JPH05992B2 - - Google Patents

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JPH05992B2
JPH05992B2 JP59073875A JP7387584A JPH05992B2 JP H05992 B2 JPH05992 B2 JP H05992B2 JP 59073875 A JP59073875 A JP 59073875A JP 7387584 A JP7387584 A JP 7387584A JP H05992 B2 JPH05992 B2 JP H05992B2
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inhibited
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Description

【発明の詳細な説明】
（発明の分野） この発明はペプチド鎖中に存在する連続する２
個の塩基性アミノ酸間のペプチド結合を加水分解
により切断する新規プロテアーゼ、及びその製造
方法に関する。 （発明の背景） 副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホル
モン、β−リポトロピン、β−エンドルフイン、
α−ネオエンドルフイン、インシユリン等のペプ
チド性ホルモンの前駆体であるプロホルモン中に
は２個の連続する塩基性アミノ酸が存在し、これ
らの塩基性アミノ酸のＮ側の結合を切断する酵
素、Ｃ側の結合を切断する酵素、及び中間を特異
的に切断する酵素がプロホルモンからの活性ホル
モンの生成において重要な機能を果すことが知ら
れている。 特に、今日における遺伝子工学の発達により、
各種の高等動物ホルモンの微生物的製造が可能に
なりつつある事と相まつて、mRNAの翻訳生成
物であるプロ−ペプチドを成熟ペプチドに転換す
るプロセシング酵素として、前記の活性を有する
酵素の実用性が注目されている。 （従来技術） Kurjan J.等、Cell 30、939−943（1982）；及
びJulius D.等、J.Cell32、839−852（1983）には
前駆体ポリペプチドをプロセシングして酵母α−
フアクターを生成せしめる膜結合ジペプチジルア
ミノペプチダーゼが記載されているが、この酵母
は反復−ｘ−Ala−配列のカルボキシル側を切断
し、この発明のプロテアーゼと作用を異にする。 連続する２個の塩基性アミノ酸間のペプチド結
合を切断する動物由来のプロテアーゼは、
Fletcher等、J.Cell Biol.90、312−322（1981）；
Loh Y.P.等、Proc.natn，Acad.Sci.U.S.A.79、
108−112（1982）；水野等、Biochem.biophys.
Res.Commun.108，1235−1242（1982）；Linderg
I.等，Biochem.biophys.Res.Commun.106、186
−193（1982）；Evangelista R.等、Biochem.
biophys.Res.Commun.106、895−902（1982）；及
びFricher L.D.等Prpc.natn.Acad.Sci.U.S.A79、
3886−3890（1982）に記載されているが、これら
の酵素はいずれも詳細な基質特異性及び各種阻害
剤に対する応答等の点でこの発明のプロテアーゼ
と異なる。また、これらの酵素はいずれも動物細
胞に由来するものであるから、これを大量に採取
することは困難である。 発明者等は、プロホルモンから活性ホルモンを
誘導する新規なプロテアーゼの探索を目的として
種々の微生物の菌体及び培養液につき検討したと
ころ、サツカロミセス属酵母がその菌体内に連続
する２個の塩基性アミノ酸配列を認識しこのアミ
ノ酸間のペプチド結合を特異的に加水分解する新
規なエンドペプチダーゼを生成蓄積する事実を見
出し、この知見を基いてこの発明を完成した。 （酵素の性質） (1) 作用 ペプチド中の連続する２個の塩基性アミノ酸の
間のペプチド結合を加水分解より特異的に切断す
る。 (2) 基質特異性 例えば、次に示すペプチド中の矢印で示した部
位を切断する。
【表】
【表】 すなわち、独立した塩基性アミノ酸の前後のペプ
チド結合は加水分解しない。またカルボキシ末端
アミノ酸が塩基性アミノ酸であつてそのカルボキ
シル基がアミド化されている場合、そのアミド結
合を切断しない。従つて、この発明のプロテアー
ゼはエンドペプチダーゼである。 (3) 分子量 電気泳動法により測定した分子量は約43000で
ある。 (4) 至適PH及び安定PH範囲 至適PHは約7.5であり、PH５〜10の範囲で安定
である（第１図参照のこと）。 (5) 作用適温の範囲 20℃〜45℃の範囲で作用し、至適温度は約37℃
である。 (6) 各種の阻害剤に対する応答 セリン−プロテアーゼ阻害剤であるフエニル
メチルスルホニルフルオリド（PMSF）及びジ
イソプロピルフルオロホスフエート（DFP）
により２×10-4Ｍの濃度において完全に阻害さ
れる。 チオール−プロテアーゼ阻害剤であるモノヨ
ードアセテートおよびｐ−クロロマーキユリー
ベンゾイツクアシド（PCMB）により阻害さ
れない。 金属キレート剤であるEDTA及び１，10−
フエナンスロリンにより10-3Ｍの濃度において
阻害されない。 一般的トリプシン阻害剤であるトシル−Ｌ−
リジンクロロメチルケトン（10-3Ｍ）及びロイ
ペプチン（10-4Ｍ）に対して耐性である。 これらの結果から、この発明のプロテアーゼは
セリンプロテアーゼ型に属するがトリプシン及び
その関連プロテアーゼとは異る。 以上の性質から、この発明のプロテアーゼは、
今まで知られているいずれのプロテアーゼとも異
る新規な酵素である。 （製造方法） この発明のプロテアーゼの製造に使用するサツ
カロミセス属酵母は、この発明のプロテアーゼを
生産するものであればいずれでもよく、例えばサ
ツカロミセス・セレビシエ
（Seccharomycescerevisiae）を挙げることがで
きる。具体例として、例えば一倍体サツカロミセ
ス・セレビシエ（接合型α）の代表的菌株である
X2180−1B株（ATCC26787）、及び（接合型ａ）
の代表的菌株であるＸ−2180−1A株
（ATCC26786）を挙げることができる。これらの
菌株はなんらの制限なく手入することができる。 この発明のプロテアーゼの製造の際に使用する
培地は、前記の酵母が生育して、この発明のプロ
テアーゼを生産するものであればどのようなもの
でもよい。炭素源としては例えばグルコース、デ
キストリン、糖蜜等を使用することができ、窒素
源としては例えばペプトン、カザミノ酸等の蛋白
質分解物、肉エキス、酵母エキス、コーンスチー
プリカー等の動植物抽出物、大豆粕、アミノ酸
類、アンモニウム塩等を使用することができる。
必要に応じて無機塩、例えば各種の燐酸塩、硫酸
マグネシウム、硫酸マンガン等を添加することが
でき、又菌の生育を促進する目的でビタミン類、
核酸関連化合物等を添加することもできる。培養
に当つては固体培地を使用することもできる多量
の菌体を得るには液体培地を用いて通気攪拌培養
又は振とう培養を行うのが好ましい。液体培養に
当つては、シリコン消泡剤、ポリプロピレングリ
コール誘導体、大豆油等を培地に添加することが
本発明のプロテアーゼの蓄積を増大させるのに効
果的な場合がある。培養においては、いきなり本
培養を行うこともできるが、大量培養を行う場合
にはまず小規模な前培養を行い、得られた培養物
を本培地に接種するのが好ましい。培養温度、培
養期間、培地の液性等の条件はこの発明のプロテ
ーアーゼの蓄積量が最大になるように適当に選
択、調節されるが、通常は好気的条件下で、25℃
〜30℃において２〜３日培養するのが好ましく、
この間培地の液性をPH５前後に保つのが好まし
い。 この発明のプロテアーゼは酵母菌体内に蓄積さ
れる。従つてこの酵素の回収、精製においてはま
ず菌体を分離し、次に分離した菌体を破砕してプ
ロテアーゼを溶出し、この溶出液からプロテアー
ゼを採取する。菌体の分離は、菌体含有培養物を
過、遠心分離等常法に従つて処理することによ
り行う。分離した菌体は、水又は等張液で洗浄し
た後、酵素法又は物理的方法によつて破砕し、こ
れによつてプロテアーゼを溶出せしめる。次に溶
出液中のプロテアーゼを常法に従つて回収、精製
する。例えば、プロテアーゼ含有溶出液を遠心分
離することにより不溶物を除去して上清液を得、
これに硫酸アンモニウムを添加して90％飽和とし
プロテアーゼを塩析し、これにより生成した不溶
物を過又は遠心分離により集めて粗酵素を得
る。これを水又は緩衝液に溶解し、緩衝液に対し
て透析する。次にDEAEセフアデツクスＡ−25を
用いてカラムクロマトグラフ処理し、0.25M塩化
ナトリウムにより溶出する。溶出液のプロテアー
ゼ活性分画をセフアアクリルＳ−300を用いてゲ
ル過し単一プロテアーゼを得る。この溶出液を
必要により脱塩し、減圧乾燥、凍結乾燥等常法に
より乾燥することにより固体酵素製品を得ること
ができる。 （酵素活性の測定方法） この発明のプロテアーゼの活性は、合成したエ
ンケフアリンペプチド（Try−Gly−Gly−Phe−
Leu−Arg−Arg−Phe−Ala−NH2）を基質とし
て用いて測定する。0.1nmolの基質を含有する
0.1M酢酸緩衝液（1mMのEDTA及び1mMの
DTTを含む、PH5.5）0.1mlに被験酵素液0.02mlを
加え、37℃にて２時間反応せしめ、100℃にて10
分間加熱することにより反応を停止せしめる。こ
の間に生成した分解物（Try−Gly−Gly−Phe−
Leu−Arg）の量を、この分解物に対する抗血清
を用いるラジオイムノアツセイにより測定する。
37℃、PH5.5において、エンケフアリンペプチド
（Try−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−Phe
−Ala−NH2）から１分間に1μMのTry−Gly−
Gly−Phe−Leu−Argを生成する酵素の量を１単
位とする。 （この発明のプロテアーゼの用途） この発明のプロテアーゼはペプチド中の連続
する２個の塩基性アミノ酸間のペプチド結合を特
異的に加水分解するから、ペプチド中のこのよう
な部位を特異的に切断する必要がある場合に広く
使用することができる。例えば、高等生物のプロ
ホルモンの切除領域には多くの場合連続する２個
の塩基性アミノ酸が含まれているから、このよう
なプロホルモンを遺伝子工学的手法により微生物
中で合成し、人為的にプロセシングして活性ホル
モンを製造しようとする場合のプロセシング酵素
として有用である。また、蛋白質のアミノ酸配列
を決定する場合のペプチド鎖切断酵素試薬として
も有用であろう。 次に、この発明をさらに具体的に説明するため
実施例を記載する。 実施例 ３ｇ／ｌの酵母エキス、３ｇ／ｌのマルトエキ
ス、５ｇ／ｌのポリペプトン及び10ｇ／ｌのグル
コースを含む液体培地を500ml容の振とうフラス
コに100mlずつ分注し、オートクレーブ中で120℃
にて15分間殺菌した。この培地に、サツカロミセ
ス・セレビシエX2180−1B株（ATCC26787）を
１白金耳接種し、往復式振とう機上で25℃にて２
日間培養した。 同じ組成の培地25lを50lのジヤーフアーメンタ
ーに入れ、120℃にて５分間殺菌し、前記の培養
液500mlを接種し、12l／分で通気し、攪拌しなが
ら25℃にて２日間培養した。２日間にさらに10
ｇ／ｌのグルコースを培養液に添加しさらに２日
間同じ条件で培養した。培養終了後、培養液を遠
心分離することにより湿重量約500ｇの酵母菌体
を得た。 この酵母菌体をダイノミル菌体破砕機で５分間
処理することにより破砕した。この破砕液を遠心
分離処理することにより不溶物を除去して上清液
を得た。この上清液に90％飽和の硫酸アンモニウ
ムを加えることにより塩析した。こうして生成し
た不溶物を過により集め、少量の0.01Mトリス
塩酸緩衝液（PH8.0）に溶解し、この溶液を
0.01Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）中で透析し、
透析内液をDEAEセフアデツクスＡ−50を充填し
たカラム（６×50cm）に吸着せしめた。吸着物を
0.0〜0.5M塩化ナトリウム溶液を用いる濃度勾配
法により溶出し、ラジオイムノアツセイにより活
性を検出することにより活性画分を得た。この溶
出の経過を第２図に示す。この活性画分をセフア
アクリルＳ−300を用いるカラムクロマトグラフ
イーによりさらに精製した。溶出した活性画分は
SDS−ゲル電気泳動法においてほぼ単一のバンド
を示した。微量に存在する不純物を除去するた
め、陽イオン交換カラムMono Ｑ ５−５
（Pharmacia Fine Chemicals，８ml、流速1.0
ml／分、登録商標）を用いる高速液体クロマトグ
ラフイーにより精製を行つた。0.0〜0.125M塩化
ナトリウムを含む緩衝溶液を用いる濃度勾配法に
より溶出を行い、純粋なプロテアーゼ画分を得
た。第３図に溶出の経過を示す。こうして得られ
たプロテアーゼはSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法において約43000の分子量を示した。
こうして得た活性画分を脱塩後凍結乾燥すること
により10mgのプロテアーゼを得た。
【図面の簡単な説明】
第１図はこの発明のプロテアーゼのPH−活性曲
線であり、第２図はDEAEセフアデツクスＡ−50
を用いるカラムクロマトグラフイーにおける溶出
経過を示し、そして第３図はMono Ｑを用いる
陽イオン交換高速液体クロマトグラフイーにおけ
る溶出経過を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 次の性質を有する新規プロテアーゼ： ペプチド鎖中に存在する連続する２個の塩基
    性アミノ酸間のペプチド結合を加水分解し； 電気泳動法により測定した分子量が約43000
    であり； フエニルメチルスルホニルフルオリド
    （PMSF）及びジイソプロピルフルオロホスフ
    エート（DFP）により阻害され、モノイオド
    アセテート、ｐ−クロロマーキユリーベンゾイ
    ツクアシド（PCMB）、EDTA、１，10−フエ
    ナンスロリン、トシル−Ｌ−リジンクロロメチ
    ルケトン（TLCK）及びロイペプチンにより阻
    害されず； 至適PHは約7.5であり、PH5〜10の範囲で安
    定であり；そして 20℃〜45℃の範囲で作用し、至適温度は約37
    ℃である。 ２ 次の性質を有する新規プロテアーゼ： ペプチド鎖中に存在する連続する２個の塩基
    性アミノ酸間のペプチド結合を加水分解し； 電気泳動法により測定した分子量が約43000
    であり； フエニルメチルスルホニルフルオリド
    （PMSF）及びジイソプロピルフルオロホスフ
    エート（DFP）により阻害され、モノイオド
    アセテート、ｐ−クロロマーキユリーベンゾイ
    ツクアシド（PCMB）、EDTA、１，10−フエ
    ナンスロリン、トシル−Ｌ−リジンクロロメチ
    ルケトン（TLCK）及びロイペプチンにより阻
    害されず； 至適PHは約7.5であり、PH5〜10の範囲で安
    定であり；そして 20℃〜45℃の範囲で作用し、至適温度は約37
    ℃である。 の製造方法において、 上記のプロテアーゼを生産する能力を有するサツ
    カロミセス（Saccharomyces）属酵母を培養し、
    この菌体から該酵素を採取することを特徴とする
    方法。
JP59073875A 1984-04-14 1984-04-14 新規プロテア−ゼ及びその製造方法 Granted JPS60217894A (ja)

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