JP3005335B2 - プレプロインスリンのインスリンへの酵素的変換方法 - Google Patents
プレプロインスリンのインスリンへの酵素的変換方法Info
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
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Description
【０００１】インスリンは２つのポリペプチド鎖、すな
わち２１個のアミノ酸残基を含むＡ鎖と３０個のアミノ
酸残基を含むＢ鎖から構成されている。ＡおよびＢ両鎖
は、２個のジスルフィド結合を介して連結されている。
すなわち、Ａ７とＢ７およびＡ２０とＢ１９の位置のシ
ステイン残基が互いに結合している。第三のジスルフィ
ド結合がＡ６とＡ１１の間にある。動物およびヒトイン
スリンは膵臓において、プレプロインスリンの形で産生
される。ヒトプレプロインスリンは、たとえば、２４個
のアミノ酸残基を有するプレペプチドに８６個のアミノ
酸残基を有するプロインスリンが結合してなり、以下の
コンフィギュレーション：プレペプチド−Ｂ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（式中、Ｃは３１残基
からなるアミノ酸鎖である）を有する。ランゲルハンス
島からの分泌時にプレペプチドは切断除去されてプロイ
ンスリンを生じる。最後にＣ鎖が蛋白分解的に切断され
て活性ヒトインスリンが生成する。
わち２１個のアミノ酸残基を含むＡ鎖と３０個のアミノ
酸残基を含むＢ鎖から構成されている。ＡおよびＢ両鎖
は、２個のジスルフィド結合を介して連結されている。
すなわち、Ａ７とＢ７およびＡ２０とＢ１９の位置のシ
ステイン残基が互いに結合している。第三のジスルフィ
ド結合がＡ６とＡ１１の間にある。動物およびヒトイン
スリンは膵臓において、プレプロインスリンの形で産生
される。ヒトプレプロインスリンは、たとえば、２４個
のアミノ酸残基を有するプレペプチドに８６個のアミノ
酸残基を有するプロインスリンが結合してなり、以下の
コンフィギュレーション：プレペプチド−Ｂ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（式中、Ｃは３１残基
からなるアミノ酸鎖である）を有する。ランゲルハンス
島からの分泌時にプレペプチドは切断除去されてプロイ
ンスリンを生じる。最後にＣ鎖が蛋白分解的に切断され
て活性ヒトインスリンが生成する。
【０００２】遺伝子操作法により、プレプロインスリン
を微生物内で発現させることが徐々に可能になってきて
いる（ＥＰ−Ａ−３４７ ７８１、ＥＰ−Ａ−３６７ １
６３）。プレプロ配列は通常、化学的におよび／または
酵素的に切断される（ＤＥ−Ｐ−３ ４４０ ９８８、Ｅ
Ｐ−Ａ−０ ２６４ ２５０）。既知の酵素的変換法は、
トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢによる切断に基
づくものである（Kemmler, W. ら：J. Biol. Chem., ２
４６：６７８６〜６７９１，１９７１；ＥＰ−Ａ−１９
５ ６９１：ＥＰ−Ｂ−８９００７）。これらの方法の
欠点は、反応溶液からの除去がかなり困難な大量の副生
成物の形成である。とくにヒトプレプロインスリンのヒ
トインスリン（ヒトインスリン、ＨＩ）への変換の場
合、大量のｄｅ−Ｔｈｒ（Ｂ３０）−ヒトインスリン
（ｄｅ−Ｔｈｒ（Ｂ３０）−ＨＩ）が形成する。この副
生成物はＨＩと、末端アミノ酸を欠く点でのみ相違し、
反応溶液からの除去がきわめて困難である。
を微生物内で発現させることが徐々に可能になってきて
いる（ＥＰ−Ａ−３４７ ７８１、ＥＰ−Ａ−３６７ １
６３）。プレプロ配列は通常、化学的におよび／または
酵素的に切断される（ＤＥ−Ｐ−３ ４４０ ９８８、Ｅ
Ｐ−Ａ−０ ２６４ ２５０）。既知の酵素的変換法は、
トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢによる切断に基
づくものである（Kemmler, W. ら：J. Biol. Chem., ２
４６：６７８６〜６７９１，１９７１；ＥＰ−Ａ−１９
５ ６９１：ＥＰ−Ｂ−８９００７）。これらの方法の
欠点は、反応溶液からの除去がかなり困難な大量の副生
成物の形成である。とくにヒトプレプロインスリンのヒ
トインスリン（ヒトインスリン、ＨＩ）への変換の場
合、大量のｄｅ−Ｔｈｒ（Ｂ３０）−ヒトインスリン
（ｄｅ−Ｔｈｒ（Ｂ３０）−ＨＩ）が形成する。この副
生成物はＨＩと、末端アミノ酸を欠く点でのみ相違し、
反応溶液からの除去がきわめて困難である。
【０００３】この副生物の形成を減少させるため、切断
混合物にある種の重金属、とくにニッケルを添加するこ
とができる（ＥＰ−Ａ ０２６４ ２５０）。この方法で
の反応の実施は、流出液に多量の重金属が負荷されるの
で、工業的観点から望ましいものではない。したがっ
て、最高の特異性と環境への適合性のあるプレプロイン
スリンの変換が求められている。
混合物にある種の重金属、とくにニッケルを添加するこ
とができる（ＥＰ−Ａ ０２６４ ２５０）。この方法で
の反応の実施は、流出液に多量の重金属が負荷されるの
で、工業的観点から望ましいものではない。したがっ
て、最高の特異性と環境への適合性のあるプレプロイン
スリンの変換が求められている。
【０００４】クロストリパイン（クロストリオペプチダ
ーゼＢ；ＥＣ ３．４．２２．８）は Clostridium hist
olyticum の培養濾液からの酵素で、分子量約３０,００
０〜８０,０００、蛋白分解活性とアミダーゼ／エステ
ラーゼ活性の両者を有する（Mitchell, W.M., Harringt
on, W.F.J.；J. Biol. Chem., ２４３（１８）：４６８
３〜４６９２，１９６８）。これはＡｒｇ−Ｃ結合に対
する高い特異性が特徴である。すなわち、インスリンの
単離されたＢ鎖においては、クロストリパインはＡｒｇ
−Ｇｌｙ結合をＬｙｓ−Ａｌａ結合の場合の５００倍以
上の速度で切断し、またグルカゴンにおいてはそのＡｒ
ｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＡｌａおよびＬｙｓ−Ｔｙｒのみ
が切断される。これらの３つの結合の加水分解の相対的
初期速度は１.１／７および１／３００である（Laboues
se, B.：Bull. Soc. Chim. Biol., ４２：１２９３，１
９６０）。驚くべきことに、クロストリパインはプレプ
ロインスリンにおけるアルギニンの後のＣ末端の特異的
切断をもたらし、Ｂ鎖に存在するアルギニン（Ｂ２２）
の後のアミノ酸の切断は無視できる程度であることを発
見し、本発明は完成された。
ーゼＢ；ＥＣ ３．４．２２．８）は Clostridium hist
olyticum の培養濾液からの酵素で、分子量約３０,００
０〜８０,０００、蛋白分解活性とアミダーゼ／エステ
ラーゼ活性の両者を有する（Mitchell, W.M., Harringt
on, W.F.J.；J. Biol. Chem., ２４３（１８）：４６８
３〜４６９２，１９６８）。これはＡｒｇ−Ｃ結合に対
する高い特異性が特徴である。すなわち、インスリンの
単離されたＢ鎖においては、クロストリパインはＡｒｇ
−Ｇｌｙ結合をＬｙｓ−Ａｌａ結合の場合の５００倍以
上の速度で切断し、またグルカゴンにおいてはそのＡｒ
ｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＡｌａおよびＬｙｓ−Ｔｙｒのみ
が切断される。これらの３つの結合の加水分解の相対的
初期速度は１.１／７および１／３００である（Laboues
se, B.：Bull. Soc. Chim. Biol., ４２：１２９３，１
９６０）。驚くべきことに、クロストリパインはプレプ
ロインスリンにおけるアルギニンの後のＣ末端の特異的
切断をもたらし、Ｂ鎖に存在するアルギニン（Ｂ２２）
の後のアミノ酸の切断は無視できる程度であることを発
見し、本発明は完成された。
【０００５】したがって、本発明は、式Ｉ
【化２】 （式中、Ｒ1はｎ個のアミノ酸で、ｎは０または１の整
数であり、Ｒ2は水素、化学的もしくは酵素的に切断除
去できるアミノ酸、または２〜３０個のアミノ酸残基を
有するペプチドであり、Ｒ3はヒドロキシル基、アミノ
酸または２〜１０個のアミノ酸を有するペプチドであ
り、ＸはＬ−アルギニンまたは２〜４５個のアミノ酸を
有しＣ末端およびＮ末端にＬ−アルギニン残基をもつペ
プチドであり、Ｙは遺伝子でコードできるアミノ酸であ
り、Ｚは遺伝子でコードできるアミノ酸であり、Ａ１〜
Ａ２０またはＢ２〜Ｂ２９は、天然のまたは１個もしく
は２個以上のアミノ酸残基を置換して修飾したヒトもし
くは動物インスリンのアミノ酸配列である）のプレプロ
インスリンのアミノ酸鎖を加水分解する方法において、
プレプロインスリンをクロストリパインの存在下に加水
分解し、必要に応じてカルボキシペプチダーゼＢにより
相当するインスリンに変換する方法に関する。
数であり、Ｒ2は水素、化学的もしくは酵素的に切断除
去できるアミノ酸、または２〜３０個のアミノ酸残基を
有するペプチドであり、Ｒ3はヒドロキシル基、アミノ
酸または２〜１０個のアミノ酸を有するペプチドであ
り、ＸはＬ−アルギニンまたは２〜４５個のアミノ酸を
有しＣ末端およびＮ末端にＬ−アルギニン残基をもつペ
プチドであり、Ｙは遺伝子でコードできるアミノ酸であ
り、Ｚは遺伝子でコードできるアミノ酸であり、Ａ１〜
Ａ２０またはＢ２〜Ｂ２９は、天然のまたは１個もしく
は２個以上のアミノ酸残基を置換して修飾したヒトもし
くは動物インスリンのアミノ酸配列である）のプレプロ
インスリンのアミノ酸鎖を加水分解する方法において、
プレプロインスリンをクロストリパインの存在下に加水
分解し、必要に応じてカルボキシペプチダーゼＢにより
相当するインスリンに変換する方法に関する。
【０００６】ペプチドおよび蛋白質のアミノ酸配列は、
そのアミノ酸鎖のＮ末端から指示される。プロテアーゼ
はペプチドおよび蛋白質のアミノ酸の間のペプチド結合
を加水分解する。クロストリパインはＬ−アルギニン含
有ペプチドまたは蛋白質をアルギニンの後で特異的に加
水分解する。プレプロインスリンに対するこの加水分解
で形成される生成物はＣ末端アルギニン残基を有するイ
ンスリン誘導体もしくはポリペプチド、またはアミノ酸
である。
そのアミノ酸鎖のＮ末端から指示される。プロテアーゼ
はペプチドおよび蛋白質のアミノ酸の間のペプチド結合
を加水分解する。クロストリパインはＬ−アルギニン含
有ペプチドまたは蛋白質をアルギニンの後で特異的に加
水分解する。プレプロインスリンに対するこの加水分解
で形成される生成物はＣ末端アルギニン残基を有するイ
ンスリン誘導体もしくはポリペプチド、またはアミノ酸
である。
【０００７】天然アミノ酸の語が意味する例は、Ｇｌ
ｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌ
ｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅ
ｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、Ｔｒｐ、Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、Ｏｒｎ、ＣｉｔまたはＨｉｓであ
る。
ｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌ
ｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅ
ｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、Ｔｒｐ、Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、Ｏｒｎ、ＣｉｔまたはＨｉｓであ
る。
【０００８】遺伝子でコードできるアミノ酸の語に含ま
れる例は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃ
ｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈ
ｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏまたはセレノシステインである。
れる例は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃ
ｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈ
ｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏまたはセレノシステインである。
【０００９】式Ｉの好ましいプレプロインスリンは、式
中、Ｒ1はＰｈｅであり、Ｒ2は水素、天然アミノ酸また
は２〜３０個の天然アミノ酸を有し末端にＣ末端Ｌ−ア
ルギニンをもつペプチドであり、Ｒ3はヒドロキシル
基、天然アミノ酸または２〜１０個の天然アミノ酸をも
つペプチドであり、ＸはＬ−アルギニンまたはヒトもし
くは動物のプロインスリンのＣ鎖であり、ＹはＴｈｒ、
ＡｌａまたはＳｅｒからなる群よりのアミノ酸であり、
ＺはＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅ
ｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＭｅｔからなる群よりのアミ
ノ酸であり、Ａ１〜Ａ２０またはＢ２〜Ｂ２９はヒトま
たは動物のインスリンアミノ酸配列のプレプロインスリ
ンである。
中、Ｒ1はＰｈｅであり、Ｒ2は水素、天然アミノ酸また
は２〜３０個の天然アミノ酸を有し末端にＣ末端Ｌ−ア
ルギニンをもつペプチドであり、Ｒ3はヒドロキシル
基、天然アミノ酸または２〜１０個の天然アミノ酸をも
つペプチドであり、ＸはＬ−アルギニンまたはヒトもし
くは動物のプロインスリンのＣ鎖であり、ＹはＴｈｒ、
ＡｌａまたはＳｅｒからなる群よりのアミノ酸であり、
ＺはＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅ
ｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＭｅｔからなる群よりのアミ
ノ酸であり、Ａ１〜Ａ２０またはＢ２〜Ｂ２９はヒトま
たは動物のインスリンアミノ酸配列のプレプロインスリ
ンである。
【００１０】式Ｉのとくに好ましいプレプロインスリン
は、式中、Ｒ1はＰｈｅであり、Ｒ2は水素または２〜３
０個の天然アミノ酸を有し末端にＣ末端Ｌ−アルギニン
をもつペプチドであり、Ｒ3はヒドロキシル基、天然ア
ミノ酸または２〜１０個の天然アミノ酸をもつペプチド
であり、ＸはＬ−アルギニンまたはヒト、ブタもしくは
ウシのプロインスリンのＣ鎖であり、ＹはＴｈｒであ
り、ＺはＡｓｎであり、Ａ１〜Ａ２０またはＢ２〜Ｂ２
９はヒト、ブタまたはウシのインスリンのアミノ酸配列
のプレプロインスリンである。
は、式中、Ｒ1はＰｈｅであり、Ｒ2は水素または２〜３
０個の天然アミノ酸を有し末端にＣ末端Ｌ−アルギニン
をもつペプチドであり、Ｒ3はヒドロキシル基、天然ア
ミノ酸または２〜１０個の天然アミノ酸をもつペプチド
であり、ＸはＬ−アルギニンまたはヒト、ブタもしくは
ウシのプロインスリンのＣ鎖であり、ＹはＴｈｒであ
り、ＺはＡｓｎであり、Ａ１〜Ａ２０またはＢ２〜Ｂ２
９はヒト、ブタまたはウシのインスリンのアミノ酸配列
のプレプロインスリンである。
【００１１】とくに好ましいインスリンは、すでにドイ
ツ特許出願Ｐ３９ １９ ８５２およびＰ４０ １２ ８１
８.０に提案されているインスリンである。たとえば、
以下のアミノ酸配列： NH2-Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn-COOH をもつＩｎｓｕＡｒｇである。
ツ特許出願Ｐ３９ １９ ８５２およびＰ４０ １２ ８１
８.０に提案されているインスリンである。たとえば、
以下のアミノ酸配列： NH2-Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn-COOH をもつＩｎｓｕＡｒｇである。
【００１２】クロストリパイン（ＥＣ ３．４．２２．
８）はクロストリジウム属（Clostridium）からの細胞
外チオールプロテアーゼである。この酵素はヘテロダイ
マーで、他の既知のチオールプロテアーゼの何れともホ
モロジーを示さない。この酵素はＡｒｇ−ＸＸＸ結合、
特にＡｒｇ−Ｐｒｏに対してきわめて高い特異性を有す
る。その特性は、分子量３０,０００〜８０,０００、等
電点ｐＨ４.８〜４.９である。アクティベーターの例に
はシステイン、メルカプトエタノール、ジチオスレイト
ールまたはカルシウムイオンがある。
８）はクロストリジウム属（Clostridium）からの細胞
外チオールプロテアーゼである。この酵素はヘテロダイ
マーで、他の既知のチオールプロテアーゼの何れともホ
モロジーを示さない。この酵素はＡｒｇ−ＸＸＸ結合、
特にＡｒｇ−Ｐｒｏに対してきわめて高い特異性を有す
る。その特性は、分子量３０,０００〜８０,０００、等
電点ｐＨ４.８〜４.９である。アクティベーターの例に
はシステイン、メルカプトエタノール、ジチオスレイト
ールまたはカルシウムイオンがある。
【００１３】クロストリパインは、たとえば、トシル−
Ｌ−リジン、クロロメチルケトン、過酸化水素、ＥＤＴ
Ａ、Ｃｏ2+、Ｃｕ2+もしくはＣｄ2+イオンまたはクエン
酸塩の存在下に阻害される。
Ｌ−リジン、クロロメチルケトン、過酸化水素、ＥＤＴ
Ａ、Ｃｏ2+、Ｃｕ2+もしくはＣｄ2+イオンまたはクエン
酸塩の存在下に阻害される。
【００１４】クロストリパインは微生物を用いる発酵に
よって製造される。この方法ではクロストリジウムを栄
養培地中にクロストリパインが蓄積するまで培養する。
適当な例としては、Clostridium histolyticum、とくに
Clostridium histolyticumＤＳＭ ６２７がある。この
微生物の突然変異株および変異株も、それらがクロスト
リパインを合成する限り適当である。
よって製造される。この方法ではクロストリジウムを栄
養培地中にクロストリパインが蓄積するまで培養する。
適当な例としては、Clostridium histolyticum、とくに
Clostridium histolyticumＤＳＭ ６２７がある。この
微生物の突然変異株および変異株も、それらがクロスト
リパインを合成する限り適当である。
【００１５】培養は嫌気的に、単一培養または混合培養
で、たとえば、酵素の不存在下にまたは必要に応じて窒
素、不活性気体または他の酵素以外の気体を導入しファ
ーメンター中で、非撹拌下の深部培養で行われる。発酵
は約１０〜４５℃、好ましくは約２５〜４０℃、とくに
３０〜３８℃の範囲の温度で行われる。発酵はｐＨ５〜
８.５、好ましくは５.５〜８の範囲で起こる。これらの
条件下では、一般的に培養ブロスは１〜３日後に検知可
能な酵素の蓄積を示すようになる。クロストリパインの
合成は後対数期に始まり、成長の静止期にその最高に到
達する。酵素の産生は活性検定（Mitchell, W.：Meth.
of Enzym. ４７巻，１６５〜１７０頁，１９７７）を用
いて追跡することができる。
で、たとえば、酵素の不存在下にまたは必要に応じて窒
素、不活性気体または他の酵素以外の気体を導入しファ
ーメンター中で、非撹拌下の深部培養で行われる。発酵
は約１０〜４５℃、好ましくは約２５〜４０℃、とくに
３０〜３８℃の範囲の温度で行われる。発酵はｐＨ５〜
８.５、好ましくは５.５〜８の範囲で起こる。これらの
条件下では、一般的に培養ブロスは１〜３日後に検知可
能な酵素の蓄積を示すようになる。クロストリパインの
合成は後対数期に始まり、成長の静止期にその最高に到
達する。酵素の産生は活性検定（Mitchell, W.：Meth.
of Enzym. ４７巻，１６５〜１７０頁，１９７７）を用
いて追跡することができる。
【００１６】クロストリパインの製造に用いられる栄養
溶液は０.２〜６％、好ましくは０.５〜３％の有機栄養
化合物、および無機塩を含有する。適当な有機栄養化合
物は、アミノ酸、ペプトン、同じく肉エキス、たとえば
トーモロコシ、小麦、インゲン豆、大豆もしくは綿の粉
砕種子、アルコール製造時の蒸留残留物、肉ミールまた
は酵母エキスである。栄養溶液に添加できる無機塩の例
には、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属、鉄、亜
鉛およびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン
酸塩、さらにアンモニウム塩および硝酸塩がある。
溶液は０.２〜６％、好ましくは０.５〜３％の有機栄養
化合物、および無機塩を含有する。適当な有機栄養化合
物は、アミノ酸、ペプトン、同じく肉エキス、たとえば
トーモロコシ、小麦、インゲン豆、大豆もしくは綿の粉
砕種子、アルコール製造時の蒸留残留物、肉ミールまた
は酵母エキスである。栄養溶液に添加できる無機塩の例
には、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属、鉄、亜
鉛およびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン
酸塩、さらにアンモニウム塩および硝酸塩がある。
【００１７】至適発酵条件は各微生物について異なる
が、これらの条件は本技術分野の熟練者には既知である
かまたは予備試験によって容易に確立することができ
る。クロストリパインは古典的な方法、たとえば硫酸ア
ンモニウム沈殿、イオン交換またはゲル透過クロマトグ
ラフィーによって精製できる。この酵素は慣用方法によ
ってカップリングさせることができる（Colowick ＆ Ka
plan：Meth. Enzymol., XLIV巻）。
が、これらの条件は本技術分野の熟練者には既知である
かまたは予備試験によって容易に確立することができ
る。クロストリパインは古典的な方法、たとえば硫酸ア
ンモニウム沈殿、イオン交換またはゲル透過クロマトグ
ラフィーによって精製できる。この酵素は慣用方法によ
ってカップリングさせることができる（Colowick ＆ Ka
plan：Meth. Enzymol., XLIV巻）。
【００１８】酵素的変換には、遊離もしくは固定化型の
全細胞、および同様に担体に結合させることもできる単
離酵素生成物の両者を使用することが可能である。
全細胞、および同様に担体に結合させることもできる単
離酵素生成物の両者を使用することが可能である。
【００１９】式Ｉのプレプロインスリンのクロストリパ
インによる切断は水性メジウム中で行われるが、これに
は水混和性の有機構成分たとえばアルコール、ケトン、
尿素またはジメチルホルムアミドを混合してもよい。と
くに、反応時のｐＨのコントロールを改善するため、反
応混合物に適当な無機または有機緩衝剤たとえばリン酸
塩、トリス、グリシンＨＥＰＥＳ等を加えることもでき
る。切断時のプレプロインスリンの濃度は、たとえば
０.０１mg／ml〜１００mg／ml、好ましくは０.１mg／ml
〜１０mg／mlとする。プレプロインスリンとクロストリ
パインの割合は〔mg対単位（Ｕ）〕１：０.０１〜１：
１,０００、好ましくは１：０.１〜１：５０とする。
インによる切断は水性メジウム中で行われるが、これに
は水混和性の有機構成分たとえばアルコール、ケトン、
尿素またはジメチルホルムアミドを混合してもよい。と
くに、反応時のｐＨのコントロールを改善するため、反
応混合物に適当な無機または有機緩衝剤たとえばリン酸
塩、トリス、グリシンＨＥＰＥＳ等を加えることもでき
る。切断時のプレプロインスリンの濃度は、たとえば
０.０１mg／ml〜１００mg／ml、好ましくは０.１mg／ml
〜１０mg／mlとする。プレプロインスリンとクロストリ
パインの割合は〔mg対単位（Ｕ）〕１：０.０１〜１：
１,０００、好ましくは１：０.１〜１：５０とする。
【００２０】反応の温度も同じく、広範囲内を変動させ
ることができる。好ましい温度範囲は０℃〜＋８０℃で
あり、＋２０℃〜＋４０℃の温度がとくに好ましい。
ることができる。好ましい温度範囲は０℃〜＋８０℃で
あり、＋２０℃〜＋４０℃の温度がとくに好ましい。
【００２１】反応のｐＨはｐＨ４〜ｐＨ１２の間を変動
させることができ、ｐＨ６〜ｐＨ９の範囲がとくに好ま
しい。
させることができ、ｐＨ６〜ｐＨ９の範囲がとくに好ま
しい。
【００２２】プレプロインスリンを相当する中間体に変
換するのに要する時間は、反応条件によって広い限界内
を変動させることができる。たとえばそれは１５分〜４
８時間であるが、１時間〜６時間の反応時間が好まし
い。
換するのに要する時間は、反応条件によって広い限界内
を変動させることができる。たとえばそれは１５分〜４
８時間であるが、１時間〜６時間の反応時間が好まし
い。
【００２３】酵素は使用前に、適当な様式でメルカプタ
ンの存在下に活性化される。この目的に適当なメルカプ
タンは、原理的にはＳＨ基を含むすべての化合物である
が、ＤＴＴ、ＤＴＥ、メルカプトエタノール、チオグリ
コール酸またはシステインの使用が好ましい。メルカプ
タンの濃度は広い範囲内で変動させることができるが、
０.１mM〜１００mMの濃度が好ましい。活性化緩衝液に
はまた、Ｃａ2+イオン、好ましくはＣａＣｌ2を含有さ
せる。活性化はｐＨ４〜ｐＨ１２、好ましくはｐＨ６〜
ｐＨ８で行われ、ｐＨ７〜ｐＨ８の範囲がとくに好まし
い。適当な緩衝物質はたとえば、トリス、ＨＥＰＥＳ、
グリシン等であり、ｐＨの維持のために添加することが
できる。活性化温度は０℃〜６０℃とすることができ
る。０℃〜１０℃の範囲が好ましく、０℃〜５℃がとく
に好ましい。この方法で活性化された酵素はそのまま使
用してもよく、また適宜、UltrogelR ＡｃＡ ２０２上
クロマトグラフィーにより活性化緩衝剤を除去して使用
してもよい。
ンの存在下に活性化される。この目的に適当なメルカプ
タンは、原理的にはＳＨ基を含むすべての化合物である
が、ＤＴＴ、ＤＴＥ、メルカプトエタノール、チオグリ
コール酸またはシステインの使用が好ましい。メルカプ
タンの濃度は広い範囲内で変動させることができるが、
０.１mM〜１００mMの濃度が好ましい。活性化緩衝液に
はまた、Ｃａ2+イオン、好ましくはＣａＣｌ2を含有さ
せる。活性化はｐＨ４〜ｐＨ１２、好ましくはｐＨ６〜
ｐＨ８で行われ、ｐＨ７〜ｐＨ８の範囲がとくに好まし
い。適当な緩衝物質はたとえば、トリス、ＨＥＰＥＳ、
グリシン等であり、ｐＨの維持のために添加することが
できる。活性化温度は０℃〜６０℃とすることができ
る。０℃〜１０℃の範囲が好ましく、０℃〜５℃がとく
に好ましい。この方法で活性化された酵素はそのまま使
用してもよく、また適宜、UltrogelR ＡｃＡ ２０２上
クロマトグラフィーにより活性化緩衝剤を除去して使用
してもよい。
【００２４】式Ｉのプレプロインスリンの本発明による
切断では、インスリンのＣ末端にアルギニン残基をもつ
インスリン誘導体と、切断された相当するアミノ酸およ
び／またはプレペプチドを生成する。このインスリン誘
導体は、所望により、カルボキシペプチダーゼＢで相当
するインスリンに変換できる。これは、クロストリパイ
ンと同時に同一の反応混合物中で行うこともまた上述の
反応条件下に引き続いて行うこともできるが、この場
合、所望により、カルボキシペプチダーゼＢ処理の前
に、それ自体公知の方法で、たとえばクロマトグラフィ
ーもしくは結晶化を用いて、インスリン誘導体を単離す
ることもできる。カルボキシペプチダーゼＢは溶解させ
た型または固定化した型で使用できる。カルボキシペプ
チダーゼＢとインスリン誘導体の割合（重量対重量）
は、約１：１０〜１：５,０００、好ましくは約１：５
００〜１：３,５００、とくに好ましくは約１：１,００
０〜１：３,０００である。
切断では、インスリンのＣ末端にアルギニン残基をもつ
インスリン誘導体と、切断された相当するアミノ酸およ
び／またはプレペプチドを生成する。このインスリン誘
導体は、所望により、カルボキシペプチダーゼＢで相当
するインスリンに変換できる。これは、クロストリパイ
ンと同時に同一の反応混合物中で行うこともまた上述の
反応条件下に引き続いて行うこともできるが、この場
合、所望により、カルボキシペプチダーゼＢ処理の前
に、それ自体公知の方法で、たとえばクロマトグラフィ
ーもしくは結晶化を用いて、インスリン誘導体を単離す
ることもできる。カルボキシペプチダーゼＢは溶解させ
た型または固定化した型で使用できる。カルボキシペプ
チダーゼＢとインスリン誘導体の割合（重量対重量）
は、約１：１０〜１：５,０００、好ましくは約１：５
００〜１：３,５００、とくに好ましくは約１：１,００
０〜１：３,０００である。
【００２５】カルボキシペプチダーゼＢとクロストリパ
インの割合（重量対重量）は約１：１〜１０：１、好ま
しくは２：１〜５：１である。
インの割合（重量対重量）は約１：１〜１０：１、好ま
しくは２：１〜５：１である。
【００２６】クロストリパインおよび／またはカルボキ
シペプチダーゼＢ切断の反応生成物は、たとえば、ｐＨ
の低下による沈殿析出および／または既知方法のカラム
クロマトグラフィーを用いる精製に付すことができる。
得られたインスリンは、慣用の表示に処方化して、糖尿
病治療用の医薬として使用できる。
シペプチダーゼＢ切断の反応生成物は、たとえば、ｐＨ
の低下による沈殿析出および／または既知方法のカラム
クロマトグラフィーを用いる精製に付すことができる。
得られたインスリンは、慣用の表示に処方化して、糖尿
病治療用の医薬として使用できる。
【００２７】本発明の方法を以下の実施例により詳細に
記述する。特に指示のない限り、百分率のデータは重量
に関するものである。
記述する。特に指示のない限り、百分率のデータは重量
に関するものである。
【００２８】実施例１Clostridium histolyticum ＤＳＭ ６２７を以下の組成
の栄養溶液中で培養する。 カゼインペプトン ３％ 肉エキス ３％ 酵母エキス ０.５％ システイン ０.０５％ ＫＨ2ＰＯ4 ０.１５％ ｐＨ７.２
の栄養溶液中で培養する。 カゼインペプトン ３％ 肉エキス ３％ 酵母エキス ０.５％ システイン ０.０５％ ＫＨ2ＰＯ4 ０.１５％ ｐＨ７.２
【００２９】前培養の１％接種を行う。培養は、密閉瓶
中嫌気的条件下、３７℃で約２日間行う。微生物株は５
０％グリセロールを含有する上述の栄養溶液中に−２０
℃で維持する。発酵槽を１％前培養で接種する。容量１
０ｌで栄養溶液８ｌを加えた発酵槽に接種を行う。培養
は、窒素を通じながら、３３℃で一定のｐＨ７.０にお
いて２４時間実施する。培養濾液中の酵素活性を測定す
ると、２０,０００ Ｕ／ｌであった（Mitchell, W.：Me
th. of Enzym., ４７巻，１６５〜１７０頁，１９７
７）。
中嫌気的条件下、３７℃で約２日間行う。微生物株は５
０％グリセロールを含有する上述の栄養溶液中に−２０
℃で維持する。発酵槽を１％前培養で接種する。容量１
０ｌで栄養溶液８ｌを加えた発酵槽に接種を行う。培養
は、窒素を通じながら、３３℃で一定のｐＨ７.０にお
いて２４時間実施する。培養濾液中の酵素活性を測定す
ると、２０,０００ Ｕ／ｌであった（Mitchell, W.：Me
th. of Enzym., ４７巻，１６５〜１７０頁，１９７
７）。
【００３０】後処理は、約６,０００ｇでの遠心分離に
よる細胞の除去、孔径０.２２μｍのフィルターを通し
た濾過による滅菌、ついで濾液への６０％氷冷（−２０
℃）メタノールの添加によって行った。次に溶液を−２
０℃に２４時間保持し、ついで遠心分離した（８,００
０ｇ）。ペレットを滅菌二重蒸留水に溶解し、遠心分離
した（１２,０００ｇ）。ペレット中の酵素活性の測定
値は３００ Ｕ／ml、２００ Ｕ／mg蛋白質であった。収
率は発酵槽中の活性の測定値の７５％であった。
よる細胞の除去、孔径０.２２μｍのフィルターを通し
た濾過による滅菌、ついで濾液への６０％氷冷（−２０
℃）メタノールの添加によって行った。次に溶液を−２
０℃に２４時間保持し、ついで遠心分離した（８,００
０ｇ）。ペレットを滅菌二重蒸留水に溶解し、遠心分離
した（１２,０００ｇ）。ペレット中の酵素活性の測定
値は３００ Ｕ／ml、２００ Ｕ／mg蛋白質であった。収
率は発酵槽中の活性の測定値の７５％であった。
【００３１】実施例２ 細胞は例１の場合と同様に培養した。発酵槽中の製造培
地は次の通りとし、 プロテアーゼペプトン（Difco） ５％ システイン ０.０５％ Ｋ2ＨＰＯ4 ０.１５％ ｐＨ７.２ ２％前培養で接種した。培養濾液中のクロストリパイン
活性は４５,０００ Ｕ／mlであった。
地は次の通りとし、 プロテアーゼペプトン（Difco） ５％ システイン ０.０５％ Ｋ2ＨＰＯ4 ０.１５％ ｐＨ７.２ ２％前培養で接種した。培養濾液中のクロストリパイン
活性は４５,０００ Ｕ／mlであった。
【００３２】後処理は、細胞を除去するための０.３μ
ｍ膜（Filtron，オメガ膜）接線流濾過、および溶解し
たクロストリパインを濃縮するための１０KD膜（Filtro
n，オメガ膜）接線流濾過によって実施した。濃縮ファ
クターは２０とした。濃縮液を次に脱塩し、ＤＥＡＥ−
セルロース上クロマトグラフィーに付した。クロストリ
パイン活性１,０００ Ｕ／ml；収率８５％。酵素プレパ
レーションは使用時まで−２０℃に保存した。
ｍ膜（Filtron，オメガ膜）接線流濾過、および溶解し
たクロストリパインを濃縮するための１０KD膜（Filtro
n，オメガ膜）接線流濾過によって実施した。濃縮ファ
クターは２０とした。濃縮液を次に脱塩し、ＤＥＡＥ−
セルロース上クロマトグラフィーに付した。クロストリ
パイン活性１,０００ Ｕ／ml；収率８５％。酵素プレパ
レーションは使用時まで−２０℃に保存した。
【００３３】実施例３ Ａ． クロストリパインの活性化 酵素プレパレーション５０μｌ(２００ Ｕ／ml，２８６
Ｕ／mg，実施例１より） 活性化緩衝液１μｌ（２５０mM ＤＴＴ，１２５mM Ｃａ
Ｃｌ2） ─混合物中含量 ＤＴＴ ５mM ＣａＣｌ2 ２.５mM ─氷上で２時間インキュベーション ─切断反応用には酵素を２５mM トリス／ＨＣｌ緩衝液
ｐＨ７.８で１：４０に希釈する。
Ｕ／mg，実施例１より） 活性化緩衝液１μｌ（２５０mM ＤＴＴ，１２５mM Ｃａ
Ｃｌ2） ─混合物中含量 ＤＴＴ ５mM ＣａＣｌ2 ２.５mM ─氷上で２時間インキュベーション ─切断反応用には酵素を２５mM トリス／ＨＣｌ緩衝液
ｐＨ７.８で１：４０に希釈する。
【００３４】Ｂ． （Ｂ３１）Ａｒｇ−インスリンを遊
離させるためのクロストリパイン切断混合物 １００μｌ ＩｎｓｕＡｒｇ（１mg／ml） ２０μｌ ＫＣｌ（１Ｍ） ５μｌ トリス／ＨＣｌ（１Ｍ，ｐＨ７.８） ５５μｌ 水 ２０μｌ クロストリパイン（１：４０希釈） ─混合物中含量 ＩｎｓｕＡｒｇ ０.５mg／ml クロストリパイン ２.５ Ｕ／ml ＤＴＴ １２.５μＭ トリス／ＨＣｌ ２５mM ＫＣｌ １００mM ＣａＣｌ2 ６μＭ ─２８℃で１〜２時間インキュベーション、反応はＨＰ
ＬＣによって容易にチェックできる。ついで反応はトシ
ル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）で停止
させる。 ─１μｌのＴＬＣＫ（１５mM）の添加により反応を停
止。 ─４℃で保存 ─結果：ヒトインスリン−Ａｒｇ。ＨＰＬＣで検出可能
なヒトインスリン（ｄｅ Ｂ３０）は形成しない。
離させるためのクロストリパイン切断混合物 １００μｌ ＩｎｓｕＡｒｇ（１mg／ml） ２０μｌ ＫＣｌ（１Ｍ） ５μｌ トリス／ＨＣｌ（１Ｍ，ｐＨ７.８） ５５μｌ 水 ２０μｌ クロストリパイン（１：４０希釈） ─混合物中含量 ＩｎｓｕＡｒｇ ０.５mg／ml クロストリパイン ２.５ Ｕ／ml ＤＴＴ １２.５μＭ トリス／ＨＣｌ ２５mM ＫＣｌ １００mM ＣａＣｌ2 ６μＭ ─２８℃で１〜２時間インキュベーション、反応はＨＰ
ＬＣによって容易にチェックできる。ついで反応はトシ
ル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）で停止
させる。 ─１μｌのＴＬＣＫ（１５mM）の添加により反応を停
止。 ─４℃で保存 ─結果：ヒトインスリン−Ａｒｇ。ＨＰＬＣで検出可能
なヒトインスリン（ｄｅ Ｂ３０）は形成しない。
【００３５】Ｃ． ヒトインスリン遊離のためのカルボ
キシペプチダーゼＢ切断混合物 クロストリパイン切断混合物２００μｌ カルボキシペプチダーゼＢ（１：１００希釈）１０μｌ ─混合物中のカルボキシペプチダーゼ含量：２.５μｇ
／ml ─２８℃で２〜４時間インキュベーション、反応はＨＰ
ＬＣで容易にチェックできる。 ─反応のためには、カルボキシペプチダーゼＢ（７５９
Ｕ／ml，１５０ Ｕ／mg，ブタ膵臓より）は２５mM ト
リス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７.８で１：１,０００に希釈す
る。 ─結果：ヒトインスリン。ＨＰＬＣで検出可能なインス
リン（ｄｅ Ｂ３０）は形成しない。
キシペプチダーゼＢ切断混合物 クロストリパイン切断混合物２００μｌ カルボキシペプチダーゼＢ（１：１００希釈）１０μｌ ─混合物中のカルボキシペプチダーゼ含量：２.５μｇ
／ml ─２８℃で２〜４時間インキュベーション、反応はＨＰ
ＬＣで容易にチェックできる。 ─反応のためには、カルボキシペプチダーゼＢ（７５９
Ｕ／ml，１５０ Ｕ／mg，ブタ膵臓より）は２５mM ト
リス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７.８で１：１,０００に希釈す
る。 ─結果：ヒトインスリン。ＨＰＬＣで検出可能なインス
リン（ｄｅ Ｂ３０）は形成しない。
【００３６】Ｄ． ＨＰＬＣ分析 切断はＲＰ １８カラム（０.１２５Ｍ ＮＨ4(ＳＯ4)2，
Ｈ2ＳＯ4でｐＨ４に調整、２５〜５０％アセトニトリル
勾配）またはＣ８カラム（０.１％ＴＦＡ，２０％〜５
０％アセトニトリル勾配）を用いてチェックした。
Ｈ2ＳＯ4でｐＨ４に調整、２５〜５０％アセトニトリル
勾配）またはＣ８カラム（０.１％ＴＦＡ，２０％〜５
０％アセトニトリル勾配）を用いてチェックした。
【００３７】実施例４ クロストリパイン：２００ Ｕ／ml（実施例１より） 活性化緩衝液：５００mM トリス／ＨＣｌ，ｐＨ７.８ １００mM ＤＴＴ ２５mM ＣａＣｌ2 活性化：クロストリパイン溶液 １００μｌ 活性化緩衝液 １０μｌ フォールディング混合物： ヒトプレ−Ｂ鎖−Ａ鎖インスリンＳ−スルホネート３
５.７mg １Ｍメルカプトエタノール３１５μｌ １Ｍアスコルビン酸１０５μｌ ２０mMグリシン緩衝液ｐＨ１０.７，１００μｌ フォールディングは冷室中４℃で一夜行い、フォールデ
ィング収量は０.１５２mg／mlであった。ｐＨ５.０にお
けるｐＨ沈殿によって不純物を除去したのち、トリスを
最終濃度５０mMになるように添加し、ｐＨをＨＣｌで
７.８に調整した。酵素溶液３０μｌを加えた。切断は
３０℃で行い、ＨＰＬＣで追跡した。 結果：上述のプレプロインスリンはヒトインスリン−Ａ
ｒｇに切断できる。インスリン（ｄｅ Ｂ３０）の形成
は微小である。
５.７mg １Ｍメルカプトエタノール３１５μｌ １Ｍアスコルビン酸１０５μｌ ２０mMグリシン緩衝液ｐＨ１０.７，１００μｌ フォールディングは冷室中４℃で一夜行い、フォールデ
ィング収量は０.１５２mg／mlであった。ｐＨ５.０にお
けるｐＨ沈殿によって不純物を除去したのち、トリスを
最終濃度５０mMになるように添加し、ｐＨをＨＣｌで
７.８に調整した。酵素溶液３０μｌを加えた。切断は
３０℃で行い、ＨＰＬＣで追跡した。 結果：上述のプレプロインスリンはヒトインスリン−Ａ
ｒｇに切断できる。インスリン（ｄｅ Ｂ３０）の形成
は微小である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リユーデイガー・マルクヴアルト ドイツ連邦共和国デー−6000フランクフ ルト・アム・マイン．ギユンタースブル クアレー69 (72)発明者 ヨハネス・マイヴエス ドイツ連邦共和国デー−6238ホフハイ ム・アム・タウヌス．マルテイン−ヴオ ーマン−シユトラ−セ27 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 1/00 - 41/00 C07K 14/00 - 14/825 C12K 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)
Claims (9)
- 【請求項１】 式Ｉ 【化１】 （式中、Ｒ1はｎ個のアミノ酸で、ｎは０または１の整
数であり、Ｒ2は水素、化学的もしくは酵素的に切断除
去できるアミノ酸、または２〜３０個のアミノ酸残基を
有するペプチドであり、Ｒ3はヒドロキシル基、アミノ
酸または２〜１０個のアミノ酸を有するペプチドであ
り、ＸはＬ−アルギニンまたは２〜４５個のアミノ酸を
有しＣ末端およびＮ末端にＬ−アルギニン残基をもつペ
プチドであり、Ｙは遺伝子でコードできるアミノ酸であ
り、Ｚは遺伝子でコードできるアミノ酸であり、Ａ１〜
Ａ２０またはＢ２〜Ｂ２９は、天然のまたは１個もしく
は２個以上のアミノ酸残基を置換して修飾したヒトもし
くは動物インスリンのアミノ酸配列である）のプレプロ
インスリンのアミノ酸鎖を加水分解する方法において、
プレプロインスリンをクロストリパインの存在下に加水
分解し、必要に応じてカルボキシペプチダーゼＢにより
相当するインスリンに変換する方法。 - 【請求項２】 式Ｉにおいて、Ｒ1はＰｈｅであり、Ｒ2
は水素、天然アミノ酸または２〜３０個の天然アミノ酸
を有し末端にＣ末端Ｌ−アルギニンをもつペプチドであ
り、Ｒ3はヒドロキシル基、天然アミノ酸または２〜１
０個の天然アミノ酸をもつペプチドであり、ＸはＬ−ア
ルギニンまたはヒトもしくは動物のプロインスリンのＣ
鎖であり、ＹはＴｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒからなる群
よりのアミノ酸であり、ＺはＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、
Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＭｅｔ
からなる群よりのアミノ酸であり、Ａ１〜Ａ２０または
Ｂ２〜Ｂ２９はヒトまたは動物のインスリンのアミノ酸
配列であるプレプロインスリンを使用する請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】 式Ｉにおいて、Ｒ1はＰｈｅであり、Ｒ2
は水素または２〜３個の天然アミノ酸を有し末端にＣ末
端Ｌ−アルギニンをもつペプチドであり、Ｒ3はヒドロ
キシル基、天然アミノ酸または２〜１０個の天然アミノ
酸をもつペプチドであり、ＸはＬ−アルギニンまたはヒ
ト、ブタもしくはウシプロインスリンのＣ鎖であり、Ｙ
はＴｈｒであり、ＺはＡｓｎであり、Ａ１〜Ａ２０また
はＢ２〜Ｂ２９はヒト、ブタまたはウシインスリンのア
ミノ酸配列であるプレプロインスリンを使用する請求項
１または２記載の方法。 - 【請求項４】 ｐＨ４〜１２、好ましくは６〜９で実施
する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 式Ｉのプレプロインスリンの濃度は０.
０１mg／ml〜１００mg／ml、好ましくは０.１mg／ml〜
１０mg／mlとする請求項１〜４のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項６】 プレプロインスリン／クロストリパイン
の比（mg対単位）は１：０.０１〜１：１,０００、好ま
しくは１：０.１〜１：５０とする請求項１〜５のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項７】 反応温度は０℃〜＋８０℃、好ましくは
＋２０℃〜＋４０℃とする請求項１〜６のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項８】 カルボキシペプチダーゼＢはクロストリ
パインと同時に存在させるかまたはクロストリパインに
よる切断後に使用する請求項１〜７のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項９】 クロストリパインおよび／またはカルボ
キシペプチダーゼＢは固定化型として存在させる請求項
１〜８のいずれかに記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4028118 | 1990-09-05 | ||
| DE40281183 | 1990-09-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04258296A JPH04258296A (ja) | 1992-09-14 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3223243A Expired - Lifetime JP3005335B2 (ja) | 1990-09-05 | 1991-09-04 | プレプロインスリンのインスリンへの酵素的変換方法 |
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|---|---|---|---|---|
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