KR100188800B1 - 프리프로인슐린을 인슐린으로 전환시키기 위한 효소적 방법 - Google Patents

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Abstract

본원에서 클로스트리파인을 사용하여 프리프로인슐린의 아미노산 쇄를 특이적으로 가수분해시켜 상응하는 중간체를 수득하고, 경우에 따라 이 중간체를 카복시펩티다제 B를 사용하여 상응하는 인슐린으로 전환시키는 방법이 기술되어 있다.

Description

프리스프로인슐린을 인슐린으로 전환시키기 위한 효소적 방법
본 발명은 프리프로인슐린(preproinsulin)을 인슐린으로 전환시키는 효소적 방법에 관한 것이다.
인슐린은 21개의 아미노산 잔기를 함유하는 A쇄 및 30개의 아미노산 잔기를 함유하는 B쇄로 구성된 2개의 폴리펩티드 쇄를 갖는다. A 및 B쇄는 A7과 B7 및 A20과 B19 위치에 있는 시스테인 잔기로 2개의 이황화물 결합을 통하여 서로 연결되어 있다. A6과 A11 사이에는 제 3개의 이황화물 결합이 있다. 동물 및 사람 인슐린은 프리프로인슐린의 형태로 췌장에서 생성된다. 사람의 프리프로인슐린은 예를들면, 24개의 아미노산 잔기로 프리펩티도-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A(여기서, C는 31개의 잔기로 이루어진 아미노산 쇄이다)의 배열을 지닌 86개의 아미노산 잔기로 이루어진 프로인슐린이 결합되어 구성된다. 랑게르한스(Langerhans)섬에서 분비되는 동안, 프리펩티드가 절단되어 프로인슐린이 생성된다. 최종적으로, C-쇄가 단백질분해적으로 절단되어 활성 사람 인슐린이 생성된다.
유전 공학 방법은 미생물에서 발현되는 프리프로인슐린의 양을 크게 증가시킨다[참조 : EP-A-347 781, 데-A-367 163]. 이 프리프로 서열은 일반적으로 화학적 및/또는 효소적으로 절단된다[참조 : DE-P-3440 988, 데-A-0264250]. 공지된 효소적 전환방법은 트립신과 카복시펩티다제 B로 절단하는 것을 근거로 한다[참조 : Kemmler W. et al. J. Biol. Chem, 246(1971) 6786-6791 ; EP-A-195 691 ; EP-B-89007]. 이 방법의 단점은 반응 용액으로부터 제거하기 어려운 다량의 부산물이 형성되는 것이다. 특히 사람 프리프로인슐린을 사람 인슐린(사람 인슐린, HI)으로 전환시키는 경우에, 다량의 de-Thr(B30)-사람 인슐린(de-Thr(B30)-HI)이 형성된다. 이 부산물은 단지 말단 아미노산이 없다는 점에서 HI와 다르며, 반응 용액으로부터 제거하기가 매우 어렵다.
이 부산물의 형성을 감소시키기 위해, 절단 혼합물에 특정 중금속, 특히 니켈을 가할 수 있다[참조 : EP-A 0264 250]. 그러나, 이러한 반응을 수행하는 방법은 중금속을 함유하는 유출액이 많이 부가되기 때문에 산업적 관점에서 바람직하지 않다. 따라서, 프리프로인슐린을 최대한 특이적이고 환경과 조화시키며 전환하는 것이 필요하다.
클로스트리파인(클로스트리오펩티다제 B; EC 3.4.22.8)은 분자량이 약 30,000 내지 80,000인 클리스트리듐 히스토라이티쿰(Clostridium histolyticum)의 배양 여액으로부터 수독된 효소로서, 단백질분해 및 아미다제/에스테라제 활성 모두를 가지고 있다[참조 : Mitchell, W. M, Harrington, W.F., J. of Biol. Chem., 243(18), 4683-4692, 1968]. 이것은 Arg-C 결합에 대한 고도의 특이성에 의해 구별된다. 따라서, 클로스트리파인은 인슐린의 분리된 B쇄에서는 Arg-Gly 결합을 Lys-Ala 결합보다 500배나 더 빨리 절단하고, 글루카곤에서는 단지 Arg-Arg, Arg-Ala 및 Lys-Tyr만 절단한다. 이러한 세 결합의 상대적인 초기 가수분해 비는 1.1/7 및 1/300이다[참조 : Labouesse, B., Bull. Soc. Chim. Biol., 42, 1293, 1960].
본 발명에 이르러 놀랍게도, 클로스트리파인이 B쇄 중에 존재하는아르기닌(B22) 뒤의 아미노산 쇄는 무시할 수 있을 만큼 절단시키면서 프리프로인슐린중의 아르기닌 뒤에서는 특이적 C-말단의 절단을 일으킨다는 것이 밝혀졌다.
본 발명은 프리프로인슐린을 클로스트리파인의 존재하에 가수분해시키고, 경우에 따라 카복시펩티다제 B를 사용하여 상응하는 인슐린으로 전환시킴을 특징으로 하여, 하기 서열식(I)의 프리프로인슐린의 아미노산쇄를 가수분해시키는 방법에 관한 것이다.
상기식에서, R1은 0또는 1개의 아미노산이고, R2는 수소, 화학적 또는 효소학적으로 절단될 수 있는 아미노산, 또는 2 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드이며, R3은 하이드록실 그룹, 아미노산, 또는 2 내지 10개의 아미노산을 포함하는 펩티드이고, X는 L-아르기닌, 또는 2 내지 45개의 아미노산을 포함하여 C-말단 및 N-말단의 L-아르기닌 잔기를 갖는 펩티드이며, Y는 유전학적으로 암호화 가능한 아미노산이고, Z는 유전학적으로 암호화 가능한 아미노산이며, Al 내지 A20 및 B2 내지 B29는 천연적이거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환되어 변형된 사람 또는 동물 인슐린의 아미노산 서열이다.
펩티드 및 단백질의 아미노산 서열은 아미노산 쇄의 N-말단부터 표시한다. 프로테아제는 펩티드 및 단백질의 아미노산간의 펩티드 결합을 가수분해한다. 클로스트리파인은 특히 아르기닌 뒤에서 L-아르기닌-함유 펩티드 또는 단백질을 가수분해한다. 프리프로인슐린의 가수분해 반응시 형성된 생성물은 C-말단 아르기닌 잔기가 있는 인슐린 유도체나 폴리펩티드, 또는 아미노산이다.
용어 천연 아미노산은 예를 들어, Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Hyp, Trp, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit 또는 His를 의미한다.
용어 유전적으로 암호화 가능한 아미노산의 예에는 Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro 또는 셀레노-시스테인이 있다.
R1이 Phe이고, R2가 수소, 천연 아미노산, 또는 2 내지 30개의 천연 아미노산을 포함하고 말단에 C-말단 L-아르기닌을 갖는 펩티드이며, R3이 하이드록실 그룹, 천연 아미노산, 또는 2 내지 10개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드이고, X가 L-아르기닌, 또는 사람 또는 동물 프로인슐린의 C쇄이며, Y가 Thr, Ala 또는 Ser로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산이고, Z가 Asn, Gln, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala 또는 Met로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산이며, Al 내지 A20 및 B2 내지 B29가 사람 또는 동물 인슐린의 아미노산 서열인 서열식(I)의 프리프로인슐린이 바람직하다.
R1이 Phe이고, R2가 수소, 또는 2 내지 30개의 천연 아미노산을 포함하고 말단에 C-말단 L-아르기닌을 갖는 펩티드이며, R3이 하이드록실 그룹, 천연 아미노산, 또는 2 내지 10개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드이고, X가 L-아르기닌, 또는 사람, 돼지 또는 소 프로인슐린의 C 쇄이며, Y가 Thr이고 Z가 Asn이며, Al 내지 A20 및 B2 내지 B29가 사람, 돼지 또는 소 인슐린의 아미노산 서열인 서열식(I)의 프리프로인슐린이 특히 바람직하다.
특히 바람직한 인슐린은 독일연방공화국 특허원 제 P 39 19 852호 및 제 P 40 12 818.0호에 이미 제안되어 있다. 예를 들면, 하기 아미노산 서열을 지닌 InsuArg이다:
NH2-Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro Asn Ser Asn Gly
Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr
Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile
Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn-COOH
클로스트리파인 (EC 3.4.22.8)은 클로스트리디아로부터 수독된 세포의 티올 프로테아제이다. 이 효소는 이종 이량체이고, 기타 공지된 어떠한 티올 프로테아제와도 동일하지 않다. 이 효소는 Arg-XXX 결합, 특히 Arg-Pro에 대해 상당히 높은 특이성을 가진다. 이것은 분자량이 30,000 내지 80,000이고 등전점이 pH 4.8 내지 4.9임을 특징으로 한다. 활성인자의 예로는 시스테인, 머캅토에탄올, 디티오트레이톨 또는 칼슘 이온이 있다.
클로스트리파인은 예를 들면, 토실-L-라이신 클로로메틸 케톤, 과산화수소, EDTA, Co2+, Cu2+또는 Cd2+이온 또는 시트레이트의 존재하에 억제된다.
클로스트리파인은 미생물을사용하여 발효시킴으로서 제조된다. 이 방법에서는 클로스트리디아를 클로스트리파인이 영양배지내에 축적될 때까지 배양한다. 적절한 예로서 클로스트리듐 히스토라이티쿰, 특히 클로스트리듐 히스토라이티쿰 DSM 627이 있다. 또한, 클로스트리파인을 합성하는 상기 미생물의 돌연변이체 및 변형체도 적합하다.
배양은 단일 또는 혼합배지에서, 예를 들면, 산소 부재하의 비-교반된 배양물 또는 발효기중에 침수시켜 수행하며, 경우에 따라 질소, 불활성 기체 또는 산소 이외의 다른 기체를 도입하여 혐기적으로 수행한다. 발효는 약 10 내지 45°C, 바람직하게는 약 25 내지 40°C, 특히 30 내지 38°C 범위의 온도에서 수행한다. 발효는 pH 5 내지 8.5, 바람직하게 5.5 내지 8에서 일어난다. 이러한 조건하에, 일반적으로 1 내지 3일후 배양 브로스(broth)에 효소 축적이 관찰된다. 클로스트리파인의 합성은 세포 성장의 대다수기 후반에서 시작되어 정체기에서 최대이다. 이 효소의 제조는 문헌[참조 : Mitchell W., Meth. of Enzym., vol. 47 (1977), pages 165-170]의 활성 검정 방법으로 수행할 수 있다.
클로스트리파인 제저에 사용되는 영양 용액은 0.2 내지 6%, 바람직하게는 0.5 내지 3%의 유기 질소 화합물과 무기염을 함유한다. 적절한 유기 질소 화합물은 아미노산, 펩톤, 또한 육즙, 분쇄된 종자(예 : 옥수수, 밀, 콩, 대두 또는 목화나무의 종자), 알올 제조시 생성된 증류잔사, 고기분말, 또는 효모 추출물이다. 영양 용액에 함유될 수 있는 무기염의 예로는 알칼리 금속 또는 알칼리토금속의 염화물, 탄산염, 황산염 또는 인산염, 철, 아연, 및 망간 뿐만 아니라, 암모늄 염 및 질산염이 있다.
최적 발효 조건은 각 미생물마다 다르다해도, 당해분야의 숙련가들에게 이미 공지되어 있거나 예비시험으로 쉽게 알 수 있다. 클로스트리파인은 통상의 방법, 예를 들면, 황산 암모늄 침전, 이온 교환 또는 겔 투과 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 이 효소는 통상적인 방법으로 결합시킬 수 있다[참조 : Colowick and Kaplan, Meth. Enzymol., vol. XLIV].
효소학적 전환을 위해 유리 형태 또는 부동형의 모든 세포와 분리된 효소 생성물 모두를 사용할 수 있는데, 이것은 또한 담체와 결합시킬 수 있다.
클로스트리파인을 사용한 서열식(I)의 프리프로인슐린의 절단은 수-혼화성 유기성분(예 : 알콜, 케톤, 우레아 또는 N,N-디메틸포름 아미드)과 또한 혼합될 수 있는 수성 매질중에서 수행한다. 특히, 반응 혼합물에 적절한 무기 또는 유기 완충액(예 : 인산염, 트리스, 글리신, HEPES 등)을 가하여 반응시의 pH 조절을 개선시킬 수 있다. 절단중의 프리프로인슐린 농도는 예를 들면 0.01mg/ml 내지 100mg/ml, 바람직하게는 0.1mg/ml 내지 10mg/ml이다. 클로스트리파인에 대한 프리프로인슐린의 비(mg : 유니트(U))는 1:0.01 내지 1:1,000, 바람직하게는 1:0.1 내지 1:50이다.
반응온도도 마찬가지로 광범위하게 변화시킬 수 있다. 바람직한 온도 범위는 0°C내지 +80°C이고, +20°C 내지 +40°C의 온도가 특히 바람직하다.
반응시의 pH는 pH 4 내지 pH 12로 상이할 수 있으며, pH 6 내지 pH 9가 특히 바람직하다.
프리프로인슐린을 상응하는 중간체로 전환시키는데 요구되는 시간은 반응 조건에 따라 광범위한 범위내에서 변화될 수 있는데, 예를 들면 15분 내지 48시간 일 수 있으며, 1시간 내지 6시간이 바람직하다.
효소는 사용전에 머캅탄의 존재하에 적절한 방법으로 활성화시킨다. 이를 위해 적절한 주요 머캅탄은 SH 그룹을 함유하는 모든 화합물이며, DTT, DTE, 머캅토에탄올, 티오글리콜산 또는 시스테인이 바람직하게 사용된다. 머캅탄의 농도는 광범위한 범위에서 변화시킬 수 있는데 0.1mM 내지 100mM의 농도가 바람직하다. 또한, 활성화완충액은 Ca2+이온, 바람직하게는 CaCl2를 함유한다. 활성화는 pH 4 내지 pH 12, 바람직하게는 pH 6 내지 pH 8에서 수행하며, pH 7 내지 pH 8이 특히 바람직하다. 적절한 완충물질, 예를 들어 트리스, HEPES, 글리신 등을 가하여 pH를 유지할 수 있다. 활성화 온도는 0°C 내지 60°C일 수 있으며, 0°C 내지 10°C가 바람직하고, 0°C 내지 5°C가 특히 바람직하다. 이러한 방법으로 활성화된 효소는 직접 사용하거나, 경우에 따라 울트로겔(Ultrogel) AcA 202 상에서 크로마토그래피로 활성화 완충액으로부터 유리시켜 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 서열식(i)의 프리프로인슐린의 절단으로 인슐린의 C-말단에 아르기닌 잔기를 갖는 인슐린 유도체 및 절단된 상응하는 아미노산 및/또는 펩티드가 수득된다. 경우에 따라, 인슐린 유도체는 카복시펩티다제 B를 사용하여 상응하는 인슐린으로 전환시킬 수 있다. 이것은 동일한 반응 혼합물 중에서 동시에 상기 언급된 반응조건하에 클로스트리파인 등으로 계속해서 수행할 수 있으며, 이 경우 인슐린 유도체는 경우에 따라 자체로 공지된 방법(예 : 크로마토그래피 또는 결정화)을 사용하여 카복시펩티다제 B로 처리하기 전에 분히시킬 수 있다. 카복시펩티다제 B는 용해된 형태 또는 부동형으로 사용할 수 있다. 인슐린 유도체에 대한 카복시펩티다제 B의 비(중량:중량)는 약 1:10 내지 1:5,000, 바람직하게는 약 1:500 내지 1:3,500 및 특히 바람직하게는 약 1:1,000 내지 1:3,000이다.
클로스트리파인에 대한 카복시펩티다제 B의 비 (중량:중량)는 약 1;1 내지 10:1이며 바람직하게는 2:1 내지 5:1이다.
클로스트리파인 및/또는 카복시펩티다제 B 절단에 의한 반응 생성물은 예를 들면 pH를 낮추어 침전시키고/시키거나 공지된 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제할 수 있다. 수득된 인슐린은 통상적인 형태로 제형화시킬 수 있고, 당뇨병의 치료를 위한 약제로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 하기 실시예에서 상세히 기술된다. 달리 제시하지 않으면, % 데이터는 중량%이다.
[실시예 1]
클로스티리듐 히스토라이티쿰 DSM 627을 하기 조성의 영양 용액중에서 배양한다:
1%의 예비배양액을 접종한다. 배양은 협기조건하에 37°C에서 약 2일간 밀폐된 용기중에서 수행한다. 미생물 균주를 -20°C에서 50% 글리세롤을 함유하는 상기 언급한 영양 용액중에 유지시킨다. 발효기에 1% 예비배양물을 접종한다. 영양용액 8ℓ를 함유하는 10ℓ 용량의 발효기에 접종한다. 배양은 33°C 및 7.0의 일정한 pH에서 24시간 동안 질소를 통과시키면서 수행한다. 배양 여액중에서 측정된 효소 활성은 20,000U/ℓ이다[참조 : Mitchell W., Meth. of Enzym., vol. 47, pages 165-170,1977].
약 6,000g에서의 원심분리로 세포를 제거함으로써 후처리하고, 세공 크기가 0.22㎛인 필터를 통해 여과시켜 멸균하며 여액에 60% 빙-냉(-20°C) 메탄올을 가한다. 이어서, 이 용액을 24시간 동안 -20°C에서 유지시킨 후 원심분리(8,000g)한다. 이 펠렛을 멸균 2차-증류수에 용해하고 원심분리(12,000g)한다. 펠렛중의 측정된 효소 활성은 300U/ml이고, 단백질의 효소활성은 200U/mg이다. 이 수율은 발효기에서 측정된 활성의 75%이다.
[실시예 2]
이 세포를 실시예1 에서와 같이 배양한다. 발효기내 생성 배지에는 하기 성분이 포함된다:
상기 발효기에 2% 예비배양물을 접종한다. 배양 여액에서 클로스트리파인 활성은 45,000U/ml이다.
0.3㎛ 막(제조원 : 필토론(Filtron) 오메가 막(Omega membrance)) 상에서 탄젠트상 유동 여과(tangential flow filtration)로 후처리하여 세포를 제거하고, 10KD 막(제조원 : 필토론, 오메가 막)상에서 탄젠트상 유동 여과로 용해된 클로스트리파인을 농축시킨다. 농축율은 20이다. 이어서, 농축액을 탈염하고 DEAE-셀룰로즈상에서 크로마토그래피한다. 클로스트리파인은 활성은 1,000U/ml이고 수율은 85%이다. 이 효소 제제는 사용할 때까지 -20°C에 저장한다.
[실시예 3]
A. 클로스트리파인의 활성
효소제제 50μl (실시예 1로부터 제조된 제제 200U/ml, 286U/mg)
활성화 완충액 1μl (250mM DTT, 125mM CaCl2)
혼합물중 함량 :
5mM DTT
2.5mM CaCl2
- 빙상에서 2시간 동안 배양
- 이 효소는 절단반응을 위해 pH 7.8의 25mM 트리스/HCI 완충액으로 1:40 희석한다.
B. (B31)ARG-인슐린을 유리시키기 위한 클로스트리파인 절단 혼합물
-28℃에서 1 내지 2시간 동안 배양하고, 반응을 HPLC로서 쉽게 분석한 후, 반응을 토실-L-라이신 클로로메틸 케톤(TLCK)로 정지시킬 수 있다.
-TLCK(15mM) 1μl를 가하여 반응을 정지시킨다.
-4℃에서 저장한다.
-결과 : 사람 인슐린-Arg. HPLC로 어떠한 사람 인슐린(deB 30)의 형성도 측정할 수 없다.
C. 사람 인슐린을 유리시키기 위한 카복시펩티다제 B 절단 혼합물
클로스트리파인 절단 혼합물 200μl
카복시펩티다제 B(1:100 희석) 10μl
-혼합물중의 카복시펩티다제 함량 : 2.5μg/ml
-28℃에서 2 내지 4시간 동안 배양, 이 반응은 HPLC로 쉽게분석할 수 있다.
-반응을 위해 카복시펩티다제 B(돼지 췌장에서 추출함, 759U/ml, 150U/mg)를 pH 7.8의 25mM 트리스/HCI 완충액으로 1:1,000 희석한다.
-결과 : 사람 인슐린. HPLC로 어떠한 인슐린(deB 30)의 형성도 측정할 수 없다.
D. HPLC 분석
RP 18 컬럼(H2SO4를 사용하여 pH 4로 조절한 0.125M NH4(SO4)2, 25 내지 50% 아세토니트릴 구배)또는 C8 컬럼(0.1% TFA, 20 내지 50% 아세토니트릴 구배)을 사용하여 절단물을 분석한다.
[실시예 4]
클로스트리파인 : 200U/ml(실시예 1에서 제조)
활성화 완충액 : 500mM 트리스/HCL (pH7.8)
100mM DTT
25mM CaCl2
활성화 : 클로스트리파인 용액 100μl
활성화 완충액 10μl
폴딩(folding) 혼합물 : 사람 프리-B-쇄-A-쇄 인슐린 S-설폰산염 35.7mg
1M 머캅토에탄올 315μl
1M 아스코르브산 105μl
20mM 글리신 완충액(pH 10.7) 100μl
폴딩을 4℃ 냉실에서 밤새 수행하며, 폴딩 수율은 0.152mg/ml이다. pH 5.0에서 pH 침전에 의해 불순물을 제거한 후, 트리스를 가하여 최종 농도를 50mM로 만들고, HCL을 사용하여 pH 7.8로 조절한다. 효소 용액 30μl를 가한다. 30℃에서 절단한 다음 HPLC 분석을 수행한다.
결과 : 상기 언급한 프리프로인슐린은 사람 인슐린-Arg로 절단시킬 수 있다. 인슐린(deB30)의 형성은 극미하다.

Claims (9)

  1. 프리프로인슐린을 클로스트리파인의 존재하에 가수분해하고 카복시펩티다제 B를 사용하거나 사용하지 않으면서 상응하는 인슐린으로 전환시킴을 특징으로 하여, 하기 서열식(I)의 프리프로인슐린의 아미노산 쇄를 가수분해하는 방법.
    상기식에서, R1은 0 또는 1개의 아미노산이고, R2는 수소, 화학적 또는 효소학적으로 절단될 수 있는 아미노산, 또는 2 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드이며, R3은 하이드록실 그룹, 아미노산, 또는 2 내지 10개의 아미노산을 포함하는 펩티드이고, X는 L-아르기닌, 또는 2 내지 45개의 아미노산을 포함하며 C-말단 및 N-말단 L-아르기닌 잔기를 갖는 펩티드이며, Y는 유전학적으로 암호화 가능한 아미노산이고, Z는 유전학적으로 암호화 가능한 아미노산이며, A1 내지 A20 및 B2 내지 B29는 천연적이거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환되어 변형된 사람 또는 동물 인슐린의 아미노산 서열이다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 Phe이고, R2가 수소, 천연 아미노산, 또는 2 내지 30개의 천연 아미노산을 포함하며 말단에 C-말단 L-아르기닌을 갖는 펩티드이며, R3이 하이드록실 그룹, 천연 아미노산, 또는 2 내지 10개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드이고, X가 L-아르기닌, 또는 사람 또는 동물 프로인슐린의 C-쇄이며, Y가 Thr, AlA 또는 Ser로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산이고, Z가 Asn, Gln, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala 또는 Met로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산이며, A1 내지 A20 및 B2 내지 B29가 사람 또는 동물 인슐린의 아미노산 서열인 서열식(I)의 프리프로인슐린이 사용되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1이 Phe이고, R2가 수소, 또는 2 내지 30개의 천연 아미노산을 포함하고 말단에 C-말단 L-아르기닌을 갖는 펩티드이며, R3이 하이드록실 그룹, 천연 아미노산, 또는 2 내지 10개의 천연 아미노산을 포함하는 펩티드이고, X가 L-아르기닌, 또는 사람, 돼지 또는 소 프로인슐린의 C쇄이며, Y가 Thr이고, Z가 Asn이며, A1 내지 A20 및 B2 내지 B29가 사람, 돼지 또는 소 인슐린의 아미노산 서열인 서열식(I)의 프리프로인슐린이 사용되는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, pH 4 내지 12에서 수행되는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열식(I)의 프리프로인슐린 농도가 0.01mg/ml 내지 100mg/ml인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프리프로인슐린/클로스트리파인비(mg:단위)가 1:0.01 내지 1:1,000인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 반응온도가 0℃ 내지 +80℃인 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서 카복시펩티다제 B가 동시에 존재하거나 클로스트리파인을 사용하여 절단한 후에 사용되는 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 클로스트리파인, 카복시펩티다제 B 또는 둘다가 부동형으로 존재하는 방법.
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