JPH0646885A - 光学活性なアミノ酸誘導体の製造法および新規酵素 - Google Patents
光学活性なアミノ酸誘導体の製造法および新規酵素Info
- Publication number
- JPH0646885A JPH0646885A JP4199975A JP19997592A JPH0646885A JP H0646885 A JPH0646885 A JP H0646885A JP 4199975 A JP4199975 A JP 4199975A JP 19997592 A JP19997592 A JP 19997592A JP H0646885 A JPH0646885 A JP H0646885A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- substituted oxycarbonyl
- enzyme
- amino acids
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
(57)【要約】
【目的】 Ｌ−アミノ酸およびＮ−置換オキシカルボニ
ル−Ｄ−アミノ酸誘導体の製造法およびこの製造に用い
る新規酵素を提供する。 【構成】 式（Ｉ） で表わされるＮ−置換オキシカルボニル−Ｄ，Ｌ−アミ
ノ酸および／またはその塩に、微生物の菌体、培養物も
しくはそれらの処理物を作用させて光学分割を行ない、
Ｌ−アミノ酸およびＤ−Ｎ−置換オキシカルボニルアミ
ノ酸誘導体を製造する方法。
ル−Ｄ−アミノ酸誘導体の製造法およびこの製造に用い
る新規酵素を提供する。 【構成】 式（Ｉ） で表わされるＮ−置換オキシカルボニル−Ｄ，Ｌ−アミ
ノ酸および／またはその塩に、微生物の菌体、培養物も
しくはそれらの処理物を作用させて光学分割を行ない、
Ｌ−アミノ酸およびＤ−Ｎ−置換オキシカルボニルアミ
ノ酸誘導体を製造する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、各種医薬中間体や食品
添加物として有用なＬ−アミノ酸およびＤ−Ｎ−置換オ
キシカルボニルアミノ酸誘導体の製造法およびこの製造
に用いる新規酵素に関する。
添加物として有用なＬ−アミノ酸およびＤ−Ｎ−置換オ
キシカルボニルアミノ酸誘導体の製造法およびこの製造
に用いる新規酵素に関する。
【０００２】
【従来の技術】ラセミ体からの光学活性なアミノ酸の製
造方法としては、N-アシル-D,L−アミノ酸のうちＬ体の
みのアシル基を酵素により選択的に脱アシル化する方法
（特開昭63ー22188号公報）、D,L-アミノ酸カルバメート
からL体のみを酵素的に加水分解する方法〔バイオテク
ノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー
（Biotech.Appl.Biochem.) ,９，251(1987)，ジャーナ
ル・オブ・バイオテクノロジー（J.Biotech.),７，49(1
988)〕、N-ベンジルオキシカルボニル− D,L −アミノ
酸からＬ体のみを酵素的に分解する方法〔アグリカルチ
ュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agri
c.Biol.Chem.),48, 1673 (1984) 〕、N-置換カルボニ
ル−D,L−アミノ酸からＬ体のみを酵素的に脱置換カル
ボニル化する方法（特開平3ー94696 号公報）などが知ら
れている。
造方法としては、N-アシル-D,L−アミノ酸のうちＬ体の
みのアシル基を酵素により選択的に脱アシル化する方法
（特開昭63ー22188号公報）、D,L-アミノ酸カルバメート
からL体のみを酵素的に加水分解する方法〔バイオテク
ノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー
（Biotech.Appl.Biochem.) ,９，251(1987)，ジャーナ
ル・オブ・バイオテクノロジー（J.Biotech.),７，49(1
988)〕、N-ベンジルオキシカルボニル− D,L −アミノ
酸からＬ体のみを酵素的に分解する方法〔アグリカルチ
ュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agri
c.Biol.Chem.),48, 1673 (1984) 〕、N-置換カルボニ
ル−D,L−アミノ酸からＬ体のみを酵素的に脱置換カル
ボニル化する方法（特開平3ー94696 号公報）などが知ら
れている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来の技術において、
アミノ酸の保護基としてよく用いられ、導入も容易なウ
レタン型保護基のウレタン結合を立体選択的に加水分解
する活性を有する微生物は一部の細菌にのみ見いだされ
ているが、その基質特異性は非常に狭く、多くのアミノ
酸への汎用性もない。従って、Ｌ−アミノ酸のウレタン
結合を特異的に効率よく切断する方法が求められてい
る。
アミノ酸の保護基としてよく用いられ、導入も容易なウ
レタン型保護基のウレタン結合を立体選択的に加水分解
する活性を有する微生物は一部の細菌にのみ見いだされ
ているが、その基質特異性は非常に狭く、多くのアミノ
酸への汎用性もない。従って、Ｌ−アミノ酸のウレタン
結合を特異的に効率よく切断する方法が求められてい
る。
【０００４】本発明の目的はウレタン結合を立体選択的
に加水分解し、Ｌ−アミノ酸およびＮ−置換オキシカル
ボニル−Ｄ−アミノ酸誘導体を製造する方法およびこの
製造に用いる新規酵素を提供することにある。
に加水分解し、Ｌ−アミノ酸およびＮ−置換オキシカル
ボニル−Ｄ−アミノ酸誘導体を製造する方法およびこの
製造に用いる新規酵素を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は，式（Ｉ）
【０００６】
【化２】
【０００７】（式中、Ｒ1 はα−アミノ酸のα−置換基
を表わし、Ｒ2 はアルキル基、アラルキル基もしくはア
ルケニル基を表わす）で表わされるN-置換オキシカルボ
ニル-D,L-アミノ酸および／またはその塩〔以下、化合
物（Ｉ）と略記する〕に、セルロモナス(Cellulomonas)
属、ズーグロエア(Zoogloea)属、ロドトルラ(Rhodotoru
la) 属、ロドスポリディウム(Rhodosporidium)属および
クロッケラ(Kloeckera) 属に属し、N-置換オキシカルボ
ニル-D,L-アミノ酸を立体選択的に加水分解する能力を
有する微生物の菌体、培養物もしくはそれらの処理物を
作用させ光学分割を行なうことを特徴とするＬ−アミノ
酸およびＤ−Ｎ−置換オキシカルボニルアミノ酸誘導体
の製造法に関する。
を表わし、Ｒ2 はアルキル基、アラルキル基もしくはア
ルケニル基を表わす）で表わされるN-置換オキシカルボ
ニル-D,L-アミノ酸および／またはその塩〔以下、化合
物（Ｉ）と略記する〕に、セルロモナス(Cellulomonas)
属、ズーグロエア(Zoogloea)属、ロドトルラ(Rhodotoru
la) 属、ロドスポリディウム(Rhodosporidium)属および
クロッケラ(Kloeckera) 属に属し、N-置換オキシカルボ
ニル-D,L-アミノ酸を立体選択的に加水分解する能力を
有する微生物の菌体、培養物もしくはそれらの処理物を
作用させ光学分割を行なうことを特徴とするＬ−アミノ
酸およびＤ−Ｎ−置換オキシカルボニルアミノ酸誘導体
の製造法に関する。
【０００８】式中、Ｒ1 の定義におけるα−アミノ酸と
しては、アラニン、ロイシンなどの中性アミノ酸、アス
パラギン酸およびそのβ−エステル、グルタミン酸およ
びそのγ−エステルなどの酸性アミノ酸、リジン、オル
ニチン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、フェニルア
ラニン、チロシンなどの芳香族アミノ酸などの天然アミ
ノ酸以外にチエニルアラニンなどの非天然型α−アミノ
酸があげられる。
しては、アラニン、ロイシンなどの中性アミノ酸、アス
パラギン酸およびそのβ−エステル、グルタミン酸およ
びそのγ−エステルなどの酸性アミノ酸、リジン、オル
ニチン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、フェニルア
ラニン、チロシンなどの芳香族アミノ酸などの天然アミ
ノ酸以外にチエニルアラニンなどの非天然型α−アミノ
酸があげられる。
【０００９】Ｒ2 の定義におけるアルキル基としては、
メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、te
rt−ブチルなどの炭素数１〜８の直鎖または分岐状のア
ルキル、ベンジル、フェネチルなどの炭素数７〜２０の
アラルキル、ビニル、アリル、ホモアリルなどの炭素数
２〜８のアルケニルがあげられる。Ｎ−置換オキシカル
ボニル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸の塩としては、ナトリウム、
カリウム、アンモニウム、カルシウムなどの塩があげら
れる。
メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、te
rt−ブチルなどの炭素数１〜８の直鎖または分岐状のア
ルキル、ベンジル、フェネチルなどの炭素数７〜２０の
アラルキル、ビニル、アリル、ホモアリルなどの炭素数
２〜８のアルケニルがあげられる。Ｎ−置換オキシカル
ボニル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸の塩としては、ナトリウム、
カリウム、アンモニウム、カルシウムなどの塩があげら
れる。
【００１０】本発明に使用される微生物としては、前記
微生物のうち、N-置換オキシカルボニル-D,L-アミノ酸
のL体だけを選択的に脱置換オキシカルボニル化して、L
-アミノ酸に変換することのできる微生物であればいず
れも用いることができる。このような微生物は一般に入
手または購入が容易である保存株から選択することもで
きるし、または自然界から分離することもできる。
微生物のうち、N-置換オキシカルボニル-D,L-アミノ酸
のL体だけを選択的に脱置換オキシカルボニル化して、L
-アミノ酸に変換することのできる微生物であればいず
れも用いることができる。このような微生物は一般に入
手または購入が容易である保存株から選択することもで
きるし、または自然界から分離することもできる。
【００１１】尚、これらの菌株に変異を生じさせて生産
性の高い菌株を得ることもできる。本発明に使用する微
生物のうち、一般に入手可能な細菌の例としては、セル
ロモナス・フラビゲナ ATCC 482 ( Cellulomonas flavi
gena ATCC 482 )、セルロモナス・タルバタ ATCC 25835
( Cellulomonas turbata ATCC 25835 )、ズーグロエア
・ラミゲラ ATCC 19623 ( Zoogloea ramigera ATCC 196
23 )があげられる。
性の高い菌株を得ることもできる。本発明に使用する微
生物のうち、一般に入手可能な細菌の例としては、セル
ロモナス・フラビゲナ ATCC 482 ( Cellulomonas flavi
gena ATCC 482 )、セルロモナス・タルバタ ATCC 25835
( Cellulomonas turbata ATCC 25835 )、ズーグロエア
・ラミゲラ ATCC 19623 ( Zoogloea ramigera ATCC 196
23 )があげられる。
【００１２】また、一般に入手可能な酵母の例としては
ロドトルラ・ミヌタ ATCC 32769 (Rhodotorula minuta
ATCC 32769 )、ロドトルラ・ミヌタ ATCC 10658 (Rhodo
torula minuta ATCC10658 )、ロドスポリディウム・ダ
クリョイダムATCC 10788 ( Rhodosporidium dacryoidum
ATCC 10788) 、クロッケラ・コルティクス ATCC 1063
5 ( Kloeckera corticis ATCC 10635 ) クロッケラ・ア
フリカナ IAM 4429 (Kloeckera africana IAM 4429 ）
があげられる。
ロドトルラ・ミヌタ ATCC 32769 (Rhodotorula minuta
ATCC 32769 )、ロドトルラ・ミヌタ ATCC 10658 (Rhodo
torula minuta ATCC10658 )、ロドスポリディウム・ダ
クリョイダムATCC 10788 ( Rhodosporidium dacryoidum
ATCC 10788) 、クロッケラ・コルティクス ATCC 1063
5 ( Kloeckera corticis ATCC 10635 ) クロッケラ・ア
フリカナ IAM 4429 (Kloeckera africana IAM 4429 ）
があげられる。
【００１３】本発明に用いる微生物の培養は、通常、振
盪培養あるいは通気攪絆深部培養などの好気的条件下で
行なう。培養温度は20〜37℃、培養pHは6〜9で、1〜7日
間培養する。培地には、使用菌が資化し得る炭素源、窒
素源、無機塩および微量有機栄養源が含まれる。
盪培養あるいは通気攪絆深部培養などの好気的条件下で
行なう。培養温度は20〜37℃、培養pHは6〜9で、1〜7日
間培養する。培地には、使用菌が資化し得る炭素源、窒
素源、無機塩および微量有機栄養源が含まれる。
【００１４】炭素源としては、グルコース、マルトー
ス、デンプン加水分解液、糖蜜などの炭水化物が使用で
きる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウムなどの各種の無機および有機のア
ンモニウム塩類、または、肉エキス、酵母エキス、麦芽
エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリ
カー、カゼイン加水分解物などの窒素含有有機物などが
使用できる。
ス、デンプン加水分解液、糖蜜などの炭水化物が使用で
きる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウムなどの各種の無機および有機のア
ンモニウム塩類、または、肉エキス、酵母エキス、麦芽
エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリ
カー、カゼイン加水分解物などの窒素含有有機物などが
使用できる。
【００１５】無機塩としては、マグネシウム、鉄、マン
ガン、カリウム、コバルトなどの塩が使用できる。前記
微生物の培養により得られる菌体の処理物としては、菌
体の乾燥物、界面活性剤および／または有機溶剤添加
物、溶菌酵素処理物、固定化菌体あるいは菌体からの抽
出酵素標品などがあげられる。また、培養物の処理物と
しては、培養物の濃縮物、乾燥物、界面活性剤および／
または有機溶剤添加物、溶菌酵素処理物などがあげられ
る。
ガン、カリウム、コバルトなどの塩が使用できる。前記
微生物の培養により得られる菌体の処理物としては、菌
体の乾燥物、界面活性剤および／または有機溶剤添加
物、溶菌酵素処理物、固定化菌体あるいは菌体からの抽
出酵素標品などがあげられる。また、培養物の処理物と
しては、培養物の濃縮物、乾燥物、界面活性剤および／
または有機溶剤添加物、溶菌酵素処理物などがあげられ
る。
【００１６】さらに、培養菌体、培養物より酵素を精製
し、これを使用してもよい。菌体、培養物から上記微生
物が生産する酵素を単離精製するには、通常の酵素の単
離精製法を用いればよい。例えば培養物を遠心分離して
集菌し、菌体を常法により破砕後、得られる破砕液を遠
心分離し、その上清に硫安などによる塩析、DEAE−セル
ロファイン（生化学工業社製）などによるイオンクロマ
トグラフィー、ブチルトヨパール（東ソー社製）などに
よる疎水性クロマトグラフィー、セファデックスＧ−１
５０（ファルマシア社製）などのゲル濾過などによるカ
ラムクロマトグラフィーを単独で、もしくは組み合わせ
て行ない、酵素を精製することができる。培養物から菌
体を分離した液も破砕液と同様に処理することにより酵
素を得ることができる。
し、これを使用してもよい。菌体、培養物から上記微生
物が生産する酵素を単離精製するには、通常の酵素の単
離精製法を用いればよい。例えば培養物を遠心分離して
集菌し、菌体を常法により破砕後、得られる破砕液を遠
心分離し、その上清に硫安などによる塩析、DEAE−セル
ロファイン（生化学工業社製）などによるイオンクロマ
トグラフィー、ブチルトヨパール（東ソー社製）などに
よる疎水性クロマトグラフィー、セファデックスＧ−１
５０（ファルマシア社製）などのゲル濾過などによるカ
ラムクロマトグラフィーを単独で、もしくは組み合わせ
て行ない、酵素を精製することができる。培養物から菌
体を分離した液も破砕液と同様に処理することにより酵
素を得ることができる。
【００１７】本発明で用いる微生物のうち、ロドトルラ
・ミヌタATCC32769 が生産する酵素を単離精製し、その
理化学的性質を調べたところ、新規な酵素であることが
判明した。従って、本発明は下記性質を有する新規酵素
を提供する。本発明における新規酵素は下記の理化学的
性質を有する。
・ミヌタATCC32769 が生産する酵素を単離精製し、その
理化学的性質を調べたところ、新規な酵素であることが
判明した。従って、本発明は下記性質を有する新規酵素
を提供する。本発明における新規酵素は下記の理化学的
性質を有する。
【００１８】１）作用および基質特異性：化合物（Ｉ）
に作用して化合物（Ｉ）を加水分解し、Ｌ−アミノ酸と
Ｄ−Ｎ−置換オキシカルボニルアミノ酸とを生成する。
に作用して化合物（Ｉ）を加水分解し、Ｌ−アミノ酸と
Ｄ−Ｎ−置換オキシカルボニルアミノ酸とを生成する。
【００１９】２）至適ｐＨ：4.0 〜6.0 ３）至適温度：５０〜６０℃ ４）分子量：225,000(38,000のサブユニットのヘキサオ
リゴマー） ５）等電点：ｐＨ6.1 〜6.5
リゴマー） ５）等電点：ｐＨ6.1 〜6.5
【００２０】６）Ｎ−アリルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパラギン酸 β−エチルエステルに対するKm値：3.74
mM（ｐＨ５）
スパラギン酸 β−エチルエステルに対するKm値：3.74
mM（ｐＨ５）
【００２１】７）力価の測定法：Ｎ−アリルオキシカル
ボニル−Ｄ，Ｌ−アスパラギン酸 β−エチルエステル
を基質として酵素反応（ｐＨ7.5 ，３０℃）を行なう。
１時間あたり１μmoleのＬ−アスパラギン酸 β−エチ
ルエステルを生成させる活性を１単位として酵素活性を
表示する。
ボニル−Ｄ，Ｌ−アスパラギン酸 β−エチルエステル
を基質として酵素反応（ｐＨ7.5 ，３０℃）を行なう。
１時間あたり１μmoleのＬ−アスパラギン酸 β−エチ
ルエステルを生成させる活性を１単位として酵素活性を
表示する。
【００２２】本発明の化合物（Ｉ）の光学分割は、水性
媒体中、前記微生物の菌体、培養物もしくはそれらの処
理物（以下、酵素類と略す）と化合物（Ｉ）とを混合
し、攪拌または振盪することにより行なわれる。
媒体中、前記微生物の菌体、培養物もしくはそれらの処
理物（以下、酵素類と略す）と化合物（Ｉ）とを混合
し、攪拌または振盪することにより行なわれる。
【００２３】水性媒体としては、水または水とエタノー
ル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメ
チルホルムアミドなどの混合溶媒が用いられる。
ル、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメ
チルホルムアミドなどの混合溶媒が用いられる。
【００２４】基質である化合物（Ｉ）は、反応液に対し
て0.1 〜50重量％用いられ、酵素類は基質に対して１〜
２００重量％用いられる。このとき、基質である化合物
（Ｉ）の分散性を向上させるためにノニオン（日本油脂
製）、スパン（関東化学社製）、トリトン（半井化学社
製）などの界面活性剤を添加することもできる。さら
に、反応液のｐＨを一定に保つために、燐酸ナトリウ
ム、燐酸カリウムなどの無機酸塩の緩衝液または酢酸ナ
トリウム、クエン酸ナトリウムなどの有機酸塩の緩衝液
などを用いることもできる。また必要に応じて、水酸化
ナトリウムなどの塩基を添加することもできる。
て0.1 〜50重量％用いられ、酵素類は基質に対して１〜
２００重量％用いられる。このとき、基質である化合物
（Ｉ）の分散性を向上させるためにノニオン（日本油脂
製）、スパン（関東化学社製）、トリトン（半井化学社
製）などの界面活性剤を添加することもできる。さら
に、反応液のｐＨを一定に保つために、燐酸ナトリウ
ム、燐酸カリウムなどの無機酸塩の緩衝液または酢酸ナ
トリウム、クエン酸ナトリウムなどの有機酸塩の緩衝液
などを用いることもできる。また必要に応じて、水酸化
ナトリウムなどの塩基を添加することもできる。
【００２５】反応は０〜７０℃、好ましくは２０〜５０
℃で行なわれる。反応時間は用いる基質濃度、酵素量、
反応温度などによって異なるが、通常１〜１００時間で
終了する。
℃で行なわれる。反応時間は用いる基質濃度、酵素量、
反応温度などによって異なるが、通常１〜１００時間で
終了する。
【００２６】反応液から目的物を単離精製するには、酵
素類をろ別した後、溶媒抽出、洗浄、濃縮、シリカゲル
カラムクロマトグラフィーなどによって行なうことがで
きる。
素類をろ別した後、溶媒抽出、洗浄、濃縮、シリカゲル
カラムクロマトグラフィーなどによって行なうことがで
きる。
【００２７】以下の実施例により本発明の態様を説明す
る。
る。
【００２８】
実施例１ ペプトン２％、肉エキス０．７％、酵母エキス０．５
％、食塩０．３％（ｐＨ７．２）の組成を有する培地３
０ｍｌを３００ｍｌ容量の三角フラスコに入れ、滅菌
後、第１表に示す菌株について各々植菌し、２８℃で２
４時間振盪培養を行なった。培養終了後、培養物を遠心
分離（10,000rpm,５分間）し、菌体を集め生理食塩水で
洗浄した。この菌体を、Ｎ−アリルオキシカルボニル−
Ｄ，Ｌ−アスパラギン酸 β−エチルエステル１５０ｍ
ｇを溶解したｐＨ６．５の０．１Ｍ燐酸緩衝液６ｍｌに
加え、３０℃で２４時間攪拌した。反応液を遠心分離
（10,000rpm,５分間）し、菌体を除去後、塩酸でｐＨ２
に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機層を食塩水で洗
浄後、濃縮するとＮ−アリルオキシカルボニル−Ｄ−ア
スパラギン酸 β−エチルエステルが得られた。また水
層に含まれるＬ−アスパラギン酸 β−エチルエステル
を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量する
と、ほぼ５０％の収率であった。
％、食塩０．３％（ｐＨ７．２）の組成を有する培地３
０ｍｌを３００ｍｌ容量の三角フラスコに入れ、滅菌
後、第１表に示す菌株について各々植菌し、２８℃で２
４時間振盪培養を行なった。培養終了後、培養物を遠心
分離（10,000rpm,５分間）し、菌体を集め生理食塩水で
洗浄した。この菌体を、Ｎ−アリルオキシカルボニル−
Ｄ，Ｌ−アスパラギン酸 β−エチルエステル１５０ｍ
ｇを溶解したｐＨ６．５の０．１Ｍ燐酸緩衝液６ｍｌに
加え、３０℃で２４時間攪拌した。反応液を遠心分離
（10,000rpm,５分間）し、菌体を除去後、塩酸でｐＨ２
に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機層を食塩水で洗
浄後、濃縮するとＮ−アリルオキシカルボニル−Ｄ−ア
スパラギン酸 β−エチルエステルが得られた。また水
層に含まれるＬ−アスパラギン酸 β−エチルエステル
を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量する
と、ほぼ５０％の収率であった。
【００２９】なおＮ−アリルオキシカルボニル−Ｄ−ア
スパラギン酸 β−エチルエステルの光学純度は、
（Ｒ）−フェネチルアミンとのアミドに導き、下記条件
下でＨＰＬＣにより測定した。以下の実施例についての
光学純度の測定についても同条件下のＨＰＬＣにより測
定した。
スパラギン酸 β−エチルエステルの光学純度は、
（Ｒ）−フェネチルアミンとのアミドに導き、下記条件
下でＨＰＬＣにより測定した。以下の実施例についての
光学純度の測定についても同条件下のＨＰＬＣにより測
定した。
【００３０】カラム：ＳＩＬ Ａ−００３（ＹＭＣ社
製） 移動層：ヘキサン：イソプロピルアルコール＝97.5：2.
5 流速：１ml／分 カラム温度：３０℃ 検出ＵＶ：２５４nm 結果を第１表に示す。
製） 移動層：ヘキサン：イソプロピルアルコール＝97.5：2.
5 流速：１ml／分 カラム温度：３０℃ 検出ＵＶ：２５４nm 結果を第１表に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】また生成するＬ−アミノ酸 β−エチルエ
ステルの定量は、７−クロロ−４−ニトロベンゾ−１，
３−ジアゾール（ＮＢＤ−Ｃｌ）を用いた蛍光法により
測定した。なお、測定に用いたＨＰＬＣの条件は下記の
とおりである。以下の実施例についてのＬ−アミノ酸の
定量についても同条件下のＨＰＬＣにより測定した。
ステルの定量は、７−クロロ−４−ニトロベンゾ−１，
３−ジアゾール（ＮＢＤ−Ｃｌ）を用いた蛍光法により
測定した。なお、測定に用いたＨＰＬＣの条件は下記の
とおりである。以下の実施例についてのＬ−アミノ酸の
定量についても同条件下のＨＰＬＣにより測定した。
【００３３】カラム：ＯＤＳ Ｃ−１８ シムパックＣ
ＬＳ（島津製作所製） 移動層：メタノール：１０mMクエン酸緩衝液（ｐＨ４）
＝３５：６５ 流速：１ml／分 検出ＵＶ：５４１nm
ＬＳ（島津製作所製） 移動層：メタノール：１０mMクエン酸緩衝液（ｐＨ４）
＝３５：６５ 流速：１ml／分 検出ＵＶ：５４１nm
【００３４】実施例２ グルコース１％、ペプトン１％、酵母エキス０．３％、
麦芽エキス０．３％（ｐＨ６．２）の組成を有する培地
３０ｍｌを３００ｍｌ容量の三角フラスコに入れ、滅菌
後、ロドトルラ・ミヌタ ATCC 32769 ( Rhodotorula mi
nuta ATCC 32769 ) を植菌し３０℃で２日間振盪培養を
行なった。培養終了後、培養物を遠心分離（10,000rpm,
５分間）し、菌体を集め生理食塩水で洗浄した。この菌
体をＮ−アリルオキシカルボニル−Ｄ，Ｌ−アスパラギ
ン酸 β−エチルエステル１５０ｍｇを溶解したｐＨ
６．５の０．１Ｍ燐酸緩衝液６ｍｌに加え、３０℃で２
４時間攪拌した。反応液を遠心分離（10,000rpm,５分
間）し、菌体を除去後、塩酸でｐＨ２に調整し、酢酸エ
チルで抽出した。有機層を食塩水で洗浄後、濃縮すると
７１ｍｇのＮ−アリルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラ
ギン酸 β−エチルエステルが得られた（収率４６．２
％、光学純度１００％ｅｅ）。また水層に含まれるＬ−
アスパラギン酸 β−エチルエステルをＨＰＬＣで定量
すると、ほぼ５０％の収率であった。
麦芽エキス０．３％（ｐＨ６．２）の組成を有する培地
３０ｍｌを３００ｍｌ容量の三角フラスコに入れ、滅菌
後、ロドトルラ・ミヌタ ATCC 32769 ( Rhodotorula mi
nuta ATCC 32769 ) を植菌し３０℃で２日間振盪培養を
行なった。培養終了後、培養物を遠心分離（10,000rpm,
５分間）し、菌体を集め生理食塩水で洗浄した。この菌
体をＮ−アリルオキシカルボニル−Ｄ，Ｌ−アスパラギ
ン酸 β−エチルエステル１５０ｍｇを溶解したｐＨ
６．５の０．１Ｍ燐酸緩衝液６ｍｌに加え、３０℃で２
４時間攪拌した。反応液を遠心分離（10,000rpm,５分
間）し、菌体を除去後、塩酸でｐＨ２に調整し、酢酸エ
チルで抽出した。有機層を食塩水で洗浄後、濃縮すると
７１ｍｇのＮ−アリルオキシカルボニル−Ｄ−アスパラ
ギン酸 β−エチルエステルが得られた（収率４６．２
％、光学純度１００％ｅｅ）。また水層に含まれるＬ−
アスパラギン酸 β−エチルエステルをＨＰＬＣで定量
すると、ほぼ５０％の収率であった。
【００３５】実施例３ 実施例２で用いたロドトルラ・ミヌタ ATCC 32769 の代
わりに第２表に示す菌株を用いる以外は、実施例２と同
様な操作を行ない、Ｎ−アリルオキシカルボニル−Ｄ−
アスパラギン酸 β−エチルエステルの光学純度を測定
した。
わりに第２表に示す菌株を用いる以外は、実施例２と同
様な操作を行ない、Ｎ−アリルオキシカルボニル−Ｄ−
アスパラギン酸 β−エチルエステルの光学純度を測定
した。
【００３６】結果を第２表に示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】実施例４ グルコース１％、ペプトン１％、酵母エキス０．３％、
麦芽エキス０．３％（ｐＨ６．２）の組成を有する培地
３００ｍｌを２Ｌ容量の三角フラスコ１０本に入れ、滅
菌後、ロドトルラ・ミヌタ ATCC 32769 ( Rhodotorula
minuta ATCC 32769 ) を植菌し３０℃で２日間振盪培養
を行なった。培養終了後、培養物を遠心分離（10,000rp
m,５分間）し、菌体を集め生理食塩水で洗浄し、１４０
ｇの湿菌体を得た。この菌体に５０ｍＭのトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５、１ｍＭジチオスライトールを含
む、以下これを単に緩衝液と略す）１４０ｍｌを加え、
ガラスビーズと共にホモゲナイザーを用い３０分間細胞
を破砕した。破砕液を遠心分離（10,000rpm,５分間）し
て得られる無細胞抽出液に緩衝液を加え、４２０ｍｌと
した。これに６０％飽和になるように硫安を添加し、５
℃で２日間放置し、生成した沈澱を集めた。この沈澱を
４５ｍｌの緩衝液に溶解し、５℃で１日透析を行なっ
た。この溶液を限外濾過により濃縮し、ＤＥＡＥ−セル
ロファイン（生化学工業社製）５００ｍｌを用いたカラ
ムに通塔し、非吸着画分を集めた。この画分を限外濾過
により濃縮し、ブチルトヨパール（東ソー社製）１０ｍ
ｌを用いたカラムクロマトグラフィーを行ない、０．８
〜０．７Ｍ硫安画分を集め、限外濾過により濃縮した。
これをセファデックスＧ−１５０（ファルマシア社製）
２０ｍｌを用いたカラムクロマトグラフィーにてさらに
精製した。活性画分を集め、限外濾過により濃縮し、精
製酵素を得た。
麦芽エキス０．３％（ｐＨ６．２）の組成を有する培地
３００ｍｌを２Ｌ容量の三角フラスコ１０本に入れ、滅
菌後、ロドトルラ・ミヌタ ATCC 32769 ( Rhodotorula
minuta ATCC 32769 ) を植菌し３０℃で２日間振盪培養
を行なった。培養終了後、培養物を遠心分離（10,000rp
m,５分間）し、菌体を集め生理食塩水で洗浄し、１４０
ｇの湿菌体を得た。この菌体に５０ｍＭのトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５、１ｍＭジチオスライトールを含
む、以下これを単に緩衝液と略す）１４０ｍｌを加え、
ガラスビーズと共にホモゲナイザーを用い３０分間細胞
を破砕した。破砕液を遠心分離（10,000rpm,５分間）し
て得られる無細胞抽出液に緩衝液を加え、４２０ｍｌと
した。これに６０％飽和になるように硫安を添加し、５
℃で２日間放置し、生成した沈澱を集めた。この沈澱を
４５ｍｌの緩衝液に溶解し、５℃で１日透析を行なっ
た。この溶液を限外濾過により濃縮し、ＤＥＡＥ−セル
ロファイン（生化学工業社製）５００ｍｌを用いたカラ
ムに通塔し、非吸着画分を集めた。この画分を限外濾過
により濃縮し、ブチルトヨパール（東ソー社製）１０ｍ
ｌを用いたカラムクロマトグラフィーを行ない、０．８
〜０．７Ｍ硫安画分を集め、限外濾過により濃縮した。
これをセファデックスＧ−１５０（ファルマシア社製）
２０ｍｌを用いたカラムクロマトグラフィーにてさらに
精製した。活性画分を集め、限外濾過により濃縮し、精
製酵素を得た。
【００３９】精製酵素の比活性および無細胞抽出液の収
率を１００とした場合の精製収率を第３表に示す。
率を１００とした場合の精製収率を第３表に示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】酵素活性は、１時間あたり１μmoleのＬ−
アスパラギン酸 β−エチルエステルを生成させる活性
を１単位（Ｕ）として表示する。本酵素のＮ−アリルオ
キシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸 β−エチルエス
テルに対するＫｍ値は３. ７４mM（ｐＨ５）である。
アスパラギン酸 β−エチルエステルを生成させる活性
を１単位（Ｕ）として表示する。本酵素のＮ−アリルオ
キシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸 β−エチルエス
テルに対するＫｍ値は３. ７４mM（ｐＨ５）である。
【００４２】また本酵素の基質特異性をＮ−アリルオキ
シカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸β−エチルエステル
に対する活性を１００とした場合の相対活性として第４
表に示す。
シカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸β−エチルエステル
に対する活性を１００とした場合の相対活性として第４
表に示す。
【００４３】
【表４】
【００４４】
【発明の効果】本発明によれば、医薬中間体や食品添加
物として有用なＬ−アミノ酸およびＮ−置換オキシカル
ボニル−Ｄ−アミノ酸誘導体を高収率で得ることができ
る。
物として有用なＬ−アミノ酸およびＮ−置換オキシカル
ボニル−Ｄ−アミノ酸誘導体を高収率で得ることができ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (2)
- 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ1 はα−アミノ酸のα−置換基を表わし、Ｒ
2 はアルキル、アラルキルもしくはアルケニルを表わ
す）で表わされるN-置換オキシカルボニル-D,L-アミノ
酸および／またはその塩〔以下、化合物（Ｉ）と略記す
る〕に、セルロモナス(Cellulomonas)属、ズーグロエア
(Zoogloea)属、ロドトルラ(Rhodotorula) 属、ロドスポ
リディウム(Rhodosporidium)属およびクロッケラ(Kloec
kera) 属に属し、N-置換オキシカルボニル-D,L-アミノ
酸を立体選択的に加水分解する能力を有する微生物の菌
体、培養物もしくはそれらの処理物を作用させ光学分割
を行なうことを特徴とするL-アミノ酸およびＤ−Ｎ−置
換オキシカルボニルアミノ酸誘導体の製造法。 - 【請求項２】 下記理化学的性質を有する新規酵素。 １）作用および基質特異性：請求項１記載の化合物
（Ｉ）に作用してＮ−置換オキシカルボニル−Ｄ，Ｌ−
アミノ酸を加水分解し、Ｌ−アミノ酸を生成する。 ２）至適ｐＨ：4.0 〜6.0 ３）至適温度：５０〜６０℃ ４）分子量：225,000 （38,000のサブユニットのヘキサ
オリゴマー） ５）等電点：ｐＨ 6.1〜6.5
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4199975A JPH0646885A (ja) | 1992-07-27 | 1992-07-27 | 光学活性なアミノ酸誘導体の製造法および新規酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4199975A JPH0646885A (ja) | 1992-07-27 | 1992-07-27 | 光学活性なアミノ酸誘導体の製造法および新規酵素 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646885A true JPH0646885A (ja) | 1994-02-22 |
Family
ID=16416704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4199975A Withdrawn JPH0646885A (ja) | 1992-07-27 | 1992-07-27 | 光学活性なアミノ酸誘導体の製造法および新規酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0646885A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6647083B1 (en) * | 2002-08-21 | 2003-11-11 | General Electric Company | Method and apparatus for stiffening a riser brace in nuclear reactor |
-
1992
- 1992-07-27 JP JP4199975A patent/JPH0646885A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6647083B1 (en) * | 2002-08-21 | 2003-11-11 | General Electric Company | Method and apparatus for stiffening a riser brace in nuclear reactor |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100635803B1 (ko) | 펩타이드 생성 효소 유전자, 펩타이드 생성 효소 및디펩타이드의 제조방법 | |
| JP2008061642A (ja) | Ｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| KR101189613B1 (ko) | 테아닌의 제조법 | |
| US4668625A (en) | Process for preparing peptides | |
| US4506011A (en) | Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters | |
| US5238838A (en) | L-carnitine amidase produced by a microorganism | |
| JPH0646885A (ja) | 光学活性なアミノ酸誘導体の製造法および新規酵素 | |
| JP3155448B2 (ja) | Ｌ−アミノ酸またはその塩の製造方法 | |
| JPH0822228B2 (ja) | アミノ酸アミド加水分解酵素及びその使用 | |
| JP2006067870A (ja) | 新規なアミノアシラーゼおよびその製造方法、並びに新規アミノアシラーゼを利用したアミノ酸誘導体の製造方法 | |
| EP0102529B1 (en) | Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters | |
| JP2674078B2 (ja) | Ｄ−α−アミノ酸の製造法 | |
| WO2002008439A1 (fr) | Procede d'elaboration d'acides 2-amino | |
| JP4485734B2 (ja) | ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法 | |
| JPS61274690A (ja) | Ｄ−α−アミノ酸の製造方法 | |
| US5134073A (en) | Microbiologically produced n-acetyl-2,3-didehydroleucine acylase | |
| US5212069A (en) | Method of using N-acetyl-2,3-Didehydroleucine acylase for the preparation of D- or L-tryptophyl glycine, D- or L-tryptophyl-D-methionine or L-tryptophyl-D-cysteine | |
| JPH1042886A (ja) | 微生物によるβ−アラニンの製造法 | |
| JPH04341185A (ja) | 新規ニトリラーゼ | |
| JP2674076B2 (ja) | Ｄ−α−アミノ酸の製造方法 | |
| JP5261709B2 (ja) | アミノ酸、ペプチド、蛋白質に脂肪酸を付加する方法 | |
| JPH0622776A (ja) | 酵素法によるｎ−長鎖アシルアミノ酸の製造方法 | |
| Tanaka et al. | Enzymatic preparation of optically active silicon-containing amino acids | |
| WO1994001577A1 (en) | Process for producing optically active d-amino acid | |
| JP2899071B2 (ja) | Ｌ―α―アラニンの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19991005 |