキモトリプシンを使用した場合、合成ができないこ
とが示されている。可能な例外としてはポリオール（例
えば１，４−ブタンジオール）を使用すると、成る場合
には酵素を安定させることもある。

Ｎ−フォルミルジペプチド（例えばＮ−フォルミルアス
パルテーム）及びポリペプチドをつくるための酵素的結
合反応に対し水性媒質または水性−有機媒質を使用する
ことは１４０８６０４９２４及びヨーロッパ特許第０１
４９５９４号に記載されている。

種々の科学的な学術雑誌には酵素を水及び水温相性有機
溶媒と組み合わせて使用することが多くの論文に記載さ
れているが、その際の収率は溶媒の選択、水、酵素及び
基質の量に依存して変化するように思われる。また酵素
が固定化されているかどうかも一つの因子になるように
思われる。アセトニトリル／水の５０１５０溶媒系を使
用することは、バイオテクノロジー・アンド・バイオエ
ンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｂｉｏｅｎｇ、）
誌、２６巻１１４６頁（１９８４年）のニルマン（Ｎｉ
ｌｓｓｏｎ）とモスバッハ（Ｍｏｓｂａｃｈ　）の論文
に記載されている。この論文にはまたブタンジオール／
水（９０／　１０　）混合物を使用することも記載され
ている。溶媒としてアセトニトリルを使用することは米
国ニューヨーク、ジエー・ウィリー（Ｊ、　Ｗｉｌｅｙ
）社、１９７６年発行、ジエー・ビー・ジョーンズ（Ｊ
、Ｂ、　Ｊｏｎｅｓ）　、シー・ジエー・サイ（Ｃ，Ｊ
、　５ｉｈ）及びディー・バールマン（Ｄ、　Ｐｅｒｌ
ｍａｎ）編「アプリケーション・オヴ・バイオケミカル
・システムズ・イン・オーガニック・ケミストリー（＾
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉａａｌ
　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｉｎＯｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）、　Ｊ第１部１０７頁以降のジエー・ビー・ジ
ョーンズ及びジエー・エフ・ベック（Ｊ、　Ｆ、　Ｂｅ
ｃｋ）の論文、及びカナディアン・ジャーナル・オヴ・
ケミストリー（Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃｈｅｗ＋、）誌、５
７巻、２２４５頁（１９７９年）のジェー・ビー・ジョ
ーンズ及びエム・エム・メーヘス（Ｍ、　Ｎ、　Ｍｅｈ
ｅｓ）の論文に記載されている。Ｌ−フェニルアラニン
メチルエステル（即ちＬ−ｐｈｅＯＭｅ）とＮ原子を保
護されたＮ−カーボベンジロキシアスパラギン酸（即ち
Ｚ−ａｓｐ）とを水−不混和性溶媒／水混和性溶媒の混
合物を使用して結合させることはバイオテクノロジー・
レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｌｅｔｔ、）誌、７巻７
８９頁（１９８５年）に記載されている。モナートシュ
リフツ・フユール・ヘミ−（Ｍｏｎａｔｓｈｒｉｆｔｓ
　ｆｕｒ　Ｃｈｅｗ＋ｉｅ）誌、１１２巻４６９〜４８
１頁（１９８１年）のコンネッケ（Ｋｏｎｎｅｃｋｅ）
等の論文にはその４フ５頁にアセトニトリルを溶媒とし
て使用することが記載されている。他の関連する論文と
しては、ジャーナル・オヴ・バイオケミストリー（Ｊ、
　［１ｉｏｃｈｅｍ、）誌、８９巻、３８５頁（１９８
１年）、ジャーナル・オヴ・オーガニック・ケミストリ
ー（Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、）誌５１巻２７２８頁
（１９８６年）、コツレクション・オヴ・チェツコスロ
バツク・ケミカル・コンミュニゲーション（Ｃｏｉｌ、
　Ｃｚｅｃｈｏｓ、　Ｃｈｅｗ、　Ｃｏｍ！ｍ、）誌、
４９巻、２３１頁、（１９８４年）、及びプロシーディ
ング・オヴ・ナショナル・アカデミ−・オヴ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、）誌、
８０巻、３２４１頁（１９８３年〉がある。

文献には一般に酵素、特にプロテアーゼは水に混合し得
る有機溶媒及び水と混合しない有機溶媒の両方で使用さ
れることが記載されているが、水に混合し得る溶媒の方
が幾分劣っているというのが一般的な見解のように思わ
れる。従って「大部分の酵素は親水性の、水と混合し得
る溶媒の中では不活性であり、このことは実質的に水が
酵素から溶媒の方へ分配されることによって容易に理解
される」ということができる。［ケムテツク（Ｃｈｅｍ
ｔｅｃｈ）誌、１９８６年６月号、３５４頁のニー・ケ
ー・クリバアノフ（＾、　Ｋ、　Ｋ１１ｂａｎｏｖ）の
論文参照］。

本発明は１０テアーゼを水と混合し得る有機溶媒中で使
用することに関する。

本発明によれば酵素を使用してＮ置換アスパラギン酸及
びフェニルアラニン低級アルキルエステルから成る群か
ら選ばれた二種の基質の間のペプチド結合生成の触媒作
用を行わせる方法が提供される。該エステルのベンジル
炭素原子は水素と容易に置換り得る動き易い一個または
それ以上の基で置換されていることができる６本発明方
法には上記方法を水と混合し得る溶媒中で行う方法が含
まれる。

水混和性溶媒を使用すると多くの利点が得られる。予想
に反してこの溶媒は酵素から不可欠の水を奪うことなく
使用することができる０例えば連続法を実施する場合、
酵素活性に必要な水は溶媒系の中で２〜１０重量％が水
で残りが水混和性有機溶媒または該溶媒と他の溶媒との
混合物であるようにすることで提供される。閉じた系（
例えば連続法ではなくて実質的なバッチ法の場合）にお
いては、酵素とその坦体は上記の２〜１０重皿％の水を
与えるのに十分な水を失うであろう、しかし酵素が十分
に大量の実質的に無水の水混和性溶媒と接触すると、十
分な水が抽出され、溶媒中の水含量は約２％以下に落ち
、酵素は変性される。１０％以上、例えば最高５０％の
量の水を使用することもできるが、その場合には水混和
性溶媒を使用する利点が減少するであろう。

多くの反応において、水混和性溶媒を唯一の溶媒として
或いは共溶媒として使用すると、単一の液相が生じ、溶
媒が水と混合しない場合に起る相変化による制限が避け
られる０例えば、水混和性溶媒を使用するとしばしば反
応速度が増加する。

また大部分の有用な水混和性溶媒の誘電定数は、５〜６
０（好ましくは３０〜６０）であり、このことは単一の
液相の生成に寄与する。何故ならば大部分のアミノ酸誘
導体は比較的極性があり、このような溶媒に可溶である
からである０例えばフェニルアラニンのメチルエステル
はヘキサンまたは酢酸エチルに対してよりもアセトニト
リルに遥かに多く溶解する。

水混和性溶媒を使用すると反応の平衡を移動させること
ができる０例えば酢酸エチル中においてＮ−フォルミル
アスパラギン酸とフェニルアラニンメチルエステルとの
反応で約１０％の収率が得られるが、アセトニトリル中
ではこの収率は約８０％になる。

酵素は固定化されていても「遊離」の形をとっていても
、水混和性溶媒に比べ水混和性溶媒中では遥かに安定で
ある。例えばシリカまたはイオン交換樹脂（例えばアン
パライト）上で固定化されたサーモリジンは、酢酸エチ
ル中よりもアセトニトリル中の方が安定である。ここで
「安定性」という言葉は、酵素が水の抽出または他の手
段による変性に抵抗性をもっていることを意味する。ま
た「溶媒系」という言葉は、液相の溶媒部分を指すのに
用いられ、水混和性溶媒及びそれと併用される任意の共
溶媒、例えば水または水混和性溶媒を含む。

「水混和性有機溶媒」という言葉は、任意の割合で水と
混和し単−相をつくる有機液体を意味する。適当な有機
溶媒の例としては、アルコール（例えばエタノール、１
−プロパツール及び２−プロパツール）、ポリオール（
例えば１．４−ブタンジオール及びジエチレングリコー
ル）、ニトリル（例えばアセトニトリル）、及びエーテ
ル（例えばジオキサン及びテトラヒドロフラン）、並び
に他の溶媒、例えばジメチルフォルムアミド、ジメチル
スルフオキシド及びアセトンがある。

アセトニトリルは好適な水混和性溶媒である。

本発明の具体化例においては、アセトニトリルを広範囲
のアミノ酸及び酵素と共に使用して酵素的結合反応によ
りジペプチド及びポリペプチドをつくることができる。

この反応に使用される適当なアミノ酸の例としては、脂
肪族アミノ酸、例えばグリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（
＾Ｉａ）、ヴアリン（Ｖａ　ｌ　）、ノルヴアリン＜ｎ
ｏｒＪａｌ）　、ロイシン（Ｌｅｕ）　、イソロイシン
（ｉｓｏ−Ｌｅｕ）　、ノルロイシン（ｎｏｒ−Ｌｅｕ
）のようなモノアミノモノカルボン酸；セリン（Ｓｅｒ
）、スレオニン（Ｔｈｒ）　、ホモセリン（ｈｏｍｏ−
Ｓｅｒ＞のようなオキシアミノ酸、メチオニン（Ｎｅｔ
）　、シスチン（ＣｙｓＳ）、及びシスティン（Ｃｙｓ
ｌりのような含硫アミノ酸；アスパラギン酸（＾ｓｐ）
及びグルタミン酸（ＩＩ：ｌｕ）のようなモノアミノジ
カルボン酸；オルニチン（Ｏｒｎ＞　、リジン（Ｌｙｓ
）　、アルギニン（＾ｒｇ）のようなジアミノジカルボ
ン酸；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ
）のような芳香族アミノ酸；ヒスチジン（旧３）及びト
リプトファン（Ｔｒｐ）のような複素環式アミノ酸が含
まれる。（アミノ酸はこの分野で普通使用されている記
号で表される。）溶媒の選択には注意が必要である。例
えば、酵素が金属を含んでいる場合には、溶媒はこの金
属と錯体を形成してはいけない。ＤＮＦ及びＤＭＳＯは
メタロプロテナーゼの金属成分と錯体をつくると思われ
るので、溶媒系の５０％以下（モル基準）に制限し、残
りは例えば水または他の溶媒にすることが好適である。

溶媒はまた酵素または基質と化学的に反応しないという
意味で不活性でなければならない。例えば、アセトンが
溶媒である場合、基質または酵素のアミノ基との反応を
最低限度に抑制する条件下で使用しなければならない。

アシル供与体として作用するアミノ酸は、一般にＮの位
置に保護基を有している。適当なＮの保護基は、ペプチ
ド合成に通常使用されるもので、例えばｔ−ブチロキシ
カルボニル（ＢＯＣ−）、ｔ−アミロキシカルボニル（
ｔ−八〇Ｃ）のようなｔ〜アルコキシカルボニル基、ベ
ンジロキシカルボニル（Ｚ−）、ｐ−メトキシベンジロ
キシカルボニル トキシベンジロキシカルボニル（Ｚ（ＯＭｅ）ｔ−）、
２，４。

６−ドリメチルベンジロキシカルボニル（ＴＭＺ−）、
ｐ−７エニルアゾベンジロキシカルボニル（ＰＺ−）　
、　ｐ−トルエンスルフォニル（ｔｏｓｙｌ−）のよう
な随時不活性置換基を有し得るベンジロキシカルボニル
基；Ｏ−ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ−）等で
ある。

フォルミル基も使用することができる。

アミン部分を供与してジペプチドまたはポリペプチドを
つくるのに適したアミノ酸の例には、上記の任意のもの
が含まれる．フェニルアラニンが好適であり、特にベン
ジル炭素に置換基をもつ誘導体、例えば接触水素化分解
または電解還元による開裂のような方法によって容易に
置換し得る少なくとも１個の基をベンジル炭素に置換基
として有する誘導体を使用することができる．適当な置
換フェニルアラニンの例としては、式 ％式％ 但し式中ｐｈはフェニル基（置換または非置換の）であ
り、Ｘは一〇〇　、−ＳＨ　、−ＣＩ　、−Ｂｒ　、−
４、−ＯＣＯＣ１１５、−０ＣＯＯＣＩＩａ、−８１，
または−ＳＣＨ　ｚであり、Ｒは炭素数１〜４の低級ア
ルキル基である、に対応するものが含まれる。

アミノ基供与アミノ酸は適当なＣ末端保護基によって保
護される．アミン成分のカルボキシル基保護基（Ｃ末端
保護基）には、メトキシ（−ＯＭｅ）、エトキシ（−０
Ｅｔ）のようなアルコキシ基；Ｌ−ブトキシ（０−ｔ−
Ｂｕ）のようなｔ−アルコキシ基；及びベンジロキシ（
−０Ｂｚｌ）　、ｐ−ニトロベンジロキシ（−０ＢＺＬ
（ｐ−ＮＯ２））、ペンズヒドリロキシ（−０Ｂｚｈ）
　、ベンジルアミノ（−ＮＨＢｚ　ｌ　）、２．４−ジ
メトキシベンジルアミノ（−ＮＨＤＢＮ）、ベンジルヒ
ドリルアミノ（−ＮＨＢｚｈ）のような置換基を有する
こともあるベンジロキシ基：または非置換のアミノ基（
−Ｎｉ１．）等が含まれる．まなアミド及びヒドラジッ
ド基もＣ末端保護基とし用いることができる。

使用できる酵素は、ペプチド結合の生成を媒介し得る公
知のものであり、アミノペプチダーゼ（例えばロイシン
アミノペプチダーゼ）、カルボキシペプチダーゼ（例え
ばカルボキシペプチダーゼｙ）、セリンプロテイナーゼ
（例えばキモトリプシン、スブチリシン）、チオールプ
ロテイナーゼ（例えばパパイン、プロメライン）、酸プ
ロテイナーゼ（例えばペプシン）、及びメタロプロテイ
ナーゼ（例えばサーモリシン、及びビブリオ・プロテオ
リテイクス（Ｖｉｂｒｉｏ　Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕ
ｓ）から得られるメタロエンドブロテイナーゼ（実施例
６参照））が含まれる．酵素は純粋な形で使用する必要
はなく、一種の酵素または多数の酵素を含む多少とも租
製の製品（例えば部分的に精製した醗酵ブイヨン濃縮物
）であることができる。

水混和性有機溶媒は実質的に無水の「割らない」形また
は水及び／又は他の有機溶媒（水混和性溶媒及び水混和
性溶媒の両方）と組み合わせて使用することができる．
水を使用する場合、その量は一般に全溶媒系（例えば水
足す水混和性溶媒）に関し５０重量％より少ない．しか
し、或種の溶媒は金属イオンと錯体をつくり種々のメタ
ロプロテイナーゼ酵素を不活性化するようなので、この
ような溶媒と共に使用する水の量は溶媒系の５０重量％
に等しいかまたはそれ以上でなければならない。

錯体をつくる溶媒の例としてはＤＭＦ及びＤＭＳＯが含
まれる．溶媒が乾燥したまたは割らない形である場合、
溶媒は酵素を固定化するのに用いられた坦体から与えら
れる若干の水（溶媒の約１０重量％までの）を含んでい
よう．好適なアセトニトリル溶媒の場合、−ｍに水の量
は最低限度に保たれ、「割らない」アセトニトリルは良
好な溶媒であることが見だされている．この場合、含ま
れた水は坦体から来るものだけである．しかし連続法を
行う場合、アセトニトリル溶媒中の水の量は少なくとも
１０重量％の水準に保たれなければならず、一般に５〜
５０重量％の範囲に入る。この水の量は酵素の脱水を避
けるに有利であり、基質を溶解する助けとなることがで
きる。連続法を行う場合には、必要ならば基質流を介し
て水を加えることができる。さらに詳細には、Ｎを保護
されたアスパラギン酸をフェニルアラニン低級エステル
及びそのベンジル置換誘導体と結合させる場合（連続法
でもバッチ法でも）、アセトニトリルを種々の量の水と
用いることができるが、水の量は５０重量％より少ない
ことが好適である。即ちＣＩ＊ＣＮ／）ＩＪの重量比は
ｌを、好ましくは約２．５を越えていなければならない
。

当業界の専門家に公知の方法を用い、各結合反応に対し
て選ばれ゛た有機溶媒は、該溶媒に対する基質及び生成
するジペプチドまたはポリペプチドの溶解度、水または
他の共溶媒の存在量、酵素に対する共溶媒の効果及び他
の因子のようないくつかの因子に関して最適化すること
ができる。

周知のように、多くのプロテアーゼ酵素はエステラーゼ
活性をも示す、この活性は水混和性有機溶媒を適当に選
択することにより時により減少させることができる０例
えばアクリロニトリルはエステラーゼ活性を減少させる
若干の効果を示す。

またエステラーゼ活性が別の酵素によって与えられるか
、または同じ分子上にあるエステラーゼ活性部位がプロ
テアーゼ活性部位と異なっている場合には、エステラー
ゼ活性をさらに減少させる阻害剤を使用することもでき
る。適当な阻害剤は、えん麦、そら豆、いんげん豆及び
馬鈴薯から抽出することができる。この抽出法は日本農
芸化学会誌、３１巻、３８頁、（１９５７年）に記載さ
れている。

阻害剤は純粋な物質の必要はなく、粗抽出物でよい。

「結合した」という言葉は酵素が適当な不溶性坦体上に
固定化され、回収及び再使用し得る錯体を形成している
ことを意味する。適当な固定化の方法には、物理的吸着
、イオン結合、共有結合、吸着に続く交叉結合または後
酵素を反応媒質に実質的に不溶な坦体材料に包含させる
その他の方法が含まれる。適当な基質としては、珪酸質
材料（例えば多孔性シリカ）、非珪酸質セラミックス（
例えばアルミナ）、または天然または合成有機重合体材
料（例えばアンパライトＸＡＤ−７、ポリアクリルアミ
ド共重合体、アガロース及びアルギネートのような樹脂
）がある、これに対し「遊離」の酵素は結合しておらず
、溶媒系中に溶解または懸濁させることができる。

基質アミノ酸の濃度を高くし適切な反応速度で工程を行
うようにすることが好咳しい、結合反応に与える各基質
は、溶媒に対するその溶解度範囲内の濃度で使用される
。しかし反応の進行と共に原料が消費されるから、基質
の一部を懸濁状態に保つことができる。溶液中において
基質材料は夫々的０、Ｃ０１〜約２モル、好ましくは約
０．１〜約１モルの範囲の濃度で存在しなければならな
い。

Ｎ−置換アスパラギン酸／フェニルアラニン低級アルキ
ルエステルの結合反応に関しては、酸／エステルのモル
比は両方の基質がＬ配置を有する場合には１：１である
ことができる。実際には１０：１〜１：１０の範囲で使
用することができ、３：１〜１：５が好適である。両基
質がＯＬ配装をもっている場合には、し−異性体の割合
が上記範囲に入るような量で使用することができる。

本発明は、例えば水を含んだ固定化された酵素を、両方
の原料を含む水と混和し得る有機溶媒中に懸濁させ、撹
拌しながら反応を進行させることにより実施することが
できる。反応が完結したら、□固定化された酵素と反応
生成物を含む溶液または懸濁液とを濾過または他の分離
方法により互いに分離することができる。

本発明はまた水を含んだ固定化した酵素を充填したカラ
ム中に、二種の原料を含む水混和性有機溶媒を流すこと
によっても行うことができる。この方法によれば、反応
を連続的に行うことができ、本発明を工業的に応用する
際に有利である。

反応温度は通常約１０〜約８０℃、好ましくは約２０〜
約５０℃である。

反応時間は二つの基質の濃度、固定化した酵素の量、予
め決められた転化率等に依存する。しかし、通常反応時
間は約０．５〜約２００時間であり、好ましくは約２〜
約２４時間で十分である。

所望の生成物がアスパルテームとして知られているジペ
プチドである場合には、反応生成物、即ちＮ−置換−Ｌ
−アスパルチル−し−フェニルアラニンメチルエステル
は通常の方法、例えば反応生成物を濃縮した後再結晶、
抽出等を行う方法により分離することができる。また反
応混合物は当業界に公知の適当な方法により固定化され
た酵素から分離することができる。分離後、固定化され
た酵素は再使用できる。

本発明を実施する場合、アミノ酸基質はＤＬまたはＬの
配置をもっていることができる。酵素がＬ異性体に対し
選択性をもっている時には、ＤＬ異性体を使用してもし
異性体だけが反応に関与し、Ｄ異性体は反応せずに反応
媒質中に残る。酵素が立体選択性をもたない場合には、
Ｄ異性体を例えばり、Ｌ選択性をもたないセリンプロテ
アーゼのような酵素と一緒に使用することができ、アミ
ノ供与体（例えばアラニンまたはフェニルアラニン）は
Ｄであることができる。

実施例１　サーモアーゼの固定化 アンパライトＸＡＤ−７樹脂のビーズをエタノールで洗
浄し、次いで水で洗浄して微細物を除去する。

洗浄したビーズを０、Ｃ５モルＭｅｓ７０、Ｃ２モルＣ
ａＣｌ２溶液の中に再懸濁させる。アンパライトＸＡＤ
−７を真空濾過して過剰の水を除去した後、ビーズ（１
００ｇ）を４°Ｃにおいて９ｇのサーモアーゼを含む０
，０５モルＭｅｓ１０、Ｃ２モルＣａＣＬｌ＋ｌＩ溶液
１００ｍ１に懸濁させる。

−晩振盪した後、固定化したサーモアーゼを上記混合Ｍ
ｆｒ溶液で十分に洗浄した後真空濾過した。

実施例２　遊離酵素を使用した 「割らない」水混和性溶媒中での結合反応２５１１のフ
ラスコ中においてＺ−Ｌ−アスパラギン酸（０，１９２
ｇ、８０ミリモル）及びり、Ｌ−エリスローフェニルセ
リンメチルエステル（０，４２Ｂ、２４０ミリモル）を
割らない有機溶媒（アセトニトリル、ジオキサン、Ｔｌ
（ＦまたはＤＭＦ）に溶解し、最終容積を９ｒ＃１にす
る。粗製のサーモアーゼ粉末（１２０ｍｇ）を上記反応
混合物に加え、反応フラスコを４０℃で振盪する。

１０時間後、反応混合物中のＺ−アスパルチル−１，−
エリスロフェニルセリンメチルエステル（Ｚ−ＯＨ−ア
スパルテーム）の濃度をＨＰＬＣによって決定する。結
果を次の表に示す。

Ｚ−ＯＨ−７スバ１．１　　　０　　１．２　　　１．
５ルー−ムの゛　　ｎＭ　　　　　　　ｍＭ　　　　ｍ
Ｍ実施例３　固定化した酵素を用いる結合反応実施例２
と及び同じ実験を繰返したが、固定化したサーモアーゼ
（サーモアーゼを固定化する方法は実施例１記載の通り
）１ｇを１２０Ｂの粗製サーモアーゼ粉末の代りに用い
た。２０時間の反応後、Ｚ−ＯＨ−アスパルテームの濃
度を肝ＬＣで決定した。

結果を下記表に示す。

Ｚ−ＯＢ−アスバ　　８．１　　０．５　　９．９　　
　６５ルー−ムの゛　　　ｍＭ　　　　ｍＭ　　　ｗＭ
　　　　ｍＭ実施例４　　Ｚ−Ｐｈｅ−ＰｈｅＯＭｅを
生成するためのアセトニトリル中での結合反応 ２５ｍ　ｌのフラスコ中においてＺ−Ｌ−フェニルアラ
ニン（０，２１６ｇ　、８０ミリモル）及びＬ−フェニ
ルアラニンメチルエステル（０，３２，，２００ミリモ
ル）を割らないアセトニトリルに溶解し、最終容積を９
ｍｌにする。固定化したサーモアーゼ（２，５ｇ）を反
応混合物に加え、反応フラスコを４０℃で振盪する。１
８時間反応させた後、Ｚ−Ｌ−フェニルアラニル−１、
−フェニルアラニンメチルエステルの濃度は７０ミリモ
ルであった。

実施例５　　Ｄ、Ｌ−エリスロフェニルセリンの結合反
応 １１のバイオリアクターの中で３０ＦｉのＺ−ａｓｐ、
６５ｇのり、Ｌ−エリスロフェニルセリンメチルエステ
ル及び８０ｇの湿った固定化したサーモアーゼを４０℃
において６５０　ｍｌのアセトニトリルに混合する。２
４時間後２２ＨのＺ−Ｌ−アスパルチル−フェニルセリ
ンメチルエステルを得た。

実施例６　ビブリオ・プロテオリティクス酵素によるプ
ロテアーゼ（即ち「ビブリオ」）の調製１、種子培養の
調製 ＾、準備　−５００ＩＩｌの目盛付きエルレンマイヤー
・フラスコの中に１００　ｍｌの種菌培地を入れ、１２
１℃で２０分間オートクレーブ処理する。

Ｂ、接種　−微生物の入った単一の一７０℃のアンプル
を水道水の下で解かし、種菌フラスコへ無菌的に移す。

Ｃ１培養　−接種したフラスコを２５Ｏｒｐｍ／　２７
℃で１８時間培養する。

０、６４０ｎｍで測定された増殖度は、光学密度４、Ｃ
〜６、Ｃであった。ブイヨンのｐＨは約８、Ｃであった
。

２、規模を拡大した醗酵　−１，５１の醗酵容器中で容
８Ｉｔ、ｏｎで行う。

＾、準備　−容器に培地のすべての成分くポリペプトン
２０ｇ、食塩２０ｇ　、　Ｍｇ５Ｏ□・７１１ｚ００．
４ｇ、　Ｐ　−２００００，２＋ｓｌ）を加えたが、滅
菌前にはｐＨの調節は行わない、　ｐｔｔは約７、Ｃで
なければならない、オートクレーブ中で滅菌した場合、
１、Ｃ１の容器を温度１２１℃で４５分間滅菌しなけれ
ばならない。

Ｂ、接種 （１）設定及び二重チェック操作パラメータａ、　６Ｎ
のＮａＯＨでｐＨを約８．６にする。

ｂ、温度７５℃ ｃ、　ＲＰＭ　　１０００ ｄ、空気１．ＯＬＰＭにおいて溶存酸素の読み　１００
％ （２）　１０ｍ１の種菌ブイヨンを接種した。

Ｃ１操作 （１）上記パラメータを維持する。

（２）溶存酸素は最高要求量の約７５〜８０％に低下す
る。

（３）次の量を監視する。

ａ、光学濃度　−６４０ｎｍにおける吸光度の読み、約
１２〜１４時間で光学濃度は１０〜１２のピークに達す
る。

ｂ、メタロエンドペプチダーゼの生成　−毎秒的０．１
単位。

３、ビブリオ酵素の収得及び濃縮 醗酵開始後約１４〜１６時間で生成酵素は、ファグラ（
ＦＡＧＬ＾）試験法で測定して約０．１０単位／秒活性
の力価に達する。ブイヨンは細胞が進んだ段階に分裂す
る前に収得する（約１０〜２５％）。

先ずブイヨン全体を遠心分離にかけ細胞部分を分離する
０次に上澄液をアミコン（八ｍ１ｃｏｎ＞社製の５ＩＯ
ＹＩＯ及び５ＩＹＩＯ限外濾過カートリツジを用いて７
０〜１００倍に濃縮する。最後に濃縮液を３回０、Ｃ１
モルのｈｅｐｅｓ及び０、Ｃ１モルのＣａＣＩ＝緩衝溶
液（ｐＨ７，２）で洗浄する。

上記方法を用いるビブリオ・プロテオリティクスを米国
メリーランド州ロックヴイル（Ｒｏａｋｖｉｌｌｅ）パ
ーク・ローン・ドライヴ（Ｐａｒｋ　Ｌａｗｎ　Ｄｒｉ
ｖｅ）　１２３０１所在のアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）番号＾ＴＣＣ５
３５５９として寄託した。

実施例７Ｎ−フォルミルアスパラギン酸の結合反応 実施例６と同様にしてつくったビブリオ・プロテオリテ
ィクスの醗酵ブイヨンを濃縮し洗浄した。

醗酵ブイヨン中の中性のプロテアーゼを実施例１と同様
な方法でアンパライトＸＡＤ−７上で固定化した。Ｎ−
フォルミルアスパラギン酸（１，９３ｇ）及びＬ−フェ
ニルアラニンメチルエステル（６，２ｇ）をアセトニト
リルに溶解し最終容積を１５０１にする。湿った固定化
中性プロテアーゼ１４．５．を加えた後、反応を室温で
２４時間行う、最終生成物（Ｎ−フォルミルアスパルチ
ル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル）の濃度はＨ
ＰＬＣで測定して１１．７ｇ／ｌであった。

溶媒を真空蒸発させ、残渣を酢酸エチルに溶解し、ＩＮ
のＨＣＩで２回洗浄する。水性相を酢酸エチルで処理す
る。−緒にした有機相を塩水で洗浄し、−晩Ｍｇ５Ｏｔ
上で乾燥する。溶媒を蒸発させると無色の固体が得られ
、これをジクロロエタンから再結晶しＮ−フォルミルア
スパルテームと同定した。

実施例８　水／水混和性溶媒系の使用 水／水混和性有機溶媒をジペプチドの酵素的合成反応の
有機媒質として試験した。各反応混合物中の基質の濃度
はＺ−アスパラギン酸が８０ミリモル、Ｄ、Ｌ−エリス
ロフェニルセリンメチルエステルが２４０ミリモルであ
った。サーモアーゼ酵素及びシリカを使用して得た固定
化した触媒は、ライ−トール（Ｗｅｅｔａｌｌ）のカル
ボニル−アルキルアミン共有結合法［メソッズ・イン・
エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）８４巻、１３４〜１４８頁（１９）６年）
のエイチ・エイチ・ライ−トールの論文参照］を使用し
て調製した。

Ｚ−７スバルチルーし一エリスロフェニルセリンメチル
エステルの合成は、シリカで固定化した酵素を用いた場
合、溶媒が９０％以上を占める濃度のエタノール、ジメ
チルスルフオキシド、Ｎ、Ｎ−ジメチルフォルムアミド
またはアセトン中では認められなかった。シリカで固定
化した酵素を用いた場合、割らない１，２−ジメトキシ
エタン及び１，４−ブタンジオール中におけるジペプチ
ドの収率は共に理論値の２５％であった。シリカではな
くアンパライトを使用した実施例３とこの結果とを比較
すると、坦体の選択が酵素反応に影響を及ぼし得ること
が示される。アンパライトで固定化した酵素を用いた場
合、９５％エタノール及び１．４−ブタンジオール中で
のジペプチドの収率は夫々２０％及び４０％であった。

すべなの反応は４０℃で行った。

実施例９　水／アセトニトリル溶媒系の使用固定化した
または遊離のサーモアーゼ酵素を使用し、ジペプチドの
酵素的合成に対する水／水混和性有機溶媒としてアセト
ニトリルを試験した。

この合成反応に使用した基質の濃度はＺ−アスパラギン
酸が８０ミリモル、Ｄ、Ｌ−エリスロフェニルセリンメ
チルエステルまたはＬ−フェニルアラニンメチルエステ
ルが２４０ミリモルであった。実施例１記載の吸着法に
よりサーモアーゼ酵素をアンパライト上に固定化した０
合成反応は１００％アセトニトル、７５％アセトニトリ
ル／２５％水、５０％アセトニトリル１５０％水及び２
５％アセトニトリル／７５％水系中で試験した。２４時
間反応を監視し、反応速度及び収率を決定した。遊離の
酵素を高アセトニトリル濃度で使用した場合、ジペプチ
ドの反応速度は遅いことが認められた。アセトニトリル
濃度が２５及び５０％の場合にはジペプチド合成反応は
著しくは認められなかった。しかし、アセトニトリル濃
度が７５％以上の場合は反応速度は同様であり、共に２
４時間で約７０％の収率を示しな。アセトニトリル濃度
９０％以上でさらに長く培養すると、ジペプチドの収率
は９０％を越えた。すべての反応は４０℃で行った。

実施例１０　　結合反応の大規模化 固定化したプロテアーゼ酵素を含むｌｉ！ｔｉｔ拌器付
タンク反応器を使用して、Ｚ−アスパルチル−Ｌ−フェ
ニルアラニンメチルエステルジペプチドの連続製造法を
示す。８０ｇのアンパライト触媒をＺ−アスパラギン酸
１６０ミリモル及びＬ−フェニルアラニンメチルエステ
ル４８０ミリモルを含む７００　ｍｌの割らないアセト
ニトリル中に加える。触媒は実施例１の方法で調製した
。一定に撹拌しながら反応温度を４０℃に保つ、２６時
間後９０％のジペプチド収率が得られた。３回の別々の
操作中同じ酵素触媒を使用して新しい反応原料とアセト
ニトリルとを反応器に装入したが、活性の低下は見られ
なかった。

実施例１１　　アセトニトリル中における固定化したプ
ロナーゼによる ２−＾５ｐ−Ｌ−エリスロＰｈ５ｅｒＯＮｅの合成Ｚ−
アスパラギン酸（１９２＋＊ｇ）及びり、Ｌ−エリスロ
フェニルセリン（４１１ｍｇ）をアセトニトリル（９ｍ
ｌ）中に含む溶液に、アンパライト上で固定化したプロ
ナーゼＥ［シグマ・ケミカルズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ）社製〕（湿った重量１．５ｇ）を加えた。

この混合物を２３℃で１９時間振盪する。ｌｌＰＬｃ分
析の結果１８２ＨのＺ−＾５ｐ−Ｌ−エリスロＰｈｓｅ
ｒＯＭｅが得られた。

実施例１２　　アセトニトリル中における固定化したキ
モトリプシンによる Ｚ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−＾１ａＯＭｅの合成Ｎ−Ｚ−Ｌ−
チロシン（１０２Ｂ、０．３２ミリモル）及びＤ−アラ
ニンメチルエステル（１３７１１１１，０，６６ミリモ
ル）をアセトニトリル（４ｍｌ）中に含む溶液に、アン
パライトＸＡＤ−７上で固定化したキモトリプシン（湿
った重量０．５ｇ）を加えた。この混合物を室温で３９
時間振盪する。固定化した酵素を濾過し、溶媒を蒸発し
て８５ｍｇのＺ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−＾１ａＯＭｅを得た
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−置換アスパラギン酸またはその塩、及びベンジ
   ル基の炭素原子が一個またはそれ以上の水素と容易に置
   き換り得る動き易い基によって置換されているフェニル
   アラニン低級エステルから成る群から選ばれた二種の基
   質の間にペプチド結合を生成させる酵素反応において、
   水混和性有機溶媒の存在下において該反応を実施するこ
   とを特徴とする改良方法。 ２、水を含んだ固定化されたメタロプロテイナーゼの存
   在下において反応を行う特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３、酵素がサーモリシンである特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ４、Ｎ原子の保護基がフォルミルまたはベンジロキシカ
   ルボニルである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、フェニルアラニンのベンジル炭素がヒドロキシルで
   置換されている特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、エステルの低級アルキル置換基がメチルである特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ７、溶媒がアセトニトリルである特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ８、エステラーゼ阻害剤の存在下において反応を行う特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、水混和性溶媒は、モノヒドロキシまたはポリヒドロ
   キシアルコール、ニトリル、エステルまたはそれらの混
   合物である特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、Ｎ−保護基がｔ−アルコキシカルボニル、ベンジ
   ロキシカルボニル、ｐ−トルエンスルフォニル、ｏ−ニ
   トロフェニルスルフェニルまたはフォルミルである特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 １１、Ｎ−末端保護基をもったアミノ酸またはペプチド
   或いはその塩の酸成分を、Ｃ−末端保護基をもったアミ
   ノ酸またはペプチド或いはその塩のアミノ成分とを、ペ
   プチド結合の生成を媒介することが知られている酵素及
   びアセトニトリル含有溶媒の存在下において反応させる
   ことによってジペプチドまたはポリペプチドを製造する
   方法。 １２、溶媒は少なくとも５０重量％のアセトニトリルを
   含んでおり、残りが水である特許請求の範囲第１１項記
   載の方法。 １３、溶媒は少なくとも５０重量％のアセトニトリルを
   含んでおり、残りが水、一種またはそれ以上の水混和性
   有機溶媒またはそれらの混合物である特許請求の範囲第
   １１項記載の方法。 １４、酵素がサーモリシンである特許請求の範囲第１１
   項記載の方法。 １５、Ｎ−末端保護基をもつアミノ酸がアスパラギン酸
   である特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １６、Ｃ−末端保護基をもつアミノ酸がフェニルアラニ
   ンの低級アルキルエステルである特許請求の範囲第１１
   項記載の方法。 １７、保護されたアミノ酸がフェニルアラニンのメチル
   エステルである特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １８、Ｎ原子の保護基がフォルミルまたはベンジロキシ
   カルボニルである特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １９、エステラーゼ阻害剤の存在下において反応を行う
   特許請求の範囲第１１項記載の方法。 ２０、Ｎ−保護基がｔ−アルコキシカルボニル、ベンジ
   ロキシカルボニル、ｐ−トルエンスルフォニル、ｏ−ニ
   トロフェニルスルフェニルまたはフォルミルである特許
   請求の範囲第１１項記載の方法。 ２１、フェニルアラニンの低級アルキルエステルは式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し式中Ｐｈはフェニル基であり、Ｘは−ＯＨ、−ＳＨ
   、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＣＯＣＨ＿３、−ＯＣＯ
   ＯＣＨ＿３、−ＮＨ＿２または−ＳＣＨ＿３であり、Ｒ
   は炭素数１〜４の低級アルキル基である、 に対応する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２２、Ｘは−ＯＨであり、Ｒはメチルである特許請求の
   範囲第２１項記載の方法。 ２３、Ｃ−末端保護基をもつアミノ酸はＤ−アラニンで
   ある特許請求の範囲第１１項記載の方法。