JP2006067870A

JP2006067870A - 新規なアミノアシラーゼおよびその製造方法、並びに新規アミノアシラーゼを利用したアミノ酸誘導体の製造方法

Info

Publication number: JP2006067870A
Application number: JP2004253987A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Nakanishi; 一弘中西; Mayuko Koreishi; 真友子是石; Takuo Chikuno; 卓夫築野; Koji Kato; 浩司加藤; Megumi Kadota; めぐみ門田
Original assignee: Tsuno Food Industrial Co Ltd; Okayama University NUC
Current assignee: Tsuno Food Industrial Co Ltd; Okayama University NUC
Priority date: 2004-09-01
Filing date: 2004-09-01
Publication date: 2006-03-16

Abstract

【課題】
大量生産が容易で、なおかつ高収率で、安定したアミノ酸誘導体を加水分解及び合成するのに有用な酵素、及び当該酵素を用いたアミノ酸誘導体の生産方法を提供することにある。
【解決手段】
本発明のアミノ酸誘導体分解合成酵素は、下記(１)〜(３)の理化学的性質を有する。(１)作用及び基質特異性アミノ酸誘導体の加水分解及び合成反応を触媒する。(２)反応至適温度の範囲６０℃付近である。(３)至適pHの範囲５．０〜８．０である。また、本発明のアミノ酸誘導体分解合成酵素を生産する能力を有する微生物を培養し、その培養液から前記アミノ酸誘導体分解合成酵素を採取することを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規な酵素、当該酵素を生産する能力を有する微生物、当該酵素の生産方法、及び当該酵素を利用した有用物質の分解合成方法に関し、特にアミノ酸誘導体の分解合成反応を触媒する酵素の生産方法、及び特に当該酵素を利用したアミノ酸誘導体の合成方法に関する。

アミノ酸は太古の時代から地球に存在する最も古い栄養成分である。原始生命から現在のヒトに至るまで、アミノ酸は、生命の源として利用されている。アミノ酸のもつ基本的な４つの機能として、呈味機能、栄養機能、生理機能、それにライフスタイル改善機能を挙げることができ、機能性食品素材や医薬品原料の分野においても有用であることから、現在世界的な注目を集めている。

このようなアミノ酸誘導体は、たとえば、有機合成化学的方法により合成することができる。

また、酵素を利用した合成として、豚腎臓由来アミノアシラーゼやアミノ基転移酵素を作用させてアミノ酸誘導体の酵素的合成に成功した例も知られている。

しかしながら、上記有機合成化学的方法によれば、使用する試薬類が食品加工用として認められていないため、食品素材の製造方法として利用することができないという欠点を有する。また、上述の酵素を利用した合成法においては、収率が10％程度であり、合成収率が低いという欠点を有する。さらに、生成物の種類もN-acyl-アミノ酸などに限定される場合が多い。その上、豚腎臓由来アミノアシラーゼにおいては、本酵素標品は、豚腎臓を原料とするため工業用途向けの大量生産が困難である。したがって、大量生産が容易で、なおかつ高収率で、安定したアミノ酸誘導体を合成し得る方法が望まれていた。

そこで、本発明の目的は、大量生産が容易で、なおかつ高収率で、安定したアミノ酸誘導体を特異的に合成するのに有能な酵素、当該酵素の生産方法、当該酵素を生産する能力を有する微生物、当該酵素を用いたアミノ酸誘導体の合成方法を提供することにある。

上記目的を達成するために、発明者等は、アミノ酸誘導体を特異的に合成する能力に優れた酵素を求めて種々の微生物について検討した結果、本発明の酵素及び当該酵素の生産方法を見出すに至った。

本発明のアミノ酸誘導体分解合成酵素は、下記（１）〜（３）の理化学的性質を有することを特徴とする。（１）作用及び基質特異性アミノ酸誘導体の加水分解及び合成反応を触媒する。（２）反応至適温度の範囲６０℃近傍である。（３）至適pHの範囲５．０〜８．０である。

本発明のアミノ酸誘導体分解合成酵素の好ましい実施態様において、アミノ酸誘導体分解合成酵素が、Streptomyces属に属する微生物由来であることを特徴とする。

本発明のアミノ酸誘導体酵素の好ましい実施態様において、Streptomyces属に属する微生物が、Streptomyces mobaraensis IFO１３８１９であることを特徴とする。

本発明の微生物は、下記（１）〜（３）の理化学的性質を有するアミノ酸誘導体分解合成酵素の生産能を有するStreptomyces属に属することを特徴とする。（１）作用及び基質特異性アミノ酸誘導体の加水分解及び合成反応を触媒する。（２）反応至適温度の範囲６０℃近傍である。（３）至適pHの範囲５．０〜８．０である。

本発明のアミノ酸誘導体分解合成酵素の生産方法は、Streptomyces属に属し、アミノ酸誘導体分解合成酵素を生産する能力を有する微生物を培養し、その培養液から前記アミノ酸誘導体分解合成酵素を採取することを特徴とする。

本発明のアミノ酸誘導体分解合成酵素の生産方法の好ましい実施様態において、前記微生物が、Streptomyces mobaraensis IFO１３８１９であることを特徴とする。

本発明のアミノ酸誘導体を合成する方法は、請求項１項に記載の酵素の存在下、芳香族カルボン酸や脂肪酸とアミノ酸を反応させることを特徴とする。

本発明のアミノ酸誘導体を合成する方法の好ましい実施態様において、コバルトイオンと亜鉛イオンの存在下で反応させることを特徴とする。

本発明によれば、大量生産が容易で、なおかつ高収率で、安定したアミノ酸誘導体を合成するのに有用な酵素、及び当該酵素を用いたアミノ酸誘導体の生産方法を提供し得るという有利な効果を奏する。

本発明のアミノ酸誘導体分解合成酵素は、アミノ酸誘導体の加水分解及び合成反応を触媒する作用を有する酵素を広く意味するものである。アミノ酸誘導体分解合成酵素は、下記（１）〜（３）の理化学的性質を有する。すなわち、（１）作用及び基質特異性アミノ酸誘導体の加水分解及び合成反応を触媒する。（２）反応至適温度の範囲６０℃近傍である。（３）至適pHの範囲５．０〜８．０である。また、本発明の分解合成酵素の分子量は、およそ１００kDaである。SDS-PAGE及びNative PAGEによって単一のバンドが得られることから、単量体であると確認された。

このような本発明のアミノ酸誘導体分解合成酵素は、好ましくはStreptomyces属に属する微生物由来のものである。より好ましくは、本酵素は、Streptomyces属に属する微生物のうち、Streptomyces mobaraensis IFO１３８１９由来である。

また、本発明のアミノ酸誘導体分解合成酵素は、好ましくは、コバルトイオン及び亜鉛イオンの存在下で、酵素活性が促進する。このような酵素活性の高い酵素を利用すれば、後述するようなアミノ酸誘導体の高効率な合成に有益である。

本発明のアミノ酸誘導体を合成する方法は、上述の本発明の分解合成酵素を用いる。具体的には、当該分解合成酵素の存在下、芳香族カルボン酸や脂肪酸とアミノ酸とを反応させる。反応式を以下に示す。

なお、上記式において、一例としてフェルラ酸を用いたが、アミノ酸と反応させて目的とするアミノ酸誘導体を得るのに、種々の芳香族カルボン酸や脂肪酸を用いることができる。同様に、アミノ酸としては特に限定されず、目的とするアミノ酸誘導体に応じて、種々のアミノ酸を用いることができる。例えば、アラニン、アルギニン、グルタミン、リシン等を挙げる事ができる。

溶媒の種類によっては、溶媒に溶解しないことも生じるので、適宜溶媒を選択して反応させることができる。また、この場合、酵素濃度を高めたり、コバルトイオンを添加して反応を促進させることも可能である。

本発明の微生物は、下記（１）〜（３）の理化学的性質を有するアミノ酸誘導体分解合成酵素の生産能を有するStreptomyces属に属する。（１）作用及び基質特異性アミノ酸誘導体の加水分解及び合成反応を触媒する。（２）反応至適温度の範囲６０℃近傍である。（３）至適pHの範囲５．０〜８．０である。

Streptomyces属に属する微生物の菌学的性質としては、真正放線菌に属し、菌糸状の状態で生育するグラム陽性(グラム染色性が陽性)の偏性好気性菌であることが挙げられる。

本発明のアミノ酸誘導体分解合成酵素の生産性が高いという観点から、微生物としては、Streptomyces mobaraensis IFO１３８１９であることが好ましい。

Streptomyces mobaraensis IFO１３８１９は、大阪の財団法人発酵研究所(IFO)より入手可能であり、IFO１３８１９は、IFOの寄託番号を示す。

なお、IFO１３８１９は、他の微生物保存期間にも同一菌株が寄託されており、理化学研究所微生物系統保存施設(JCM)ではJCM４１６８、米国のAmerican Type Culture Collection (ATCC)ではATCC２９０３２、同じく米国National Center for Aqricultural Utilization ATCC２７４４６である。

本発明のアミノ酸誘導体分解合成酵素の生産方法は、Streptomyces属に属し、アミノ酸誘導体分解合成酵素を生産する能力を有する微生物を、通常の方法で培養し、その培養液から前記アミノ酸誘導体分解合成酵素を採取すればよい。また、上記微生物の自然的又は人工的変異株の培養物から、本発明の分解合成酵素を採取してもよい。培養の形態としては、液体培養、固体培養等を挙げる事ができ、いずれも適用可能である。工業的に有利に培養するために、振盪培養、通気攪拌培養等を行っても良い。

培地の栄養源としては、特に限定されることはなく、微生物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源等を挙げることができる。炭素源としては、酵母エキス、グリセリン、グルコースなどを、または窒素源としては、ペプトン、肉エキス、コーンスチーブリカー等の有機窒素化合物を挙げる事ができる。その他、無機塩類、例えば、食塩、リン酸塩類、硫酸塩類、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛などの金属塩類を適宜培地に加えても良い。培養温度、培養時間等の培養条件について、使用する微生物の発育に適し、かつ本発明の分解合成酵素の生産が最高になるような条件を適宜選択する。例えば、培地のpHは、中性、好ましくは５．５〜７．５より好ましくは７．０近傍である。また、放線菌の生育温度は一般的には２８〜３７℃である。これらの菌体の好ましい培養温度としては２８〜３２℃の範囲である。特に、IFOでは、以下に述べるStreptomyces mobaraensis IFO１３８１９の菌株の培養温度として２８℃を推奨している。

このようにして得られた培養物から本発明の分解合成酵素を得るには、代謝産物を採取するのに通常用いられる方法を適宜利用することができる。例えば、当該分解合成酵素と不純物との溶解度の差を利用する方法、親和力を利用する方法、分子量の差を利用する方法等を、単独又は組み合わせて、あるいは反復して使用することができる。例えば、本発明の分解合成酵素は、微生物の体外に分泌されるので、微生物の培養を行い、培養液から硫酸アンモニウムを用いた塩析、各種のイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を組み合わせて本発明の分解合成酵素を精製すればよい。
(実施例)

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。

＜アミノ酸誘導体分解合成酵素の精製＞まず、アミノ酸誘導体分解合成酵素の菌体外の比活性を調べたところ、その比活性は、培養日数と共に増加した。よって、本菌株の産生するアミノ酸誘導体分解合成酵素は効率よく菌体外に分泌されていると考えられる。

ついで、アミノ酸誘導体分解合成酵素活性の高いものを選別する目的で、他の起源についてスクリーニングを行った。スクリーニング方法は以下の通りである。

培地は４％beef extract、２％polypepton等を用いて培養し、初期pH７．０、振盪速度１２０strokes/min、温度３０℃で８日間培養を行った。活性については、15 mM N-Ac-L-メチオニンを基質として、３７℃で反応を行った。遊離したL-メチオニンをニンヒドリン法で測定した。なお、酵素活性１Uは、１μmolのN-Ac-L-メチオニンを37℃、1分間で加水分解するのに必要な酵素量として定義した。その結果、S. mobaraensis IFO１３８１９由来の酵素の比活性(３２３U/mg)は、既往のP. furiosの酵素の比活性(５００U/mg)とほぼ同程度であった。

これらの知見から、菌株としてS. mobaraensis IFO１３８１９を用いて、培養を行った。可溶性澱粉４．０％、ポリペプトン２．０％、肉エキス４．０％、リン酸水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム２．０％からなるpH７の液体培地にStreptomyces mobaraensis IFO１３８１９の胞子懸濁液を採取し、３０℃で８日間培養した。

その後、酵素を培養上清に終濃度６０％になるように硫酸アンモニウムを加え、硫安沈殿を行った。得られた沈殿をバッファーに溶解後、CM Sephadex C-50で画分し、さらにヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー、Phenyl-Sepharose CL-４Bカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。

CM-Sephadex C-50カラムクロマトグラフィーで活性画分は、NaCl濃度２５０mM付近で溶出した。この活性画分をヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで画分して活性画分を得たが、不純なタンパク質の混在が認められたため、この活性画分をPhenyl-Sepharose CL-４Bカラムクロマトグラフィーで画分した。

このようにして、遠心除去して当該酵素を含む上清を得た。ついで、得られた上清についての活性を調べた。その結果、上清７８０mL中の当該酵素の総活性は、２４９７Uであった。ここで、酵素活性１Uは、３７℃、１分間で１μmolのN-Acetyl-L-メチオニンを加水分解する酵素量であった。この上清に６０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して沈殿画分を得た後、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びPhenyl-Sepharose CL-４Bカラムクロマトグラフィーを行うことにより、比活性は１５２U/mgとなり(表１)、SDSポリアクリルアミド電気泳動的に単一(分子量約１００kDa)に精製された酵素が得られた(図１)。

なお、この比活性はこれまでに報告されているアミノ酸分解活性を有する諸酵素の比活性より高いまたは同程度の活性を有している。

種々の試薬に対する影響について調べたところ、金属キレート剤として知られる１,１０-フェナントロリンの添加により活性が減少したことから、本酵素は金属酵素であると考えられる(表２)。そこで、１,１０-フェナントロリン溶液で透析した酵素を用いて、金属イオンの影響について検討したところ、コバルトイオン及び亜鉛イオンにより活性が回復した(表３)。

また、アミノ酸誘導体分解合成酵素の至適pHは７．５付近であった(図２)。熱安定性に関しては、おそよ６０℃まで安定であった(図３)。また、反応至適温度ついて検討したところ、６０℃で最も高い反応性を示した(図４)。

次に、本発明のアミノ酸誘導体分解合成酵素を用いて、アミノ酸誘導体の合成を試みた。

当該酵素のアミノ酸誘導体合成能力を示す例は、以下のとおりである。３０％グリセロールを含む１００mM Tris-塩酸バッファー中で、初期pH７．２、０．０１Mフェルラ酸(終濃度)と０．５Mアミノ酸(終濃度)の条件下で、２．５U/mLの酵素を用いて攪拌しながら、６日間反応を行った。反応温度は、３７℃であった。

当該酵素のアミノ酸誘導体合成能力を示す例は、以下のとおりである。基質として３．３Mリジンと０．１Mフェルラ酸を用い、１００mM Tris-塩酸バッファー(pH６．５)中で、３７℃反応を行ったところ、反応２日間で、収率３５．５％で生成物が得られた。

比較例として、豚腎臓由来を用いた。反応溶液のHPLC分析を行ってアミノ酸誘導体を定量した。表４に両酵素を用いた場合の種々のアミノ酸を基質とした反応の結果を示す。

その結果、収率約11.5%でアミノ酸誘導体合成が確認できた(図５)。また、フェルラ酸と各種アミノ酸とを基質とする合成反応活性に関しては、フェニルアラニンの場合が最も高いのが特徴である。

以上、具体例を挙げながら発明の実施の形態に基づいて本発明を詳細に説明したが、本発明は上記内容に限定されることを意図するものではなく、本発明の要旨を逸脱しない限りにおいてあらゆる変更が可能であることは、当業者にとって明白であろう。

本発明の一実施例である精製酵素のSDS-PAGEの結果を示す図である。本発明の一実施例である精製酵素の酵素活性に対する至適pHを示す図である。本発明の一実施例である精製酵素の熱安定性を示す図である。本発明の一実施例である精製酵素の酵素活性に対する至適温度を示す図である。アミノ酸誘導体合成反応の生成物を示す図である。

Claims

下記の理化学的性質を有するアミノ酸誘導体分解合成酵素。
(１)作用及び基質特異性アミノ酸誘導体の加水分解及び合成反応を触媒する。
(２)反応至適温度の範囲６０℃近傍である。
(３)至適pHの範囲５．０〜８．０である。
前記アミノ酸誘導体分解合成酵素が、Streptomyces属に属する微生物由来であることを特徴とする請求項１記載のアミノ酸誘導体分解合成酵素。
Streptomyces属に属する微生物が、Streptomyces mobaraensis IFO１３８１９であることを特徴とする請求項２記載のアミノ酸誘導体分解合成酵素。
Streptomyces属に属し、アミノ酸誘導体分解合成酵素を生産する微生物を培養し、その培養液から前記アミノ酸誘導体分解合成酵素を採取することを特徴とするアミノ酸誘導体分解合成酵素の生産方法。
前記微生物が、Streptomyces mobaraensis IFO１３８１９である請求項４記載の方法。
下記の理化学的性質を有するアミノ酸誘導体分解合成酵素の生産能を有するStreptomyces属に属する微生物。
(１)作用及び基質特異性アミノ酸誘導体の加水分解及び合成反応を触媒する。
(２)反応至適温度の範囲６０℃近傍である。
(３)至適pHの範囲５．０〜８．０である。
請求項１〜３項のいずれか１項に記載の酵素の存在下、フェルラ酸とアミノ酸を反応させることを特徴とするアミノ酸誘導体を合成する方法。
さらに、好ましくはコバルトイオンと亜鉛イオンの存在下で反応させることを特徴とする請求項７記載の方法。