LT3328B - Process for the preparation of insulin - Google Patents
Process for the preparation of insulin Download PDFInfo
- Publication number
- LT3328B LT3328B LTIP712A LTIP712A LT3328B LT 3328 B LT3328 B LT 3328B LT IP712 A LTIP712 A LT IP712A LT IP712 A LTIP712 A LT IP712A LT 3328 B LT3328 B LT 3328B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- amino acid
- arginine
- clostripan
- insulin
- process according
- Prior art date
Links
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 34
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 5
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 20
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 claims description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims description 10
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 7
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000001820 oxy group Chemical group [*:1]O[*:2] 0.000 claims description 6
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 claims description 5
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims 2
- 108090001092 clostripain Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 abstract 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 8
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- RDFCSSHDJSZMTQ-ZDUSSCGKSA-N Tos-Lys-CH2Cl Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)CCl)C=C1 RDFCSSHDJSZMTQ-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 3
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 3
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Natural products OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 101710097834 Thiol protease Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- TYQCGQRIZGCHNB-JLAZNSOCSA-N l-ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(O)=C(O)C1=O TYQCGQRIZGCHNB-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002897 organic nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BMLMGCPTLHPWPY-REOHCLBHSA-N (4R)-2-oxo-4-thiazolidinecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CSC(=O)N1 BMLMGCPTLHPWPY-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N Arg-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OGMDXNFGPOPZTK-GUBZILKMSA-N Asn-Glu-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OGMDXNFGPOPZTK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BWJZSLQJNBSUPM-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BWJZSLQJNBSUPM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N Cys-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N Cys-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical class S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- XMVLTPMCUJTJQP-FXQIFTODSA-N Glu-Gln-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N XMVLTPMCUJTJQP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000193159 Hathewaya histolytica Species 0.000 description 1
- DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N Ile-Cys-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N Leu-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 108010047562 NGR peptide Proteins 0.000 description 1
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N Ser-Asn-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UFKPDBLKLOBMRH-XHNCKOQMSA-N Ser-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O UFKPDBLKLOBMRH-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N Ser-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- TWAVEIJGFCBWCG-JYJNAYRXSA-N Tyr-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N TWAVEIJGFCBWCG-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Insulinas susideda iš dviejų polipeptidinių grandinių: A grandinės, kuri sudaryta iš 21 aminorūgšties liekanos, ir B grandinės, kuri sudaryta iš 30 aminorūgščių liekanų. A ir B grandinės sujungtos tarpusavyje dviem disulfidiniais tilteliais - cisteino liekanos A7 ir B7 padėtyse, bei A20 ir BĮ9 padėtyse sujungtos viena su kita. Trečias disulfidinis tiltelis yra tarp A6 ir Ali. Gyvulių ir žmogaus insulinai susidaro kasoje preproinsulinų formoje. Pavyzdžiui, žmogaus preproinsulinas susideda iš 24 aminorūgščių liekanas turinčio prepeptido, prie kurio prisijungia proinsulinas, turintis 86 aminorūgščių liekanas. Jo struktūra yra:
Prepeptidas-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A, kur C yra grandinė, susidedanti iš 31 aminorūgšties liekanos. Išskiriant iš kasos salelių (Langergenso salelių), prepeptidas atskyla ir susidaro proinsulinas. Galų gale proteolitiškai suskyla C grandinė ir susidaro veiklus žmogaus insulinas.
Genų technologijos metodai vis didėjančiais kiekiais leidžia pagaminti preproinsulinus mikroorganizmuose (EP Nr. A 347781, EP Nr. A 367163). Presekos skaldymas, kaip taisyklė, atliekamas chemiškai ir/arba fermentiniu būdu (DE Nr. P-3440988, EP Nr. A024250) . Žinomi fermentiniai metodai yra paremti skaldymu, veikiant tripsinui ir karboksipeptidazei B (Kemmler W ir kt.). Biol. Chem. 24, 678-791 (1971), EP Nr. A 95691, EP Nr. B 89007) . Šių metodų trūkumas yra tas, kad susidaro dideli pašalinių produktų kiekiai, kuriuos labai sunku atskirti iš reakcijos tirpalo. Ypatingai paverčiant žmogaus preproinsuliną į žmogaus insuliną (Humaninsulin, HI), gaunamas didelis kiekis Des-Thr (B30) - žmogaus insulino (Des-Thr (B30)-HI). Šis pašalinis produktas nuo HI skiriasi tik tuo, kad HI nėra galinės aminorūgsties, ir jis labai sunkiai atskiriamas iš reakcijos tirpalo.
Norint sumažinti šio pašalinio produkto susidarymą, gali būti pridedama tam tikrų sunkiųjų metalų, kaip skaldymo priedų, būtent nikelio (EP Nr. A 0264250). Tačiau tokia reakcijos eiga stambiatonažinės gamybos požiūriu yra nepageidautina, nes labai užteršiami sunkiaisiais metalais nutekamieji vandenys. Todėl reikia sukurti specifinį ir ekologiškai tinkamą preproinsulino skaldymo metodą.
Klostripanas (klostriopeptidazė B, EC 3.4.22.8) fermentas, išskiriamas iš Clostridium histolyticum kultūros terpės, kurio molekulinis svoris yra apytikriai nuo 30 000 iki 80 000, pasižymi tiek proteolitiniu, tiek ir amidaz-esteraziniu aktyvumu (Mitchell, W.M., Harringtom, W.F., J. Biol. Chem., 243 (18), 4688-4692 (1968)).
Jis išsiskiria dideliu specifiškumu Arg-Gly jungčių atžvilgiu. Pavyzdžiui, izoliuotos insulino B grandinės Arg-Gly jungtį klostripanas skaldo 500 kartų greičiau, negu Lys-Ala jungtį, o gliukagone skaldomos tik ArgArg, Arg-Ala ir Lys-Tyr jungtys. Šių jungčių hidrolizės greičių santykiai yra 1/7 ir 1/300 (Labouesse, b., Bull. Soc. Chim. Biol., 42, 1293 (1960)).
Netikėtai buvo rasta, kad klostripanas specifiškai skaldo preproinsuliną nuo C-galo už arginino, o aminorūgščių grandinės, esančios už arginino (B22), esančio B-grandinėje, skaldymo nepastebėta.
Taigi, išradimas priskiriamas preproinsulino formulė (I) kurio
| (A-l) | Gly-NH - | - X | ||
| (A-6) | ( | jye-S-S | ||
| (A-Λ0) | (A—21) | |||
| (A—7 ) | 3ye—Cys - | — Cys - Z - | a3 | |
| 1 (A—11) | 1 | (I) |
S S (B—2) S S
H1- Rz-HN-Val---Cys -— Gys -' Y (B-7) (B-19) (B-30) kurioje
R1 yra n aminorūgščių, kur n yra sveikas skaičius ir yra 0 arba 1,
R yra vandenilis, chemiškai arba fermentiniu būdu atskeliama aminorūgštis arba peptidas, sudarytas iš 2-10 aminorūgščių liekanų,
R3 yra oksigrupė, aminorūgštis arba peptidas, sudarytas iš 2-10 aminorūgščių liekanų,
X yra L-argininas arba peptidas, sudarytas iš 245 aminorūgščių liekanų, kurio C-gale arba N-gale yra L-arginino radikalas,
Y yra genetiškai koduojama aminorūgštis,
Z yra genetiškai koduojama aminorūgštis,
A1-A20 arba B2-B29 yra gamtinė arba pakeista, pakeičiant vieną arba keletą aminorūgščių, žmogaus arba gyvulio insulino aminorūgščių seka, aminorūgščių grandinės hidrolizės būdui, kuris skiriasi tuo, kad preproinsulinas hidrolizuoj amas, esant klostripanui, ir šiomis sąlygomis paverčiamas insulinu karboksipeptidazės B pagalba.
Peptidų ir proteinų aminorūgščių seka nurodoma nuo aminorūgščių grandinės N-galo. Proteazės hidrolizuoja peptidinę jungtį tarp peptidų arba proteinų aminorūgščių. Klostripanas hidrolizuoja peptidus arba proteinus, turinčius L-argininą esanti už arginino. Preproinsulino hidrolizės reakcijos produktas yra insulino dariniai arba polipeptidai, kurie C-gale turi arginino grupę, arba aminorūgštys.
Gamtinėmis aminorūgštimis vadinamos aminorūgštys, pavyzdžiui, Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Hyp, Trp, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit arba His.
Genetiškai koduojamomis aminorūgštimis laikomos aminorūgštys, pavyzdžiui, Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro arba selenocisteinas.
Tinkamiausi yra (I) formulės preproinsulinai, kuriuose R1 yra fenilalaninas (Phe),
R yra vandenilis, gamtinė anr norugštis arba peptidas, sudarytas iš 2-30 gamtinių aminorūgščių, kurio C-gale yra L-argininas,
R3 yra oksigrupė, gamtinė aminorūgštis arba peptidas, sudarytas iš 2-10 gamtinių aminorūgščių,
X yra L-argininas arba žmogaus arba gyvulio proinsulino C-grandinė,
Y yra aminorūgštis iš Thr, Ala arba Ser grupės,
Z yra aminorūgštis iš Asn, Gln, Asp, Glu, Gly, Ser,
Thr, Ala arba Met grupės,
A1-A20 arba B2-B29 yra žmogaus arba gyvulio insulino aminorūgščių seka.
Ypatingai tinkami yra (I) formulės preproinsulinai, kuriuose
R1 yra Phe,
R2 yra vandenilis arba peptidas, sudarytas iš 230 gamtinių aminorūgščių, kurio C-gale yra Largininas,
R3 yra oksigrupė, gamtinė aminorūgštis arba peptidas, sudarytas iš 2-10 gamtinių aminorūgščių,
X yra L-argininas arba žmogaus, kiaulės arba raguočių proinsulino C-grandinė,
Y yra Thr,
Z yra Asn,
A1-A20 arba B2-B29 yra žmogaus, kiaulės arba raguočių insulino aminorūgščių seka.
Be to, tinkami yra insulinai, kurie buvo siūlyti Vokietijos patentų paraiškose Nr. P 39 19 852 ir Nr. P 40 12 818 0. Pavyzdžiui, InsuArg, kuris turi tokią aminorūgščių seką:
| H2N-Asp | Thr | Thr | Vai | Ser | Glu | Pro | Asp | Pro | Asn | Ser | Asn |
| Gly | Arg | Phe | Vai | Asn | Glu | His | Leu | Cys | Gly | Ser | His |
| Leu | Vai | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Vai | Cys | Gly | Glu | Arg |
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Gly | Ile | Vai |
| Glu | Gln | Cys | Cys | Thr | Ser | Ile | Cys | Ser | Leu | Tyr | Gln |
| Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys | Asn- | COOH |
Klostripanas (EC 3.4.22.8) - tai ekstraceliuliarinė tiolproteazė iš klostridijų (Clostridien). Fermentas yra heterodimeras ir nėra kitų žinomų tiolproteazių homologas. Jis yra ypatingai specifiškas jungčių ArgXXX, ypač Arg-Pro, atžvilgiu. Fermentas charakterizuojamas molekuliniu svoriu nuo 30 000 iki 80 000 ir izoelektriniu tašku, pH nuo aktyvatoriai veikia, pavyzdžiui,
4,8 iki 4,9. Kaip cisternas, merkaptoetanolis, ditiotreitolis arba kalcio jonai.
Esant, pavyzdžiui, tozil-L-lizin-chlormetilketonui, vandenilio peroksidui, EDTA, Co2+, Cu2+, Cd2+ jonams arba citratui, klostripanas inhibuoj amas.
Klostripanas gaminamas iš mikroorganizmų fermentacijos būdu. Šiame gavimo būde klostridijos (Clostridien) kultivuojamos tol, kol maitinančioje terpėje susikaupia klostripanas. Tinkamos yra, pavyzdžiui, Clostridium histoliticum, būtent Clostridium histoliticum DSM 627. Taip pat tinkami yra minėtų mikroorganizmų mutantai ir variantai, jeigu jie sintezuoja klostripaną.
Auginama anaerobinėse sąlygose individualiai arba mišrioje kultūroje, pavyzdžiui, panardinus nejudrioje kultūroje, nesant deguonies, arba fermentatoriuose azoto, inertinių dujų arba kitų dujų atmosferoje, išskyrus deguonį. Fermentacija atliekama nuo 10 iki 45°C, geriausia apytikriai nuo 25 iki 40°C, ypač nuo 30 iki 38°C temperatūrų intervale. Fermentacija vyksta pH srityje nuo 5 iki 8,5, geriausia nuo 5,5 iki 8.
Šiomis sąlygomis kultūriniame buljone po maždaug 13 dienų susikaupia pastebimas fermento kiekis. Klostripano sintezė prasideda vėlyvoje log-fazėje ir pasiekia maksimumą standartinėje augimo fazėje. Fermento pasigaminimą galima kontroliuoti, panaudojant aktyvumo testą (Mitchell, W., Meth. Enzymol., vol. 47, p. 165-170, 1977).
Klostripano gavimui naudojamame maitinančiame tirpale yra nuo 0,2 iki 6%, geriausia nuo 0,5 iki 3%, organinių azoto junginių bei neorganinių druskų. Organiniais azoto junginiais gali būti: aminorūgštys, peptonai bei mėsos ekstraktai, sumaltos sėklos, pavyzdžiui, kukurūzų, kviečių, pupų, sojos arba medvilnės, alkoholio gamybos distiliacijos atliekos, mėsos miltai arba mielių ekstraktai. Kaip neorganinės druskos maitinančiame tirpale gali būti pavyzdžiui, šarminių arba žemės šarminių metalų, geležies, cinko ir mangano chloridai, karbonatai, sulfatai arba fosfatai, o taip pat ir amonio druskos bei nitratai.
Optimalios fermentacijos sąlygos kiekvienam mikroorganizmui nors ir skiriasi, tačiau jos yra arba žinomos tyrinėtojui, arba gali būti lengvai parenkamos, panaudojant paruošiamųjų bandymų duomenis. Klostripanas gali būti valomas klasikiniais metodais, pavyzdžiui, nusodinimu (NH4)2SO4, jonitinės arba gel-skvarbos chromatografijos metodais. Fermentų sujungimas gali būti atliktas pagal žinomus metodus (Colowick ir Kaplan, Meth. Enzymol., vol.XLIV).
Fermentinėje reakcijoje gali būti naudojamos tiek sveikos ląstelės laisvoje arba imobilizuotoje formoje, o taip pat ir išskirtas fermentinis produktas, kuris taip pat gali būti surištas su nešikliu (pagrindu).
(I) formulės preproinsulino skaldymas, panaudojant klostripaną, yra atliekamas vandeninėje terpėje, į kurią gali būti pridėta besimaišančių su vandeniu organinių komponenčių, kaip pavyzdžiui, alkoholių, ketonų, šlapalo, N,N-dimetilformamido. Tarp kitko, norint geriau kontroliuoti pH, i pradini reakcijos mišinį gali būti pridedama atitinkamų organinių arba neorganinių buferių, tokių kaip fosfatas, Tris, glicinas, HEPES ir kt. Preproinsulino koncentracija skaldymo mišinyje yra, pavyzdžiui, 0,01 mg/ml ir 100 mg/ml intervale, geriausia nuo 0,1 mg/ml iki 10 mg/ml. Preproinsulino santykis su klostripanu (mg: aktyvumo vienetai (U)) yra nuo 1:0,01 iki 1:1000, geriausia nuo 1:0,1 iki 1:50.
Reakcijos terpės rūgštingumas gali kisti nuo pH 4 iki pH 12, ypatingai tinkama yra sritis nuo pH 6 iki pH 9.
Laikas, reikalingas suskaldyti preproinsulinui iki atitinkamo intermediato, gali kisti priklausomai nuo reakcijos sąlygų plačiose ribose, pavyzdžiui, nuo 15 minučių iki 48 valandų, geriausia reakciją vykdyti nuo 1 iki 6 valandų.
Prieš naudojant fermentą, jis atitinkamai aktyvuojamas, esant merkaptanųi. Merkaptanais laikomi iš esmės visi junginiai, kurie turi SH-grupes; geriausiai tinka DTT, DTE, merkaptoetanolis, tioglikolinė rūgštis arba cisternas. Merkaptanų koncentracija gali kisti plačiose ribose; geriausiai tinka koncentracijos nuo 0,1 mM iki 100 mM. Toliau, aktyvuojančiame buferyje yra Ca2+ jonai, geriausia CaCl2. Aktyvacija vykdoma, esant pH reikšmėms nuo 4 iki 12, geriau nuo pH 6 iki pH 8, ypatingai tinkamos ribos yra nuo pH 7 iki pH 8. pH palaikymui gali būti pridedama buferinių medžiagų, pavyzdžiui, Tris HEPES, glicino ir kt. Aktyvacijos temperatūra gali būti nuo 0°C iki 60°C, geriau nuo 0°C iki 10°C, ypatingai tinkamas intervalas yra nuo 0°C iki 5°C. Taip aktyvuotas fermentas gali būti naudojamas tiesiogiai, arba duotose sąlygose iš jo pašalinamas aktyvuojantis buferis, panaudojant chromatografiją per Ultrogelį AcA 202 (®Ultrogel AcA 202) .
atitinkamus insulinus, B. Karboksipeptidazę B
Skaldant (I) formulės preproinsuliną išradime aprašomu būdu, gaunami insulino dariniai, turintys insulino išgale arginino liekanas, ir atitinkamos atskeltos aminorūgštys ir/arba peptidai. Esant reikalui, insulino darinius galima paversti į panaudojant karboksipeptidazę galima pridėti į tą pati pradinį reakcijos mišinį kartu su klostripanu, arba aukščiau minėtomis reakcijos sąlygomis galima juos pridėti vienas po kito; be to, insulino darinys minėtomis sąlygomis, prieš pridedant karboksipeptidazę, gali būti išskirtas žinomais metodais, tokiais kaip, pavyzdžiui, chromatografija arba kristalizacija. Karboksipeptidazę B galima naudoti ištirpintoje arba imobilizuotoje formoje. Karboksipeptidazės B ir insulino darinio santykis (pagal svorį) yra apytikriai nuo 1:10 iki 1:5000, geriausia apie 1:500 iki 1:3500 ir ypatingai tinkamas yra apytikriai nuo 1:1000 iki 1:3000.
Karboksipeptidazės B ir klostripano santykis (pagal svorį) yra apytikriai nuo 1:1 iki 10:1, geriausia nuo 2:1 iki 5:1.
Klostripano ir/arba karboksipeptidazės B skaldymo reakcijos produktai gali, pavyzdžiui, būti nusodinami, sumažinus pH reikšmę, ir/arba išskiriami ir išvalomi, panaudojant žinomus kolonėlių chromatografijos metodus. Taip gautas insulinas gali būti paruošiamas naudojimui įprastomis formomis ir panaudojamas kaip vaistai, gydant diabetą.
io
Toliau duodamose pavyzdžiuose iš dalies aprašomas išradime siūlomas būdas. Jeigu atskirai nepaminėta, duodami % yra svorio %.
pavyzdys
Clostridium histoliticum DSM 627 kultivavimas buvo atliktas -tirpale, kuriame yra:
kazeinpentonas 3% mėsos ekstraktas 3% mielių ekstraktas 0,5% cisteinas 0,05%
KH2PO4 0,15% pH=7,2
Predkultūra (pirminė kultūra) užkrečiama 1% mikroorganizmų. Kultivuojama uždarame inde anaerobinėmis sąlygomis 37°C temperatūroje 2 dienas. Mikroorganizmų štamai išlaikomi aukščiau minėtame maitinimo tirpale, turinčiame 50% glicerino, -20°C temperatūroje. Fermentatoriuje įskiepijama predkultūra (1%). Įskiepijamo (užkrečiamo) maitinančio tirpalo kiekis fermentatoriuje buvo nuo 10 iki 8 1. Kultivavimas atliekamas, įsotinant azotu, 33°C temperatūroje 24 valandas, esant pastoviam pH 7,0. Kultūrinio skysčio išmatuotas fermentinis aktyvumas sudarė 20 000 U/l (Mitchell W., Meth. Enzymol., 47 t., p. 165-170, 1977).
Gautas skystis buvo apdorojamas centrifūguoj ant ląsteles esant 6000 g, steriliai filtruojant per filtrą, kurio porų dydis buvo 0,22 μη, ir pridedant 60%-nio ledinio (-20°C) metilo alkoholio į filtratą. Tirpalas išlaikytas 24 valandas -20°C temperatūroje ir vėl centrifūguoj amas (8000 g). Nuosėdos tirpinamos sterilioje terpėje ir vėl centrifūguojama (12 000 g) . Fermentinis aktyvumas, išmatuotas nuosėdose, buvo 300 U/ml, 200 U/baltymo mg. Išeiga sudarė 75% išmatuoto fermentatoriuje aktyvumo.
pavyzdys
Ląstelės buvo praskiestos, kaip aprašyta 1 pavyzdyje.
Darbinė terpė fermentatoriuje susidėjo iš:
Penton-proteazė (Difco) 5%
Cisteinas 0,05%
KH2PO4 0,15% pH 7,2 ir buvo įskiepyta (užkrėta) 2% predkultūros.
Klostripano aktyvumas kultūriniame skystyje buvo 45 000 U/ml.
Gautas skystis buvo apdirbamas, filtruojant per 0,3 μπι membranas (Filtron Omega Membran), norint atskirti ląsteles, ir filtruojant tangentinio srauto (Tangential-Flow) sistemoje per 10 KD membranas, norint sukoncentruoti ištirpusį klostripaną. Sukoncentravimo koeficientas buvo 20. Po to, iš koncentrato buvo pašalintos druskos ir chromatografuojama per DEAEceliuliozę. Klostripano aktyvumas nuo 1000 U/ml, išeiga 85%. Preparatas iki panaudojimo buvo laikomas -20°C temperatūroje.
pavyzdys
A. Klostripano aktyvavimas μΐ fermentinio preparato (200 U/ml, 286 U/mg) iš 1 pavyzdžio, μΐ aktyvuojančio buferio (250 mM DTT, 125 mM CaCl2)
- Kiekis pradiniame mišinyje:
DTT , 5 mM
CaCl2 2,5mM
- Inkubuojama 2 valandas, šaldant ledu.
- Skaldymo reakcijai atlikti fermentas praskiedžiamas 1:40 25 mM Tris/HCl buferiu, pH 7,8.
B. Skaldymo, norint išskirti (B31) Arg-insuliną, 15 klostripano pradinis mišinys
| 100 μΐ | Insu-Arg | (1 mg/ml) |
| 20 μΐ | KC1 | (1 M) |
| 5 μΐ | Tris/HCl | (1 M, pH 7,8) |
| 55 μΐ | H2O | |
| 2 0 μΐ | klostripano | (praskiedimas 1:40) |
- Kiekis pradiniame mišinyje:
Insu-Arg
Klostripanas
DTT
Tris/HCl
0,5 mg/ml
2,5 U/ml
12,5 μΜ mM
KC1
100 mM
CaCl2 μΜ
- Inkubuojama 1-2 valandas 28°C temperatūroje, reakciją galima lengvai kontroliuoti aukšto slėgio skystinės chromatografijos (HPLC) pagalba, po to nutraukti, panaudojant tozil-L-lizinchlormetilketoną (TLCK)
- Reakcija nutraukiama, pridedant 1 μΐ TLCK (15 mM)
- Laikoma 4°C temperatūroje
Rezultatas:žmogaus insulinas-Arg. Pagal HPLC duomenis, žmogaus insulinas (DesB30) nesusidaro.
C. Skaldymo, norint išskirti žmogaus insuliną, karboksipeptidazės B pradinis mišinys
200 μΐ skaldymui skirto klostripano pradinio mišinio, 10 μΐ karboksipeptidazės B (praskiedimas 1:100)
- Karboksipeptidazės kiekis pradiniame mišinyje: 2,5 mg/m
- Inkubuojama 2-4 valandas 28°C temperatūroje; reakciją lengvai galima kontroliuoti HPLC chromatografijos pagalba
- Karboksipeptidazė B (759 U/ml, 150 U/mg iš kiaulės kasos), skirta reakcijai, praskiedžiama 1:1000 25 mM Tris/HCl buferiu, pH 7,8.
Rezultatas: žmogaus insulinas. Medžiaga insulinas (DesB30) pagal HPLC duomenis nesusidaro.
(0, 125 M (NH4)2SO4,
D. HPLC-analizė
Skilimo kontrolei buvo naudojama kolonėlė RP su H2SO4 nustatomas pH4, 25-50% acetonitrilo gradientas) arba kolonėlė C8 (0,1% TFA, 20-50% acetonitrilo gradientas).
pavyzdys
Klostripanas: 200 U/ml (iš 1 pavyzdžio)
Aktyvuojantis buferis: 500 mM Tris/HCl, pH 7,8
100 mM DTT 25 mM CaCl2
Aktyvacija: 100 μΐ klostripano tirpalo μΐ aktyvuojančio buferio
Pradinis mišinys: 35,7 mg žmogaus pre-B-grandis-Agrandis-insulin-sulfonato
315 μΐ 1 M merkaptoetanolio
105 μΐ 1 M askorbino rūgšties
100 ml 20 mM glicino buferio, pH 10,7.
200 μΐ skaldymui skirto klostripano pradinio mišinio, μΐ karboksipeptidazės B (praskiedimas 1:100)
- Karboksipeptidazės B kiekis pradiniame mišinyje: 2,5 mg/ml
- Inkubuojama 2-4 valandas 28°C temperatūroje; reakciją lengva kontroliuoti HPLC metodu
- Karboksipeptidazė B (759 U/ml, 150 U/ml, iš kiaulės kasos) praskiedžiama 1:1000 25 mM Tris/HCl buferiu, pH 7,8. Rezultatas: žmogaus insulinas. Medžiaga insulinas (DesB30), pagal HPLC duomenis, nesusidaro.
HPLC-analizė
Skilimo kontrolei buvo naudojama kolonėlė RP 18 (0,125 M (NH4)2SO4, su H2SO4 nustatomas pH4, 25-50% acetonitrilo gradientas) arba kolonėlė C8 (0,1% TFA, 20-50% acetonitrilo gradientas).
pavyzdys
Klostripanas: 200 U/ml (iš 1 pavyzdžio)
Aktyvuojantis buferis: 500 mM Tris/HCl, pH 7,8
100 mM DTT 25 mM CaCl2
Aktyvacija: 100 μΐ klostripano tirpalo μΐ aktyvuojančio buferio
Pradinis mišinys: 35,7 mg žmogaus pre-B-grandis-Agrandis-insulin-sulfonato 315 1 1 M merkaptoetanolio 105 1 1 M askorbino rūgšties 100 ml 20 mM glicino buferio, pH 10,7
Pradinio mišinio susiformavimas buvo vykdomas per naktį šaldytuve, 4°C temperatūroje, išeiga 0,152 mg/ml. Priemaišos atskiriamos, sumažinant pH reikšmę iki 5,0, po to pridedama Tris iki galutinės koncentracijos 50 mM ir su HC1 nureguliuojama pH reikšmė lygi 7,8. Po to buvo pridėta 30 μΐ fermento tirpalo. Skaldymas atliekamas 30°C temperatūroje ir kontroliuojamas HPLC chromatografijos pagalba.
Rezultatas: aukščiau minėtas preproinsulinas suskyla iki žmogaus insulino Arg. Susidaro minimalus kiekis insulino (DesB30).
Claims (9)
- IŠRADIMO APIBRĖŽTIS1. Insulino gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad atlieka preproinsulino, kurio formulė (I):(A-l) Gly-NH--- X (A-6) Cye-S-S (A-«0) (A—21) (A—7) Cys-Cys - Cys — Z — H3 | (A-ll) |S s (B-2) S S | I ti1- £2-HN-Vai---Cys -- -----* Y (B-7) (B-19) (B—30)5 kuriojeR1 yra n aminorūgščių, kur n yra sveikas skaičius ir yra 0 arba 1,10 R yra vandenilis, chemiškai arba fermentiniu būdu atskeliama aminorūgštis arba peptidas, sudarytas iš 2-10 aminorūgščių liekanų,R yra oksigrupė, aminorūgštis arba peptidas,15 sudarytas iš 2-10 aminorūgščių liekanų,X yra L-argininas arba peptidas, sudarytas iš 245 aminorūgščių liekanų, kurio C-gale arba N-gale yra L-arginimo radikalas,Y yra genetiškai koduojama aminorūgštis,Z yra genetiškai koduojama aminorūgštis,A1-A20 arba B2-B29 yra gamtinė arba pakeista, pakeičiant vieną arba keletą aminorūgščių, žmogaus arba gyvulio insulino aminorūgščių seka, aminorūgščių grandinės hidrolizę, esant klostripanui, ir esant reikalui, panaudoja karboksipeptidazę B.
- 2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad naudoja (I) formulės preproinsuliną, kuriameR1 yra fenilas (Phe),R yra vandenilis, gamtinė aminorūgštis arba peptidas, sudarytas iš 2-30 gamtinių aminorūgščių, kurio C-gale yra L-argininas,R3 yra oksigrupė, gamtinė aminorūgštis arba peptidas, sudarytas iš 2-10 gamtinių aminorūgščių,X yra L-argininas arba žmogaus arba gyvulio proinsulino C-grandinė,Y yra aminorūgštis iš Thr, Ala arba Ser grupės,Z yra aminorūgštis iš Asn, Gly, Asp, Glu, Gln, Ser,Thr, Ala arba Met grupės,A1-A20 arba B2-B29 yra žmogaus arba gyvulio insulino aminorūgščių seka.
- 3. Būdas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad naudoja (I) formulės insulinus, kuriuoseR1 yra fenilas (Phe)R2 yra vandenilis arba peptidas, sudarytas iš 230 aminorūgščių, kurio C-gale yra L-argininas,R3 yra oksigrupė, gamtinė aminorūgštis arba peptidas, sudarytas iš 2-10 gamtinių aminorūgščių,X yra L-argininas, arba žmogaus, kiaulės arba karvės proinsulino C-grandinė,Y yra Thr,Z yra Asn,A1-A20 arba B2-B29 yra žmogaus, kiaulės arba karvės insulino aminorūgščių seka.
- 4. Būdas pagal vieną arba keletą iš 1-3 punktų, besiskiriantis tuo, kad skaldymą atlieka, esant pH reikšmės nuo 4 iki 12, geriausia nuo 6 iki 9.
- 5. Būdas pagal vieną arba keletą iš 1-4 punktų, besiskiriantis tuo, kad (I) formulės preproinsulino koncentracija yra nuo 0,01 mg/ml iki 100 mg/ml, geriausia nuo 0,1 mg/ml iki 10 mg/ml.
- 6. Būdas pagal vieną arba keletą iš 1-5 punktų, besiskiriantis tuo, kad preproinsulino ir klostripano santykis (mg ir aktyvumo vienetų santykis) yra nuo 1:0,01 iki 1:1000, geriausia nuo 1:0,1 iki 1:50.
- 7. Būdas pagal vieną arba keletą iš 1-6 punktų, besiskiriantis tuo, kad reakcijos temperatūra yra nuo 0°C iki +80°C, geriausia nuo +20°C iki +40°C.
- 8. Būdas pagal vieną arba keletą iš 1-7 punktų, besiskiriantis tuo, kad karboksipeptizė B dalyvauja kartu arba panaudojama po skaldymo klostripanu.
- 9. Būdas pagal vieną keletą iš 1-8 punktų, besiskiriantis tuo, kad klostripanas ir/arba karboksipeptidazė B naudojami imobilizuotoje formoje.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4028118 | 1990-09-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LTIP712A LTIP712A (en) | 1995-01-31 |
| LT3328B true LT3328B (en) | 1995-07-25 |
Family
ID=6413629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LTIP712A LT3328B (en) | 1990-09-05 | 1993-06-25 | Process for the preparation of insulin |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5728543A (lt) |
| EP (1) | EP0474212B1 (lt) |
| JP (1) | JP3005335B2 (lt) |
| KR (1) | KR100188800B1 (lt) |
| AT (1) | ATE145922T1 (lt) |
| AU (1) | AU637254B2 (lt) |
| CA (1) | CA2050606C (lt) |
| CZ (1) | CZ283234B6 (lt) |
| DE (1) | DE59108392D1 (lt) |
| DK (1) | DK0474212T3 (lt) |
| ES (1) | ES2095891T3 (lt) |
| FI (1) | FI103805B1 (lt) |
| GR (1) | GR3021909T3 (lt) |
| HR (1) | HRP940766A2 (lt) |
| HU (1) | HU214676B (lt) |
| IE (1) | IE75723B1 (lt) |
| IL (1) | IL99383A (lt) |
| LT (1) | LT3328B (lt) |
| LV (1) | LV10508B (lt) |
| NO (1) | NO300980B1 (lt) |
| NZ (1) | NZ239652A (lt) |
| PL (1) | PL167810B1 (lt) |
| RU (1) | RU2062301C1 (lt) |
| SK (1) | SK279686B6 (lt) |
| YU (1) | YU147491A (lt) |
| ZA (1) | ZA917008B (lt) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2122549C1 (ru) * | 1997-12-29 | 1998-11-27 | Закрытое акционерное общество "Фосфосорб" | Способ хроматографического выделения и очистки белков, пептидов и их комплексов |
| RU2238951C2 (ru) * | 1998-03-31 | 2004-10-27 | Тонгхуа Гэнтеч Биотекнолоджи Лтд. | Химерный белок, обеспечивающий образование биоактивной конформации, способ получения белка с инсулиновой активностью, способ идентификации пептидильного фрагмента |
| US6461834B1 (en) | 1998-11-06 | 2002-10-08 | Bionebraska, Inc. | Clostripain catalyzed amidation of peptides |
| DE19915938A1 (de) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Aventis Pharma Gmbh | Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre Verwendung |
| EP1572720A4 (en) * | 2002-05-24 | 2008-12-24 | Nps Allelix Corp | PROCESS FOR THE ENZYMATIC PRODUCTION OF GLP-2 (1-34) AND GLP-2 (1-33) PEPTIDES |
| AU2003239863A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Restoragen Inc. | Method for enzymatic production of glp-1 (7-36) amide peptides |
| WO2003099848A2 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Restoragen Inc. | Method for universal enzymatic production of bioactive peptides |
| SI1704234T1 (sl) * | 2003-11-21 | 2012-08-31 | Nps Pharma Inc | Proizvodnja glukagonu podobnih peptidov 2 in analogov |
| WO2013015697A1 (en) * | 2011-07-28 | 2013-01-31 | Mabion S.A. | A recombinant protein, a polynucleotide encoding it as well as a method of obtaining insulin or its an analogue |
| KR102646845B1 (ko) * | 2018-08-08 | 2024-03-14 | 주식회사 대웅제약 | 클로스트리파인을 이용한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0024250A1 (de) | 1979-08-14 | 1981-02-25 | Arbed S.A. | Verfahren und Einrichtung zur Wiederverwertung kohlenstoffreicher Abfälle |
| EP0095691A1 (de) | 1982-05-27 | 1983-12-07 | Neiman S.A. | Zylinderschloss, insbesondere Lenkschloss für ein Kraftfahrzeug |
| DE3440988A1 (de) | 1984-11-09 | 1986-07-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung |
| EP0264250A2 (en) | 1986-10-14 | 1988-04-20 | Eli Lilly And Company | Process for transforming a human insulin precursor to human insulin |
| EP0347781A2 (de) | 1988-06-23 | 1989-12-27 | Hoechst Aktiengesellschaft | Mini-Proinsulin, seine Herstellung und Verwendung |
| EP0367163A2 (de) | 1988-11-03 | 1990-05-09 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten |
| EP0890007A1 (en) | 1996-02-29 | 1999-01-13 | Sweepy International S.A. | Fluted swimming pool cleaner discs |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
| JPS60217894A (ja) * | 1984-04-14 | 1985-10-31 | Suntory Ltd | 新規プロテア−ゼ及びその製造方法 |
| DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
| DE4012818A1 (de) * | 1990-04-21 | 1991-10-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
| DE3919852A1 (de) * | 1988-06-23 | 1989-12-28 | Hoechst Ag | Mini-proinsulin, seine herstellung und verwendung |
-
1991
- 1991-09-03 FI FI914151A patent/FI103805B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 IL IL9938391A patent/IL99383A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 CZ CS912711A patent/CZ283234B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 NZ NZ239652A patent/NZ239652A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 KR KR1019910015314A patent/KR100188800B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-03 SK SK2711-91A patent/SK279686B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 AU AU83567/91A patent/AU637254B2/en not_active Expired
- 1991-09-04 DK DK91114934.2T patent/DK0474212T3/da active
- 1991-09-04 IE IE311791A patent/IE75723B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 PL PL91291617A patent/PL167810B1/pl unknown
- 1991-09-04 YU YU147491A patent/YU147491A/sh unknown
- 1991-09-04 AT AT91114934T patent/ATE145922T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 ZA ZA917008A patent/ZA917008B/xx unknown
- 1991-09-04 RU SU915001486A patent/RU2062301C1/ru active
- 1991-09-04 CA CA002050606A patent/CA2050606C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 EP EP91114934A patent/EP0474212B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 DE DE59108392T patent/DE59108392D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 JP JP3223243A patent/JP3005335B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 ES ES91114934T patent/ES2095891T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 NO NO913474A patent/NO300980B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-09-05 HU HU912875A patent/HU214676B/hu unknown
-
1993
- 1993-05-05 LV LVP-93-288A patent/LV10508B/xx unknown
- 1993-06-25 LT LTIP712A patent/LT3328B/lt not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-08-08 US US08/291,060 patent/US5728543A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 HR HRP-1474/91A patent/HRP940766A2/hr not_active Application Discontinuation
-
1996
- 1996-12-05 GR GR960403067T patent/GR3021909T3/el unknown
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0024250A1 (de) | 1979-08-14 | 1981-02-25 | Arbed S.A. | Verfahren und Einrichtung zur Wiederverwertung kohlenstoffreicher Abfälle |
| EP0095691A1 (de) | 1982-05-27 | 1983-12-07 | Neiman S.A. | Zylinderschloss, insbesondere Lenkschloss für ein Kraftfahrzeug |
| DE3440988A1 (de) | 1984-11-09 | 1986-07-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung |
| EP0264250A2 (en) | 1986-10-14 | 1988-04-20 | Eli Lilly And Company | Process for transforming a human insulin precursor to human insulin |
| EP0347781A2 (de) | 1988-06-23 | 1989-12-27 | Hoechst Aktiengesellschaft | Mini-Proinsulin, seine Herstellung und Verwendung |
| EP0367163A2 (de) | 1988-11-03 | 1990-05-09 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten |
| EP0890007A1 (en) | 1996-02-29 | 1999-01-13 | Sweepy International S.A. | Fluted swimming pool cleaner discs |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5512459A (en) | Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides | |
| RU2205836C2 (ru) | Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками | |
| EP0489711B1 (en) | Method for producing human growth hormone | |
| NO180379B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et vesentlig renset insulinderivat | |
| US5763215A (en) | Method of removing N-terminal amino acid residues from eucaryotic polypeptide analogs and polypeptides produced thereby | |
| KITAGAWA et al. | Amino Acid Sequence of Copper, Zinc-Superoxide Dimutase from Spinach Leaves | |
| RU2073686C1 (ru) | Способ получения стабильных соматотропинов, стабильные соматотропины и композиция стабильного соматотропина | |
| LT3328B (en) | Process for the preparation of insulin | |
| US4639332A (en) | Process for the preparation of insulin derivatives | |
| NO153061B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et b30-threonininsulin | |
| US5565349A (en) | Dictyostelium dipeptidylaminopeptidase | |
| US6461834B1 (en) | Clostripain catalyzed amidation of peptides | |
| IE883462L (en) | A method for the selective cleavage of fusion proteins | |
| NO326247B1 (no) | Fremgangsmate for fremstilling av modent insulin eller et modent insulin derivat. | |
| PT98859B (pt) | Processo enzimatico para a transformacao de preproinsulinas em insulinas | |
| Okamoto et al. | An improved method for large-scale purification of recombinant human glucagon | |
| NO163531B (no) | Beskyttet b30-thr(r1)(r2)-insulin egnet for fremstilling av et b30-threonininsulin. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC9A | Transfer of patents |
Free format text: 20020812 * AVENTIS PHARMA DEUTSCHLAND GMBH,DE |
|
| MK9A | Expiry of a patent |
Effective date: 20130625 |