NO163531B - Beskyttet b30-thr(r1)(r2)-insulin egnet for fremstilling av et b30-threonininsulin. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et mellomprodukt (utgangsforbindelse) egnet for fremstilling av et B30-threonininsu-lin, i form av et beskyttet B30-Thr(R1)(R2)-insulin, og det særegne ved mellomproduktet i henhold til oppfinnelsen er at Thr er L-threoningruppen, R<1> er hydrogen, t-butyl, benzyl eller acetyl, og R<2> er en alkylester, særlig en t-butylester, en aralkylester, særlig en benzylester, en amidgruppe, et substituert amid, særlig et anilid, eller et salt, særlig natriumsaltet.

Disse trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravet.

Oppfinnelsen har tilknytning til en halvsyntese av human-insulin, i form av en enzymatisk syntese av et B30-threonin-insulin inklusive human-insulin. Syntesen frem til B30-threonininsulinet gjennomføres ved å omsette et des-B30-insulin med en overskuddsmengde av threoninderivat i nærvær av et enzym som spesifikt virker på det basiske aminosyre-karbonyl i peptidbindinger, hvoretter den eller de beskyttende grupper i det erholdte beskyttede B-30-Thr(R<1>)(R<2>)-insulinmellomprodukt (mellomproduktet i henhold til den foreliggende oppfinnelse) fjernes til å gi B30-threonin-insulinet.

Fremstillingen av det beskyttede B30-Thr (R^-) (R2)-insulin, dets egenskaper og anvendelse for fremstilling av B30-threonininsulinet (ved fjernelse av beskyttelsesgruppene) er illustrert senere i beskrivelsen. Det vises også til norsk patentskrift 153.061.

Insulin er en uomgjengelig nødvendig medisin for behandling av diabetes. Okse- og svine-insuliner kan i dag fås i handelen. Men disse insuliner er dog forskjellige fra human-insulin med hensyn til noen aminosyre-komponenter, som bevirker dannelse av antistoffer i pasienter. Antistoffene vil som kjent nedsette effektiviteten av fortsatt insulin-behandling. Derfor begunstiges human-insulin og dets kommersielle tilgjengelighet har lenge vært sterkt ønsket. Human-insulin er forskjellig fra annet animalsk insulin ved aminosyre-komponentene i posisjonene 8, 9 og 10 i A-kjeden og ved posisjon 30 i B-kjeden. Norsk patentskrift 153.061 omhandler en enzymatisk fremgangsmåte for å erstatte aminosyren i 30-posisjonen i B-kjeden av et animalsk insulin med L-threonin. Følgelig kan human-insulin lett fremstilles ved den nevnte fremgangsmåte ved å anvende svine-insulin som utgangsmateriale. Svine-insulin er forskjellig fra human-insulin i aminosyren i B30-posisjonen. Således oppnådd human-insulin anvendes fordelaktig for behandling av dia-betiske tilstander. Den nevnte fremgangsmåte muliggjør anvendelse av andre B30-threonininsuliner ved å gå ut fra andre animalske insuliner. De resulterende insuliner er forskjellig fra human-insulin med hensyn til aminosyrene 8, 9 og 10-posisjonene av A-kjeden og kan anvendes som reagenser for å teste antigenicitet og medikament for diabetes.

Human-insulin ble kjemisk fremstilt av M.A. Ruttenberg som vist i US patentskrift Nr. 3.903.068 og R. Obermeier et al. beskreveti Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 357, 759-767 ,

(1976). Disse prosesser omfatter kondensering av et desoktapeptid-(B23-30)-svine-insulin med et syntetisk oktapeptid tilsvarende posisjonene B23-30 i human-insulin. Den første prosess omfatter imidlertid alkalisk hydrolyse som gir skadelige bireaksjoner. Den siste prosess er også en ikke spesifikk reaksjion som medfører mange bireaks joner og krever kompliserte renseprosedyrer. Disse prosesser kan derfor ikke anvendes i industriell målestokk.

M. Bodanszky et al. foreslo en fremgangsmåte for fremstilling av human-insulin i US patentskrift nr. 3.276.961 hvor human-insulin fremstilles fra andre animalske insuliner ved en

innvirkning av et enzym som karboksypeptidase A og trypsin i nærvær av threonin. Denne prosess vil sannsynlig ikke frem-bringe human-insulin pga. at trypsin og karboksypeptidase A ikke bare hydrolyserer peptid-bindingen i lysyl-alanin (B29-B30), men også de andre posisjoner i insulin under de betingelser som er beskrevet der. Trypsin hydrolyserer

foretrukket peptid-bindingen i arginyl-glycin (B22-B23) snarere enn lysyl-alaninet (B29-B30). Karboksypeptidase A kan imidlertid ikke frigi bare alaninet ved C-enden av B-kjeden uten å frigi asparagin ved C-enden av A-kjeden. En spesiell betingelse, dvs. omsetning i en ammonium-hydrogen-karbonat-buffer-løsning er nødvendig for å forhindre frigi-velsen av asparaginet. Denne betingelse ble oppdaget i 1978 (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359, 799-802 (1978)). Videre vil peptid-syntese neppe foregå pga. at hydrolysehas-tigheten er større enn syntesehastigheten ved denne tilstand.

Det konkluderes derfor med at det ikke har vært noen til-gjengelig industriell fremgangsmåte for fremstilling av human-insulin til denne tid.

Med utgangsforbindelsen i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan imidlertid human-insulin med høyt utbytte fremstilles i kommersiell målestokk ved en enkel fjernelse av de beskyttende grupper R<1> og R<2> fra utgangs-B30-Thr(R1)(R2) - insulinet. Denne utgangsforbindelse fremstilles ved fremgangsmåten som er gjenstand for norsk patentskrift 153.061 og består i enzymatisk kondensering av et des-B30-insulin med et L-threoninderivat. Fremgangsmåten er forskjellig fra alle tidligere kjente prosesser og har mange fordeler. Den er en spesifikk reaksjon som ikke medfølges av noen skadelige bireaks joner som f.eks. racemisering. I tillegg kan uomsatt utgangsmaterial lett gjenvinnes uten skade og anvendes på nytt. Prosessen anvender en overskuddsmengde av L-threoninderivat. Overskuddsmengden av threonin-derivatet forhindrer bruddet av karbonyl-bindingen til argininet i 22-posisjonen i B-kjeden, selv om bindingen vanligvis spaltes av trypsin. Følgelig er beskyttelse av arginin-resten som må foretas ved vanlig enzymatisk reaksjon, ikke nødvendig ved den nevnte fremgangsmåte hvor da utgangs-B30-Thr(R<1>)(R<2>) i henhold til den foreliggende oppfinnelse opptrer som et mellomprodukt og hvorfra beskyttelsesgruppene bare behøver å fjernes for å oppnå det terapeutisk aktive human-insulin.

Prosessen for å komme frem til mellomproduktet omfatter således en omsetning av et des-B30-insulin (benevnt forbindelse II heretter) med en overskuddsmengde av L-threoninderivat (benevnt forbindelse I heretter) i nærvær av et enzym som spesifikt virker på det basiske aminosyre-karbonyl i peptid-bindinger.

Forbindelsen I representeres ved hjelp av følgende formel:

hvori Thr er L-threoninresten; R<1> er hydrogen eller en hydroksy-beskyttende gruppe av tidligere angitt type, og R<2 >er en karboksylbeskyttende gruppe av tidligere angitt type.

Forbindelsen (des-B30-insulinet) II kan fremstilles ved å omsette forskjellige animalske insuliner (f.eks. fra svin, okse, hval, sau, kanin, fisk, aper o.l.) med karboksypeptidase A som omhandlet av E.W. Shimitt et al. i Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359, 799 (1978). Den kan også, fremstilles ved å anvende en protease fremstilt ved hjelp av Achromobacter lyticus. Proteasen har en spesifikk virkning overfor lysin og spalter spesifikt lysinkarbonyl-bindinger i peptid-bindinger. Isolasjonen og egenskapene er beskrevet av Masaki et al. i Agric. Biol. Chem., 42, 1443 (1978). Enzymet benevnes protease I. Fremstillingen av des-B30-svine-insulin er for øvrig omhandlet i Biochem. Biophys. Res. Commun. 92,

396-402 (1980) og j;apansk patentpublikasjon 54-135789. Des-B30-insuliner av andre dyr kan fremstilles på samme måte.

Hydroksygruppen i forbindelsen I kan være beskyttet og en anvendt beskyttende gruppe velges fra hvilken som helst av de hydroksy-beskyttende grupper t-butyl, benzyl eller acetyl. Karboksyl^gruppen i forbindelsen I må beskyttes, og de følgende karboksyl-beskyttende grupper anvendt ved peptid-syntese kan anvendes, nemlig en alkylester (særlig en t-butylester), en aralkylester (særlig en benzylester), et amid, et substituert amid (særlig et anilid), eller et salt (særlig et natriumsalt).

Den beskyttende gruppe velges i betraktning av innføringsre-aksjonen og fjernelsesreaksjonen for insulin pga. at reak-sjonene kan resultere i denaturering eller inaktivering av insulinet. Hvis en hydroksy-beskyttende gruppe og en karboksyl-beskyttende gruppe av threoninresten velges på passende måte, er e_n fjernelsesprosedyre nok for å fjerne begge de beskyttende grupper.

Enzymet anvendt for fremstillingen av utgangsforbindelsen, nemlig det beskyttede B30-Thr(R<1>)(R<2>)-insulin, omfatter enzymer som spesifikt virker på det basiske aminosyre-karbonyl i peptid-bindinger som kan oppnås fra forskjellige planter og dyr, og disse er f.eks. trypsin og trypsinlignende enzymer. Trypsinlignende enzymer er illustrert som f.eks. protease isolert av Morihara et al. i Arch. Biochem. Biophys. 126, 971 (1968) og proteasen er omhandlet av Yoshida et al. i FEBS Lett., 15, 129 (1971). Det enzym som skal anvendes kan behandles med tosyl-L-fenylalanin-klormetylketon (forkortet TPCK i det følgende) for å fjerne blandede enzymer som f.eks. chymotrypsin og chymotrypsinlignende enzym.

Videre er proteaser I fremstilt av Achromobacter lyticus M497-1 et trypsinlignende enzym og inkludert i de enzymer som kan anvendes. Protease I virker spesifikt på lysin-karbonyl i peptid-bindinger og isoleringen og egenskapene er beskrevet i Agric. Biol. Chem., 42, 1443 (1978). Kondenseringen av forbindelsen I med forbindelsen II gjennomføres under passende betingelser for peptid-syntesen av de ovennevnte enzymer. Reaksjonen gjennomføres foretrukket ved pH omtrent 5 til 9, foretrukket pH 6 til 7. Reaksjonstemperaturen er omtrent 0 til 30°C, foretrukket omtrent 20 til 40°C. Det er ønskelig at begge konsentrasjoner, både av forbindelsen I og forbindelsen II, er så høy som mulig. Det foretrukne mol-forhold mellom forbindelsen I og forbindelsen II er omtrent 5:1 til 1000:1, spesielt omtrent 25:1 til 200:1. Vannbland-bare organiske løsningsmidler tilsettes foretrukket til reaksjonsblandingen. Tilsetningen av organisk løsningsmiddel nedsetter de vandige konsentrasjoner av reaksjonsblandingen og resulterer i forhindring av reverserte reaksjoner, dvs. hydrolyse av produktet, og det øker også oppløseligheten av forbindelsen I og forbindelsen II merkbart. De organiske løsningsmidler som anvendes er f.eks. metanol, etanol, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, glycerol o.l. De kan anvendes enkeltvis eller som en blanding. Den foretrukne konsentrasjon av det organiske løsningsmidlet er omtrent 0 til 65 %, spesielt omtrent 40 til 60 % av reaksjonsblandingen. Forholdet av organisk løsningsmiddel bør bestemmes av oppløseligheten av utgangsmaterialene, tendensen til denaturering for enzymet og dets hydrolyserende aktivitet.

Reaksjonsmediet kan velges fra trishydroksymetyl-aminometan (forkortet tris i det følgende), karbonat, borat-buffer-løsninger o.l. Enzym-konsentrasjonen bestemmes i avhengighet av konsentrasjonen av substrater og enzym-aktiviteter. F.eks. anvendes handelsvanlig krystallinsk trypsin foretrukket i konsentrasjoner på omtrent 1 mg/ml til 10 mg/ml. Enzymet kan anvendes intakt eller i en fiksert form som

f.eks. en kombinasjon mellom eller en inklusjon i en uopp-- løselig bærer som f.eks. cellulose, dextran (f.eks. "Sephadex"), agarose (f.eks. "Sepharose"), polyakrylamid-gel ("Bio-gel"), porøst glass o.l.

Reaksjonstiden er varierbar og påvirkes av andre reaksjons-betingelser. Reaksjonen kan fortsettes inntil substrat og produkt blir i likevekt. Det tar vanligvis omtrent 3 til 72 timer og i de fleste tilfeller omtrent 6 til 24 timer.

Insulinproduktet kan isoleres ved kombinasjon av den vanlige metode anvendt i peptid-kjemien. En isolasjonsprosedyre illustreres som følger: Reaksjonsblandingen underkastes gel-filtrering for å isolere og samle ureagert forbindelse I og enzym. Gjenvunnet forbindelse I og enzym kan anvendes på nytt. Den resterende del overføres til passende kromatografering for å isolere et resulterende beskyttet insulin og et ureagert des-B30-insulin.

Det sistnevnte kan anvendes på nytt som forbindelse II. Det førstnevnte beskyttede insulin utgjør mellomproduktet eller utgangsforbindelsen i henhold til oppfinnelsen, nemlig det beskyttede B30-Thr (R^-) (R2)-insulin. Herfra kan da humaninsu-linet oppnås ved fjernelse av de beskyttende grupper som gjennomføres på vanlig måte, selv om metoden bør velges i avhengighet av egenskapene av den beskyttende gruppe, t-butyl-gruppen er et eksempel på en beskyttende gruppe for både hydroksy- og karboksyl-gruppen i threonin. Den kan fjernes ved å behandle med trifluoreddiksyre i nærvær av kation-bindende middel, f.eks. anisol. Som bemerket ovenfor, hvis en enkel behandling kan fjerne den hydroksybeskyttende og den karboksylbeskyttende gruppe samtidig, blir prosessen enkel og fører til godt utbytte. Når C-enden av det resulterende insulin er beskyttet med en annen beskyttende gruppe som ester, amid, substituert amid eller salt, kan den beskyttende gruppe fjernes ved passende hydrolyse eller avsaltningsteknikk.

Insulin fremstilt på denne måte er nyttig for behandling av diabetes, og viser den samme aktivitet med senkning av blodsukker-nivået som okse-insulin.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

(1) Desalanin-(B30)-svine-insulin.

Til en oppløsning av svine-insulin (500 mg) i 0,1 M ammonium-hydrogenkarbonat (100 ml, pH 8,3) tilsettes krystallinsk karboksypeptidase A (5 mg, Worthington Co., forhåndsbehandlet med diisopropylfluorofosfat, 49 u/mg). Blandingen inkuberes ved romtemperatur i 8 timer.

Inkubasjonen stanses når alanin frigis med en hastighet på 0,77 M/IM insulin. Reaksjonsblandingen frysetørkes. Produktet oppløses i 0,5 M eddiksyre og absorberes på en kolonne av "Sephadex G 50" (3,5 x 95 cm) av superfine partik-ler. Kolonnen elueres med 0,5 M eddiksyre med en del av 11,5 ml pr. fraksjon. Fraksjon nr. 40-60 oppsamles og frysetørkes til å gi den i overskriften nevnte forbindelse (460 mg). Utbyttet er 92 %.

Produktet hydrolyseres for aminosyre-analyse med 6 M saltsyre ved 110°C i 24 timer til å gi følgende resultat. Tallene i parentes viser de teoretiske verdier i denne sammenheng.

Aminosyre-analyse: Lys 1.00 (1), His 1.91 (2),

Arg 0.95 (1), Asp 3.21 (3), Thr 2.09 (2), Ser 2.97 (3),

Glu 7.35 (7), Gly 4.29 (4), Ala 1.26 (1), Cys03H 5.94 (6), Val 3.86 (4), Ile 1.55 (2), Leu 6.53 (6), Tyr 4.08 (4),

Phe 3.22 (3), Pro 1.2 (1).

(2) [B30-Thr-OBu<t>]-svine-insulin.

Det ovennevnte produkt (100 mg, 10 mM) og L-threonin-t-butylester (205 mg, 500 mM) oppløses i en blanding (1.05 ml) av etanol og dimetylformamid (1:1, v/v som volum). Til opp-løsningen tilsettes en oppløsning av krystallinsk trypsin

(4 mg, Worthington Co., omkrystallisert tre ganger) i 0,5 borat buffer-løsning (0,75 ml, pH 6,5) og TPCK i den endelige konsentrasjon på 0,01 mM. Blandingen holdes over natten ved 37°C. Produktet bekreftes ved hjelp av HPLC væskekromatografering og det teoretiske utbytte er 7 5 %. Blandingen gjøres sur med iseddik og tilføres gel-filtrering i en kolonne av "Sephadex G 50" (4.2 x 130 cm) av superfine partik-ler til å gi tre fraksjoner tilsvarende trypsin, det i overskriften nevnte insulinderivat og L-threonin-t-butylester. Målinger av enzym-aktivitet og ninhydrin-reaksjon viser at trypsin og L-threonin-t-butylester gjenvinnes hver med 50 %.

Fraksjonen inneholdende insulin-derivatet frysetørkes til å gi et råpulver (89 mg) av den i overskriften nevnte forbindelse. Produktet tilføres ved 4°C til en kolonne av "DEAE-Sephadex A 25" (1,9 x 24,5 cm) som på forhånd er ekvilibrert med 0,01 M tris buffer-løsning (pH 7,6) og 7 M urea. Kolonnen elueres med den ovennevnte buffer-løsning (800 ml) og deretter en lineær Na<+> gradient (til 0,3 M NaCl) gjennom-føres til en fraksjon A nær til 0,08 til 0,09 M konsentrasjon og en fraksjon B nær til 0,13 til 0,14 M. Hver fraksjon dia-lyseres umiddelbart mot 0,01 ammonium-acetat i 3 til 4 døgn på et koldt sted og frysetørkes til å gi et pulver (35 mg) fra fraksjon A og et pulver (27 mg) fra fraksjon B. Den førstnevnte identifiseres som den i overskriften nevnte forbindelse og den sistnevnte bekreftes å være en blanding av desalanin-(B30)-svine-insulin og intakt svine-insulin ved hjelp av HPLC væskekromatografering og polyakrylamidgel-elektroforese.

Eksempel 2

(1) Desalanin-(B30)-okse-insulin.

Til en løsning av okse-insulin (200 mg) i 0,1 M ammonium-hydrogenkarbonat (40 ml) tilsettes krystallinsk karboksypeptidase A (1,8 mg, 49 u/mg). Blandingen holdes over natten ved romtemperatur og frysetørkes til å gi et råpulver

(180 mg) av den ovennevnte forbindelse. Produktet påvises å bestå av 78 % av den i overskriften nevnte forbindelse og 22 % desasparagin-(A21)-desalanin-(B30)-insulin.

(2) [B30-Thr-OBu<t>]-okse-insulin.

Produktet (116 mg, 5 mM) oppnådd ovenfor (1) og L-threonin-t-butylester (448 mg, 500 mM) oppløses i en blanding (2,4 ml) av etanol og dimetylformamid (1:1). Oppløsningen blandes med 0,5 M borat-bufferløsning (1,6 ml, pH 7,0) inneholdende krystallinsk trypsin (87,5 mg, 0,94 mM) og TPCK (0,27 mg, 0,2 mM) og inkuberes over natten ved 37°c. Fremstillingen av den i overskriften nevnte forbindelse bekreftes ved HPLC væskekromatografering og utbyttet beregnes å være 80 %.

Reaksjonsblandingen behandles på samme måte som i Eksempel 1 (2). Den resulterende fraksjon A rekromatograferes for å fjerne desasparagin-(A21)-desalanin-(B30)-insulin og behandles på samme måte som i Eksempel 1 (2) til å gi et råpulver (63 mg). Produktet identifiseres som den i overskriften nevnte forbindelse ved hjelp av HPLC væskekromatografering og gel-elektroforese.

Ek sempel 3

(1) [B30-Thr-OBu<t>]-svine-insulin.

Desalanin-(B30)-svine-insulin (100 mg, 10 mM) fremstilt ved hjelp av prosessen i Eksempel 1 (1) og L-threonin-t-butylester (205 mg, 500 mM) oppløses i en blanding (1.05 ml) av etanol og dimetylformamid (1:1, v/v volumbasis). Oppløsnin-gen blandes med en 0,5 M borat buffer-løsning (0,7 ml) av protease I (0,35 mg) fremstilt av Achromobacter lyticus M497-1 og inkuberes ved 37°C i 2 døgn. Reaksjonsblandingen gjøres sur med iseddik og tilføres en gel-filtrering med en kolonne (4,2 x 130 cm) av "Sephadex G 50" av superfine par-tikler til separering til en enzym-fraksjon, en insulin-fraksjon og en threoninfraksjon. Enzymet og L-threonin-t-butylester gjenvinnes med mer enn 50 %. Insulin-fraksjonen frysetørkes til å gi et råpulver (83 mg). Pulveret tilføres kolonne-kromatografering på samme måte som i Eksempel 1 (2) til å gi et pulver (48 mg) fra fraksjon A og et annet pulver (20 mg) fra fraksjon B. Den førstnevnte identifiseres å være den i overskriften nevnte forbindelse og den sistnevnte identifiseres til å være en blanding av desalanin-(B30)-svine-insulin og forurenset svine-insulin.

Mellomproduktet (utgangsforbindelsen) i henhold til den foreliggende oppfinnelse er ny og kan ved en enkel fremgangsmåte føre til human-insuliner med særdeles høyt utbytte, således 93,3 % i Eksempel 1, 95,2 % i Eksempel 2 og 92,5 % i Eksempel 3 i et trinn med fjernelse av beskyttelsesgruppene. For nærmere detaljer ved dette trinn vises det til norsk patentskrift 153.061.

Claims (1)

1. Mellomprodukt (utgangsforbindelse) egnet for fremstilling av et B30-threonininsulin, i form av et beskyttet B30-Thr-(R1)(R<2>)-insulin,

   karakterisert ved at Thr er L-threoningruppen, R<1> er hydrogen, t-butyl, benzyl eller acetyl, og R<2> er en alkylester, særlig en t-butylester, en aralkylester, særlig en benzylester, en amidgruppe, et substituert amid, særlig et anilid, eller et salt, særlig natriumsaltet.