JP2876645B2 - アルカリホスファターゼ及びその製造法 - Google Patents
アルカリホスファターゼ及びその製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 アルカリホスファターゼは組換えプラスミド作成やDN
A塩基配列決定の際の、DNA及びRNAの末端リン酸基の除
去、リン脂質等のリン酸残基を有する物質の定量に用い
られているほか、酵素免疫測定法における標識酵素とし
て使用されている。
A塩基配列決定の際の、DNA及びRNAの末端リン酸基の除
去、リン脂質等のリン酸残基を有する物質の定量に用い
られているほか、酵素免疫測定法における標識酵素とし
て使用されている。
本発明は、これらの用途に好適なアルカリホスファタ
ーゼ及びその製造法に関する。
ーゼ及びその製造法に関する。
アルカリホスファターゼの給源としては、これまでに
大腸菌及び仔牛小腸由来のものが知られている。
大腸菌及び仔牛小腸由来のものが知られている。
しかし、前者の酵素は酵素反応の分解産物である無機
リン酸及びエチレンジアミンテトラ酢酸（以下、EDTAと
略記することがある。）による阻害を受け［A.Torrian
i,Methods in Enzymology、Academic Press,NewYork,Vo
l.12B,p212（1968）］、後者の酵素もEDTAによる阻害を
受けるという欠点がある。［Biochemistry,13,1783,M.F
osset,］したがって、充分な加水分解反応を進行させる
ためには、無機リン酸濃度の低い反応液組成として基質
濃度を高めなければならない。
リン酸及びエチレンジアミンテトラ酢酸（以下、EDTAと
略記することがある。）による阻害を受け［A.Torrian
i,Methods in Enzymology、Academic Press,NewYork,Vo
l.12B,p212（1968）］、後者の酵素もEDTAによる阻害を
受けるという欠点がある。［Biochemistry,13,1783,M.F
osset,］したがって、充分な加水分解反応を進行させる
ためには、無機リン酸濃度の低い反応液組成として基質
濃度を高めなければならない。
本発明の目的は、酵素反応の分解産物である無機リン
酸による阻害を受けにくく、効率的に反応が進行する新
規アルカリホスファターゼを得ること及び好熱菌を用い
て該酵素を製造する方法を提供することである。
酸による阻害を受けにくく、効率的に反応が進行する新
規アルカリホスファターゼを得ること及び好熱菌を用い
て該酵素を製造する方法を提供することである。
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意
研究を重ね、自然界から分離した好熱性微生物につい
て、上記アルカリホスファターゼ生産能を有する菌株の
検索を行った。その結果、好熱性バチルス属に属する微
生物バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus ste
arothermophilus）TB−443（以下、TB−443菌と称す
る。）が目的とするアルカリホスファターゼを生産する
ことを見出し、かかる知見に基づいて本発明を完成した
のである。
研究を重ね、自然界から分離した好熱性微生物につい
て、上記アルカリホスファターゼ生産能を有する菌株の
検索を行った。その結果、好熱性バチルス属に属する微
生物バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus ste
arothermophilus）TB−443（以下、TB−443菌と称す
る。）が目的とするアルカリホスファターゼを生産する
ことを見出し、かかる知見に基づいて本発明を完成した
のである。
すなわち本発明は、無機リン酸による阻害を受けにく
いアルカリホスファターゼを提供すると共に、好熱性バ
チルス属に属し、該アルカリホスファターゼ生産能を有
する微生物を培養し、培養液中に該アルカリホスファタ
ーゼを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
するアルカリホスファターゼの製造法を提供するもので
ある。
いアルカリホスファターゼを提供すると共に、好熱性バ
チルス属に属し、該アルカリホスファターゼ生産能を有
する微生物を培養し、培養液中に該アルカリホスファタ
ーゼを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
するアルカリホスファターゼの製造法を提供するもので
ある。
本発明に用いるアルカリホスファターゼ生産菌として
は、好熱性バチルス属に属し、上記のアルカリホスファ
ターゼを生産し得る微生物であればよい。したがって、
前記TB−443菌の他に、その自然的または人為的変異株
ならびにこれら菌株の遺伝子を導入された各種生物も本
発明のアルカリホスファターゼ生産能を有する限り、本
発明に使用することができる。
は、好熱性バチルス属に属し、上記のアルカリホスファ
ターゼを生産し得る微生物であればよい。したがって、
前記TB−443菌の他に、その自然的または人為的変異株
ならびにこれら菌株の遺伝子を導入された各種生物も本
発明のアルカリホスファターゼ生産能を有する限り、本
発明に使用することができる。
次に、TB−443菌の菌学的性質を示す。なお、この菌
学的性質の検討には「微生物の分類と同定」（長谷川武
治編著、東京大学出版会）及び「微生物同定法」（衛生
技術会）に記載されている方法，培地組成を用いた。
学的性質の検討には「微生物の分類と同定」（長谷川武
治編著、東京大学出版会）及び「微生物同定法」（衛生
技術会）に記載されている方法，培地組成を用いた。
〔形態的所見〕（55℃,18時間培養） 1.細胞の形及び大きさ：桿状、0.3〜0.5X1.5〜2.5μｍ 2.多形性：なし 3.運動性：なし 4.胞子：円筒形の内生胞子を細胞先端に形成し、胞子の
うが膨れる。
うが膨れる。
5.グラム染色：陽性 6.抗酸性：なし 7.カプセル：なし 8.異染顆粒：なし 〔生育状態〕（55℃,24時間培養） 1.肉汁寒天平板培養 形状：円形 周縁：波状乃至裂片状 隆起：扁平状 光沢：鈍光 表面：疣状 色調：半透明 2.肉汁寒天斜面培養 生育度：良好 形状：太糸状 3.肉汁液体培養 表面生育：なし 濁度：やや混濁 沈渣：少量 着色、脱色：なし 4.肉汁ゼラチン穿刺培養（ゼラチンは30％添加、55℃で
適時培養後、冷却して固化状態を判定）ゼラチンを液化
する 5.肉汁寒天穿刺培養 形状：表面生育のみ 表面生育：良好 6.リトマスミルク リトマス退色なく、pHややアルカリ性となる。ミルク
の凝固あり。
適時培養後、冷却して固化状態を判定）ゼラチンを液化
する 5.肉汁寒天穿刺培養 形状：表面生育のみ 表面生育：良好 6.リトマスミルク リトマス退色なく、pHややアルカリ性となる。ミルク
の凝固あり。
Ｄ−キシロース,D−グルコース，フクトース,D−マン
ニトール，デンプンを資化して増殖し、酸を生成する。
ニトール，デンプンを資化して増殖し、酸を生成する。
アラビノース，シュークロース,D−ガラクトース，イ
ノシトールの利用性は微弱またはなし。
ノシトールの利用性は微弱またはなし。
以上の本菌の菌学的諸性質から、バージェイズ・マニ
ュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー
（Bergey's manual of systematic bact−eriology）
（1984）の分類方法にしたがって検索し、前記TB−443
菌はバチルス・ステアロサーモフィラスと大略一致した
が、運動性がない点で公知菌株と異なっていた。更に、
標準菌株バチルス・ステアロサーモフィラスIAM 11001,
11002,11003,11004,12043（東京大学応用微生物研究所
保管株）はいずれも後述の培養方法でアルカリホスファ
ターゼを生産しなかった。
ュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー
（Bergey's manual of systematic bact−eriology）
（1984）の分類方法にしたがって検索し、前記TB−443
菌はバチルス・ステアロサーモフィラスと大略一致した
が、運動性がない点で公知菌株と異なっていた。更に、
標準菌株バチルス・ステアロサーモフィラスIAM 11001,
11002,11003,11004,12043（東京大学応用微生物研究所
保管株）はいずれも後述の培養方法でアルカリホスファ
ターゼを生産しなかった。
以上の事項から明らかなように、TB−443菌は、公知
の菌株と区別されるため、これを新菌株として設定する
ことが適当であると結論された。
の菌株と区別されるため、これを新菌株として設定する
ことが適当であると結論された。
TB−443菌は工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第10522号（FERM P−10522）として寄託されてい
る。
研菌寄第10522号（FERM P−10522）として寄託されてい
る。
本発明のアルカリホスファターゼ生産能を有する微生
物を栄養培地に培養し、培養物中に該アルカリホスファ
ターゼを生成せしめ、これを採取することによって目的
とするアルカリホスファターゼが得られる。
物を栄養培地に培養し、培養物中に該アルカリホスファ
ターゼを生成せしめ、これを採取することによって目的
とするアルカリホスファターゼが得られる。
本発明に使用する栄養培地としては、炭素源，窒素
源，無機物及び必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄
養素を程よく含有するものであれば天然及び合成培地の
いずれでもよい。
源，無機物及び必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄
養素を程よく含有するものであれば天然及び合成培地の
いずれでもよい。
炭素源としては通常微生物培養に用いられるグルコー
ス，デンプン，デキストリン，グリセロール，マルトー
ス，フラクトース，乳糖，キシロース，マンニトール，
シュークロース，イノシトールなどを使用できるが、中
でもグルコース，デンプン，デキストリン，グリセロー
ル，マルトースを主炭素源に用いることにより本酵素を
より効果的に生産することが出来る。窒素源としては綿
実粕，綿実油，大豆加水分解物，大豆油，ペプトン，酵
母エキス，肉エキス，麦芽エキス，コーンスティープリ
カーなどの含窒素天然物やグルタミン酸,L−アラニンな
どのアミノ酸が利用できる。その他必要に応じて鋼，マ
グネシウム，カルシウム，ナトリウム，コバルト，カリ
ウムなどの金属の塩やビタミンなどの微量栄養物を適宜
含む培地を用いればよい。
ス，デンプン，デキストリン，グリセロール，マルトー
ス，フラクトース，乳糖，キシロース，マンニトール，
シュークロース，イノシトールなどを使用できるが、中
でもグルコース，デンプン，デキストリン，グリセロー
ル，マルトースを主炭素源に用いることにより本酵素を
より効果的に生産することが出来る。窒素源としては綿
実粕，綿実油，大豆加水分解物，大豆油，ペプトン，酵
母エキス，肉エキス，麦芽エキス，コーンスティープリ
カーなどの含窒素天然物やグルタミン酸,L−アラニンな
どのアミノ酸が利用できる。その他必要に応じて鋼，マ
グネシウム，カルシウム，ナトリウム，コバルト，カリ
ウムなどの金属の塩やビタミンなどの微量栄養物を適宜
含む培地を用いればよい。
培養は36〜62℃の範囲で行うことができるが、45〜55
℃の範囲が好適である。pHは中性域が望ましい。
℃の範囲が好適である。pHは中性域が望ましい。
酵素の生成は条件によって変わってくるが、通常は６
時間から24時間であり、アルカリホスファターゼの生成
が確認されたとき、好ましくは生成が最大に達したとき
に培養を停止する。
時間から24時間であり、アルカリホスファターゼの生成
が確認されたとき、好ましくは生成が最大に達したとき
に培養を停止する。
培養物中からのアルカリホスファターゼの採取は適宜
既知の方法を組合せて実施すればよい。例えば、培養終
了後、菌体内のアルカリホスファターゼを取得する場合
は培養物中から菌体を遠心分離などにより集め、適当な
手段で菌体を破砕してアルカリホスファターゼを抽出
し、次いでイオン交換，ゲル濾過及び疎水クロマトグラ
フィーによって精製を行なう。
既知の方法を組合せて実施すればよい。例えば、培養終
了後、菌体内のアルカリホスファターゼを取得する場合
は培養物中から菌体を遠心分離などにより集め、適当な
手段で菌体を破砕してアルカリホスファターゼを抽出
し、次いでイオン交換，ゲル濾過及び疎水クロマトグラ
フィーによって精製を行なう。
菌体外のアルカリホスファターゼを取得する場合は、
先の遠心上清を濃縮し、同様のクロマトグラフィーで精
製を行なう。
先の遠心上清を濃縮し、同様のクロマトグラフィーで精
製を行なう。
アルカリホスファターゼ活性の測定はHulett＆Campbe
llの方法［Biochemistry、10,1364,（1971）］を改変し
て行なった。2mlの1mM p−ニトロフェニルホスフェート
（以下、ｐ−NPPと略す。）及び1.25mM MgCl2を含む1M
Tris−HCl緩衝液（pH9.0）に対して、酵素液0.5mlを添
加し、37℃で反応を開始した。一定時間後、0.5mlの0.7
5M K2HPO4を加えて反応を停止させ、遊離したｐ−ニト
ロフェノール（以下、ｐ−NPと略す。）量を410nmの吸
光度の増加により測定した。酵素の活性は１分間に１μ
moleのｐ−Npを遊離する活性を1unitと定義した。
llの方法［Biochemistry、10,1364,（1971）］を改変し
て行なった。2mlの1mM p−ニトロフェニルホスフェート
（以下、ｐ−NPPと略す。）及び1.25mM MgCl2を含む1M
Tris−HCl緩衝液（pH9.0）に対して、酵素液0.5mlを添
加し、37℃で反応を開始した。一定時間後、0.5mlの0.7
5M K2HPO4を加えて反応を停止させ、遊離したｐ−ニト
ロフェノール（以下、ｐ−NPと略す。）量を410nmの吸
光度の増加により測定した。酵素の活性は１分間に１μ
moleのｐ−Npを遊離する活性を1unitと定義した。
次に、後記実施例で得られた本酵素の理化学的性質を
示す。
示す。
（１）作用 本酵素は、リン酸モノエステル結合を加水分解する。
（２）至適pH 0.2Mの各種緩衝液を用い測定したところ、第１図に示
したように本酵素の至適pHは９〜10であった。
したように本酵素の至適pHは９〜10であった。
（３）至適温度 至適温度は第２図から65〜75℃と判明した。
（４）安定pH範囲 本酵素標品を第３図に示す種々の緩衝液に溶解し、37
℃で１時間保持したのち、残存活性を測定した。その結
果、本酵素の安定pH範囲はpH9〜12の範囲であった。
℃で１時間保持したのち、残存活性を測定した。その結
果、本酵素の安定pH範囲はpH9〜12の範囲であった。
（５）安定温度範囲 酵素液を1mM MgCl2を含む1M Tris−HCl緩衝液（pH9.
0）で各温度に30分間保持し、氷水中で５分間冷却した
のち、残存活性を測定した。第４図に示したように50℃
で65％の活性を維持していた。
0）で各温度に30分間保持し、氷水中で５分間冷却した
のち、残存活性を測定した。第４図に示したように50℃
で65％の活性を維持していた。
（６）基質特異性 各種基質を10mMの濃度で本酵素と反応させ、1mlの25
％トリクロロ酢酸添加により反応を停止させた後、反応
液の一部をとり、Fiske＆Subbarowの変法〔生化学分析
法、由岐英剛編、南江堂、p13,（1984）］で無機リン酸
の定量を行った。表１にｐ−NPPに対する活性を100％と
した場合の各種基質に対する相対活性を示した。
％トリクロロ酢酸添加により反応を停止させた後、反応
液の一部をとり、Fiske＆Subbarowの変法〔生化学分析
法、由岐英剛編、南江堂、p13,（1984）］で無機リン酸
の定量を行った。表１にｐ−NPPに対する活性を100％と
した場合の各種基質に対する相対活性を示した。
（７）金属の影響 5mMのMg2+，Co2+，Zn2+により３倍以上の活性亢進が
認められ、Ca2+，Cu2+ではほとんど影響はなかった（表
２）。
認められ、Ca2+，Cu2+ではほとんど影響はなかった（表
２）。
（８）分子量 SDS PAGE法，ゲル濾過法で分子量を求めたところそれ
ぞれ55,000,112,000であった。このことから、本酵素
は、分子量55,000のサブユニットからなるダイマー構造
をとっているものと推察される。
ぞれ55,000,112,000であった。このことから、本酵素
は、分子量55,000のサブユニットからなるダイマー構造
をとっているものと推察される。
（９）無機リン酸による阻害 Lineweaver−Burkプロットによりｐ−NPPに対するKm
値を、またDixonプロットによりK2HPO4に対するKi値を
求め、市販のE. coli由来酵素及び仔牛小腸由来酵素と
比較した。本酵素は表３に示したように、他の二つの酵
素に比較してKm値に大きな差はないが、Ki値が大きく、
Ki/Km値が約９〜20倍の大きさでこれら公知の酵素より
も無機リン酸による阻害を受けにくいという特徴を有し
ている。
値を、またDixonプロットによりK2HPO4に対するKi値を
求め、市販のE. coli由来酵素及び仔牛小腸由来酵素と
比較した。本酵素は表３に示したように、他の二つの酵
素に比較してKm値に大きな差はないが、Ki値が大きく、
Ki/Km値が約９〜20倍の大きさでこれら公知の酵素より
も無機リン酸による阻害を受けにくいという特徴を有し
ている。
（10）キレート剤による阻害 表２に示したように、本酵素は1mM EDTA存在下で91
％,5mM EDTA存在下では96％の活性を保持しており、キ
レート剤による阻害を受けにくい特徴を有している。
％,5mM EDTA存在下では96％の活性を保持しており、キ
レート剤による阻害を受けにくい特徴を有している。
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例 デンプン2.0％，グルコース1.0％，綿実粕1.0％,L−
アラニン0.5％，CaCl2・2H2O0.05％,NaCl 0.03％，CuSO
4・5H2O0.13％，CoCl2・6H2O0.002％,KCl 0.0008％及び
水道水からなる培地3lを5l容のジャー・ファーメンター
に入れ、常法により殺菌後pHを7.0に調整し、バチルス
・ステアロサーモフィラス TB−443 （FERMP−10522）
菌を種菌として接種し、50℃，通気量3l/分，溶存酸素
濃度2.0ppmの条件で16時間の通気攪拌培養を行った。
アラニン0.5％，CaCl2・2H2O0.05％,NaCl 0.03％，CuSO
4・5H2O0.13％，CoCl2・6H2O0.002％,KCl 0.0008％及び
水道水からなる培地3lを5l容のジャー・ファーメンター
に入れ、常法により殺菌後pHを7.0に調整し、バチルス
・ステアロサーモフィラス TB−443 （FERMP−10522）
菌を種菌として接種し、50℃，通気量3l/分，溶存酸素
濃度2.0ppmの条件で16時間の通気攪拌培養を行った。
培養終了後、培養液を超音波処理してアルカリホスフ
ァターゼ活性を測定したところ8.0unit/mlであった。同
様に、遠心分離により菌体を除去した上清液について酵
素活性を測定したところ4.0unit/mlであった。
ァターゼ活性を測定したところ8.0unit/mlであった。同
様に、遠心分離により菌体を除去した上清液について酵
素活性を測定したところ4.0unit/mlであった。
上記の遠心分離した菌体を10mM Tris−HCl（pH7.2）
緩衝液に懸濁し、超音波により菌体を破砕後、Mg（CH3C
OO)2を1M濃度となるように添加し、４℃で一晩攪拌抽出
を行った。次に、遠心分離により不溶物を除去し、10mM
Tris−HCl（pH7.2）緩衝液に対して透析後、同緩衝液
で平衡化したDEAE−Toyopearlカラムへ添加した。活性
画分は10mM Tris−HCl（pH7.2）緩衝液と1M Mg（CH3CO
O)2を含む同緩衝液によるグラジエント溶出により回収
し、濃縮後、0.15M Mg（CH3COO)2を含む同緩衝液で平衡
化したSuperose 12のゲル濾過カラムへ添加した。更
に、活性画分を1.7M硫安を含む30mM Tris−HCl（pH7.
2）緩衝液で平衡化したPhenyl−Superoseの疎水クロマ
トカラムへ添加し、溶離液中の硫安濃度を直線的に減少
させることで溶出させた。
緩衝液に懸濁し、超音波により菌体を破砕後、Mg（CH3C
OO)2を1M濃度となるように添加し、４℃で一晩攪拌抽出
を行った。次に、遠心分離により不溶物を除去し、10mM
Tris−HCl（pH7.2）緩衝液に対して透析後、同緩衝液
で平衡化したDEAE−Toyopearlカラムへ添加した。活性
画分は10mM Tris−HCl（pH7.2）緩衝液と1M Mg（CH3CO
O)2を含む同緩衝液によるグラジエント溶出により回収
し、濃縮後、0.15M Mg（CH3COO)2を含む同緩衝液で平衡
化したSuperose 12のゲル濾過カラムへ添加した。更
に、活性画分を1.7M硫安を含む30mM Tris−HCl（pH7.
2）緩衝液で平衡化したPhenyl−Superoseの疎水クロマ
トカラムへ添加し、溶離液中の硫安濃度を直線的に減少
させることで溶出させた。
精製酵素標品の純度決定をSDS電気泳動で行ったとこ
ろ、１本の蛋白バンドのみが認められた。精製酵素標品
の活性収率は12％であった。
ろ、１本の蛋白バンドのみが認められた。精製酵素標品
の活性収率は12％であった。
本発明によれば、培養期間の短い好熱菌を用いて、酵
素反応の分解産物である無機リン酸による阻害を受けに
くいアルカリホスファターゼを提供でき、さらに好まし
い態様としてキレート剤による阻害をも受けにくいアル
カリホスファターゼを提供できる。
素反応の分解産物である無機リン酸による阻害を受けに
くいアルカリホスファターゼを提供でき、さらに好まし
い態様としてキレート剤による阻害をも受けにくいアル
カリホスファターゼを提供できる。
第１図は本発明のアルカリホスファターゼの至適pHを、
第２図は該アルカリホスファターゼの作用至適温度を、
第３図は該アルカリホスファターゼの安定pH範囲を、第
４図は該アルカリホスファターゼの安定温度範囲をそれ
ぞれ示すものである。
第２図は該アルカリホスファターゼの作用至適温度を、
第３図は該アルカリホスファターゼの安定pH範囲を、第
４図は該アルカリホスファターゼの安定温度範囲をそれ
ぞれ示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C21N 9/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】DixonプロットによるK2HPO4に対するKi値
が3.02×10-4M以上であり、かつ、以下の理化学的性質
を有することを特徴とするアルカリホスファターゼ。 作用：リン酸モノエステル結合を加水分解する 至適pH:9〜10 至適温度:65〜75℃ 分子量：分子量55000のサブユニットからなるダイマ
ー構造を有する - 【請求項２】50℃にて、pH9.0の緩衝液中で30分間の処
理により65％以上の活性が保持される請求項１記載のア
ルカリホスファターゼ。 - 【請求項３】１〜5mMのEDTA存在下で91％以上の活性が
保持される請求項１または２に記載のアルカリホスファ
ターゼ。 - 【請求項４】以下の理化学的性質を有することを特徴と
するアルカリホスファターゼ。 作用：リン酸モノエステル結合を加水分解する 至適pH:9〜10 至適温度:65〜75℃ 安定pH性:pH9〜12の範囲において、37℃、１時間の処
理により、75％以上の活性が保持される 安定温度性:50℃にて、pH9.0の緩衝液中で30分間の処
理により65％以上の活性が保持される 分子量：分子量55000のサブユニットからなるダイマ
ー構造を有する 無機リン酸による阻害:DixonプロットによるK2HPO4に
対するKi値が3.02×10-4M以上である キレート剤による阻害:1〜5mMのEDTA存在下で91％以
上の活性が保持される - 【請求項５】アルカリホスファターゼの生産性を有する
バチルス属の細菌を培養し、該バチルス属の細菌の培養
液中に該アルカリホスファターゼを生成、蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする請求項１〜４のいずれ
かに記載のアルカリホスファターゼの製造法。 - 【請求項６】バチルス属の細菌がバチルス・ステアロサ
ーモフィラスTB−443（FERM P−10522）である請求項５
記載のアルカリホスファターゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1241756A JP2876645B2 (ja) | 1989-09-20 | 1989-09-20 | アルカリホスファターゼ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1241756A JP2876645B2 (ja) | 1989-09-20 | 1989-09-20 | アルカリホスファターゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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