JPS6121095A - Ｌ‐α‐アスパルチル‐Ｌ‐フエニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ペプチドの製造方法に関し、更に詳細には、
適当なＮ−アシル誘導体を酵素により加水分解してＬ−
α−アスパルチル−し−フェニルアラニンのｃ１〜ｃ４
低級アルキルエステルを製造する方法に関するものであ
る。

更にまた、本発明は適当なＮ−アシル誘導体を酵素によ
り加水分解して、慣用的にアスパルテームと称されるよ
く知られた甘味剤を製造する方法に関するものである。

アスパルテーム、すなわちＬ−α−アスパルチル−し−
フェニルアラニンは、低カロリーの、食品および飲料に
対する甘味剤として広く用いられ、その用途は、ベルギ
ー国特許第７１７，３７３号に開示され、特許請求され
ている。そしてこの物質についての製造、抽出および精
製方法については、多数の改良法が開示され、特許請求
されている。

文献によれば、微生物源または動゛物器管に由来する轟
当な酵素１例えばＬ−アミノ酸アシラーゼを用いること
によりその対応するＩｌ、Ｌ−（Ｎ−アシル）誘導体の
混合物からし一アミノ酸、例えばＬ−メチオニン、Ｌ−
フェニルアラニン等を製造したり、分離したりするため
にアミノ酸（例えば、Ｎ−アシル置換アミノ酸）のＮ−
アミノ保護基を除去するのに酵素を用いるという方法が
知られている。

事実、酵素は、その極めて高度の特異性を考慮した場合
、通常大多数の化学反応に用いられる触媒または試薬に
比較して、はるかに優れた、生体反応における高活性な
触媒として作用する蛋白質である。

しかしながら、種々の方法で合成されたペプチドの末端
アミノ基に結合したＮ−保護基の加水分解を選択的に触
媒するために酵素が用いられることはあまり知られてい
ない。

事実、ペプシン、キモトリプシンおよびプロテアーゼ等
の酵素は、通常、ペプチド′活性、すなわちＰ−ＮＯ−
Ｇｏ−Ｐ’　（式中ＰおよびＰ′はアミノ酸またはペプ
チド残基を表わす。）のペプチド結合を加水分解し得る
という活性を示すか、アミド加水分解活性、すなわちＡ
−Ｇｏ−ＮＨ−Ｐ（式中、Ｐはアミノ酸またはペプチド
残基を表わし、Ａは芳香族または脂肪族のカルボン酸残
基を表わす。）の゛アミド結合を加水分解し得る活性を
示す。

例えば、牛の肝臓から抽出され、α−Ｎ−アシルペプチ
ドヒドラーゼと定義された酵素がゲイト（Ｇａｄｅ）８
よびブラウンによって単離されたことが公知とされてお
り　［ジェイ・パイオル０ケム（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２５３．１４．５０１２−５
０１８］　、この酵素はアシルトリアラニンとその他の
トリーおよびジ−ペプチドに対して異なる速度で活性を
示すことが公知とされている。ペニシリンアシラーゼと
定義され、よく知られたアシラーゼ類は、６−位のアミ
ノ基に種々の脂肪族または芳香族側鎖を有するペニシリ
ン類の酵素による加水分解により６−アミノペニシラン
酸（８−ＡＰＡ）を製造するために工業的に広く用いら
れている。これらの酵素は、加水分解さるべき置換基の
種々の性質に従ってペニシリン類Ｇ−Ｖ−Ｘ−Ｆ等に作
用するペニシリンアシラーゼとして分類されている。

アスパルテーム製造の特定の領域においては、アシル−
し−アスパルチル誘導体とＬ−フェニルアラニンメチル
エステルとを出発物質としてＮ−アシル−し−α−アス
パルチル−し−フェニルアラニンのメチルエステルの化
学的、酵素的な合成が行なわれている。

このようにして得られたＮ−７シルジペプチドは、通常
次いで、化学的な加水分解、例えば塩酸による加水分解
により最終的な所望の化合物、すなわちＬ−α−７スバ
ルチルーし一フェニルアラニンのメチルエステルを与え
る。

しかしながら、化学的な加水分解法においてはとりわけ
アスパラギン酸と−フェニルアラニン誘導体とを形成す
るペプチド加水分解反応、脱メチル化したアスパルテー
ムを形成するエステル化反応または最終的に置換基の異
なるジケトピペラジンを形成する環化反応が生じ、その
非特異性および望ましくない化合物を形成する等積々の
欠陥がある。

これら副生成物が全て存在するとその生成収率を低下さ
せるのみならず、所望の化合物を所望の純度で抽出層に
取り出すことが難しくなり、反応の重要な副生成物・を
回収し、経済的な観点からその方法を最適化するために
更に化学的および生化学的な方法を必要とすることとな
る。

本発明の目的は、ヒドラーゼ酵素を用いることを特徴と
するＮ−７シルーアスパルテームの酵素による加水分解
方法を提供することである。特に、ここで開示しかつ特
許請求した方法は、化学的な加水分解に用いられる条件
よりも著しく簡単な条件下で、最終生成物、アスパルテ
ームを極めて高収率で、かつ、望ましくない副生成物の
量を著しく低収率で生成させることができるものである
。

本方法に適したヒドラーゼ酵素は、例えば酸性または塩
基性のプロテアーゼであり、適当な条件下で所望のペプ
チドを形成しなからＮ−アシルペプチドのアミド結合を
加水分解する。

特に、Ｎ−アシル−アスパルテームの酵素による加水分
解方法のための好ましいヒドラーゼ酵素は、エシエリチ
ア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ’ａ）　、ノカルディア（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）　、
ペニシリウム（Ｐｅｎｊｃｉｌｌｉｕｍ）またはストレ
プトマイセス属の微生物菌株（ｍｉｃｒｏｂｉｃ　５ｔ
ｒａｉｎ）から得られる脱アシル化酵素であり、通常は
アシラーゼとして分類され、更に具体的にはペニシリン
−アシラーゼとして分類される。

加水分解プロセスは、遊離または固定化された微生物細
胞を直接用いて行なうこともできるし、特定の酵素を単
離し、これを遊離の形で用いるか、あるいは酵素を公知
の技術に従って、樹脂、ガラス、セルロースまたはこれ
らと同様な物質にイオン結合、共有結合または基質浸透
性の繊維にグラフトさせて用いることにより行なうこと
ができる。抽出または精製プロセスにより、通常は、望
ましくない副生成物を形成しかつ酵素反応の収率を低下
させる夾雑酵素の存在を低減させたり、除去したりする
ことができるので、粗製の細胞抽出物よりも、単離され
かつ所望する程度に精製された酵素を用いるのが好まし
い、したがって本発明によればＮ−置換ペプチドの脱ア
シル化は、水媒体中この化合物をアシラーゼ活性を示す
酵素で処理して行なうのが好ましい。

本方法によれば、Ｌ−α−アスパルチル−し−フェニル
アラニンメチルエステルのＮ−置換誘導体を、単離し、
精製しかつアシラーゼ活性を示す酵素で脱アシル化する
のが更に好ましい。

上述したように、本発明に従って用いられるヒドラーゼ
酵素は、可溶形でも、適当な不活性基質に固定化されて
いても、交差結合方法により不溶化されていてもよく、
これらはアシラーゼとして分類され、今日まで大部分が
ペニシリンアシラーゼとして知られている。

これらの酵素の例としては、種々のアクチノプラネス（
ａｃｔｉｎｏＢｃｅｔｅｓ）　、　７　ｙ　７ジ（ｆｕ
ｎｇｉ）および酵母の発酵によって生じるファンジ由来
の７シラーゼがあり、例えば下記のものがある。

アスパルチル（Ａ　ｌ　ｔｅ　ｒｎａ　ｔ　ｉａ）ムコ
ル（Ｍｕｃｏｒ） アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ペニシリウ
ム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）ボトリチス（Ｂｏｔｒｙ
ｔｉｓ） フォーマ（Ｐｈｏｍａ） セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）
クリプトコｙカス（Ｃｒｙｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）ストレ
プトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）エメリセロプ
シス（ＥｍｅｒｉｃｅｌｌｏｐｓｉＳ）トリコデルマ（
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）エビコツカム（Ｅｐｉｃｏｃ
ｃｕｍ） ト　リ　コフィ　　ト　ン　（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏ
ｎ）トリコスポロン（Ｔｒｉｃｏｓｐｏｒｏｎ）エピデ
ルモフィトン（Ｅｐｅｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）アクチ
ノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）ファッサリウ
ム（Ｆａｓｓａｒｉｕｍ）メカルディア（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ） また下記のような種々のバクテリア種の発酵によって生
成するバクテリア由来のアシラーゼがある。

エアロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）フラボバクテ
リウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）アルカリゲネ
ス（ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅＳ）ミクロコツカス（Ｍｉｃ
ｒａｃｏｃｃｕｓ）ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
） プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ） セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）シュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）コリネバクテリウム（
Ｃｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）サルモネラ（Ｓａｌｍ
ａｎｅｌｌａ） エルウイニイア（Ｅｒｗｉｎｉａ） サルシナ（Ｓａｒｃｉｎａ） エシエリチア（Ｅ、５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）キサントモ
ナス（Ｘａｎｔｈｏ＋ａｏｎａｓ）ビー・メガテリウム
（Ｂ、　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ビーズブチリス（Ｂ、
　ｓｕｂｔｉｌｉｇ）アクロモバクタ−（Ａｃｈｒｏｍ
ｂａｃｔｅｒ）動物器管の抽出により得られる酵素、例
えば豚の腎臓のアシラーゼも、有機酸のカルボニル基と
Ｌ−アスパルチル−し−７エニルアラニンメチルエステ
ルのアミノ基との間のアミド結合を加水分解することが
できる。

アスパルチルム、すなわちＬ−α−アスパルチル−し−
フェニルアラニンのメチルエステルは、有機酸残基、例
えば、蟻酸、酢酸等でＮ−置換されたＬ−アスパラギン
酸の活性形と、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルと
を化学的に縮合させることにより、従来製造されていた
　（フランス国特許第２，０４０，４７３号）。またＬ
−７エニルアラニンメチルエステルとＮ−置換し一アス
パラギン酸誘導体（ベルキー国特許第８８２，５０３号
）、例えばベンジルオキシカルボニル、ブチルオキシカ
ルボニル等との間の酵素的な合成を非水媒体中メタルブ
ロテナーゼと称する酵素で行なうことも知られている。

化学的な方法または酵素的な合成によって得られる中間
体、すなわちＮ−置換し一α−アスパルチルーＬ−フェ
ニルアラニンメチルエステルは、濃縮結晶化、抽出また
はその他の操作により反応混合物から単離することがで
きる。次いでこの化合物を加水分解してＮ−保護基をは
ずすと、サッカロースよりも　２００＠以上甘い性質を
示すし−α−アスパルチル−し−フェニルアラニンメチ
ルエステルを得ることができる。

Ｎ−保護基をはずすために用いられる公知の方法におい
ては、主として酸性または塩基性の加水分解が行なわれ
る。例えば、Ｎ−保護基の脱離は、強酩の存在（米国特
許第４，０７１，５１１号）または塩基、例えばヒドロ
キシルアミンあるいはアセチルヒドラジンの存在　（米
国特許第４，０２１，４１８号および英国特許第２，０
９８，２２０号）によって行なうことができる。

前述したように、これらの化学的な脱アシル化方法には
、工業的な観点から数多くの欠陥がある。例えば、収率
が低く、高価な試薬を必要とし、更には遊離のカルボキ
シ基のエステル化またはエステルあるいはペプチド結合
の加水分解によって生じる種々の副生成物を除去するた
めに、得られる生成物は繰り返し精製しなければならな
い。

ジペプチドアルキルエステル、例えばＬ−α−アスパル
チル−し−フェニルアラニンのＮ−保護基を化学的に加
水分解する際のこうした欠陥および限界は、本発明の方
法に従う酵素的な加水分解により克服される。

脱アシル化作用を示す好ましい酵素は、ペニシリウム、
ストレプトマイセス、アスペルギルス、エシエリチアコ
リ、ノカルディア、プロテウス等の微生物によって生成
せしめ、望ましくない酵素活性、例えば加水分解される
生成物すなわちＮ−置換し一α−アスパルチルーし一フ
ェニルアラニンメチルエステルに作用するエステル化活
性を排除し、脱メチルしたアスパルテームを得るために
特殊な方法で精製するのが好ましい。

上記酵素は、同一の固定化酵素を繰り返し用いることに
より本方法を経済的にするために、適当な方法で樹脂そ
の他の適当な物質に固定化するのがよい。

酵素を固定化しない形で用いても明らかに上述と同じ結
果を得ることができる。

このようにして製造し、選択された酵素を、用いる酵素
に応じて水溶液もしくは種々のｐＨ１才なわち２〜９．
好ましくは５〜７の緩和に緩衝化された水溶液に、下記
の式１ ％式％ （式中、Ｒは、水素または、炭素原子数１〜１１の非置
換もしくは置換された、アルキル、アルケニルあるいは
フェこルアルキル基を表わし、好ましくは水素原子、−
ＣＨ３、−（Ｃ：Ｒ２）ｎＣ：）１３　（式中、ｎは　
１〜１０）数）、−ＣＢＨ５、−ＣＨ２−ＣＢＨ３、−
ＣＨ２−Ｃ６）１４−０）１、−ＣＨ２−０６Ｈ４−Ｎ
Ｏ２，、、−Ｃ６Ｈ３（ＯＣ’Ｈ３）２、−ＣＲ２−Ｃ
６Ｈ３（ＯＨ）　２　、−（Ｊ２−Ｃ：Ｈ＝ＣＩ−ＣＨ
２−ＣＨ２−ＣＨ２−３−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｃ）Ｉ−ＣＨ
２−０−Ｒ’　［式中、Ｒ′は、−ｃＢＨ５、−ＣＨ３
、−（にＨ２）。−−ＣＲ３（式中、ｍは　１〜５の数
）　、−ＣＢ）１４−ＣＨ３゜−Ｃ６Ｈ４−ＯＨからな
る群から選択される。］を表わし、　Ｒ１はＣ１〜Ｇ４
の低級アルキルを表わす。）で示された０、２〜２５０
ｇ／　ｌの濃度のアスパルテームＮ−アシル誘導体の存
在下添加する。

反応は、反応混合物中に存在する酵素の量および溶液中
または固定化された形の酵素の量と反応程合物中に存在
するＮ−置換ジペプチドの量との間の比に応じてパ・ン
チ式またはカラム式で操作し、１０〜６０℃の温度、好
ましくは１５〜４０℃の温度で１〜４８時間行なう。

反応を最適条件下で行なうと反応の収率は５０％以上の
高い値となり、アスパルテームＮ−保護基の加水分解を
化学的に行なう際に通常必要とされる、未反応の化合物
または望ましくない副生成物を回収するための複雑かつ
高価なプロセスを必要としなくなる。

このようにして得られるアスパルテームは公知２、の技
術操作に従っ、て抽出することができる。

以ド木発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。

なお製造例を特に示さなかったＮ−アシル誘導体も、出
発物質として適当なアシル化誘導体を用い、製造例Ａ、
Ｂ、ＣおよびＤに記載したように操作することにより高
収率が得られる。

製ｊＬ江Ｌ Ｌ−アスパラギン酸Ｈ，８ｇを水１００ＪＬに懸濁させ
た。１０％のＮａＯＨ２００＋ｓ文を加え、混合物を１
５〜１７℃に冷却した。これニｌＯ％ノＮａＯＨ（１０
０ｔｉ　）とフェニルアセチルクロリド（７０厘文）と
の溶液を同時に　１時間かけて滴下した。

反応混合物を２０°Ｃに３時間保持し、次いで、３７％
の塩化水素をｐＨ２になるまで加えた。

０〜５°Ｃに冷却し濾過した後、反応混合物を乾燥させ
ると、力価１１１９．７７％のＮ−フェニルアセチルア
スパラギン酸１２０ｇが得られた。

トフェニルアセチルアスパラギン酸７８ｇを無水酢酸５
０−に懸濁させた。反応混合物を５０℃に２時間加熱し
た。冷却し溶媒を用いて不溶化すると、Ｎ−フェニルア
セチルアスパラギン醸無水物７０ｇが得られた。氷酢酸
５２ｉ＋Ｊｌとジクロルエタン１００ｍＪ１とに懸濁さ
せ、１０℃に冷却したトフェニルアセチルアスパラギン
酸５２ｇに、フェニルアラニンメチルエステル４０．２
ｇを含有するジクロルエタン２００−を加えた。

塩基で抽出後、ｐＨを酸性値に調整し、濾過したところ
標記化合物８５ｇが得られた。

フェニルアセチルクロリドの代すにフェノキシ＝７セチ
ルクロリド？７．２ｇを出発物質とする以外は製造例Ａ
に記載したのと同様の操作をすることにより、標記化合
物１１０ｇが得られた。

二基 ｐ−ヒドロキシフェニルアセチルクロリド５０．４ｇを
出発物質とする以外は製造例Ａに記載したのと同様に操
作することにより、標記化合物７０．７ｇが得られた。

糺り皇Ｊ Ｈ−プロピオニル−し−α　−アスパルチル−Ｌ−フェ
ニルアセチルクロリドの代りにプロピオニルクロリド４
１．８ｇを出発物質とし、製造例Ａに・記載したのと同
様に操作することにより標記化合物３３．８ｇが得られ
た。

アシラーゼ酵素は、特定の培養液中上述の微生物で発酵
させることにより製造した。

酵母抽出物、グルタミン酸ナトリウム、フェニル酢酸お
よびアンモニウム塩がらなり初期のｐＨが６．８〜６．
９となるように緩衝させた培養液で微生物を発酵させた
。

１０〜１２時間で微生物は最も増殖し、セルラーゼの乾
燥重量は、培養液１ｏｏ−当たり　３００〜４００ｍｇ
であった。

発酵が終了したら、遠心分離により細胞を分離し、洗浄
し、酢酸ｎ−ブチルで分解処理した。

分解質化合物を凝集させ、清澄化し限外濾過した。

選択的な限外濾過により得られる濃縮物を（ＮＨ４）２
ＳＯ４で塩析した。

塩析された化合物は、６００〜９００１１／＋ｊＬの活
性を示す安定なアシラーゼからなっていた。

支呈１」 Ｎ−フェニルアセチル−し−アスパルチル−し−フェニ
ルアラニンのメチルエステル（製造例Ａで得られた。）
を水１００−に溶解し、次いで１０％ＮａＯＨを加え、
この混合物を３７℃ｐ）１７．５以下で振盪し続けた。

溶解後、ＩＮ　　ＮａＯＨまたはＩＮ　　）１０文を加
えてｐＨ値を８．５〜Ｇに安定化させ、この混合物に製
造例Ｅの化合物を固体の気質に固定化し、選択的吸着お
よびグルタルアルデヒドを用いた交差結合により得られ
、アルブミンの存在下で５００／ｇのアシル化活性を示
す酵素化合物０．５ｇを得た。

反応混合物を３７℃に加熱し、振盪しながら２３時間反
応させ、その間ＩＮ　　ＮａＯＨを加えることによりｐ
Ｈを　８±０．５に保持した。反応を終えたら、グラス
フィルターを通して固定化された酵素を減圧濾過により
分離し、水１００ｗＪで洗浄した。

濾液と洗浄液とを合わせ、この溶液を高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）により分析したところ、理論値
の５０％のフェニルアセチル−し−α−アスパルチル−
し−フェニルアラニンのメチルエステルが加水分解され
、未反応の上記化合物はわずかに　５％であり望ましく
ない生成物は５％であった。

次いで低塩含有水溶液からの適当な製造方法に従って、
得られたアスパルテームを抽出し、結晶化させた。そし
て遊離のフェニル酢酸を溶媒抽出または樹脂への吸着に
より回収し、再び製造に使用した。

夷］１１ヱ 製造例Ｂにおいて得られたＮ−フェノキシアセチル−Ｌ
−７スパルチルーＬ−フェニルアラニンのメチルエステ
ル２ｇを３５℃に加熱した水　１００−に溶解させ、１
０％のＮａＯＨを加えてｐＨを　７．５以下に保持した
。溶解後、ｐＨを６．０に調整し、ＳＯＵ／ｇのノポチ
ムアシラーゼ２１７（Ｎｏｖｏｚｙｍ　ａｃｙｌａｓｉ
ｓ　２１？）０．５ｇを適当な不溶性の基質に固定化し
ながら加えた。　　υ 混合物を振盪しながら３５℃で２４吋間反応させ、その
間ＩＮ　　ＮａＯＨを加えることによりｐＨを　６±０
．５に保持した。グラスフィルターで濾過することによ
り固定化させた酵素を回収し、水１０−で洗浄した。

濾液と洗浄液とを合わせ、この溶液をＨＰＬＣでクロマ
ト分離したところ、理論値の８３％の収率が得られた。

尖ＪＬ卸λ 酵素を公知の方法［ハイネス・アール；パイオケム・へ
イオフィズ・リス・コミユニ（Ｈｙｎｅｓ　Ｒ，；Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ
ｕｎ）３６．２３５（１９６９）］に従ってイオン交換
樹脂に吸着させ、グルタルアルデヒドとジアミンとの存
在下、交差結合により不溶化した以外は、実施例１にお
いて記載したのと同様に反応を行なった。

ＩＥＩＵ／ｇの化合物をＮ−フェニルアセチル−Ｌ−ア
ヌパルチルーＬ−フェニルアラニンのメチルエステルの
２％溶液１０〇−当り２ｇ量用いた。２２時間反応させ
たところ反応収率は５０％であった。・支ム遣」 酵素を公知の方法［デイネリ・ディｍ−プロセス　パイ
オケム（Ｄｉｎｅｌｌｉ　Ｄ、、　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ）７１８、９．１ｆ１７２］　に従って、
酢酸セルロース繊維にグラフトさせることにより不溶化
させる以外は実施例１において記載したと同様に反応を
行なった。得られた化合物は１０．００００／ｇであり
、繊維１ｇを用いると実施例１に述べた条件で９０％の
転化が起こった。

１１貫に」 その第１級アミノ基をグルタルアルデヒ１により活性化
させたり、カルボニル中間体に共有結合させることによ
り、酵素を多孔質ガラス粒子に不溶化させた以外は実施
例１において記載したと同様に反応を行なった。得られ
た化合物は２５０／ｇであり、固定化された酵素２ｇを
用いると、実施例１で述べた条件で７５％の添加が起こ
った。

支ム１」 製造例Ｅの酵素を可溶形で用いた以外は実施例１におい
て記載したのと同様に反応を行なった。

Ｎ−フェニルアセチル−し−アスパルチル−し−フェニ
ルアラニンの２％溶液１００−にＥ、　Ｃｏｒｉ培養液
から抽出された酵素ＩＢＯＵを加えた。反応混合物を３
７’Ｃ，Ｐ）Ｉｆｆ〜６．５で８時間保持すると、かか
る条件で理論値の８７％の収率で所望の生成物が得られ
た。

文」１殊Ｊ Ｎ−ｐ−ヒドロキシフェニルアセチル−し−アスパルチ
ル−し−フェニルアラニンのメチルエステル（製造例Ｃ
において得られた。）　３ｇを水　１００−に溶解させ
、ｐＨを６に調整した。この溶液を４０℃に加熱し、次
いでＥ、　Ｃｏｒｉ　に由来し、イオン交換樹脂に吸着
させ、４０Ｕ／ｇの活性を示すアシラーゼ（ペニシリン
アシラーゼ）１ｇを加えた。

反応混合物を振盪させながら、４０℃、ＰＨ５，５〜６
．５に２０時間保持した。次いで、固定化された酵素を
濾過により分離し、反応混合物をＨＰＬＣ：で分析した
ところ酵素による加水分解で生成するアスパルチームの
量が理論量の８２％であった。

支息貫１ 用いる酵素がノカルディアの培養液の抽出物であり、可
溶形である以外は実施例６に記載したと同様にして行な
った。

上述した条件で反応を行なったところ、Ｎ−ｐ−ヒドロ
キシフェニルアセチル−し−アスパルチル−し−フェニ
ルアラニンのメチルエステルが理論値の５０％の収率で
アスパルテームに転化した。

支ｉ皇」 用いられる固定化された酵素がプロテウスの培養液から
抽出によって得られ、２５Ｕ／ｇの活性を示し、反応混
合物のＩｇ／１００ＷＪ量用いられる以外は実施例１に
おいて記載したと同様にして反応を行なった。このよう
な条件の下、得られるアスパルテームの収率は理論値の
４８％であった。

支崖皇」 製造例りに従って得られるＮ−プロピオニル−し−アス
パルチル−し−フェニルアラニンのメチルエステル３ｇ
を水　１００−に溶解し、この溶液を３７℃に加熱し、
ｐ）Ｉを６．５に調整した。

反応混合物に、Ｅ、　Ｃｏｒｉの培養液を公知の方法に
従って抽出し、精製して得られた酵素化合物３００Ｕ／
ｇを加えた。

反応混合物を上記表示温度で２４時間振盪しながら保持
するとともにＰＨを６．５±０．５に保持した。

アスパルテームの最終収率は理論値の４０％以上であっ
た。

尖膚コ１堕 Ｎ−プロピオニル−し−アスパルチル−し−フェニルア
ラニンのメチルエステルを、Ｎ−ウンデシルカルボニル
−し−アスパルテームの０．５ｇ／ＪＬを含有する溶液
にｐ）ｌ　６±１で反応するアシラーゼ活性を示す化合
物で置き換えた以外は実施例９において記載したと同様
に操作した。加水分解収率は理論値の３０％であった。

実」１諮」」 Ｎ−ホルミル−し−アスパルチル−し−フェニルアラニ
ンのメチルエステル２ｇを３７℃に加熱した水　１０〇
−に溶解させた。溶解が完了したら、１０％ＮａＯＨで
ｐＨを　６．５〜７に調整し、シュードモナス培養番こ
より得られるアシラーゼ活性を示す酵素化合物２５０Ｕ
を加えた。反応混合物を３７℃で３６時間放置した。次
いでｐ）Ｉを４〜４．５に調整し、濃縮により化合物ヲ
分離した。Ｌ−α−アスノぐルチル−Ｌ−フェニルアラ
ニンのメチルエステルの収率は理論値の２０％であった
。

支ｌ旌Ｂ アスペルギルスめ培養液から抽出され１Ｂ、０００Ｕ／
ｇを示す酵素をＮ−フェノキシメチル−し−アスノくル
テームの濃度の２％の濃度で用いた以外は実施例２にお
いて記載したと同様に操作した。加水分解収率は理論値
の２０％であった。

支１五旦 酵素を単離せず、細胞を全て固溶化する以外は実施例１
において記載したと同様に行なった。

Ｅ、　Ｃｏｒｉ培養により得られる湿潤細胞１ｇをｐ）
Ｉ７．５　、５０ｍＭの緩衝リン酸塩５−に懸濁させた
。

この溶液に仔牛アルブミン０．５％およびグルタルアル
デヒド　１％を加えた。室温で２時間放置した後、得ら
れたペレットを濾過により分離し、５０＋ａＭの緩衝リ
ン酸塩で洗浄した。用いた化合物は、１４１Ｊ／ｇの活
性を示し、Ｎ−フェニルアセチル孔−アスパルチルーＬ
−フェニルアラニンのメチルエステルの２％溶液　１０
〇−当たり２ｇ量用いた。

３７℃で８時間インキュベーションした後の転化率は理
論値の６５％であった。

実−施［ 酵素を単離せず、ストレプトマイセス培養により得られ
る菌糸塊を固定化した以外は実施例２（こおいて記載し
たのと同様に行なった。結合方法は、実施例１３に記載
したのと同様であった。交差結合した菌糸塊を濾過によ
り分離し、水洗し、凍結乾燥した。凍結乾燥した化合物
を粗く磨り潰して、Ｎ−フェノキシアセチル−し−アス
パルチル−な加水分解のために用いた。＋２０／ｇの活
性を示すこの化合物２ｇを加水分解さるべき生成物の２
％溶液１００−につき用いた。

３７℃テ８時間インキュベーションした後の転化率は理
論値の６０％であった。

１１九」 Ｎ−プロポキシアセチル−し−アスパルチル−し−フェ
ニルアラニンのメチルエステル１ｇを３７℃に加熱した
水　１００−に加えた。１０％ＮａＯＨでｐＨを調整し
ながら生成物を溶解させた。この反応混合物に、セファ
ロスポリウム培養により得られるアシラーゼ活性を示す
酵素化合物２５０ｕを加えた。得られた混合物を３７℃
で２０時間放置した。酵素反応の終了時に収率は理論値
の４５％であった。

１１且」 Ｎ−トリルオキシアセチル−し−アスパルチル−し−フ
ェニルアラニンのメチルエステル１ｇを水　１０〇−に
溶解し、次いでｐＨ８〜７となるまで１０％のＮａ０）
ｌを加えた。この混合物にアクチノプラネス・ウタヘン
シス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ　Ｕｔａｈｅｎｓｉｓ
）培養に由来するアシラーゼ活性を示す酵素化合物２５
０Ｕを加えた。この反応は、３７℃で２４時間行なった
。Ｎ−トリルオキシメチル誘導体の加水分解収率は理論
値の４０％であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンのＣ
   ＿１〜Ｃ＿４低級アルキルエステルの製造方法であって
   、 式Ｉ Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＨ＿２−
   Ｃ＿６Ｈ＿５ＣＨ＿２−ＣＯＯＨ（ I ） ［式中、Ｒは、水素または、炭素原子数１〜１１の非置
   換もしくは置換された、アルキル、アルケニルあるいは
   フェニルアルキル基を表わし、Ｒ＿１はＣ＿１〜Ｃ＿４
   の低級アルキル基を表わす。］で示されるＮ−アシル誘
   導体を酵素により加水分解し、Ｌ−α−アスパルチル−
   Ｌ−フェニルアラニンの低級エステルを抽出し、単離す
   ることを特徴とする方法。 ２、Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低
   級アルキルエステルが式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるメチルエステルである特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ３、Ｒが水素原子、−ＣＨ＿３、−（ＣＨ＿２）＿ｎＣ
   Ｈ＿３（式中、ｎは１〜１０の数）、−Ｃ＿６Ｈ＿５、
   −ＣＨ＿２−Ｃ＿６Ｈ＿５、−ＣＨ＿２−Ｃ＿６Ｈ＿４
   −ＯＨ、−ＣＨ＿２−Ｃ＿６Ｈ＿４−ＮＯ＿２、−Ｃ＿
   ６Ｈ＿３（ＯＣＨ＿３）＿２、−ＣＨ＿２−Ｃ＿６Ｈ＿
   ３（ＯＨ）＿２、−ＣＨ＿２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＿２−
   ＣＨ＿２−ＣＨ＿２−Ｓ−ＣＨ＿２−ＣＨ＝ＣＨ＿２、
   −ＣＨ＿２−Ｏ−Ｒ′ ［式中、Ｒ′は、−Ｃ＿６Ｈ＿５、−ＣＨ＿３、−（Ｃ
   Ｈ＿２）＿ｍ−ＣＨ＿３（式中、ｍは１〜５の数）、−
   Ｃ＿６Ｈ＿４−ＣＨ＿３、−Ｃ＿６Ｈ＿４−ＯＨからな
   る群から選択される。］ からなる群から選択される特許請求の範囲第１項または
   第２項に記載の方法。 ４、酵素による加水分解をヒドラーゼ酵素で行なう特許
   請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の方法
   。 ５、ヒドラーゼ酵素を微生物から製造する特許請求の範
   囲第４項記載の方法。 ６、微生物がアクチノマイセテス、ファンジおよびバク
   テリアからなる群から選択される特許請求の範囲第５項
   記載の方法。 ７、用いられる上記アクチノマイセテスがノカルディア
   、アクチノプラネスもしくはストレプトマイセス属であ
   る特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、上記ファンジがアルテルナチア、アスペルギルス、
   ボトリチス、セファロスポリウム、クリプトコッカス、
   エメリセロプシス、エピコッカム、エピデルモフィトン
   、フサリウム、ムコル、ペニシリウム、フォーマ、トリ
   クトデルマ、トリコフイトンもしくはトリコスポロン属
   である特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９、上記バクテリアがエアロバクター、アルカリゲネス
   、ボルデテラ、セルロモナス、コリネバクテリウム、エ
   ルウイニア、エシエリチア、アクロモバクター、フラボ
   バクテリウム、ミクロコッカス、プロテウス、シュード
   モナス、サルモネラ、サルシナ、キサントモナス、もし
   くはビーズブチリス属である特許請求の範囲第６項記載
   の方法。 １０、所望の酵素を生成する微生物細胞の存在下または
   別に酵素を製造し、次いでこの酵素を式 I の化合物に
   作用させることにより酵素による加水分解を行なう特許
   請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の方法
   。 １１、上記別に製造した酵素を単離し、精製する特許請
   求の範囲第１０項記載の方法。 １２、上記微生物細胞または上記別に製造した酵素を不
   活性基質に固定化するかまたは交差結合法により不溶化
   する特許請求の範囲第１０項または第１１項に記載の方
   法。 １３、ｐＨ２〜９、好ましくはｐＨ５〜７に緩衝化し、
   かつ、１０〜５０℃、好ましくは１５〜４０℃の温度と
   した０．２〜２５０ｇ／ｌの濃度の水溶液中で上記式
   I で示されるＮ−アシル誘導体の加水分解を行なう特許
   請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の方法
   。