JPH0586094A - ペプチドおよびその製造方法 - Google Patents
ペプチドおよびその製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 小麦蛋白を酸性プロテアーゼで加水分解した
後，中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼで
更に加水分解してオピオイド活性を有するペプチド類を
製造する方法，並びにそのような加水分解処理法や化学
合成法により得られる特に式 Gly-Tyr-Tyr-Pro，Gly-Ty
r-Tyr-Pro-Thr，Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr-Ser，Tyr-Gly-Gl
y-Trp-Leu，Tyr-Gly-Gly-Trp又はTry-Pro-Ile-Ser-Leu
で表されるアミノ酸配列を有するペプチド類，並びにそ
れらのペプチド類及びその塩を有効成分とするオピオイ
ド活性を有する剤。 【効果】 これらのペプチド類及びその塩は，オピオイ
ド活性を有し，且つ安全性が高いため，鎮痛麻酔剤，催
眠剤，消化管ホルモン促進剤，腸管ぜん動抑制による下
痢改善剤等として有用である。
後，中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼで
更に加水分解してオピオイド活性を有するペプチド類を
製造する方法，並びにそのような加水分解処理法や化学
合成法により得られる特に式 Gly-Tyr-Tyr-Pro，Gly-Ty
r-Tyr-Pro-Thr，Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr-Ser，Tyr-Gly-Gl
y-Trp-Leu，Tyr-Gly-Gly-Trp又はTry-Pro-Ile-Ser-Leu
で表されるアミノ酸配列を有するペプチド類，並びにそ
れらのペプチド類及びその塩を有効成分とするオピオイ
ド活性を有する剤。 【効果】 これらのペプチド類及びその塩は，オピオイ
ド活性を有し，且つ安全性が高いため，鎮痛麻酔剤，催
眠剤，消化管ホルモン促進剤，腸管ぜん動抑制による下
痢改善剤等として有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は，オピオイド活性を有す
るペプチドおよびその塩，その製造方法，並びに当該ペ
プチドおよびその塩を有効成分として含むオピオイド活
性を有する剤に関する。
るペプチドおよびその塩，その製造方法，並びに当該ペ
プチドおよびその塩を有効成分として含むオピオイド活
性を有する剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】食品中には高次の生命活動に関与する多
数の生体調節因子が存在することが広く知られるように
なっており，それらの生体調節因子を健康の増進，病気
の予防や治療，老化の予防等に積極的に利用することが
近年色々試みられるようになっている。そのような生体
調節因子としては神経系，消化吸収系，循環系，生体防
御・免疫系，内分泌系，細胞分化・増殖系等に作用する
種々の因子が知られている。それらのうちで，ある種の
食品蛋白質中には神経系に作用してモルヒネ様の麻酔，
鎮痛作用等（いわゆるオピオイド活性）を有するペプチ
ド単位が存在していることが明らかになっており，その
ようなペプチドはオピオイドペプチドと一般に称されて
いる。
数の生体調節因子が存在することが広く知られるように
なっており，それらの生体調節因子を健康の増進，病気
の予防や治療，老化の予防等に積極的に利用することが
近年色々試みられるようになっている。そのような生体
調節因子としては神経系，消化吸収系，循環系，生体防
御・免疫系，内分泌系，細胞分化・増殖系等に作用する
種々の因子が知られている。それらのうちで，ある種の
食品蛋白質中には神経系に作用してモルヒネ様の麻酔，
鎮痛作用等（いわゆるオピオイド活性）を有するペプチ
ド単位が存在していることが明らかになっており，その
ようなペプチドはオピオイドペプチドと一般に称されて
いる。
【０００３】食品から得られる外来性オピオイドペプチ
ドの最初の例は１９７９年にBrantlらにより発見された
牛乳β−カゼイン由来の配列番号７で表されるペプチド
であり，これはβ−casomorphin（１−７)と命名され
た。カゼイン由来のオピオイドペプチドはその後も多数
発見されており，例えば，配列番号８で表されるβ−ca
somorphin（１−５）（Henschen:1979)、β−casomorph
in（１−３)（Tyr−Pro−Phe：Lottspeichら:1980），
配列番号９で表されるα−casein exorphin（Loukasら:
1983）がある。一方，上記したβ−casomorphin（１−
７）の発見と同じ年 (1979）にZioudrouらは小麦グルテ
ンのペプシン分解物からグルテンエクソルフィンと呼ば
れるオピオイドペプチドを単離したがその構造は未決定
であった[J.Biol.Chem.,254, 2446（1979)］。また，１
９８７年にGrafらはカゼイン中に含まれるβ−カゾモル
フィンと呼ばれるオピオイドペプチドと構造が極めて類
似している配列番号１０で表されるペプチド（グリアド
ルフィン）を小麦蛋白の一種であるα−グリアジン中に
見出して化学合成したが，このペプチドはオピオイド活
性を示さなかった［Neuropeptides, 9, 113 (1987)］。
ドの最初の例は１９７９年にBrantlらにより発見された
牛乳β−カゼイン由来の配列番号７で表されるペプチド
であり，これはβ−casomorphin（１−７)と命名され
た。カゼイン由来のオピオイドペプチドはその後も多数
発見されており，例えば，配列番号８で表されるβ−ca
somorphin（１−５）（Henschen:1979)、β−casomorph
in（１−３)（Tyr−Pro−Phe：Lottspeichら:1980），
配列番号９で表されるα−casein exorphin（Loukasら:
1983）がある。一方，上記したβ−casomorphin（１−
７）の発見と同じ年 (1979）にZioudrouらは小麦グルテ
ンのペプシン分解物からグルテンエクソルフィンと呼ば
れるオピオイドペプチドを単離したがその構造は未決定
であった[J.Biol.Chem.,254, 2446（1979)］。また，１
９８７年にGrafらはカゼイン中に含まれるβ−カゾモル
フィンと呼ばれるオピオイドペプチドと構造が極めて類
似している配列番号１０で表されるペプチド（グリアド
ルフィン）を小麦蛋白の一種であるα−グリアジン中に
見出して化学合成したが，このペプチドはオピオイド活
性を示さなかった［Neuropeptides, 9, 113 (1987)］。
【０００４】オピオイドペプチドが消化管や消化管ホル
モン分泌に対して影響を有することが知られており，そ
して小麦グルテンの分解物を経口投与した場合に食物の
腸内滞留時間の延長，血中のインシュリンやソマトスタ
チン量の上昇等のオピオイド活性による影響が観察され
るという報告もあることから，小麦グルテンの加水分解
物からオピオイドペプチドを得ようとする試みはこれま
で色々なされてきたが，現在までに小麦グルテンに由来
するオピオイドペプチドを単離し，その構造を決定した
という報告は知られていない。
モン分泌に対して影響を有することが知られており，そ
して小麦グルテンの分解物を経口投与した場合に食物の
腸内滞留時間の延長，血中のインシュリンやソマトスタ
チン量の上昇等のオピオイド活性による影響が観察され
るという報告もあることから，小麦グルテンの加水分解
物からオピオイドペプチドを得ようとする試みはこれま
で色々なされてきたが，現在までに小麦グルテンに由来
するオピオイドペプチドを単離し，その構造を決定した
という報告は知られていない。
【０００５】
【発明の内容】上記のような状況下に本発明者らは小麦
蛋白の分解物からオピオイド活性を有するペプチドを得
るべく研究を進めてきた。その結果，小麦蛋白を酸性プ
ロテアーゼを使用して加水分解した後，中性プロテアー
ゼまたはアルカリ性プロテアーゼを使用して更に加水分
解して得られたペプチド混合物を高速液体クロマトグラ
フィーを用いた逆相クロマトグラフィーで分画すると，
そのうちの特定の画分がオピオイド活性を有するペプチ
ドからなることを見出した。
蛋白の分解物からオピオイド活性を有するペプチドを得
るべく研究を進めてきた。その結果，小麦蛋白を酸性プ
ロテアーゼを使用して加水分解した後，中性プロテアー
ゼまたはアルカリ性プロテアーゼを使用して更に加水分
解して得られたペプチド混合物を高速液体クロマトグラ
フィーを用いた逆相クロマトグラフィーで分画すると，
そのうちの特定の画分がオピオイド活性を有するペプチ
ドからなることを見出した。
【０００６】特に，小麦蛋白を酸性プロテアーゼで加水
分解した後，更に中性プロテアーゼまたはアルカリ性プ
ロテアーゼ（特にサーモライシン等のバチルス起源の中
性プロテアーゼ，アスペルギルス起源の中性プロテアー
ゼまたはバチルス起源のアルカリ性プロテアーゼ）を使
用して更に加水分解を行ってペプチド混合物を形成さ
せ，そこから得られたオピオイド活性を有する画分を単
離，精製して，その構造を決定したところ，グリシン−
チロシン−チロシン−プロリンが配列した配列番号１で
表される新規なペプチド，グリシン−チロシン−チロシ
ン−プロリン−スレオニンが配列した配列番号２で表さ
れる新規なペプチド，チロシン−グリシン−グリシン−
トリプトファン−ロイシンが配列した配列番号４で表さ
れるペプチド，およびチロシン−グリシン−グリシン−
トリプトファンが配列した配列番号５で表されるペプチ
ドであることを見出した。
分解した後，更に中性プロテアーゼまたはアルカリ性プ
ロテアーゼ（特にサーモライシン等のバチルス起源の中
性プロテアーゼ，アスペルギルス起源の中性プロテアー
ゼまたはバチルス起源のアルカリ性プロテアーゼ）を使
用して更に加水分解を行ってペプチド混合物を形成さ
せ，そこから得られたオピオイド活性を有する画分を単
離，精製して，その構造を決定したところ，グリシン−
チロシン−チロシン−プロリンが配列した配列番号１で
表される新規なペプチド，グリシン−チロシン−チロシ
ン−プロリン−スレオニンが配列した配列番号２で表さ
れる新規なペプチド，チロシン−グリシン−グリシン−
トリプトファン−ロイシンが配列した配列番号４で表さ
れるペプチド，およびチロシン−グリシン−グリシン−
トリプトファンが配列した配列番号５で表されるペプチ
ドであることを見出した。
【０００７】更に，小麦蛋白を酸性プロテアーゼで加水
分解した後，中性プロテアーゼとしてトリプシンとキモ
トリプシンの両者を使用して加水分解処理を行ってペプ
チド混合物を形成し，そこから得られたオピオイド活性
を有する画分を単離，精製して，その構造を決定したと
ころ，チロシン−プロリン−イソロイシン−セリン−ロ
イシンが配列した配列番号６で表されるペプチドである
ことを見出した。
分解した後，中性プロテアーゼとしてトリプシンとキモ
トリプシンの両者を使用して加水分解処理を行ってペプ
チド混合物を形成し，そこから得られたオピオイド活性
を有する画分を単離，精製して，その構造を決定したと
ころ，チロシン−プロリン−イソロイシン−セリン−ロ
イシンが配列した配列番号６で表されるペプチドである
ことを見出した。
【０００８】また，配列番号３で表されるペプチドのア
ミノ酸配列自体も，小麦グルテニンのアミノ酸配列中に
複数個存在することが報告されているところから［Bioc
hemica et Biophysica Acta,788(1984),35-40］，配列
番号２のペプチドのＣ末端を延長して配列番号３で表さ
れるペプチドを化学的に合成したところ，この配列番号
３で表されるペプチドも配列番号１，配列番号２，配列
番号４，配列番号５および配列番号６で表されるペプチ
ドと同様にオピオイド活性を示すことを見出した。
ミノ酸配列自体も，小麦グルテニンのアミノ酸配列中に
複数個存在することが報告されているところから［Bioc
hemica et Biophysica Acta,788(1984),35-40］，配列
番号２のペプチドのＣ末端を延長して配列番号３で表さ
れるペプチドを化学的に合成したところ，この配列番号
３で表されるペプチドも配列番号１，配列番号２，配列
番号４，配列番号５および配列番号６で表されるペプチ
ドと同様にオピオイド活性を示すことを見出した。
【０００９】したがって，本発明は，小麦蛋白を酸性プ
ロテアーゼを使用して加水分解した後，中性プロテアー
ゼまたはアルカリ性プロテアーゼを使用して更に加水分
解し，得られた加水分解物からオピオイド活性を有する
ペプチドを回収することを特徴とするオピオイドペプチ
ドの製造方法であり，ここで製造されたオピオイドペプ
チドにはその化学構造が明らかなもの，および明らかで
ないオピオイドペプチドの両方が含まれる。そして，本
発明のかかる製造方法で使用する小麦蛋白は，グルテン
のみからなっていても，またはグルテンから主としてな
っていてアルブミン，グロブリン等の小麦中に含有され
ることが知られている他の蛋白質を含有しているもので
あってもよい。
ロテアーゼを使用して加水分解した後，中性プロテアー
ゼまたはアルカリ性プロテアーゼを使用して更に加水分
解し，得られた加水分解物からオピオイド活性を有する
ペプチドを回収することを特徴とするオピオイドペプチ
ドの製造方法であり，ここで製造されたオピオイドペプ
チドにはその化学構造が明らかなもの，および明らかで
ないオピオイドペプチドの両方が含まれる。そして，本
発明のかかる製造方法で使用する小麦蛋白は，グルテン
のみからなっていても，またはグルテンから主としてな
っていてアルブミン，グロブリン等の小麦中に含有され
ることが知られている他の蛋白質を含有しているもので
あってもよい。
【００１０】そして，上記本発明の製造方法は，小麦蛋
白を酸性プロテアーゼで加水分解した後，中性プロテア
ーゼとしてバチルス起源の中性プロテアーゼであるサー
モライシンまたはアスペルギルス起源の中性プロテアー
ゼを使用して更に加水分解を行って，配列番号１，配列
番号２，配列番号３，配列番号４または配列番号５で表
されるオピオイドペプチドを製造する方法；並びに小麦
蛋白を酸性プロテアーゼで加水分解した後，中性プロテ
アーゼとしてトリプシンおよびキモトリプシンを使用し
て加水分解を行って，配列番号６で表されるオピオイド
ペプチドを製造する方法を包含する。
白を酸性プロテアーゼで加水分解した後，中性プロテア
ーゼとしてバチルス起源の中性プロテアーゼであるサー
モライシンまたはアスペルギルス起源の中性プロテアー
ゼを使用して更に加水分解を行って，配列番号１，配列
番号２，配列番号３，配列番号４または配列番号５で表
されるオピオイドペプチドを製造する方法；並びに小麦
蛋白を酸性プロテアーゼで加水分解した後，中性プロテ
アーゼとしてトリプシンおよびキモトリプシンを使用し
て加水分解を行って，配列番号６で表されるオピオイド
ペプチドを製造する方法を包含する。
【００１１】また，本発明は，小麦蛋白を酸性プロテア
ーゼを使用して加水分解した後，更に中性プロテアーゼ
またはアルカリ性プロテアーゼを使用して加水分解する
ことにより得られるオピオイドペプチド自体を包含する
ものであり，そのようなオピオイドペプチドには，配列
番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番
号５または配列番号６で表されるオピオイドペプチドお
よびそれらの混合物が含まれる。
ーゼを使用して加水分解した後，更に中性プロテアーゼ
またはアルカリ性プロテアーゼを使用して加水分解する
ことにより得られるオピオイドペプチド自体を包含する
ものであり，そのようなオピオイドペプチドには，配列
番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番
号５または配列番号６で表されるオピオイドペプチドお
よびそれらの混合物が含まれる。
【００１２】更に，配列番号１，配列番号２，配列番号
３，配列番号４，配列番号５および配列番号６で表され
るペプチド並びにその塩は，化学合成によっても製造す
ることができ，したがって本発明は，配列番号１，配列
番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５および配
列番号６で表されるペプチド並びにその塩を化学合成す
る方法を包含する。
３，配列番号４，配列番号５および配列番号６で表され
るペプチド並びにその塩は，化学合成によっても製造す
ることができ，したがって本発明は，配列番号１，配列
番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５および配
列番号６で表されるペプチド並びにその塩を化学合成す
る方法を包含する。
【００１３】上記の点から，本発明は，その製造方法の
如何を問わず，配列番号１，配列番号２，配列番号３，
配列番号４，配列番号５および配列番号６で表されるペ
プチド並びにその塩自体を包含する。更に，本発明は，
配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配
列番号５および配列番号６で表されるペプチド並びにそ
の塩の１種または２種以上を有効成分として含むオピオ
イド活性を有する剤をも包含する。
如何を問わず，配列番号１，配列番号２，配列番号３，
配列番号４，配列番号５および配列番号６で表されるペ
プチド並びにその塩自体を包含する。更に，本発明は，
配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配
列番号５および配列番号６で表されるペプチド並びにそ
の塩の１種または２種以上を有効成分として含むオピオ
イド活性を有する剤をも包含する。
【００１４】そして，上記６種類のペプチドのうち，配
列番号１，配列番号２，配列番号４および配列番号５で
表されるペプチドは，上記したようにグルテンを酸性プ
ロテアーゼで加水分解した後，更に上記したような微生
物起源の中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアー
ゼを使用して加水分解して得られたペプチド混合物中に
発見され回収したものである。また，配列番号６で表さ
れるペプチドはグルテンを酸性プロテアーゼで加水分解
した後，生体内に存在する中性プロテアーゼであるトリ
プシンとキモトリプシンで加水分解処理して得られるペ
プチド混合物中に発見され回収したものである。更に，
配列番号３で表されるペプチドはその存在を小麦グルテ
ニンの一次構造より見いだして化学的に合成したもので
ある。したがって，その場合には，それら６種類のペプ
チドを構成する８種類のアミノ酸Gly，Tyr，Pro，Thr，
Ser，Trp，Leu，Ile は，天然のグルテンに由来するた
めに，いずれもＬ-アミノ酸である。しかしながら本発
明のペプチドは，それらのＬ−アミノ酸からなるものに
限定されず，配列番号１〜配列番号６で表されるアミノ
酸配列を有するペプチドであればどのような光学異性体
であってもよい。例えば，アミノ酸の全部がＤ−アミノ
酸からなっていても，４〜８個のアミノ酸のうちのいず
れかがＬ−アミノ酸であって残りがＤ−アミノ酸からな
るペプチドも包含され，そのようなペプチドは化学合成
により製造することができる。
列番号１，配列番号２，配列番号４および配列番号５で
表されるペプチドは，上記したようにグルテンを酸性プ
ロテアーゼで加水分解した後，更に上記したような微生
物起源の中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアー
ゼを使用して加水分解して得られたペプチド混合物中に
発見され回収したものである。また，配列番号６で表さ
れるペプチドはグルテンを酸性プロテアーゼで加水分解
した後，生体内に存在する中性プロテアーゼであるトリ
プシンとキモトリプシンで加水分解処理して得られるペ
プチド混合物中に発見され回収したものである。更に，
配列番号３で表されるペプチドはその存在を小麦グルテ
ニンの一次構造より見いだして化学的に合成したもので
ある。したがって，その場合には，それら６種類のペプ
チドを構成する８種類のアミノ酸Gly，Tyr，Pro，Thr，
Ser，Trp，Leu，Ile は，天然のグルテンに由来するた
めに，いずれもＬ-アミノ酸である。しかしながら本発
明のペプチドは，それらのＬ−アミノ酸からなるものに
限定されず，配列番号１〜配列番号６で表されるアミノ
酸配列を有するペプチドであればどのような光学異性体
であってもよい。例えば，アミノ酸の全部がＤ−アミノ
酸からなっていても，４〜８個のアミノ酸のうちのいず
れかがＬ−アミノ酸であって残りがＤ−アミノ酸からな
るペプチドも包含され，そのようなペプチドは化学合成
により製造することができる。
【００１５】また，本発明における「オピオイド活性を
有する剤」とは，鎮痛，麻酔，情動，呼吸，脈動，体
温，消化管機能，摂食，免疫，インシュリンやソマトス
タチン等のホルモンの分泌調節，電解質の吸収促進，心
筋の収縮調節等に関与するいわゆるオピオイド活性とし
て認識されている活性を有する剤をいう。
有する剤」とは，鎮痛，麻酔，情動，呼吸，脈動，体
温，消化管機能，摂食，免疫，インシュリンやソマトス
タチン等のホルモンの分泌調節，電解質の吸収促進，心
筋の収縮調節等に関与するいわゆるオピオイド活性とし
て認識されている活性を有する剤をいう。
【００１６】下記の方法に限定されないが，本発明のペ
プチドの調製法の例を挙げると以下のとおりである。小麦グルテンの加水分解による方法 小麦グルテンをプロテアーゼを使用して加水分解して水
溶性のペプチド混合物を調製する。この場合に，まず小
麦グルテンを希塩酸等の酸性溶液中に分散溶解させた状
態で酸性プロテアーゼで加水分解し，次いで中和または
アルカリ性にした後に中性プロテアーゼまたはアルカリ
性プロテアーゼで更に加水分解してペプチド混合物を調
製するのがよい。
プチドの調製法の例を挙げると以下のとおりである。小麦グルテンの加水分解による方法 小麦グルテンをプロテアーゼを使用して加水分解して水
溶性のペプチド混合物を調製する。この場合に，まず小
麦グルテンを希塩酸等の酸性溶液中に分散溶解させた状
態で酸性プロテアーゼで加水分解し，次いで中和または
アルカリ性にした後に中性プロテアーゼまたはアルカリ
性プロテアーゼで更に加水分解してペプチド混合物を調
製するのがよい。
【００１７】酸性プロテアーゼの例としては，ペプシ
ン，ヒイロタケ起源のアスパルティックプロティナー
ゼ，アスペルギルス起源のアスパルティックプロティナ
ーゼ，ペニシリウム起源のアスパルティックプロティナ
ーゼを挙げることができる。酸性プロテアーゼは，１種
類のみを使用しても，またはプロテアーゼ同士がお互い
に悪影響を及ぼさないかぎりは複数種を併用することも
できる。複数の酸性プロテアーゼを使用する場合は，複
数の酸性プロテアーゼを同時に存在下させて加水分解を
行っても，または１種類ずつ逐次に用いて加水分解を行
ってもよい。
ン，ヒイロタケ起源のアスパルティックプロティナー
ゼ，アスペルギルス起源のアスパルティックプロティナ
ーゼ，ペニシリウム起源のアスパルティックプロティナ
ーゼを挙げることができる。酸性プロテアーゼは，１種
類のみを使用しても，またはプロテアーゼ同士がお互い
に悪影響を及ぼさないかぎりは複数種を併用することも
できる。複数の酸性プロテアーゼを使用する場合は，複
数の酸性プロテアーゼを同時に存在下させて加水分解を
行っても，または１種類ずつ逐次に用いて加水分解を行
ってもよい。
【００１８】そして，中性プロテアーゼの例としては，
バチルス起源の耐熱性プロテアーゼであるサーモライシ
ン，アスペルギルス起源の中性プロテアーゼ，ストレプ
トマイセス起源の中性プロテアーゼ，リゾプス起源の中
性プロテアーゼ等の微生物起源の金属プロテアーゼ；パ
パイン，ブロメライン等の植物起源の中性プロテアー
ゼ；トリプシン，キモトリプシン，プラスミン，トロン
ビン等の動物の生体内等に存在する中性プロテアーゼ挙
げることができる。また，アルカリ性プロテアーゼとし
ては，バチルス起源のセリンプロテアーゼ等を挙げるこ
とができる。中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテ
アーゼは，１種類のみを使用しても，またはプロテアー
ゼ同士がお互いに悪影響を及ぼさないかぎりは複数種を
併用することもできる。複数の中性プロテアーゼを使用
する場合は，複数の中性プロテアーゼを同時に存在下さ
せて加水分解を行っても，または１種類ずつ逐次に用い
て加水分解を行ってもよい。
バチルス起源の耐熱性プロテアーゼであるサーモライシ
ン，アスペルギルス起源の中性プロテアーゼ，ストレプ
トマイセス起源の中性プロテアーゼ，リゾプス起源の中
性プロテアーゼ等の微生物起源の金属プロテアーゼ；パ
パイン，ブロメライン等の植物起源の中性プロテアー
ゼ；トリプシン，キモトリプシン，プラスミン，トロン
ビン等の動物の生体内等に存在する中性プロテアーゼ挙
げることができる。また，アルカリ性プロテアーゼとし
ては，バチルス起源のセリンプロテアーゼ等を挙げるこ
とができる。中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテ
アーゼは，１種類のみを使用しても，またはプロテアー
ゼ同士がお互いに悪影響を及ぼさないかぎりは複数種を
併用することもできる。複数の中性プロテアーゼを使用
する場合は，複数の中性プロテアーゼを同時に存在下さ
せて加水分解を行っても，または１種類ずつ逐次に用い
て加水分解を行ってもよい。
【００１９】上記したように，小麦蛋白を酸性プロテア
ーゼ加水分解した後，上記した微生物起源の中性プロテ
アーゼ，植物起源の中性プロテアーゼまたはアルカリ性
プロテアーゼを使用して更に加水分解すると，配列番号
１〜配列番号５で表されるペプチドを含有するペプチド
混合物を得ることができる。また，小麦蛋白を酸性プロ
テアーゼ加水分解した後，中性プロテアーゼとしてトリ
プシンおよびキモトリプシン等の生体内プロテアーゼを
使用して加水分解すると，配列番号６で表されるペプチ
ドを含有するペプチド混合物を得ることができる。この
場合，トリプシンとキモトリプシンは同時に作用させて
も，または逐次に作用させてもよい。
ーゼ加水分解した後，上記した微生物起源の中性プロテ
アーゼ，植物起源の中性プロテアーゼまたはアルカリ性
プロテアーゼを使用して更に加水分解すると，配列番号
１〜配列番号５で表されるペプチドを含有するペプチド
混合物を得ることができる。また，小麦蛋白を酸性プロ
テアーゼ加水分解した後，中性プロテアーゼとしてトリ
プシンおよびキモトリプシン等の生体内プロテアーゼを
使用して加水分解すると，配列番号６で表されるペプチ
ドを含有するペプチド混合物を得ることができる。この
場合，トリプシンとキモトリプシンは同時に作用させて
も，または逐次に作用させてもよい。
【００２０】配列番号１〜配列番号６で表されるペプチ
ドを製造するに当たって，酸性プロテアーゼとして，ペ
プシンを使用すると，目的物を高収率で得ることができ
好ましい。また，配列番号１，２，４および５で表され
るペプチドを製造するに当たって，中性プロテアーゼと
してバチルス起源のサーモライシンまたはアスペルギル
ス（特にアスペルギルスオリゼー）起源の中性プロテア
ーゼを使用すると，目的物を高収率で得ることができ好
ましい。
ドを製造するに当たって，酸性プロテアーゼとして，ペ
プシンを使用すると，目的物を高収率で得ることができ
好ましい。また，配列番号１，２，４および５で表され
るペプチドを製造するに当たって，中性プロテアーゼと
してバチルス起源のサーモライシンまたはアスペルギル
ス（特にアスペルギルスオリゼー）起源の中性プロテア
ーゼを使用すると，目的物を高収率で得ることができ好
ましい。
【００２１】そして，酸性プロテアーゼ，中性プロテア
ーゼおよびアルカリ性プロテアーゼは，いずれもフリー
の状態で使用しても，または固定化して使用してもよ
い。プロテアーゼの使用量は，いずれの場合も乾燥した
グルテン１００ｇ当たり，プロテアーゼ約５,０００〜
１００,０００ unitsの割合で用いるとよい。
ーゼおよびアルカリ性プロテアーゼは，いずれもフリー
の状態で使用しても，または固定化して使用してもよ
い。プロテアーゼの使用量は，いずれの場合も乾燥した
グルテン１００ｇ当たり，プロテアーゼ約５,０００〜
１００,０００ unitsの割合で用いるとよい。
【００２２】ここで本明細書中のプロテアーゼ活性（un
it）はすべて下記の方法により測定した。 《プロテアーゼ活性（unit）の測定》基質として米国メ
ルク社製のハマーステインカゼイン１％溶液を用い，ア
ンソン−萩原変法［赤堀四郎編 “酵素研究法” 第２
巻，第２３７頁（昭和３６年１月１０日；朝倉書店発
行）］により測定した。反応は３０℃で３０分間行い１
分間に１μｇのチロシン相当量を遊離するのに要する酵
素量を１unitとした。
it）はすべて下記の方法により測定した。 《プロテアーゼ活性（unit）の測定》基質として米国メ
ルク社製のハマーステインカゼイン１％溶液を用い，ア
ンソン−萩原変法［赤堀四郎編 “酵素研究法” 第２
巻，第２３７頁（昭和３６年１月１０日；朝倉書店発
行）］により測定した。反応は３０℃で３０分間行い１
分間に１μｇのチロシン相当量を遊離するのに要する酵
素量を１unitとした。
【００２３】プロテアーゼ処理は，各々の状況（例えば
プロテアーゼの種類，プロテアーゼの使用形態等）に応
じて最適のｐＨ，温度，プロテアーゼ量，処理速度，処
理時間等の条件を選択して行うのがよい。例えば酸性プ
ロテアーゼとしてペプシンを使用して加水分解してから
サーモライシンで加水分解する場合，または酸性プロテ
アーゼとしてペプシンを使用して加水分解してからトリ
プシンとキモトリプシンで加水分解する場合は，グルテ
ンの水溶液または水性分散液のｐＨを約１.５〜５.０と
して，温度約３０〜５０℃でペプシンにより加水分解
し，次いで液のｐＨを約６.０〜８.０とした後，サーモ
ライシン，またはトリプシンとキモトリプシンを温度約
３０〜５０℃で作用させて０.７５Ｍトリクロロ酢酸へ
の溶解率が約４０〜８０％になるまで加水分解を行うと
よい。
プロテアーゼの種類，プロテアーゼの使用形態等）に応
じて最適のｐＨ，温度，プロテアーゼ量，処理速度，処
理時間等の条件を選択して行うのがよい。例えば酸性プ
ロテアーゼとしてペプシンを使用して加水分解してから
サーモライシンで加水分解する場合，または酸性プロテ
アーゼとしてペプシンを使用して加水分解してからトリ
プシンとキモトリプシンで加水分解する場合は，グルテ
ンの水溶液または水性分散液のｐＨを約１.５〜５.０と
して，温度約３０〜５０℃でペプシンにより加水分解
し，次いで液のｐＨを約６.０〜８.０とした後，サーモ
ライシン，またはトリプシンとキモトリプシンを温度約
３０〜５０℃で作用させて０.７５Ｍトリクロロ酢酸へ
の溶解率が約４０〜８０％になるまで加水分解を行うと
よい。
【００２４】目的とする加水分解状態が達成された時点
で加熱によりおよび／またはｐＨを調整して，プロテア
ーゼを失活させ，失活した酵素，未分解グルテン等の不
溶性固形物を遠心分離等の適当な手段で分離除去し，残
留液中に含まれているペプチド混合物を乾燥等により回
収する。次いで，このペプチド混合物を水等に溶解させ
た状態で高速液体クロマトグラフィー（例えば逆相カラ
ムを使用した高速液体クロマトグラフィー）等により処
理して上記ペプチドを純粋な形態で単離する。
で加熱によりおよび／またはｐＨを調整して，プロテア
ーゼを失活させ，失活した酵素，未分解グルテン等の不
溶性固形物を遠心分離等の適当な手段で分離除去し，残
留液中に含まれているペプチド混合物を乾燥等により回
収する。次いで，このペプチド混合物を水等に溶解させ
た状態で高速液体クロマトグラフィー（例えば逆相カラ
ムを使用した高速液体クロマトグラフィー）等により処
理して上記ペプチドを純粋な形態で単離する。
【００２５】上記したペプチド混合物を含有する水溶液
からの配列番号１，配列番号２，配列番号４および配列
番号５で表されるペプチドの単離は，例えば，次の（ａ
1)〜(ｈ1)の工程からなる方法で行うことができる。
からの配列番号１，配列番号２，配列番号４および配列
番号５で表されるペプチドの単離は，例えば，次の（ａ
1)〜(ｈ1)の工程からなる方法で行うことができる。
【００２６】［配列番号１，配列番号２，配列番号４お
よび配列番号５で表されるペプチドの単離］ (ａ1) 小麦グルテンをペプシンおよびサーモライシン
によって上記のようにして逐次に加水分解して得られた
ペプチド混合物を，高速液体クロマトグラフィー(使用
カラムは例えばナカライテスク社製のＯＤＳカラムであ
るCosmosil ５Ｃ18−ＡＲに供して，０.０５％トリフル
オロ酢酸水溶液（Ａ液）と０.０５％トリフルオロ酢酸
を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）で，Ｂ液の濃度
が０％から４０％まで直線的に増加する濃度勾配にて溶
出し，アセトニトリル濃度が約２２.５〜２３.５％の範
囲のピーク画分（画分Ｉ），約２４〜２５％の範囲のピ
ーク（画分II），約２８〜２９％の範囲のピーク画分
（画分III）および約３４〜３５％の範囲のピーク画分
（画分IV）を各々分取し，これらの画分のオピオイド活
性を確認する;
よび配列番号５で表されるペプチドの単離］ (ａ1) 小麦グルテンをペプシンおよびサーモライシン
によって上記のようにして逐次に加水分解して得られた
ペプチド混合物を，高速液体クロマトグラフィー(使用
カラムは例えばナカライテスク社製のＯＤＳカラムであ
るCosmosil ５Ｃ18−ＡＲに供して，０.０５％トリフル
オロ酢酸水溶液（Ａ液）と０.０５％トリフルオロ酢酸
を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）で，Ｂ液の濃度
が０％から４０％まで直線的に増加する濃度勾配にて溶
出し，アセトニトリル濃度が約２２.５〜２３.５％の範
囲のピーク画分（画分Ｉ），約２４〜２５％の範囲のピ
ーク（画分II），約２８〜２９％の範囲のピーク画分
（画分III）および約３４〜３５％の範囲のピーク画分
（画分IV）を各々分取し，これらの画分のオピオイド活
性を確認する;
【００２７】(ｂ1) 工程(ａ1)で得たオピオイド活性画
分を上記工程(ａ1)で使用したカラムと特性の異なるカ
ラムを使用した逆相クロマトグラフィー（使用カラムは
例えばナカライテスク社製のCosmosil ５Ｐｈ)に供し
て，工程(ａ1)と同様にして溶出して，画分Ｉについて
はアセトニトリル濃度約２４〜２５％の範囲のピーク画
分（画分Ｉ−１），画分IIについてはアセトニトリル濃
度約３３〜３４％の範囲のピーク画分（画分II−１），
画分IIIについてはアセトニトリル濃度約３０〜３１％
の範囲のピーク画分（画分III−１）および画分IVにつ
いてはアセトニトリル濃度約３６〜３７％の範囲のピー
ク画分（画分IV−１）を分取し，これらの画分のオピオ
イド活性を確認する；
分を上記工程(ａ1)で使用したカラムと特性の異なるカ
ラムを使用した逆相クロマトグラフィー（使用カラムは
例えばナカライテスク社製のCosmosil ５Ｐｈ)に供し
て，工程(ａ1)と同様にして溶出して，画分Ｉについて
はアセトニトリル濃度約２４〜２５％の範囲のピーク画
分（画分Ｉ−１），画分IIについてはアセトニトリル濃
度約３３〜３４％の範囲のピーク画分（画分II−１），
画分IIIについてはアセトニトリル濃度約３０〜３１％
の範囲のピーク画分（画分III−１）および画分IVにつ
いてはアセトニトリル濃度約３６〜３７％の範囲のピー
ク画分（画分IV−１）を分取し，これらの画分のオピオ
イド活性を確認する；
【００２８】(ｃ1) 工程(ｂ1)得たオピオイド活性画分
を工程(ａ1)および(ｂ1)で使用したカラムとは特性の異
なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィー（使用カ
ラムは例えばナカライテスク社製のCosmosil ５ＣＮ−
Ｒ）に供して，工程(ａ1)および(ｂ1)と同様にして溶出
し，画分Ｉ−１についてはアセトニトリル濃度が約１８
〜１９％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｉ−２），画分
II−１についてはアセトニトリル濃度が約２７％付近の
高吸収ピーク画分(画分II−２)，画分III−１について
はアセトニトリル濃度が約２６〜２７％の範囲のピーク
画分（画分III−２），そして画分IV−１についてはア
セトニトリル濃度が約３２〜３３％の範囲のピーク画分
(画分IV−２)を分取して，これらの画分のオピオイド活
性を確認する;
を工程(ａ1)および(ｂ1)で使用したカラムとは特性の異
なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィー（使用カ
ラムは例えばナカライテスク社製のCosmosil ５ＣＮ−
Ｒ）に供して，工程(ａ1)および(ｂ1)と同様にして溶出
し，画分Ｉ−１についてはアセトニトリル濃度が約１８
〜１９％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｉ−２），画分
II−１についてはアセトニトリル濃度が約２７％付近の
高吸収ピーク画分(画分II−２)，画分III−１について
はアセトニトリル濃度が約２６〜２７％の範囲のピーク
画分（画分III−２），そして画分IV−１についてはア
セトニトリル濃度が約３２〜３３％の範囲のピーク画分
(画分IV−２)を分取して，これらの画分のオピオイド活
性を確認する;
【００２９】(ｄ1) 工程(ｃ1)で得たオピオイド活性画
分のうち，画分Ｉ−２，画分III−２および画分IV−２
については，上記(ａ1)で使用したカラムに供して，１
０ｍＭＫＨ2ＰＯ4−Ｎa2ＨＰＯ4緩衝液（ｐＨ７）（Ｃ
液）と１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4−Ｎa2ＨＰＯ4緩衝液を含有
するアセトニトリル溶液（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の
濃度を０％から１００％まで直線的に増加する濃度勾配
にて溶出し，画分Ｉ−２については，アセトニトリル濃
度が約１８％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｉ−３），
画分III−２については，約２１％付近の高吸収ピーク
画分（画分III−３），画分IV−２については約２８％
付近の高吸収ピーク画分（画分IV−３）を分取して，こ
れらのオピオイド活性を確認する；
分のうち，画分Ｉ−２，画分III−２および画分IV−２
については，上記(ａ1)で使用したカラムに供して，１
０ｍＭＫＨ2ＰＯ4−Ｎa2ＨＰＯ4緩衝液（ｐＨ７）（Ｃ
液）と１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4−Ｎa2ＨＰＯ4緩衝液を含有
するアセトニトリル溶液（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の
濃度を０％から１００％まで直線的に増加する濃度勾配
にて溶出し，画分Ｉ−２については，アセトニトリル濃
度が約１８％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｉ−３），
画分III−２については，約２１％付近の高吸収ピーク
画分（画分III−３），画分IV−２については約２８％
付近の高吸収ピーク画分（画分IV−３）を分取して，こ
れらのオピオイド活性を確認する；
【００３０】(ｅ1) 工程(ｄ1)で得たオピオイド活性画
分のうち，画分IV−３については，上記(ａ1)で使用し
たカラムに供して，上記工程(ａ1)，(ｂ1)および(ｃ1)
と同様にして溶出し，アセトニトリル濃度が約３１％付
近の高吸収ピーク画分（画分IV−４）を分取してオピオ
イド活性を確認する；
分のうち，画分IV−３については，上記(ａ1)で使用し
たカラムに供して，上記工程(ａ1)，(ｂ1)および(ｃ1)
と同様にして溶出し，アセトニトリル濃度が約３１％付
近の高吸収ピーク画分（画分IV−４）を分取してオピオ
イド活性を確認する；
【００３１】(ｆ1) 工程(ｅ1)で得たオピオイド活性画
分のうち，画分IV−４については，上記工程(ａ1)，(ｂ
1)および(ｃ1)で使用したカラムとは特性の異なるカラ
ムを使用した逆相クロマトグラフィー（使用カラムは例
えば野村化学社製のDevelosilＰｈＡ−Ｔ−５）に供し
て，工程(ｄ1)と同様にして溶出し，アセトニトリル濃
度が約２９％付近の高吸収ピーク画分（画分IV−５）を
分取して，オピオイド活性を確認する；
分のうち，画分IV−４については，上記工程(ａ1)，(ｂ
1)および(ｃ1)で使用したカラムとは特性の異なるカラ
ムを使用した逆相クロマトグラフィー（使用カラムは例
えば野村化学社製のDevelosilＰｈＡ−Ｔ−５）に供し
て，工程(ｄ1)と同様にして溶出し，アセトニトリル濃
度が約２９％付近の高吸収ピーク画分（画分IV−５）を
分取して，オピオイド活性を確認する；
【００３２】(ｇ1) 工程(ｃ1)で得たオピオイド活性画
分（画分II−２），工程(ｄ1)で得たオピオイド活性画
分（画分Ｉ−２）（画分III−３），工程(ｆ1)で得たオ
ピオイド活性画分（画分IV−５）から溶媒を乾燥等によ
り除去して回収する；そして
分（画分II−２），工程(ｄ1)で得たオピオイド活性画
分（画分Ｉ−２）（画分III−３），工程(ｆ1)で得たオ
ピオイド活性画分（画分IV−５）から溶媒を乾燥等によ
り除去して回収する；そして
【００３３】(ｈ1) 工程(ｇ1)で得た乾燥物のアミノ酸
配列を，例えばアプライドバイオシステムス社製のプロ
テインシーケンサー（４７７−Ａ型）等を使用して調べ
て，画分Ｉ−３は配列番号２，画分II−２は配列番号
１，画分III−３は配列番号５，そして画分IV−５は配
列番４５で表されるペプチドであることを確認する。
配列を，例えばアプライドバイオシステムス社製のプロ
テインシーケンサー（４７７−Ａ型）等を使用して調べ
て，画分Ｉ−３は配列番号２，画分II−２は配列番号
１，画分III−３は配列番号５，そして画分IV−５は配
列番４５で表されるペプチドであることを確認する。
【００３４】また，上記したペプチド混合物を含有する
水溶液からの配列番号６で表されるペプチドの単離は，
例えば次の(ａ2)〜(ｆ2)の工程からなる方法で行うこと
ができる。
水溶液からの配列番号６で表されるペプチドの単離は，
例えば次の(ａ2)〜(ｆ2)の工程からなる方法で行うこと
ができる。
【００３５】配列番号６で表されるペプチドの単離 (ａ2) 小麦グルテンをペプシンで加水分解した後トリ
プシンおよびキモトリプシンによって加水分解して得ら
れたペプチド混合物を，高速液体クロマトグラフィー
（使用カラムは例えばナカライテスク社製のＯＤＳカラ
ムであるＣosmosil５Ｃ18−ＡＲに供して，０.０５％ト
リフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０.０５％トリフルオ
ロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）で，Ｂ液
の濃度を０％から４０％まで直線的に増加する濃度勾配
にて溶出し，アセトニトリルの濃度が約３１〜３２％の
範囲のピーク画分（画分Ｖ）を分取し，これらの画分の
オピオイド活性を確認する；
プシンおよびキモトリプシンによって加水分解して得ら
れたペプチド混合物を，高速液体クロマトグラフィー
（使用カラムは例えばナカライテスク社製のＯＤＳカラ
ムであるＣosmosil５Ｃ18−ＡＲに供して，０.０５％ト
リフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０.０５％トリフルオ
ロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）で，Ｂ液
の濃度を０％から４０％まで直線的に増加する濃度勾配
にて溶出し，アセトニトリルの濃度が約３１〜３２％の
範囲のピーク画分（画分Ｖ）を分取し，これらの画分の
オピオイド活性を確認する；
【００３６】(ｂ2) 工程(ａ2)で得たオピオイド活性画
分（画分Ｖ）を上記工程(ａ2)で使用したカラムと特性
の異なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィー（使
用したカラムは例えばナカライテスク社製の Ｃosmosil
５Ｐｈ）に供して工程(ａ2)と同様にして溶出し，アセ
トニトリル濃度約３３％付近のピーク画分（画分Ｖ−
１）を分取し，この画分のオピオイド活性を確認する；
分（画分Ｖ）を上記工程(ａ2)で使用したカラムと特性
の異なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィー（使
用したカラムは例えばナカライテスク社製の Ｃosmosil
５Ｐｈ）に供して工程(ａ2)と同様にして溶出し，アセ
トニトリル濃度約３３％付近のピーク画分（画分Ｖ−
１）を分取し，この画分のオピオイド活性を確認する；
【００３７】(ｃ2) 工程(ｂ2)でオピオイド活性画分
（画分Ｖ−１）を工程(ａ2)および(ｂ2)で使用したカラ
ムとは特性の異なるカラムを使用した逆相クロマトグラ
フィー（使用カラムは例えばナカライテスク社製のＣos
mosil ５ＣＮ−Ｒ）に供して工程(ａ2)および（ｂ2)と
同様にして溶出し，アセトニトリル濃度が約２７〜２８
％の範囲のピーク画分（画分Ｖ−２）を分取し，この画
分のオピオイド活性を確認する；
（画分Ｖ−１）を工程(ａ2)および(ｂ2)で使用したカラ
ムとは特性の異なるカラムを使用した逆相クロマトグラ
フィー（使用カラムは例えばナカライテスク社製のＣos
mosil ５ＣＮ−Ｒ）に供して工程(ａ2)および（ｂ2)と
同様にして溶出し，アセトニトリル濃度が約２７〜２８
％の範囲のピーク画分（画分Ｖ−２）を分取し，この画
分のオピオイド活性を確認する；
【００３８】(ｄ2) 工程(ｃ2)で得たオピオイド活性画
分（画分Ｖ−２）を上記工程(ａ2)で使用したカラムに
供して１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液（ｐ
Ｈ７）（Ｃ液）と１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4
緩衝液を含有する５０％アセトニトリル溶液（ｐＨ７）
（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１００％まで直線的
に増加する濃度勾配にて溶出し，アセトニトリル濃度が
約２４％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｖ−３）を分取
し，このオピオイド活性を確認する；
分（画分Ｖ−２）を上記工程(ａ2)で使用したカラムに
供して１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液（ｐ
Ｈ７）（Ｃ液）と１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4
緩衝液を含有する５０％アセトニトリル溶液（ｐＨ７）
（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１００％まで直線的
に増加する濃度勾配にて溶出し，アセトニトリル濃度が
約２４％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｖ−３）を分取
し，このオピオイド活性を確認する；
【００３９】(ｅ2) 工程(ｄ2)で得たオピオイド活性画
分（画分Ｖ−３）から溶媒を乾燥等により除去して回収
する；そして(ｆ2) 工程(ｅ2)で得た乾燥物のアミノ酸
配列を例えばアプライドバイオシステムス社製のプロテ
インシーケンサー（４７７−Ａ型）等を使用して調べ
て，画分Ｖ−３は配列番号６で表されるペプチドである
ことを確認する。
分（画分Ｖ−３）から溶媒を乾燥等により除去して回収
する；そして(ｆ2) 工程(ｅ2)で得た乾燥物のアミノ酸
配列を例えばアプライドバイオシステムス社製のプロテ
インシーケンサー（４７７−Ａ型）等を使用して調べ
て，画分Ｖ−３は配列番号６で表されるペプチドである
ことを確認する。
【００４０】また，配列番号１〜配列番号６で表される
本発明のペプチドを化学合成により製造する場合は，例
えば次の方法を採用することができる。本発明のペプチドの化学合成法 米国バイオサーチ社のＳＡＭ ＴＷＯ 型自動ペプチド合
成装置を使用して同装置の標準プロトコールにしたがっ
て合成を行う。すなわち，Boc（ブトキシカルボニル)−
Pro−樹脂を４５％トリフルオロ酢酸を含むデブロック
液で処理した後に，Boc−Tyr(Cl2−Bzl)をジイソプロピ
ルカルボジイミドの存在下でカップリングさせる。以
下，上記と同様にデブロッキングした後に，Boc−Tyr
(Cl2−Bzl）およびBoc−Glyを順次カップリングさせてB
oc−Gly−Tyr(Cl2−Bzl)−Tyr(Cl2−Bzl)−Pro−樹脂を
得る。このペプチド樹脂を１０％アニソールを含むフッ
化水素中に入れて０℃で１時間撹拌する。フッ化水素を
留去した後，エーテルで残渣を洗浄し，３０％酢酸でペ
プチドを抽出する。抽出して得た粗ペプチドをＯＤＳカ
ラムによる高速液体クロマトグラフィーを使用して精製
することにより，配列番号１で表されるペプチドを得
る。また，配列番号２〜配列番号６で表されるペプチド
も同様の操作により合成および精製することにより得ら
れる。
本発明のペプチドを化学合成により製造する場合は，例
えば次の方法を採用することができる。本発明のペプチドの化学合成法 米国バイオサーチ社のＳＡＭ ＴＷＯ 型自動ペプチド合
成装置を使用して同装置の標準プロトコールにしたがっ
て合成を行う。すなわち，Boc（ブトキシカルボニル)−
Pro−樹脂を４５％トリフルオロ酢酸を含むデブロック
液で処理した後に，Boc−Tyr(Cl2−Bzl)をジイソプロピ
ルカルボジイミドの存在下でカップリングさせる。以
下，上記と同様にデブロッキングした後に，Boc−Tyr
(Cl2−Bzl）およびBoc−Glyを順次カップリングさせてB
oc−Gly−Tyr(Cl2−Bzl)−Tyr(Cl2−Bzl)−Pro−樹脂を
得る。このペプチド樹脂を１０％アニソールを含むフッ
化水素中に入れて０℃で１時間撹拌する。フッ化水素を
留去した後，エーテルで残渣を洗浄し，３０％酢酸でペ
プチドを抽出する。抽出して得た粗ペプチドをＯＤＳカ
ラムによる高速液体クロマトグラフィーを使用して精製
することにより，配列番号１で表されるペプチドを得
る。また，配列番号２〜配列番号６で表されるペプチド
も同様の操作により合成および精製することにより得ら
れる。
【００４１】そして，上記のようにして製造された配列
番号１〜配列番号６で表されるペプチドおよびその塩，
並びにその化学構造は未だ解明されていないが小麦蛋白
を酸性プロテアーゼで加水分解した後，中性プロテアー
ゼまたはアルカリ性プロテアーゼで更に加水分解して得
られるオピオイドペプチドおよびその塩を有効成分とし
て含有する剤は，鎮痛，麻酔，情動，呼吸，脈動，体
温，消化管機能，摂食，免疫，インシュリンやソマトス
タチン等のホルモンの分泌調節，心筋の収縮調節等に関
与している可能性があり，例えば，鎮痛麻酔剤，催眠
剤，消化管ホルモン促進剤，電解質吸収促進剤，腸管ぜ
ん動抑制による下痢改善剤性剤等として，人間や種々の
動物に投与することができる。その際に，上記オピオイ
ドペプチドおよびその塩は，１種類のみを使用してもま
たは２種以上のペプチドを含む混合物の形態で使用して
もよい。本発明のオピオイド活性を有する剤の好適な投
与量は，投与される人間や動物の年令，体重，性別，症
状，動物の種類等の種々の条件によって異なる。
番号１〜配列番号６で表されるペプチドおよびその塩，
並びにその化学構造は未だ解明されていないが小麦蛋白
を酸性プロテアーゼで加水分解した後，中性プロテアー
ゼまたはアルカリ性プロテアーゼで更に加水分解して得
られるオピオイドペプチドおよびその塩を有効成分とし
て含有する剤は，鎮痛，麻酔，情動，呼吸，脈動，体
温，消化管機能，摂食，免疫，インシュリンやソマトス
タチン等のホルモンの分泌調節，心筋の収縮調節等に関
与している可能性があり，例えば，鎮痛麻酔剤，催眠
剤，消化管ホルモン促進剤，電解質吸収促進剤，腸管ぜ
ん動抑制による下痢改善剤性剤等として，人間や種々の
動物に投与することができる。その際に，上記オピオイ
ドペプチドおよびその塩は，１種類のみを使用してもま
たは２種以上のペプチドを含む混合物の形態で使用して
もよい。本発明のオピオイド活性を有する剤の好適な投
与量は，投与される人間や動物の年令，体重，性別，症
状，動物の種類等の種々の条件によって異なる。
【００４２】そして，本発明のオピオイド活性を有する
剤は経口および非経口のいずれによっても投与可能であ
り，更に単独で投与しても，また製薬工業において通常
使用されている固体担体や液状担体と一緒に投与しても
よく，或は他の薬剤と混合または組合わせて使用するこ
とができる。また投与形態は，錠剤，丸剤，顆粒剤，カ
プセル，散剤，水溶液，注射剤等の任意の形態が可能で
ある。更に，本発明のオピオイド活性を有する剤は食品
や飼料中に添加して，またはそれらと一緒に投与するこ
ともでき，その場合小麦グルテンから得られたオピオイ
ドペプチドが安全性が高く望ましい。以下に，本発明を
例を挙げて具体的に説明するが本発明はそれらによって
限定されない。
剤は経口および非経口のいずれによっても投与可能であ
り，更に単独で投与しても，また製薬工業において通常
使用されている固体担体や液状担体と一緒に投与しても
よく，或は他の薬剤と混合または組合わせて使用するこ
とができる。また投与形態は，錠剤，丸剤，顆粒剤，カ
プセル，散剤，水溶液，注射剤等の任意の形態が可能で
ある。更に，本発明のオピオイド活性を有する剤は食品
や飼料中に添加して，またはそれらと一緒に投与するこ
ともでき，その場合小麦グルテンから得られたオピオイ
ドペプチドが安全性が高く望ましい。以下に，本発明を
例を挙げて具体的に説明するが本発明はそれらによって
限定されない。
【００４３】
【実施例】実施例 １ ［小麦グルテンの加水分解による配列番号１，配列番号
２，配列番号４および配列番号５で表される本発明のペ
プチドの調製］ (１) 小麦グルテン５ｇを０.０２Ｎ塩酸１００ｍｌに
分散溶解させた後，３５００Ｇで２０分間遠心分離して
不溶物を除き，１Ｎ塩酸を加えてｐＨを２.０に調整し
た。この小麦グルテン液にペプシン(米国シグマ社製)５
０００units を加えて３７℃で１５時間インキュベート
した。反応終了後１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加え
てｐＨを７.０に調整した後，サーモライシン（ペプチ
ド研究所製）５０００units を加えて３７℃において４
時間インキュベートした。反応終了後，９０℃で２０分
間加熱して酵素を失活させ，３５００Ｇで２０分間遠心
分離して不溶物を除き，得られた上澄液を凍結乾燥して
ペプシンとサーモライシンによる小麦グルテンの加水分
解物約３.５ｇを得た。
２，配列番号４および配列番号５で表される本発明のペ
プチドの調製］ (１) 小麦グルテン５ｇを０.０２Ｎ塩酸１００ｍｌに
分散溶解させた後，３５００Ｇで２０分間遠心分離して
不溶物を除き，１Ｎ塩酸を加えてｐＨを２.０に調整し
た。この小麦グルテン液にペプシン(米国シグマ社製)５
０００units を加えて３７℃で１５時間インキュベート
した。反応終了後１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加え
てｐＨを７.０に調整した後，サーモライシン（ペプチ
ド研究所製）５０００units を加えて３７℃において４
時間インキュベートした。反応終了後，９０℃で２０分
間加熱して酵素を失活させ，３５００Ｇで２０分間遠心
分離して不溶物を除き，得られた上澄液を凍結乾燥して
ペプシンとサーモライシンによる小麦グルテンの加水分
解物約３.５ｇを得た。
【００４４】(２) 上記(１)で得た小麦グルテンの加水
分解物８０ｍｇをナカライテスク社製オクタデシルシラ
ン（ＯＤＳ）カラムであるCosmosil ５Ｃ18−ＡＲ（内
径 ２０ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を使用した逆相クロマ
トグラフィーに供した。次いで０.０５％トリフルオロ
酢酸水溶液（Ａ液）および０.０５％トリフルオロ酢酸
を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）を使用して，Ｂ
液の濃度を０％から４０％まで４０分かけて直線的に増
加する濃度勾配にて１０ｍｌ／分の流速で溶出させた。
その時の波長２３０ｎｍにおけるフローチャートを図１
に示す。図１に示したフローチャートにおける各画分を
分取してそのオピオイド活性を測定したところ，アセト
ニトリルの濃度が約２２.５〜２３．５％の範囲で溶出
してくる画分（画分Ｉ），約２４〜２５％の範囲で溶出
してくる画分（画分II），約２８〜２９％の範囲で溶出
してくる画分（画分III），および約３４〜３５％の範
囲で溶出してくる画分（画分IV）にオピオイド活性が認
められた。
分解物８０ｍｇをナカライテスク社製オクタデシルシラ
ン（ＯＤＳ）カラムであるCosmosil ５Ｃ18−ＡＲ（内
径 ２０ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を使用した逆相クロマ
トグラフィーに供した。次いで０.０５％トリフルオロ
酢酸水溶液（Ａ液）および０.０５％トリフルオロ酢酸
を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）を使用して，Ｂ
液の濃度を０％から４０％まで４０分かけて直線的に増
加する濃度勾配にて１０ｍｌ／分の流速で溶出させた。
その時の波長２３０ｎｍにおけるフローチャートを図１
に示す。図１に示したフローチャートにおける各画分を
分取してそのオピオイド活性を測定したところ，アセト
ニトリルの濃度が約２２.５〜２３．５％の範囲で溶出
してくる画分（画分Ｉ），約２４〜２５％の範囲で溶出
してくる画分（画分II），約２８〜２９％の範囲で溶出
してくる画分（画分III），および約３４〜３５％の範
囲で溶出してくる画分（画分IV）にオピオイド活性が認
められた。
【００４５】(３) そこで，上記で(１)で得た小麦グル
テンの加水分解物２０００ｍｇを使用して上記(２)と同
じ工程を繰り返して，画分Ｉ，画分II，画分IIIおよび
画分IVのオピオイド活性画分を得て，これらの画分を次
にナカライテスク社製のフェニルカラム Cosmosil ５Ｐ
ｈ（内径 ４.６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を用いた逆相ク
ロマトグラフィーに供した。上記したＡ液とＢ液を使用
してＢ液の濃度を０％から４０％まで４０分かけて直線
的に増加する濃度勾配にて１ｍｌ／分の流速で溶出させ
た。溶出してくる各画分のオピオイド活性を測定したと
ころ，画分Ｉについてはアセトニトリルの濃度が約２４
〜２５％の範囲で溶出してくる画分（画分Ｉ−１），画
分IIについては約３３〜３４％の範囲で溶出してくる画
分(画分II−１)，画分IIIについては約３０〜３１％の
範囲で溶出してくる画分（画分III−１），そして画分I
Vについては約３６〜３７％の範囲で溶出してくる画分
(画分IV−１)にオピオイド活性が認められた。
テンの加水分解物２０００ｍｇを使用して上記(２)と同
じ工程を繰り返して，画分Ｉ，画分II，画分IIIおよび
画分IVのオピオイド活性画分を得て，これらの画分を次
にナカライテスク社製のフェニルカラム Cosmosil ５Ｐ
ｈ（内径 ４.６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を用いた逆相ク
ロマトグラフィーに供した。上記したＡ液とＢ液を使用
してＢ液の濃度を０％から４０％まで４０分かけて直線
的に増加する濃度勾配にて１ｍｌ／分の流速で溶出させ
た。溶出してくる各画分のオピオイド活性を測定したと
ころ，画分Ｉについてはアセトニトリルの濃度が約２４
〜２５％の範囲で溶出してくる画分（画分Ｉ−１），画
分IIについては約３３〜３４％の範囲で溶出してくる画
分(画分II−１)，画分IIIについては約３０〜３１％の
範囲で溶出してくる画分（画分III−１），そして画分I
Vについては約３６〜３７％の範囲で溶出してくる画分
(画分IV−１)にオピオイド活性が認められた。
【００４６】(４) 次に，上記(３)で得た画分Ｉ−１，
画分II−１，画分III−１および画分IV−１のオピオイ
ド活性画分をナカライテスク社製のシアノプロピルカラ
ムCosmosil ５ＣＮ−Ｒ（内径４.６ｍｍ，長さ２５０ｍ
ｍ）を用いた逆相クロマトグラフィーに供して，上記
(３)におけるのと同条件で溶出させた。溶出してくる各
画分を分取してそのオピオイド活性を測定したところ，
画分Ｉ−１についてはアセトニトリルの濃度が約１８〜
１９％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｉ−２），画分II
−１については約２７％付近の高吸収ピーク画分（画分
II−２），画分III−１については約２６〜２７％の範
囲のピーク画分（画分III−２），そして画分IVについ
ては約３２〜３３％の範囲のピーク画分(画分IV−２)に
オピオイド活性が認められた。
画分II−１，画分III−１および画分IV−１のオピオイ
ド活性画分をナカライテスク社製のシアノプロピルカラ
ムCosmosil ５ＣＮ−Ｒ（内径４.６ｍｍ，長さ２５０ｍ
ｍ）を用いた逆相クロマトグラフィーに供して，上記
(３)におけるのと同条件で溶出させた。溶出してくる各
画分を分取してそのオピオイド活性を測定したところ，
画分Ｉ−１についてはアセトニトリルの濃度が約１８〜
１９％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｉ−２），画分II
−１については約２７％付近の高吸収ピーク画分（画分
II−２），画分III−１については約２６〜２７％の範
囲のピーク画分（画分III−２），そして画分IVについ
ては約３２〜３３％の範囲のピーク画分(画分IV−２)に
オピオイド活性が認められた。
【００４７】(５) 次に，上記(４)で得たオピオイド活
性画分のうち，画分Ｉ−２，画分III−２と画分IV−２
については，更にナカライテスク社製のオクタデシルシ
ラン（ＯＤＳ）カラムであるCosmosil ５Ｃ18−ＡＲ
（内径４.６ｍｍ，長さ１５０ｍｍ）を使用して，逆相
クロマトグラフィーに供した。次いで，１０ｍＭ ＫＨ
2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０
ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液を含有する５０
％アセトニトリル溶液（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃
度を０％から１００％まで直線的に増加する濃度勾配に
て溶出させた。溶出してくる各画分を分取して，そのオ
ピオイド活性を測定したところ，画分Ｉ−２について
は，アセトニトリル濃度が約１８％の高吸収ピーク画分
（画分Ｉ−３），画分III−２については，約２１％付
近の高吸収ピーク画分（画分III−３），そして画分IV
−２についてはアセトニトリル濃度が約２８％付近の高
吸収ピーク画分（画分IV−３）にオピオイド活性が認め
られた。
性画分のうち，画分Ｉ−２，画分III−２と画分IV−２
については，更にナカライテスク社製のオクタデシルシ
ラン（ＯＤＳ）カラムであるCosmosil ５Ｃ18−ＡＲ
（内径４.６ｍｍ，長さ１５０ｍｍ）を使用して，逆相
クロマトグラフィーに供した。次いで，１０ｍＭ ＫＨ
2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０
ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液を含有する５０
％アセトニトリル溶液（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃
度を０％から１００％まで直線的に増加する濃度勾配に
て溶出させた。溶出してくる各画分を分取して，そのオ
ピオイド活性を測定したところ，画分Ｉ−２について
は，アセトニトリル濃度が約１８％の高吸収ピーク画分
（画分Ｉ−３），画分III−２については，約２１％付
近の高吸収ピーク画分（画分III−３），そして画分IV
−２についてはアセトニトリル濃度が約２８％付近の高
吸収ピーク画分（画分IV−３）にオピオイド活性が認め
られた。
【００４８】(６) 次に，上記(５)で得たオピオイド活
性画分のうち画分IV−３については，再び上記(５)で用
いたカラムを使用した逆相クロマトグラフィーに供し，
次いで，上記(４)におけるのと同条件で溶出させた。溶
出してくる各画分を分取してそのオピオイド活性を測定
したところ，アセトニトリル濃度が約３１％付近の高吸
収ピーク画分（画分IV-４)にオピオイド活性が認められ
た。
性画分のうち画分IV−３については，再び上記(５)で用
いたカラムを使用した逆相クロマトグラフィーに供し，
次いで，上記(４)におけるのと同条件で溶出させた。溶
出してくる各画分を分取してそのオピオイド活性を測定
したところ，アセトニトリル濃度が約３１％付近の高吸
収ピーク画分（画分IV-４)にオピオイド活性が認められ
た。
【００４９】(７) 更に，上記(６)で得たオピオイド活
性画分のうち画分IV−４については，更に野村化学社製
のフェネチルカラムであるDevelosil ＰｈＡ−Ｔ−５
（内径４.６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）に供して，上記
(５)におけるのと同条件で溶出させた。溶出してくる各
画分のオピオイド活性を測定したところ，アセトニトリ
ル濃度が約２９％付近の高吸収ピーク画分（画分IV-５)
にオピオイド活性が認められた。
性画分のうち画分IV−４については，更に野村化学社製
のフェネチルカラムであるDevelosil ＰｈＡ−Ｔ−５
（内径４.６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）に供して，上記
(５)におけるのと同条件で溶出させた。溶出してくる各
画分のオピオイド活性を測定したところ，アセトニトリ
ル濃度が約２９％付近の高吸収ピーク画分（画分IV-５)
にオピオイド活性が認められた。
【００５０】(８) 上記(４)で得た画分II−２，上記
(５)で得た画分Ｉ−３および画分III−３，並びに上記
(７）で得た画分IV−５を回収し，濃縮乾燥した。な
お，上記図１において，左側縦軸は溶離してきた液の
Ａｂｓ.２３０を，右側縦軸は溶離液中のアセトニトリ
ル濃度(％)を示す。
(５)で得た画分Ｉ−３および画分III−３，並びに上記
(７）で得た画分IV−５を回収し，濃縮乾燥した。な
お，上記図１において，左側縦軸は溶離してきた液の
Ａｂｓ.２３０を，右側縦軸は溶離液中のアセトニトリ
ル濃度(％)を示す。
【００５１】上記で得た乾燥物をアプライドバイオシス
テム社製のプロテインシーケンサー４７７−Ａ型を使用
してそのアミノ酸配列を調べたところ，画分Ｉ−３の乾
燥物については，Ｎ末端から順次L-Gly，L-Tyr，L-Ty
r，L-ProおよびL-Thrが遊離してきた。このことから，
その構成アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番
号２で表されるペプチドであることが確認された。ま
た，画分II−２の乾燥物についてはＮ−末端から順次L-
Gly，L-Tyr，L-TyrおよびL-Proが遊離してきた。このこ
とから，その構成アミノ酸すべてがＬ−アミノ酸である
配列番号１で表されるペプチドであることが確認され
た。
テム社製のプロテインシーケンサー４７７−Ａ型を使用
してそのアミノ酸配列を調べたところ，画分Ｉ−３の乾
燥物については，Ｎ末端から順次L-Gly，L-Tyr，L-Ty
r，L-ProおよびL-Thrが遊離してきた。このことから，
その構成アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番
号２で表されるペプチドであることが確認された。ま
た，画分II−２の乾燥物についてはＮ−末端から順次L-
Gly，L-Tyr，L-TyrおよびL-Proが遊離してきた。このこ
とから，その構成アミノ酸すべてがＬ−アミノ酸である
配列番号１で表されるペプチドであることが確認され
た。
【００５２】また，画分III−３の乾燥物については,Ｎ
末端から順次 L-Tyr，L-Gly，L-GlyおよびL-Trpが遊離
してきた。このことからその構成アミノ酸のすべてがＬ
−アミノ酸である配列番号５で表されるペプチドである
ことが確認された。そして，画分IV−５から得た乾燥物
については，Ｎ末端から順次L-Tyr，L-Gly，L-Gly，L-T
rpおよびL-Leuが遊離してきた。このことからその構成
アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番号４で表
されるペプチドであることが確認された。
末端から順次 L-Tyr，L-Gly，L-GlyおよびL-Trpが遊離
してきた。このことからその構成アミノ酸のすべてがＬ
−アミノ酸である配列番号５で表されるペプチドである
ことが確認された。そして，画分IV−５から得た乾燥物
については，Ｎ末端から順次L-Tyr，L-Gly，L-Gly，L-T
rpおよびL-Leuが遊離してきた。このことからその構成
アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番号４で表
されるペプチドであることが確認された。
【００５３】配列番号１，配列番号２，配列番号４およ
び配列番号５で表される各ペプチドの原料グルテンから
の収率（％）を，その分子量とＡｂｓ.280における分子
吸光係数から求めたところ，順に約４×１０-2(％)，４
×１０-3（％），３×１０-4（％）および１×１０
-5（％）であることが確認された。
び配列番号５で表される各ペプチドの原料グルテンから
の収率（％）を，その分子量とＡｂｓ.280における分子
吸光係数から求めたところ，順に約４×１０-2(％)，４
×１０-3（％），３×１０-4（％）および１×１０
-5（％）であることが確認された。
【００５４】また，シリカゲルプレートによる薄層クロ
マトグラフィーでＲｆ値を求めたところ，ブタノール：
酢酸：ピリジン：水＝１５：３：１０：１２の展開溶媒
を使用した場合のRf値は，配列番号１，配列番号２，配
列番号４および配列番号５で表される各ペプチドで，順
に，０.５８，０.５４，０.７７および０.６１であっ
た。
マトグラフィーでＲｆ値を求めたところ，ブタノール：
酢酸：ピリジン：水＝１５：３：１０：１２の展開溶媒
を使用した場合のRf値は，配列番号１，配列番号２，配
列番号４および配列番号５で表される各ペプチドで，順
に，０.５８，０.５４，０.７７および０.６１であっ
た。
【００５５】実施例 ２ 「小麦グルテンの加水分解による配列番号１，配列番号
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］酸性プロテアーゼと
してペプシンの代わりにアスペルギルスニガー起源のア
スパルティクプロティナーゼ（商品名「プロテアーゼＹ
Ｐ−ＳＳ」；ヤクルト本社製）をペプシンの場合と同じ
量(units)で使用し，小麦グルテン溶液をｐＨ３.０に調
整して，３７℃で１５時間インキュベートした他は実施
例１と全く同様にして小麦グルテンの加水分解を行った
ところ，実施例１の(２)と同様の逆相クロマトグラフィ
ーにて，図１とにされた画分Ｉ，画分II，画分IIIおよ
び画分IVに実施例１と同程度のオピオイド活性が認めら
れた。したがって，この実施例においても，配列番号
１，配列番号２，配列番号４および配列番号５で表され
るペプチドを混合含有するオピオイド活性を有するペプ
チド混合物が得られた。
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］酸性プロテアーゼと
してペプシンの代わりにアスペルギルスニガー起源のア
スパルティクプロティナーゼ（商品名「プロテアーゼＹ
Ｐ−ＳＳ」；ヤクルト本社製）をペプシンの場合と同じ
量(units)で使用し，小麦グルテン溶液をｐＨ３.０に調
整して，３７℃で１５時間インキュベートした他は実施
例１と全く同様にして小麦グルテンの加水分解を行った
ところ，実施例１の(２)と同様の逆相クロマトグラフィ
ーにて，図１とにされた画分Ｉ，画分II，画分IIIおよ
び画分IVに実施例１と同程度のオピオイド活性が認めら
れた。したがって，この実施例においても，配列番号
１，配列番号２，配列番号４および配列番号５で表され
るペプチドを混合含有するオピオイド活性を有するペプ
チド混合物が得られた。
【００５６】実施例 ３ 「小麦グルテンの加水分解による配列番号１，配列番号
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］中性プロテアーゼと
してサーモライシン代わりにアスペルギルオリゼー起源
の中性プロテアーゼ（商品名「プロチンＦＮ」；大和化
成製）をサーモライシンの場合と同じ量（units）で使
用した他は実施例１と全く同様にして小麦グルテンの加
水分解を行ったところ，実施例１の(２)と同様の逆相ク
ロマトグラフィーにて，図１と示された画分Ｉ，画分I
I，画分IIIおよび画分IVに実施例１と同程度のオピオイ
ド活性が認められた。したがって，この実施例において
も，配列番号１，配列番号２，配列番号４および配列番
号５で表されるペプチドを混合含有するオピオイド活性
を有するペプチド混合物が得られた。
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］中性プロテアーゼと
してサーモライシン代わりにアスペルギルオリゼー起源
の中性プロテアーゼ（商品名「プロチンＦＮ」；大和化
成製）をサーモライシンの場合と同じ量（units）で使
用した他は実施例１と全く同様にして小麦グルテンの加
水分解を行ったところ，実施例１の(２)と同様の逆相ク
ロマトグラフィーにて，図１と示された画分Ｉ，画分I
I，画分IIIおよび画分IVに実施例１と同程度のオピオイ
ド活性が認められた。したがって，この実施例において
も，配列番号１，配列番号２，配列番号４および配列番
号５で表されるペプチドを混合含有するオピオイド活性
を有するペプチド混合物が得られた。
【００５７】実施例 ４ 「小麦グルテンの加水分解による配列番号１，配列番号
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］中性プロテアーゼの
代わりにバチルス起源のセリンプロテアーゼ（商品名
「ビオプラーゼＳＰ−４」；長瀬産業製）をサーモライ
シンの場合と同じ量（units）で使用した他は実施例１
と同様にして小麦グルテンの加水分解を行ったところ，
実施例１の(２)と同様の逆相クロマトグラフィーにて，
図１と示された画分Ｉ，画分II，画分IIIおよび画分IV
に実施例１と同程度のオピオイド活性が認められた。し
たがって，この実施例においても，配列番号１，配列番
号２，配列番号４および配列番号５で表されるペプチド
を混合含有するオピオイド活性を有するペプチド混合物
が得られた。
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］中性プロテアーゼの
代わりにバチルス起源のセリンプロテアーゼ（商品名
「ビオプラーゼＳＰ−４」；長瀬産業製）をサーモライ
シンの場合と同じ量（units）で使用した他は実施例１
と同様にして小麦グルテンの加水分解を行ったところ，
実施例１の(２)と同様の逆相クロマトグラフィーにて，
図１と示された画分Ｉ，画分II，画分IIIおよび画分IV
に実施例１と同程度のオピオイド活性が認められた。し
たがって，この実施例においても，配列番号１，配列番
号２，配列番号４および配列番号５で表されるペプチド
を混合含有するオピオイド活性を有するペプチド混合物
が得られた。
【００５８】実施例 ５ ［小麦グルテンの加水分解による配列番号６で表される
本発明のペプチドの調製］ (１) 小麦グルテン５ｇを０.０２Ｎ塩酸１００ｍｌに
分散溶解させた後，３５００Ｇで２０分間遠心分離して
不溶物を除き，１Ｎ塩酸を加えてｐＨを２.０に調整し
た。この小麦グルテン液にペプシン(米国シグマ社製)５
０００units を加えて３７℃で１５時間インキュベート
した。反応終了後１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加え
てｐＨを７.０に調整した後，トリプシン（米国シグマ
社製）およびキモトリプシン（米国シグマ社製）を各５
０００units づつ加えて３７℃において４時間インキュ
ベートした。反応終了後，９０℃で２０分間加熱して酵
素を失活させ，３５００Ｇで２０分間遠心分離して不溶
物を除き，得られた上澄液を凍結乾燥してペプシンとト
リプシンおよびキモトリプシンによる小麦グルテンの加
水分解物約３.０ｇを得た。
本発明のペプチドの調製］ (１) 小麦グルテン５ｇを０.０２Ｎ塩酸１００ｍｌに
分散溶解させた後，３５００Ｇで２０分間遠心分離して
不溶物を除き，１Ｎ塩酸を加えてｐＨを２.０に調整し
た。この小麦グルテン液にペプシン(米国シグマ社製)５
０００units を加えて３７℃で１５時間インキュベート
した。反応終了後１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加え
てｐＨを７.０に調整した後，トリプシン（米国シグマ
社製）およびキモトリプシン（米国シグマ社製）を各５
０００units づつ加えて３７℃において４時間インキュ
ベートした。反応終了後，９０℃で２０分間加熱して酵
素を失活させ，３５００Ｇで２０分間遠心分離して不溶
物を除き，得られた上澄液を凍結乾燥してペプシンとト
リプシンおよびキモトリプシンによる小麦グルテンの加
水分解物約３.０ｇを得た。
【００５９】(２) 上記(１)で得た小麦グルテンの加水
分解物をナカライテスク社製オクタデシルシラン（ＯＤ
Ｓ）カラムであるCosmosil ５Ｃ18−ＡＲ（内径 ２０ｍ
ｍ，長さ２５０ｍｍ）を使用した逆相クロマトグラフィ
ーに供した。次いで０.０５％トリフルオロ酢酸水溶液
（Ａ液）および０.０５％トリフルオロ酢酸を含有する
アセトニトリル溶液（Ｂ液）を使用して，Ｂ液の濃度を
０％から４０％まで４０分かけて直線的に増加する濃度
勾配にて１０ｍｌ／分の流速で溶出させた。その時の波
長２３０ｎｍにおけるフローチャートを図２に示す。図
２に示したフローチャートにおける，各画分を分取して
そのオピオイド活性を測定したところ，アセトニトリル
の濃度が約３１〜３２％の範囲で溶出してくる画分（画
分Ｖ）にオピオイド活性が認められた。
分解物をナカライテスク社製オクタデシルシラン（ＯＤ
Ｓ）カラムであるCosmosil ５Ｃ18−ＡＲ（内径 ２０ｍ
ｍ，長さ２５０ｍｍ）を使用した逆相クロマトグラフィ
ーに供した。次いで０.０５％トリフルオロ酢酸水溶液
（Ａ液）および０.０５％トリフルオロ酢酸を含有する
アセトニトリル溶液（Ｂ液）を使用して，Ｂ液の濃度を
０％から４０％まで４０分かけて直線的に増加する濃度
勾配にて１０ｍｌ／分の流速で溶出させた。その時の波
長２３０ｎｍにおけるフローチャートを図２に示す。図
２に示したフローチャートにおける，各画分を分取して
そのオピオイド活性を測定したところ，アセトニトリル
の濃度が約３１〜３２％の範囲で溶出してくる画分（画
分Ｖ）にオピオイド活性が認められた。
【００６０】(３) そこで，上記(１)で得た小麦グルテ
ンの加水分解物２０００ｍｇを使用して，工程(２)と同
じ処理を繰り返して，画分Ｖのオピオイド活性画分を得
て，この画分を次にナカライテスク社製のフェニルカラ
ム Cosmosil ５Ｐｈ（内径 ４.６ｍｍ，長さ２５０ｍ
ｍ）を用いた逆相クロマトグラフィーに供した。上記し
たＡ液とＢ液を使用してＢ液の濃度を０％から４０％ま
で４０分かけて直線的に増加する濃度勾配にて１ｍｌ／
分の流速で溶出させた。溶出してくる画分のオピオイド
活性を測定したところ，アセトニトリルの濃度が約３３
％付近で溶出してくる画分（画分Ｖ−１）にオピオイド
活性が認められた。
ンの加水分解物２０００ｍｇを使用して，工程(２)と同
じ処理を繰り返して，画分Ｖのオピオイド活性画分を得
て，この画分を次にナカライテスク社製のフェニルカラ
ム Cosmosil ５Ｐｈ（内径 ４.６ｍｍ，長さ２５０ｍ
ｍ）を用いた逆相クロマトグラフィーに供した。上記し
たＡ液とＢ液を使用してＢ液の濃度を０％から４０％ま
で４０分かけて直線的に増加する濃度勾配にて１ｍｌ／
分の流速で溶出させた。溶出してくる画分のオピオイド
活性を測定したところ，アセトニトリルの濃度が約３３
％付近で溶出してくる画分（画分Ｖ−１）にオピオイド
活性が認められた。
【００６１】(４) 次に，上記(３)で得た画分Ｖ−１の
オピオイド活性画分をナカライテスク社製のシアノプロ
ピルカラムCosmosil ５ＣＮ−Ｒ（内径４.６ｍｍ，長さ
２５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグラフィーに供し
て，上記(３)におけるのと同条件で溶出させた。溶出し
てくる各画分を分取してそのオピオイド活性を測定した
ところ，アセトニトリルの濃度が約２７〜２８％の範囲
のピーク画分（画分Ｖ−２）にオピオイド活性が認めら
れた。
オピオイド活性画分をナカライテスク社製のシアノプロ
ピルカラムCosmosil ５ＣＮ−Ｒ（内径４.６ｍｍ，長さ
２５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグラフィーに供し
て，上記(３)におけるのと同条件で溶出させた。溶出し
てくる各画分を分取してそのオピオイド活性を測定した
ところ，アセトニトリルの濃度が約２７〜２８％の範囲
のピーク画分（画分Ｖ−２）にオピオイド活性が認めら
れた。
【００６２】(５) 次に，上記(４)で得た画分Ｖ−２の
オピオイド活性画分を，ナカライテスク社製のオクタデ
シルシラン（ＯＤＳ）カラムであるCosmosil ５Ｃ18−
ＡＲ（内径４.６ｍｍ，長さ１５０ｍｍ）を使用して逆
相クロマトグラフィーに供した。次いで，１０ｍＭ Ｋ
Ｈ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液（pH７）（Ｃ液）と１０
ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液を含有する５０
％アセトニトリル溶液（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃
度を０％から１００％まで直線的に増加する濃度勾配に
て溶出させた。溶出してくる各々の画分を分取して，そ
のオピオイド活性を測定したところ，アセトニトリル濃
度が約２４％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｖ−３）に
オピオイド活性が認められた。
オピオイド活性画分を，ナカライテスク社製のオクタデ
シルシラン（ＯＤＳ）カラムであるCosmosil ５Ｃ18−
ＡＲ（内径４.６ｍｍ，長さ１５０ｍｍ）を使用して逆
相クロマトグラフィーに供した。次いで，１０ｍＭ Ｋ
Ｈ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液（pH７）（Ｃ液）と１０
ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液を含有する５０
％アセトニトリル溶液（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃
度を０％から１００％まで直線的に増加する濃度勾配に
て溶出させた。溶出してくる各々の画分を分取して，そ
のオピオイド活性を測定したところ，アセトニトリル濃
度が約２４％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｖ−３）に
オピオイド活性が認められた。
【００６３】(６) 上記(５)で得られた画分Ｖ−３を回
収し，濃縮乾燥した。上記で得た乾燥物を実施例１で使
用したのと同じプロテインシーケンサー ４７７−Ａ型
を使用してそのアミノ酸配列を調べたところ，Ｎ末端か
ら順次 L-Tyr，L-Pro，L-Ile，L-SerおよびL-Leuが遊離
してきた。このことからその構成アミノ酸のすべてがＬ
−アミノ酸である配列番号６で表されるペプチドである
ことが確認された。配列番号６で表されるペプチドの原
料グルテンからの収率（％）は，その分子量とＡｂｓ．
280における分子吸光係数より，約４×１０-4（％）で
あることが確認された。また，実施例１と同様にシリカ
ゲルプレートによる薄層クロマトグラフィーでＲｆ値を
求めたところ０.７３であった。
収し，濃縮乾燥した。上記で得た乾燥物を実施例１で使
用したのと同じプロテインシーケンサー ４７７−Ａ型
を使用してそのアミノ酸配列を調べたところ，Ｎ末端か
ら順次 L-Tyr，L-Pro，L-Ile，L-SerおよびL-Leuが遊離
してきた。このことからその構成アミノ酸のすべてがＬ
−アミノ酸である配列番号６で表されるペプチドである
ことが確認された。配列番号６で表されるペプチドの原
料グルテンからの収率（％）は，その分子量とＡｂｓ．
280における分子吸光係数より，約４×１０-4（％）で
あることが確認された。また，実施例１と同様にシリカ
ゲルプレートによる薄層クロマトグラフィーでＲｆ値を
求めたところ０.７３であった。
【００６４】実施例 ６ ［合成による本発明のペプチドの製造］配列番号１で表
されるペプチドの合成は以下の方法で行った。市販のBo
c(ブトキシカルボニル)−Pro−樹脂(置換率０.４ｍｅｑ
／ｇ)０.７５ｇと４５％トリフルオロ酢酸および２.５
％アニソールを含む塩化メチレン２０ｍｌをバイオサー
チ社のペプチド合成装置 ＳＡＭ ＴＷＯの反応槽の中で
室温で２５分間反応させてBoc基を除去した。次にBoc基
の除去された Pro−樹脂を塩化メチレンで洗浄し，次い
で１０％のジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチ
レンにより中和した後，更に塩化メチレンで洗浄した。
この樹脂に０.４Ｍ Boc−Tyr（Cl2-Bzl)のジメチルホル
ムアミド溶液５ｍｌ，０.４Ｍジイソプロピルカルボジ
イミドの塩化メチレン溶液５ｍｌを混合して反応槽に入
れて室温で２時間撹拌下に反応させた。
されるペプチドの合成は以下の方法で行った。市販のBo
c(ブトキシカルボニル)−Pro−樹脂(置換率０.４ｍｅｑ
／ｇ)０.７５ｇと４５％トリフルオロ酢酸および２.５
％アニソールを含む塩化メチレン２０ｍｌをバイオサー
チ社のペプチド合成装置 ＳＡＭ ＴＷＯの反応槽の中で
室温で２５分間反応させてBoc基を除去した。次にBoc基
の除去された Pro−樹脂を塩化メチレンで洗浄し，次い
で１０％のジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチ
レンにより中和した後，更に塩化メチレンで洗浄した。
この樹脂に０.４Ｍ Boc−Tyr（Cl2-Bzl)のジメチルホル
ムアミド溶液５ｍｌ，０.４Ｍジイソプロピルカルボジ
イミドの塩化メチレン溶液５ｍｌを混合して反応槽に入
れて室温で２時間撹拌下に反応させた。
【００６５】上記で得られた樹脂を，順にジメチルホル
ムアミド，塩化メチレン，ジイソプロピルエチルアミン
を１０％含有する塩化メチレン，塩化メチレンおよび塩
化メチレン／ジメチルホルムアミド混合液で洗浄して，
Boc−Tyr（Cl2−Bzl)−Pro−樹脂を得た。引き続き上記
と同様にしてBoc基の除去，Bocアミノ酸のカップリング
を繰り返してBoc−Tyr（Cl2−Bzl)−Tyr(Cl2−Bzl)−Pr
o−樹脂からなる生成物を得た。更に同様にしてBoc基の
除去，Bocアミノ酸のカップリングを繰り返して，Boc−
Gly−Tyr(Cl2−Bzl)−Tyr(Cl2−Bzl)-Pro−樹脂からな
る生成物を得た。
ムアミド，塩化メチレン，ジイソプロピルエチルアミン
を１０％含有する塩化メチレン，塩化メチレンおよび塩
化メチレン／ジメチルホルムアミド混合液で洗浄して，
Boc−Tyr（Cl2−Bzl)−Pro−樹脂を得た。引き続き上記
と同様にしてBoc基の除去，Bocアミノ酸のカップリング
を繰り返してBoc−Tyr（Cl2−Bzl)−Tyr(Cl2−Bzl)−Pr
o−樹脂からなる生成物を得た。更に同様にしてBoc基の
除去，Bocアミノ酸のカップリングを繰り返して，Boc−
Gly−Tyr(Cl2−Bzl)−Tyr(Cl2−Bzl)-Pro−樹脂からな
る生成物を得た。
【００６６】この樹脂を１０％のアニソールを含有する
フッ化水素２０ｍｌに入れて０℃で２時間撹拌してペプ
チドを樹脂から遊離させた。その後，フッ化水素を減圧
留去し，残渣を３０％酢酸で抽出し，それを凍結乾燥し
て粗ペプチド１５０ｍｇを得た。これをナカライテスク
株式会社製のオクタデシルシラン（ＯＤＳ）カラムであ
るCosmosil ５Ｃ18−ＡＲを用いた逆相クロマトグラフ
ィーにより精製して最終生成物４０ｍｇを得た。そのア
ミノ酸組成（モル比）は，Gly：Tyr：Tyr：Pro＝１：
１：１：１であった。更に実施例１で使用したのと同じ
プロテインシーケンサーにより分析したところ，配列番
号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであるこ
とが判明した。また該生成物の薄層クロマトグラフィー
のＲｆ値は，実施例１の生成物と同様に０.５８であっ
た。
フッ化水素２０ｍｌに入れて０℃で２時間撹拌してペプ
チドを樹脂から遊離させた。その後，フッ化水素を減圧
留去し，残渣を３０％酢酸で抽出し，それを凍結乾燥し
て粗ペプチド１５０ｍｇを得た。これをナカライテスク
株式会社製のオクタデシルシラン（ＯＤＳ）カラムであ
るCosmosil ５Ｃ18−ＡＲを用いた逆相クロマトグラフ
ィーにより精製して最終生成物４０ｍｇを得た。そのア
ミノ酸組成（モル比）は，Gly：Tyr：Tyr：Pro＝１：
１：１：１であった。更に実施例１で使用したのと同じ
プロテインシーケンサーにより分析したところ，配列番
号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであるこ
とが判明した。また該生成物の薄層クロマトグラフィー
のＲｆ値は，実施例１の生成物と同様に０.５８であっ
た。
【００６７】また，配列番号２で表されるペプチドの場
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て市販のBoc−Thr(Bzl)−樹脂(置換率０.３ｍｅｑ／ｇ)
１ｇから最終生成物３０ｍｇを得た。そのアミノ酸組成
(モル比)は，Gly：Tyr：Tyr：Pro：Thr＝１：１：１：
１：１であり，そして実施例１で使用したプロテインシ
ーケンサーにより分析したところ，配列番号２で表され
るアミノ酸配列を有するペプチドであることが判明し
た。またこの生成物の薄層クロマトグラフィーのRf値は
実施例１の生成物と同様に０.５４であった。
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て市販のBoc−Thr(Bzl)−樹脂(置換率０.３ｍｅｑ／ｇ)
１ｇから最終生成物３０ｍｇを得た。そのアミノ酸組成
(モル比)は，Gly：Tyr：Tyr：Pro：Thr＝１：１：１：
１：１であり，そして実施例１で使用したプロテインシ
ーケンサーにより分析したところ，配列番号２で表され
るアミノ酸配列を有するペプチドであることが判明し
た。またこの生成物の薄層クロマトグラフィーのRf値は
実施例１の生成物と同様に０.５４であった。
【００６８】更に，配列番号３で表されるペプチドの場
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て市販のBoc−Ser（Bzl)−樹脂(置換率０.３９ｍｅｑ／
ｇ）０.７７ｇから最終生成物３０ｍｇを得た。そのア
ミノ酸組成(モル比)は，Gly：Tyr：Tyr：Pro：Thr：Ser
＝１：１：１：１：１：１であり，そして実施例１で使
用したプロテインシーケンサーにより分析したところ，
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドで
あることが判明した。またこの生成物の薄層クロマトグ
ラフィーのＲｆ値は０.５３であった。
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て市販のBoc−Ser（Bzl)−樹脂(置換率０.３９ｍｅｑ／
ｇ）０.７７ｇから最終生成物３０ｍｇを得た。そのア
ミノ酸組成(モル比)は，Gly：Tyr：Tyr：Pro：Thr：Ser
＝１：１：１：１：１：１であり，そして実施例１で使
用したプロテインシーケンサーにより分析したところ，
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドで
あることが判明した。またこの生成物の薄層クロマトグ
ラフィーのＲｆ値は０.５３であった。
【００６９】そして，配列番号４で表されるペプチドの
場合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様に
して，市販のBoc−Leu−樹脂(置換率０.５ｍｅｑ／ｇ)
０.６ｇから最終生成物４０ｍｇを得た。そのアミノ酸
組成(モル比）は，Tyr：Gly：Gly：Try：Leu＝１：１：
１：１：１であった。更に，実施例１で使用したプロテ
インシーケンサーにより分析したところ，配列番号４で
表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが判
明した。また，該生成物の薄層クロマトグラフィーのＲ
ｆ値は，実施例２の生成物と同様に０.７７であった。
場合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様に
して，市販のBoc−Leu−樹脂(置換率０.５ｍｅｑ／ｇ)
０.６ｇから最終生成物４０ｍｇを得た。そのアミノ酸
組成(モル比）は，Tyr：Gly：Gly：Try：Leu＝１：１：
１：１：１であった。更に，実施例１で使用したプロテ
インシーケンサーにより分析したところ，配列番号４で
表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが判
明した。また，該生成物の薄層クロマトグラフィーのＲ
ｆ値は，実施例２の生成物と同様に０.７７であった。
【００７０】更に，配列番号５で表されるペプチドの場
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て，市販のBoc−Trp−樹脂（置換率０.３ｍｅｑ／ｇ）
１ｇから最終生成物３０ｍｇを得た。そのアミノ酸組成
(モル比)は，Tyr：Gly：Gly：Trp＝１：１：１：１であ
り，そして実施例１で使用したプロテインシーケンサー
により分析したところ，配列番号５で表されるアミノ酸
配列を有するペプチドであることが判明した。また，該
生成物の薄層クロマトグラフィーのＲｆ値は，実施例２
の生成物と同様に０.６１であった。
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て，市販のBoc−Trp−樹脂（置換率０.３ｍｅｑ／ｇ）
１ｇから最終生成物３０ｍｇを得た。そのアミノ酸組成
(モル比)は，Tyr：Gly：Gly：Trp＝１：１：１：１であ
り，そして実施例１で使用したプロテインシーケンサー
により分析したところ，配列番号５で表されるアミノ酸
配列を有するペプチドであることが判明した。また，該
生成物の薄層クロマトグラフィーのＲｆ値は，実施例２
の生成物と同様に０.６１であった。
【００７１】そして，配列番号６で表されるペプチドの
場合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様に
して，市販のBoc−Leu−樹脂(置換率０.5ｍｅｑ／ｇ）
０.６ｇから最終生成物４０ｍｇを得た。そのアミノ酸
組成（モル比）は，Tyr：Pro：Ile：Ser：Leu＝１：
１：１：１：１であった。そして実施例１で使用したプ
ロテインシーケンサーにより分析したところ，配列番号
６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであること
が判明した。また，該生成物の薄層クロマトグラフィー
のＲｆ値は，実施例３の生成物と同様に０.７３であっ
た。
場合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様に
して，市販のBoc−Leu−樹脂(置換率０.5ｍｅｑ／ｇ）
０.６ｇから最終生成物４０ｍｇを得た。そのアミノ酸
組成（モル比）は，Tyr：Pro：Ile：Ser：Leu＝１：
１：１：１：１であった。そして実施例１で使用したプ
ロテインシーケンサーにより分析したところ，配列番号
６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであること
が判明した。また，該生成物の薄層クロマトグラフィー
のＲｆ値は，実施例３の生成物と同様に０.７３であっ
た。
【００７２】上記の実施例１〜６における各画分のオピ
オイド活性および配列番号１〜配列番号６で表されるペ
プチド，ならびに既知のオピオイドペプチドのオピオイ
ド活性は，いずれも次のようにして測定した。
オイド活性および配列番号１〜配列番号６で表されるペ
プチド，ならびに既知のオピオイドペプチドのオピオイ
ド活性は，いずれも次のようにして測定した。
【００７３】《オピオイド活性の測定法》体重３０〜３
５ｇのＩＣＲ系の雄マウスより摘出した２本の輸精管を
アイソトニックトランスデューサー（日本光電工業株式
会社製：ＴＢ ６１２−Ｔ）に接続して０.４ｇの張力を
かける。３６℃に保温した２ｍｌ容量のマグヌス管内
に，Ｋrebs等張液(ＮaＣl １１８ｍＭ，ＫＣｌ ４.７５
ｍＭ，ＣａＣｌ2 ２.５４ｍＭ，ＮａＨＣＯ3 ２５ｍ
Ｍ，ＫＨ2ＰＯ4 １.１９ｍＭ，グルコース１１ｍＭ）を
満たしたものの中に輸精管を浸して，ボンベから通気
（０2 ９５％：ＣＯ2 ５％）を行った。このようにして
約２時間安定化させた後，３０Ｖで１ｍsec の電気刺激
を与え，マウス輸精管を電気収縮させた。電気収縮が安
定した後，アミノペプチダーゼ阻害剤等を含むインヒビ
ター５０μｌを加え，小麦グルテンの酵素分解物の高速
液体クロマトグラフィーにより分画された各画分を添加
し，マウス輸精管の電気収縮の変化をレコーダーで記録
した。オピオイド活性は画分添加後の電気収縮の抑制と
１０-４Ｍナロキソン２０μｌ添加による抑制の解除に
よって判定した。そしてマウス輸精管の電気収縮を５０
％抑制する濃度(ＩＣ50)を測定した。
５ｇのＩＣＲ系の雄マウスより摘出した２本の輸精管を
アイソトニックトランスデューサー（日本光電工業株式
会社製：ＴＢ ６１２−Ｔ）に接続して０.４ｇの張力を
かける。３６℃に保温した２ｍｌ容量のマグヌス管内
に，Ｋrebs等張液(ＮaＣl １１８ｍＭ，ＫＣｌ ４.７５
ｍＭ，ＣａＣｌ2 ２.５４ｍＭ，ＮａＨＣＯ3 ２５ｍ
Ｍ，ＫＨ2ＰＯ4 １.１９ｍＭ，グルコース１１ｍＭ）を
満たしたものの中に輸精管を浸して，ボンベから通気
（０2 ９５％：ＣＯ2 ５％）を行った。このようにして
約２時間安定化させた後，３０Ｖで１ｍsec の電気刺激
を与え，マウス輸精管を電気収縮させた。電気収縮が安
定した後，アミノペプチダーゼ阻害剤等を含むインヒビ
ター５０μｌを加え，小麦グルテンの酵素分解物の高速
液体クロマトグラフィーにより分画された各画分を添加
し，マウス輸精管の電気収縮の変化をレコーダーで記録
した。オピオイド活性は画分添加後の電気収縮の抑制と
１０-４Ｍナロキソン２０μｌ添加による抑制の解除に
よって判定した。そしてマウス輸精管の電気収縮を５０
％抑制する濃度(ＩＣ50)を測定した。
【００７４】その結果，上記実施例で得られた配列番号
１〜配列番号６で表される本発明のペプチドのＩＣ50は
表１に示すとおりであった。参考のため，既知のペプチ
ドのオピオイド活性を上記と同様にして測定したときの
ＩＣ50を表１に併記する。
１〜配列番号６で表される本発明のペプチドのＩＣ50は
表１に示すとおりであった。参考のため，既知のペプチ
ドのオピオイド活性を上記と同様にして測定したときの
ＩＣ50を表１に併記する。
【００７５】
【表１】
【００７６】表１の結果から，本発明のオピオイド活性
剤は低濃度でＩＣ50を達成できることがわかる。
剤は低濃度でＩＣ50を達成できることがわかる。
【００７７】
【発明の効果】］本発明の方法によるときは，小麦グル
テン等の小麦蛋白を使用して，目的とするオピオイドペ
プチド，特に，配列番号１，２，４，５および６で表さ
れるペプチドを確実に得ることができる。また，合成に
よって配列番号３で表されるペプチドを得ることができ
る。
テン等の小麦蛋白を使用して，目的とするオピオイドペ
プチド，特に，配列番号１，２，４，５および６で表さ
れるペプチドを確実に得ることができる。また，合成に
よって配列番号３で表されるペプチドを得ることができ
る。
【００７８】本発明のペプチドおよびその塩はオピオイ
ド活性を有しているので，該ペプチドおよびその塩を有
効成分とする剤は極めて少量の投与で，鎮痛，麻酔，情
動，呼吸，脈動，体温，消化管機能，摂食，免疫，イン
シュリンやソマトスタチン等のホルモンの分泌調節，電
解質の吸収促進，心筋の収縮調節機能を示す可能性があ
るため，鎮痛麻酔剤，催眠剤，消化管ホルモン分泌促進
剤，電解質の吸収促進剤，胃腸輸送筋収縮による下痢改
善剤としての利用が期待できる。その場合に，本発明の
ペプチドおよびその塩は，水溶性の白色粉末であるた
め，そのままでまたは水等に溶解させて経口および非経
口のいずれの方法によっても極めて簡単に投与すること
ができる。
ド活性を有しているので，該ペプチドおよびその塩を有
効成分とする剤は極めて少量の投与で，鎮痛，麻酔，情
動，呼吸，脈動，体温，消化管機能，摂食，免疫，イン
シュリンやソマトスタチン等のホルモンの分泌調節，電
解質の吸収促進，心筋の収縮調節機能を示す可能性があ
るため，鎮痛麻酔剤，催眠剤，消化管ホルモン分泌促進
剤，電解質の吸収促進剤，胃腸輸送筋収縮による下痢改
善剤としての利用が期待できる。その場合に，本発明の
ペプチドおよびその塩は，水溶性の白色粉末であるた
め，そのままでまたは水等に溶解させて経口および非経
口のいずれの方法によっても極めて簡単に投与すること
ができる。
【００７９】更に，本発明のペプチドおよびその塩は４
〜６個のアミノ酸が配列しただけの極めて簡単な構造を
有する低分子量化合物であるため化学合成によっても簡
単に製造することができる。また，本発明のペプチド
は，小麦グルテンの酵素による加水分解物として得られ
るために安全性が高い。
〜６個のアミノ酸が配列しただけの極めて簡単な構造を
有する低分子量化合物であるため化学合成によっても簡
単に製造することができる。また，本発明のペプチド
は，小麦グルテンの酵素による加水分解物として得られ
るために安全性が高い。
【図１】小麦グルテンをペプシンで加水分解した後，サ
ーモライシンで加水分解して得られたペプチド混合物を
高速液体クロマトグラフィーに通し，その吸着成分を直
線濃度勾配を有する特定の溶離液により溶離した時の該
成分の吸光度を測定したフローチャートである。
ーモライシンで加水分解して得られたペプチド混合物を
高速液体クロマトグラフィーに通し，その吸着成分を直
線濃度勾配を有する特定の溶離液により溶離した時の該
成分の吸光度を測定したフローチャートである。
【図２】小麦グルテンをペプシンで加水分解した後，ト
リプシンとキモトリプシンで加水分解して得られたペプ
チド混合物を高速液体クロマトグラフィーに通し，その
吸着成分を直線濃度勾配を有する特定の溶離液により溶
離した時の該成分の吸光度を測定したフローチャートで
ある。
リプシンとキモトリプシンで加水分解して得られたペプ
チド混合物を高速液体クロマトグラフィーに通し，その
吸着成分を直線濃度勾配を有する特定の溶離液により溶
離した時の該成分の吸光度を測定したフローチャートで
ある。
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：２ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：４ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：５ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：６ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：７ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：８ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：９ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：１０ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年１０月１６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【従来の技術】食品中には高次の生命活動に関与する多
数の生体調節因子が存在することが広く知られるように
なっており，それらの生体調節因子を健康の増進，病気
の予防や治療，老化の予防等に積極的に利用することが
近年色々試みられるようになっている。そのような生体
調節因子としては神経系，消化吸収系，循環系，生体防
御・免疫系，内分泌系，細胞分化・増殖系等に作用する
種々の因子が知られている。それらのうちで，ある種の
食品蛋白質中には神経系に作用してモルヒネ様の麻酔，
鎮痛作用等（いわゆるオピオイド活性）を有するペプチ
ドが存在していることが明らかになっており，そのよう
なペプチドはオピオイドペプチドと一般に称されてい
る。
数の生体調節因子が存在することが広く知られるように
なっており，それらの生体調節因子を健康の増進，病気
の予防や治療，老化の予防等に積極的に利用することが
近年色々試みられるようになっている。そのような生体
調節因子としては神経系，消化吸収系，循環系，生体防
御・免疫系，内分泌系，細胞分化・増殖系等に作用する
種々の因子が知られている。それらのうちで，ある種の
食品蛋白質中には神経系に作用してモルヒネ様の麻酔，
鎮痛作用等（いわゆるオピオイド活性）を有するペプチ
ドが存在していることが明らかになっており，そのよう
なペプチドはオピオイドペプチドと一般に称されてい
る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】 （ｄ１）工程（ｃ１）で得たオピオイド
活性画分のうち，画分Ｉ−２，画分ＩＩＩ−２および画
分ＩＶ−２については，上記（ａ１）で使用したカラム
に供して，１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩
衝液（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎ
ａ２ＨＰＯ４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル溶
液（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１００
％まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出し，画分Ｉ−
２については，アセトニトリル濃度が約１８％付近の高
吸収ピーク画分（画分Ｉ−３），画分ＩＩＩ−２につい
ては，約２１％付近の高吸収ピーク画分（画分ＩＩＩ−
３），画分ＩＶ−２については約２８％付近の高吸収ピ
ーク画分（画分ＩＶ−３）を分取して，これらのオピオ
イド活性を確認する；
活性画分のうち，画分Ｉ−２，画分ＩＩＩ−２および画
分ＩＶ−２については，上記（ａ１）で使用したカラム
に供して，１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩
衝液（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎ
ａ２ＨＰＯ４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル溶
液（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１００
％まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出し，画分Ｉ−
２については，アセトニトリル濃度が約１８％付近の高
吸収ピーク画分（画分Ｉ−３），画分ＩＩＩ−２につい
ては，約２１％付近の高吸収ピーク画分（画分ＩＩＩ−
３），画分ＩＶ−２については約２８％付近の高吸収ピ
ーク画分（画分ＩＶ−３）を分取して，これらのオピオ
イド活性を確認する；
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】 （ｈ１）工程（ｇ１）で得た乾燥物のア
ミノ酸配列を，例えばアプライドバイオシステムス社製
のプロテインシーケンサー（４７７−Ａ型）等を使用し
て調べて，画分Ｉ−３は配列番号２，画分ＩＩ−２は配
列番号１，画分ＩＩＩ−３は配列番号５，そして画分Ｉ
Ｖ−５は配列番号４で表されるペプチドであること確認
する。
ミノ酸配列を，例えばアプライドバイオシステムス社製
のプロテインシーケンサー（４７７−Ａ型）等を使用し
て調べて，画分Ｉ−３は配列番号２，画分ＩＩ−２は配
列番号１，画分ＩＩＩ−３は配列番号５，そして画分Ｉ
Ｖ−５は配列番号４で表されるペプチドであること確認
する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５３】 配列番号１，配列番号２，配列番号４お
よび配列番号５で表される各ペプチドの原料グルテンか
らの収率（％）を，その分子量とＡｂｓ．２８０におけ
る分子吸光係数から求めたところ，順に約４×１０−２
（％），４×１０−３（％），１×１０−５（％）およ
び３×１０−４（％）であることが確認された。 ─────────────────────────────────────────────────────
よび配列番号５で表される各ペプチドの原料グルテンか
らの収率（％）を，その分子量とＡｂｓ．２８０におけ
る分子吸光係数から求めたところ，順に約４×１０−２
（％），４×１０−３（％），１×１０−５（％）およ
び３×１０−４（％）であることが確認された。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年３月５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 ペプチドおよびその製造方法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は，オピオイド活性を有す
るペプチドおよびその塩，その製造方法，並びに当該ペ
プチドおよびその塩を有効成分として含むオピオイド活
性を有する剤に関する。
るペプチドおよびその塩，その製造方法，並びに当該ペ
プチドおよびその塩を有効成分として含むオピオイド活
性を有する剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】食品中には高次の生命活動に関与する多
数の生体調節因子が存在することが広く知られるように
なっており，それらの生体調節因子を健康の増進，病気
の予防や治療，老化の予防等に積極的に利用することが
近年色々試みられるようになっている。そのような生体
調節因子としては神経系，消化吸収系，循環系，生体防
御・免疫系，内分泌系，細胞分化・増殖系等に作用する
種々の因子が知られている。それらのうちで，ある種の
食品蛋白質中には神経系に作用してモルヒネ様の麻酔，
鎮痛作用等（いわゆるオピオイド活性）を有するペプチ
ドが存在していることが明らかになっており，そのよう
なペプチドはオピオイドペプチドと一般に称されてい
る。
数の生体調節因子が存在することが広く知られるように
なっており，それらの生体調節因子を健康の増進，病気
の予防や治療，老化の予防等に積極的に利用することが
近年色々試みられるようになっている。そのような生体
調節因子としては神経系，消化吸収系，循環系，生体防
御・免疫系，内分泌系，細胞分化・増殖系等に作用する
種々の因子が知られている。それらのうちで，ある種の
食品蛋白質中には神経系に作用してモルヒネ様の麻酔，
鎮痛作用等（いわゆるオピオイド活性）を有するペプチ
ドが存在していることが明らかになっており，そのよう
なペプチドはオピオイドペプチドと一般に称されてい
る。
【０００３】食品から得られる外来性オピオイドペプチ
ドの最初の例は１９７９年にＢｒａｎｔｌらにより発見
された牛乳β−カゼイン由来の配列番号７で表されるペ
プチドであり，これはβ−ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（１
−７）と命名された。カゼイン由来のオピオイドペプチ
ドはその後も多数発見されており，例えば，配列番号８
で表されるβ−ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（１−５）
（Ｈｅｎｓｃｈｅｎ：１９７９）、β−ｃａｓｏｍｏｒ
ｐｈｉｎ（１−３）（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ：Ｌｏｔ
ｔｓｐｅｉｃｈら：１９８０），配列番号９で表される
α−ｃａｓｅｉｎｅｘｏｒｐｈｉｎ（Ｌｏｕｋａｓら：
１９８３）がある。一方，上記したβ−ｃａｓｏｍｏｒ
ｐｈｉｎ（１−７）の発見と同じ年（１９７９）にＺｉ
ｏｕｄｒｏｕらは小麦グルテンのペプシン分解物からグ
ルテンエクソルフィンと呼ばれるオピオイドペプチドを
単離したがその構造は未決定であった［Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２５４，２４４６（１９７９）］。また，
１９８７年にＧｒａｆらはカゼイン中に含まれるβ−カ
ゾモルフィンと呼ばれるオピオイドペプチドと構造が極
めて類似している配列番号１０で表されるペプチド（グ
リアドルフィン）を小麦蛋白の一種であるα−グリアジ
ン中に見出して化学合成したが，このペプチドはオピオ
イド活性を示さなかった［Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ，９，１１３（１９８７）］。
ドの最初の例は１９７９年にＢｒａｎｔｌらにより発見
された牛乳β−カゼイン由来の配列番号７で表されるペ
プチドであり，これはβ−ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（１
−７）と命名された。カゼイン由来のオピオイドペプチ
ドはその後も多数発見されており，例えば，配列番号８
で表されるβ−ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（１−５）
（Ｈｅｎｓｃｈｅｎ：１９７９）、β−ｃａｓｏｍｏｒ
ｐｈｉｎ（１−３）（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ：Ｌｏｔ
ｔｓｐｅｉｃｈら：１９８０），配列番号９で表される
α−ｃａｓｅｉｎｅｘｏｒｐｈｉｎ（Ｌｏｕｋａｓら：
１９８３）がある。一方，上記したβ−ｃａｓｏｍｏｒ
ｐｈｉｎ（１−７）の発見と同じ年（１９７９）にＺｉ
ｏｕｄｒｏｕらは小麦グルテンのペプシン分解物からグ
ルテンエクソルフィンと呼ばれるオピオイドペプチドを
単離したがその構造は未決定であった［Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２５４，２４４６（１９７９）］。また，
１９８７年にＧｒａｆらはカゼイン中に含まれるβ−カ
ゾモルフィンと呼ばれるオピオイドペプチドと構造が極
めて類似している配列番号１０で表されるペプチド（グ
リアドルフィン）を小麦蛋白の一種であるα−グリアジ
ン中に見出して化学合成したが，このペプチドはオピオ
イド活性を示さなかった［Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ，９，１１３（１９８７）］。
【０００４】オピオイドペプチドが消化管や消化管ホル
モン分泌に対して影響を有することが知られており，そ
して小麦グルテンの分解物を経口投与した場合に食物の
腸内滞留時間の延長，血中のインシュリンやソマトスタ
チン量の上昇等のオピオイド活性による影響が観察され
るという報告もあることから，小麦グルテンの加水分解
物からオピオイドペプチドを得ようとする試みはこれま
で色々なされてきたが，現在までに小麦グルテンに由来
するオピオイドペプチドを単離し，その構造を決定した
という報告は知られていない。
モン分泌に対して影響を有することが知られており，そ
して小麦グルテンの分解物を経口投与した場合に食物の
腸内滞留時間の延長，血中のインシュリンやソマトスタ
チン量の上昇等のオピオイド活性による影響が観察され
るという報告もあることから，小麦グルテンの加水分解
物からオピオイドペプチドを得ようとする試みはこれま
で色々なされてきたが，現在までに小麦グルテンに由来
するオピオイドペプチドを単離し，その構造を決定した
という報告は知られていない。
【０００５】
【発明の内容】上記のような状況下に本発明者らは小麦
蛋白の分解物からオピオイド活性を有するペプチドを得
るべく研究を進めてきた。その結果，小麦蛋白を酸性プ
ロテアーゼを使用して加水分解した後，中性プロテアー
ゼまたはアルカリ性プロテアーゼを使用して更に加水分
解して得られたペプチド混合物を高速液体クロマトグラ
フィーを用いた逆相クロマトグラフイーで分画すると，
そのうちの特定の画分がオピオイド活性を有するペプチ
ドからなることを見出した。
蛋白の分解物からオピオイド活性を有するペプチドを得
るべく研究を進めてきた。その結果，小麦蛋白を酸性プ
ロテアーゼを使用して加水分解した後，中性プロテアー
ゼまたはアルカリ性プロテアーゼを使用して更に加水分
解して得られたペプチド混合物を高速液体クロマトグラ
フィーを用いた逆相クロマトグラフイーで分画すると，
そのうちの特定の画分がオピオイド活性を有するペプチ
ドからなることを見出した。
【０００６】特に，小麦蛋白を酸性プロテアーゼで加水
分解した後，更に中性プロテアーゼまたはアルカリ性プ
ロテアーゼ（特にサーモライシン等のバチルス起源の中
性プロテアーゼ，アスペルギルス起源の中性プロテアー
ゼまたはバチルス起源のアルカリ性プロテアーゼ）を使
用して更に加水分解を行ってペプチド混合物を形成さ
せ，そこから得られたオピオイド活性を有する画分を単
離，精製して，その構造を決定したところ，グリシン−
チロシン−チロシン−プロリンが配列した配列番号１で
表される新規なペプチド，グリシン−チロシン−チロシ
ン−プロリン−スレオニンが配列した配列番号２で表さ
れる新規なペプチド，チロシン−グリシン−グリシン−
トリプトファン−ロイシンが配列した配列番号４で表さ
れるペプチド，およびチロシン−グリシン−グリシン−
トリプトファンが配列した配列番号５で表されるペプチ
ドであることを見出した。
分解した後，更に中性プロテアーゼまたはアルカリ性プ
ロテアーゼ（特にサーモライシン等のバチルス起源の中
性プロテアーゼ，アスペルギルス起源の中性プロテアー
ゼまたはバチルス起源のアルカリ性プロテアーゼ）を使
用して更に加水分解を行ってペプチド混合物を形成さ
せ，そこから得られたオピオイド活性を有する画分を単
離，精製して，その構造を決定したところ，グリシン−
チロシン−チロシン−プロリンが配列した配列番号１で
表される新規なペプチド，グリシン−チロシン−チロシ
ン−プロリン−スレオニンが配列した配列番号２で表さ
れる新規なペプチド，チロシン−グリシン−グリシン−
トリプトファン−ロイシンが配列した配列番号４で表さ
れるペプチド，およびチロシン−グリシン−グリシン−
トリプトファンが配列した配列番号５で表されるペプチ
ドであることを見出した。
【０００７】更に，小麦蛋白を酸性プロテアーゼで加水
分解した後，中性プロテアーゼとしてトリプシンとキモ
トリプシンの両者を使用して加水分解処理を行ってペプ
チド混合物を形成し，そこから得られたオピオイド活性
を有する画分を単離，精製して，その構造を決定したと
ころ，チロシン−プロリン−イソロイシン−セリン−ロ
イシンが配列した配列番号６で表されるペプチドである
ことを見出した。
分解した後，中性プロテアーゼとしてトリプシンとキモ
トリプシンの両者を使用して加水分解処理を行ってペプ
チド混合物を形成し，そこから得られたオピオイド活性
を有する画分を単離，精製して，その構造を決定したと
ころ，チロシン−プロリン−イソロイシン−セリン−ロ
イシンが配列した配列番号６で表されるペプチドである
ことを見出した。
【０００８】また，配列番号３で表されるペプチドのア
ミノ酸配列自体も，小麦グルテニンのアミノ酸配列中に
複数個存在することが報告されているところから［Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃ
ｔａ，７８８（１９８４），３５−４０］，配列番号２
のペプチドのＣ末端を延長して配列番号３で表されるペ
プチドを化学的に合成したところ，この配列番号３で表
されるペプチドも配列番号１，配列番号２，配列番号
４，配列番号５および配列番号６で表されるペプチドと
同様にオピオイド活性を示すことを見出した。
ミノ酸配列自体も，小麦グルテニンのアミノ酸配列中に
複数個存在することが報告されているところから［Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃ
ｔａ，７８８（１９８４），３５−４０］，配列番号２
のペプチドのＣ末端を延長して配列番号３で表されるペ
プチドを化学的に合成したところ，この配列番号３で表
されるペプチドも配列番号１，配列番号２，配列番号
４，配列番号５および配列番号６で表されるペプチドと
同様にオピオイド活性を示すことを見出した。
【０００９】したがって，本発明は，小麦蛋白を酸性プ
ロテアーゼを使用して加水分解した後，中性プロテアー
ゼまたはアルカリ性プロテアーゼを使用して更に加水分
解し，得られた加水分解物からオピオイド活性を有する
ペプチドを回収することを特徴とするオピオイドペプチ
ドの製造方法であり，ここで製造されたオピオイドペプ
チドにはその化学構造が明らかなもの，および明らかで
ないオピオイドペプチドの両方が含まれる。そして，本
発明のかかる製造方法で使用する小麦蛋白は，グルテン
のみからなっていても，またはグルテンから主としてな
っていてアルブミン，グロブリン等の小麦中に含有され
ることが知られている他の蛋白質を含有しているもので
あってもよい。
ロテアーゼを使用して加水分解した後，中性プロテアー
ゼまたはアルカリ性プロテアーゼを使用して更に加水分
解し，得られた加水分解物からオピオイド活性を有する
ペプチドを回収することを特徴とするオピオイドペプチ
ドの製造方法であり，ここで製造されたオピオイドペプ
チドにはその化学構造が明らかなもの，および明らかで
ないオピオイドペプチドの両方が含まれる。そして，本
発明のかかる製造方法で使用する小麦蛋白は，グルテン
のみからなっていても，またはグルテンから主としてな
っていてアルブミン，グロブリン等の小麦中に含有され
ることが知られている他の蛋白質を含有しているもので
あってもよい。
【００１０】そして，上記本発明の製造方法は，小麦蛋
白を酸性プロテアーゼで加水分解した後，中性プロテア
ーゼとしてバチルス起源の中性プロテアーゼであるサー
モライシンまたはアスペルギルス起源の中性プロテアー
ゼを使用して更に加水分解を行って，配列番号１，配列
番号２，配列番号３，配列番号４または配列番号５で表
されるオピオイドペプチドを製造する方法；並びに小麦
蛋白を酸性プロテアーゼで加水分解した後，中性プロテ
アーゼとしてトリプシンおよびキモトリプシンを使用し
て加水分解を行って，配列番号６で表されるオピオイド
ペプチドを製造する方法を包含する。
白を酸性プロテアーゼで加水分解した後，中性プロテア
ーゼとしてバチルス起源の中性プロテアーゼであるサー
モライシンまたはアスペルギルス起源の中性プロテアー
ゼを使用して更に加水分解を行って，配列番号１，配列
番号２，配列番号３，配列番号４または配列番号５で表
されるオピオイドペプチドを製造する方法；並びに小麦
蛋白を酸性プロテアーゼで加水分解した後，中性プロテ
アーゼとしてトリプシンおよびキモトリプシンを使用し
て加水分解を行って，配列番号６で表されるオピオイド
ペプチドを製造する方法を包含する。
【００１１】また，本発明は，小麦蛋白を酸性プロテア
ーゼを使用して加水分解した後，更に中性プロテアーゼ
またはアルカリ性プロテアーゼを使用して加水分解する
ことにより得られるオピオイドペプチド自体を包含する
ものであり，そのようなオピオイドペプチドには，配列
番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番
号５または配列番号６で表されるオピオイドペプチドお
よびそれらの混合物が含まれる。
ーゼを使用して加水分解した後，更に中性プロテアーゼ
またはアルカリ性プロテアーゼを使用して加水分解する
ことにより得られるオピオイドペプチド自体を包含する
ものであり，そのようなオピオイドペプチドには，配列
番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番
号５または配列番号６で表されるオピオイドペプチドお
よびそれらの混合物が含まれる。
【００１２】更に，配列番号１，配列番号２，配列番号
３，配列番号４，配列番号５および配列番号６で表され
るペプチド並びにその塩は，化学合成によっても製造す
ることができ，したがって本発明は，配列番号１，配列
番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５および配
列番号６で表されるペプチド並びにその塩を化学合成す
る方法を包含する。
３，配列番号４，配列番号５および配列番号６で表され
るペプチド並びにその塩は，化学合成によっても製造す
ることができ，したがって本発明は，配列番号１，配列
番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５および配
列番号６で表されるペプチド並びにその塩を化学合成す
る方法を包含する。
【００１３】上記の点から，本発明は，その製造方法の
如何を問わず，配列番号１，配列番号２，配列番号３，
配列番号４，配列番号５および配列番号６で表されるペ
プチド並びにその塩自体を包含する。更に，本発明は，
配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配
列番号５および配列番号６で表されるペプチド並びにそ
の塩の１種または２種以上を有効成分として含むオピオ
イド活性を有する剤をも包含する。
如何を問わず，配列番号１，配列番号２，配列番号３，
配列番号４，配列番号５および配列番号６で表されるペ
プチド並びにその塩自体を包含する。更に，本発明は，
配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配
列番号５および配列番号６で表されるペプチド並びにそ
の塩の１種または２種以上を有効成分として含むオピオ
イド活性を有する剤をも包含する。
【００１４】そして，上記６種類のペプチドのうち，配
列番号１，配列番号２，配列番号４および配列番号５で
表されるペプチドは，上記したようにグルテンを酸性プ
ロテアーゼで加水分解した後，更に上記したような微生
物起源の中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアー
ゼを使用して加水分解して得られたペプチド混合物中に
発見され回収したものである。また，配列番号６で表さ
れるペプチドはグルテンを酸性プロテアーゼで加水分解
した後，生体内に存在する中性プロテアーゼであるトリ
プシンとキモトリプシンで加水分解処理して得られるペ
プチド混合物中に発見され回収したものである。更に，
配列番号３で表されるペプチドはその存在を小麦グルテ
ニンの一次構造より見いだして化学的に合成したもので
ある。したがって，その場合には，それら６種類のペプ
チドを構成する８種類のアミノ酸Ｇｌｙ，Ｔｙｒ，Ｐｒ
ｏ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅは，天然
のグルテンに由来するために，いずれもＬ−アミノ酸で
ある。しかしながら本発明のペプチドは，それらのＬ−
アミノ酸からなるものに限定されず，配列番号１〜配列
番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであれ
ばどのような光学異性体であってもよい。例えば，アミ
ノ酸の全部がＤ−アミノ酸からなっていても，４〜８個
のアミノ酸のうちのいずれかがＬ−アミノ酸であって残
りがＤ−アミノ酸からなるペプチドも包含され，そのよ
うなペプチドは化学合成により製造することができる。
列番号１，配列番号２，配列番号４および配列番号５で
表されるペプチドは，上記したようにグルテンを酸性プ
ロテアーゼで加水分解した後，更に上記したような微生
物起源の中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアー
ゼを使用して加水分解して得られたペプチド混合物中に
発見され回収したものである。また，配列番号６で表さ
れるペプチドはグルテンを酸性プロテアーゼで加水分解
した後，生体内に存在する中性プロテアーゼであるトリ
プシンとキモトリプシンで加水分解処理して得られるペ
プチド混合物中に発見され回収したものである。更に，
配列番号３で表されるペプチドはその存在を小麦グルテ
ニンの一次構造より見いだして化学的に合成したもので
ある。したがって，その場合には，それら６種類のペプ
チドを構成する８種類のアミノ酸Ｇｌｙ，Ｔｙｒ，Ｐｒ
ｏ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅは，天然
のグルテンに由来するために，いずれもＬ−アミノ酸で
ある。しかしながら本発明のペプチドは，それらのＬ−
アミノ酸からなるものに限定されず，配列番号１〜配列
番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであれ
ばどのような光学異性体であってもよい。例えば，アミ
ノ酸の全部がＤ−アミノ酸からなっていても，４〜８個
のアミノ酸のうちのいずれかがＬ−アミノ酸であって残
りがＤ−アミノ酸からなるペプチドも包含され，そのよ
うなペプチドは化学合成により製造することができる。
【００１５】また，本発明における「オピオイド活性を
有する剤」とは，鎮痛，麻酔，情動，呼吸，脈動，体
温，消化管機能，摂食，免疫，インシュリンやソマトス
タチン等のホルモンの分泌調節，電解質の吸収促進，心
筋の収縮調節等に関与するいわゆるオピオイド活性とし
て認識されている活性を有する剤をいう。
有する剤」とは，鎮痛，麻酔，情動，呼吸，脈動，体
温，消化管機能，摂食，免疫，インシュリンやソマトス
タチン等のホルモンの分泌調節，電解質の吸収促進，心
筋の収縮調節等に関与するいわゆるオピオイド活性とし
て認識されている活性を有する剤をいう。
【００１６】下記の方法に限定されないが，本発明のペ
プチドの調製法の例を挙げると以下のとおりである。小麦グルテンの加水分解による方法 小麦グルテンをプロテアーゼを使用して加水分解して水
溶性のペプチド混合物を調製する。この場合に，まず小
麦グルテンを希塩酸等の酸性溶液中に分散溶解させた状
態で酸性プロテアーゼで加水分解し，次いで中和または
アルカリ性にした後に中性プロテアーゼまたはアルカリ
性プロテアーゼで更に加水分解してペプチド混合物を調
製するのがよい。
プチドの調製法の例を挙げると以下のとおりである。小麦グルテンの加水分解による方法 小麦グルテンをプロテアーゼを使用して加水分解して水
溶性のペプチド混合物を調製する。この場合に，まず小
麦グルテンを希塩酸等の酸性溶液中に分散溶解させた状
態で酸性プロテアーゼで加水分解し，次いで中和または
アルカリ性にした後に中性プロテアーゼまたはアルカリ
性プロテアーゼで更に加水分解してペプチド混合物を調
製するのがよい。
【００１７】酸性プロテアーゼの例としては，ペプシ
ン，ヒイロタケ起源のアスパルティックプロティナー
ゼ，アスペルギルス起源のアスパルティックプロティナ
ーゼ，ペニシリウム起源のアスパルティックプロティナ
ーゼを挙げることができる。酸性プロテアーゼは，１種
類のみを使用しても，またはプロテアーゼ同士がお互い
に悪影響を及ぼさないかぎりは複数種を併用することも
できる。複数の酸性プロテアーゼを使用する場合は，複
数の酸性プロテアーゼを同時に存在下させて加水分解を
行っても，または１種類ずつ逐次に用いて加水分解を行
ってもよい。
ン，ヒイロタケ起源のアスパルティックプロティナー
ゼ，アスペルギルス起源のアスパルティックプロティナ
ーゼ，ペニシリウム起源のアスパルティックプロティナ
ーゼを挙げることができる。酸性プロテアーゼは，１種
類のみを使用しても，またはプロテアーゼ同士がお互い
に悪影響を及ぼさないかぎりは複数種を併用することも
できる。複数の酸性プロテアーゼを使用する場合は，複
数の酸性プロテアーゼを同時に存在下させて加水分解を
行っても，または１種類ずつ逐次に用いて加水分解を行
ってもよい。
【００１８】そして，中性プロテアーゼの例としては，
バチルス起源の耐熱性プロテアーゼであるサーモライシ
ン，アスペルギルス起源の中性プロテアーゼ，ストレプ
トマイセス起源の中性プロテアーゼ，リゾプス起源の中
性プロテアーゼ等の微生物起源の金属プロテアーゼ；パ
パイン，ブロメライン等の植物起源の中性プロテアー
ゼ；トリプシン，キモトリプシン，プラスミン，トロン
ビン等の動物の生体内等に存在する中性プロテアーゼ挙
げることができる。また，アルカリ性プロテアーゼとし
ては，バチルス起源のセリンプロテアーゼ等を挙げるこ
とができる。中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテ
アーゼは，１種類のみを使用しても，またはプロテアー
ゼ同士がお互いに悪影響を及ぼさないかぎりは複数種を
併用することもできる。複数の中性プロテアーゼを使用
する場合は，複数の中性プロテアーゼを同時に存在下さ
せて加水分解を行っても，または１種類ずつ逐次に用い
て加水分解を行ってもよい。
バチルス起源の耐熱性プロテアーゼであるサーモライシ
ン，アスペルギルス起源の中性プロテアーゼ，ストレプ
トマイセス起源の中性プロテアーゼ，リゾプス起源の中
性プロテアーゼ等の微生物起源の金属プロテアーゼ；パ
パイン，ブロメライン等の植物起源の中性プロテアー
ゼ；トリプシン，キモトリプシン，プラスミン，トロン
ビン等の動物の生体内等に存在する中性プロテアーゼ挙
げることができる。また，アルカリ性プロテアーゼとし
ては，バチルス起源のセリンプロテアーゼ等を挙げるこ
とができる。中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテ
アーゼは，１種類のみを使用しても，またはプロテアー
ゼ同士がお互いに悪影響を及ぼさないかぎりは複数種を
併用することもできる。複数の中性プロテアーゼを使用
する場合は，複数の中性プロテアーゼを同時に存在下さ
せて加水分解を行っても，または１種類ずつ逐次に用い
て加水分解を行ってもよい。
【００１９】上記したように，小麦蛋白を酸性プロテア
ーゼ加水分解した後，上記した微生物起源の中性プロテ
アーゼ，植物起源の中性プロテアーゼまたはアルカリ性
プロテアーゼを使用して更に加水分解すると，配列番号
１〜配列番号５で表されるペプチドを含有するペプチド
混合物を得ることができる。また，小麦蛋白を酸性プロ
テアーゼ加水分解した後，中性プロテアーゼとしてトリ
プシンおよびキモトリプシン等の生体内プロテアーゼを
使用して加水分解すると，配列番号６で表されるペプチ
ドを含有するペプチド混合物を得ることができる。この
場合，トリプシンとキモトリプシンは同時に作用させて
も，または逐次に作用させてもよい。
ーゼ加水分解した後，上記した微生物起源の中性プロテ
アーゼ，植物起源の中性プロテアーゼまたはアルカリ性
プロテアーゼを使用して更に加水分解すると，配列番号
１〜配列番号５で表されるペプチドを含有するペプチド
混合物を得ることができる。また，小麦蛋白を酸性プロ
テアーゼ加水分解した後，中性プロテアーゼとしてトリ
プシンおよびキモトリプシン等の生体内プロテアーゼを
使用して加水分解すると，配列番号６で表されるペプチ
ドを含有するペプチド混合物を得ることができる。この
場合，トリプシンとキモトリプシンは同時に作用させて
も，または逐次に作用させてもよい。
【００２０】配列番号１〜配列番号６で表されるペプチ
ドを製造するに当たって，酸性プロテアーゼとして，ペ
プシンを使用すると，目的物を高収率で得ることができ
好ましい。また，配列番号１，２，４および５で表され
るペプチドを製造するに当たって，中性プロテアーゼと
してバチルス起源のサーモライシンまたはアスペルギル
ス（特にアスペルギルスオリゼー）起源の中性プロテア
ーゼを使用すると，目的物を高収率で得ることができ好
ましい。
ドを製造するに当たって，酸性プロテアーゼとして，ペ
プシンを使用すると，目的物を高収率で得ることができ
好ましい。また，配列番号１，２，４および５で表され
るペプチドを製造するに当たって，中性プロテアーゼと
してバチルス起源のサーモライシンまたはアスペルギル
ス（特にアスペルギルスオリゼー）起源の中性プロテア
ーゼを使用すると，目的物を高収率で得ることができ好
ましい。
【００２１】そして，酸性プロテアーゼ，中性プロテア
ーゼおよびアルカリ性プロテアーゼは，いずれもフリー
の状態で使用しても，または固定化して使用してもよ
い。プロテアーゼの使用量は，いずれの場合も乾燥した
グルテン１００ｇ当たり，プロテアーゼ約５，０００〜
１００，０００ ｕｎｉｔｓの割合で用いるとよい。
ーゼおよびアルカリ性プロテアーゼは，いずれもフリー
の状態で使用しても，または固定化して使用してもよ
い。プロテアーゼの使用量は，いずれの場合も乾燥した
グルテン１００ｇ当たり，プロテアーゼ約５，０００〜
１００，０００ ｕｎｉｔｓの割合で用いるとよい。
【００２２】ここで本明細書中のプロテアーゼ活性（ｕ
ｎｉｔ）はすべて下記の方法により測定した。 《プロテアーゼ活性（ｕｎｉｔ）の測定》基質として米
国メルク社製のハマーステインカゼイン１％溶液を用
い，アンソン−萩原変法［赤堀四郎編 “酵素研究法”
第２巻，第２３７頁（昭和３６年１月１０日；朝倉書
店発行）］により測定した。反応は３０℃で３０分間行
い１分間に１μｇのチロシン相当量を遊離するのに要す
る酵素量を１ｕｎｉｔとした。
ｎｉｔ）はすべて下記の方法により測定した。 《プロテアーゼ活性（ｕｎｉｔ）の測定》基質として米
国メルク社製のハマーステインカゼイン１％溶液を用
い，アンソン−萩原変法［赤堀四郎編 “酵素研究法”
第２巻，第２３７頁（昭和３６年１月１０日；朝倉書
店発行）］により測定した。反応は３０℃で３０分間行
い１分間に１μｇのチロシン相当量を遊離するのに要す
る酵素量を１ｕｎｉｔとした。
【００２３】プロテアーゼ処理は，各々の状況（例えば
プロテアーゼの種類，プロテアーゼの使用形態等）に応
じて最適のｐＨ，温度，プロテアーゼ量，処理速度，処
理時間等の条件を選択して行うのがよい。例えば酸性プ
ロテアーゼとしてペプシンを使用して加水分解してから
サーモライシンで加水分解する場合，または酸性プロテ
アーゼとしてペプシンを使用して加水分解してからトリ
プシンとキモトリプシンで加水分解する場合は，グルテ
ンの水溶液または水性分散液のｐＨを約１．５〜５．０
として，温度約３０〜５０℃でペプシンにより加水分解
し，次いで液のｐＨを約６．０〜８．０とした後，サー
モライシン，またはトリプシンとキモトリプシンを温度
約３０〜５０℃で作用させて０．７５Ｍトリクロロ酢酸
への溶解率が約４０〜８０％になるまで加水分解を行う
とよい。
プロテアーゼの種類，プロテアーゼの使用形態等）に応
じて最適のｐＨ，温度，プロテアーゼ量，処理速度，処
理時間等の条件を選択して行うのがよい。例えば酸性プ
ロテアーゼとしてペプシンを使用して加水分解してから
サーモライシンで加水分解する場合，または酸性プロテ
アーゼとしてペプシンを使用して加水分解してからトリ
プシンとキモトリプシンで加水分解する場合は，グルテ
ンの水溶液または水性分散液のｐＨを約１．５〜５．０
として，温度約３０〜５０℃でペプシンにより加水分解
し，次いで液のｐＨを約６．０〜８．０とした後，サー
モライシン，またはトリプシンとキモトリプシンを温度
約３０〜５０℃で作用させて０．７５Ｍトリクロロ酢酸
への溶解率が約４０〜８０％になるまで加水分解を行う
とよい。
【００２４】目的とする加水分解状態が達成された時点
で加熱によりおよび／またはｐＨを調整して，プロテア
ーゼを失活させ，失活した酵素，未分解グルテン等の不
溶性固形物を遠心分離等の適当な手段で分離除去し，残
留液中に含まれているペプチド混合物を乾燥等により回
収する。次いで，このペプチド混合物を水等に溶解させ
た状態で高速液体クロマトグラフィー（例えば逆相カラ
ムを使用した高速液体クロマトグラフィー）等により処
理して上記ペプチドを純粋な形態で単離する。
で加熱によりおよび／またはｐＨを調整して，プロテア
ーゼを失活させ，失活した酵素，未分解グルテン等の不
溶性固形物を遠心分離等の適当な手段で分離除去し，残
留液中に含まれているペプチド混合物を乾燥等により回
収する。次いで，このペプチド混合物を水等に溶解させ
た状態で高速液体クロマトグラフィー（例えば逆相カラ
ムを使用した高速液体クロマトグラフィー）等により処
理して上記ペプチドを純粋な形態で単離する。
【００２５】上記したペプチド混合物を含有する水溶液
からの配列番号１，配列番号２，配列番号４および配列
番号５で表されるペプチドの単離は，例えば，次の（ａ
１）〜ｈ１）の工程からなる方法で行うことができる。
からの配列番号１，配列番号２，配列番号４および配列
番号５で表されるペプチドの単離は，例えば，次の（ａ
１）〜ｈ１）の工程からなる方法で行うことができる。
【００２６】［配列番号１，配列番号２，配列番号４お
よび配列番号５で表されるペプチドの単離］ ａ１） 小麦グルテンをペプシンおよびサーモライシン
によって上記のようにして逐次に加水分解して得られた
ペプチド混合物を，高速液体クロマトグラフィー（使用
カラムは例えばナカライテスク社製のＯＤＳカラムであ
るＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲに供して，０．０
５％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０．０５％トリ
フルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）
で，Ｂ液の濃度が０％から４０％まで直線的に増加する
濃度勾配にて溶出し，アセトニトリル濃度が約２２．５
〜２３．５％の範囲のピーク画分（画分Ｉ），約２４〜
２５％の範囲のピーク（画分ＩＩ），約２８〜２９％の
範囲のピーク画分（画分ＩＩＩ）および約３４〜３５％
の範囲のピーク画分（画分ＩＶ）を各々分取し，これら
の画分のオピオイド活性を確認する；
よび配列番号５で表されるペプチドの単離］ ａ１） 小麦グルテンをペプシンおよびサーモライシン
によって上記のようにして逐次に加水分解して得られた
ペプチド混合物を，高速液体クロマトグラフィー（使用
カラムは例えばナカライテスク社製のＯＤＳカラムであ
るＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲに供して，０．０
５％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０．０５％トリ
フルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）
で，Ｂ液の濃度が０％から４０％まで直線的に増加する
濃度勾配にて溶出し，アセトニトリル濃度が約２２．５
〜２３．５％の範囲のピーク画分（画分Ｉ），約２４〜
２５％の範囲のピーク（画分ＩＩ），約２８〜２９％の
範囲のピーク画分（画分ＩＩＩ）および約３４〜３５％
の範囲のピーク画分（画分ＩＶ）を各々分取し，これら
の画分のオピオイド活性を確認する；
【００２７】（ｂ１）工程（ａ１）で得たオピオイド活
性画分を上記工程（ａ１）で使用したカラムと特性の異
なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィー（使用カ
ラムは例えばナカライテスク社製のＣｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｐｈ）に供して，工程（ａ１）と同様にして溶出し
て，画分Ｉについてはアセトニトリル濃度約２４〜２５
％の範囲のピーク画分（画分Ｉ−１），画分ＩＩについ
てはアセトニトリル濃度約３３〜３４％の範囲のピーク
画分（画分ＩＩ−１），画分ＩＩＩについてはアセトニ
トリル濃度約３０〜３１％の範囲のピーク画分（画分Ｉ
ＩＩ−１）および画分ＩＶについてはアセトニトリル濃
度約３６〜３７％の範囲のピーク画分（画分ＩＶ−１）
を分取し，これらの画分のオピオイド活性を確認する；
性画分を上記工程（ａ１）で使用したカラムと特性の異
なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィー（使用カ
ラムは例えばナカライテスク社製のＣｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｐｈ）に供して，工程（ａ１）と同様にして溶出し
て，画分Ｉについてはアセトニトリル濃度約２４〜２５
％の範囲のピーク画分（画分Ｉ−１），画分ＩＩについ
てはアセトニトリル濃度約３３〜３４％の範囲のピーク
画分（画分ＩＩ−１），画分ＩＩＩについてはアセトニ
トリル濃度約３０〜３１％の範囲のピーク画分（画分Ｉ
ＩＩ−１）および画分ＩＶについてはアセトニトリル濃
度約３６〜３７％の範囲のピーク画分（画分ＩＶ−１）
を分取し，これらの画分のオピオイド活性を確認する；
【００２８】（ｃ１）工程（ｂ１）得たオピオイド活性
画分を工程（ａ１）および（ｂ１）で使用したカラムと
は特性の異なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィ
ー（使用カラムは例えばナカライテスク社製のＣｏｓｍ
ｏｓｉｌ ５ＣＮ−Ｒ）に供して，工程（ａ１）および
（ｂ１）と同様にして溶出し，画分Ｉ−１についてはア
セトニトリル濃度が約１８〜１９％付近の高吸収ピーク
画分（画分Ｉ−２），画分ＩＩ−１についてはアセトニ
トリル濃度が約２７％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｉ
Ｉ−２），画分ＩＩＩ−１についてはアセトニトリル濃
度が約２６〜２７％の範囲のピーク画分（画分ＩＩＩ−
２），そして画分ＩＶ−１についてはアセトニトリル濃
度が約３２〜３３％の範囲のピーク画分（画分ＩＶ−
２）を分取して，これらの画分のオピオイド活性を確認
する；
画分を工程（ａ１）および（ｂ１）で使用したカラムと
は特性の異なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィ
ー（使用カラムは例えばナカライテスク社製のＣｏｓｍ
ｏｓｉｌ ５ＣＮ−Ｒ）に供して，工程（ａ１）および
（ｂ１）と同様にして溶出し，画分Ｉ−１についてはア
セトニトリル濃度が約１８〜１９％付近の高吸収ピーク
画分（画分Ｉ−２），画分ＩＩ−１についてはアセトニ
トリル濃度が約２７％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｉ
Ｉ−２），画分ＩＩＩ−１についてはアセトニトリル濃
度が約２６〜２７％の範囲のピーク画分（画分ＩＩＩ−
２），そして画分ＩＶ−１についてはアセトニトリル濃
度が約３２〜３３％の範囲のピーク画分（画分ＩＶ−
２）を分取して，これらの画分のオピオイド活性を確認
する；
【００２９】（ｄ１）工程（ｃ１）で得たオピオイド活
性画分のうち，画分Ｉ−２，画分ＩＩＩ−２および画分
ＩＶ−２については，上記（ａ１）で使用したカラムに
供して，１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝
液（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２
ＨＰＯ４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル溶液
（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１００％
まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出し，画分Ｉ−２
については，アセトニトリル濃度が約１８％付近の高吸
収ピーク画分（画分Ｉ−３），画分ＩＩＩ−２について
は，約２１％付近の高吸収ピーク画分（画分ＩＩＩ−
３），画分ＩＶ−２については約２８％付近の高吸収ピ
ーク画分（画分ＩＶ−３）を分取して，これらのオピオ
イド活性を確認する；
性画分のうち，画分Ｉ−２，画分ＩＩＩ−２および画分
ＩＶ−２については，上記（ａ１）で使用したカラムに
供して，１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝
液（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２
ＨＰＯ４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル溶液
（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１００％
まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出し，画分Ｉ−２
については，アセトニトリル濃度が約１８％付近の高吸
収ピーク画分（画分Ｉ−３），画分ＩＩＩ−２について
は，約２１％付近の高吸収ピーク画分（画分ＩＩＩ−
３），画分ＩＶ−２については約２８％付近の高吸収ピ
ーク画分（画分ＩＶ−３）を分取して，これらのオピオ
イド活性を確認する；
【００３０】（ｅ１）工程（ｄ１）で得たオピオイド活
性画分のうち，画分ＩＶ−３については，上記（ａ１）
で使用したカラムに供して，上記工程（ａ１），
（ｂ１）および（ｃ１）と同様にして溶出し，アセトニ
トリル濃度が約３１％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｉ
Ｖ−４）を分取してオピオイド活性を確認する；
性画分のうち，画分ＩＶ−３については，上記（ａ１）
で使用したカラムに供して，上記工程（ａ１），
（ｂ１）および（ｃ１）と同様にして溶出し，アセトニ
トリル濃度が約３１％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｉ
Ｖ−４）を分取してオピオイド活性を確認する；
【００３１】（ｆ１）工程（ｅ１）で得たオピオイド活
性画分のうち，画分ＩＶ−４については，上記工程（ａ
１），（ｂ１）および（ｃ１）で使用したカラムとは特
性の異なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィー
（使用カラムは例えば野村化学社製のＤｅｖｅｌｏｓｉ
ｌ ＰｈＡ−Ｔ−５）に供して，工程（ｄ１）と同様に
して溶出し，アセトニトリル濃度が約２９％付近の高吸
収ピーク画分（画分ＩＶ−５）を分取して，オピオイド
活性を確認する；
性画分のうち，画分ＩＶ−４については，上記工程（ａ
１），（ｂ１）および（ｃ１）で使用したカラムとは特
性の異なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィー
（使用カラムは例えば野村化学社製のＤｅｖｅｌｏｓｉ
ｌ ＰｈＡ−Ｔ−５）に供して，工程（ｄ１）と同様に
して溶出し，アセトニトリル濃度が約２９％付近の高吸
収ピーク画分（画分ＩＶ−５）を分取して，オピオイド
活性を確認する；
【００３２】（ｇ１）工程（ｃ１）で得たオピオイド活
性画分（画分ＩＩ−２），工程（ｄ１）で得たオピオイ
ド活性画分（画分Ｉ−２）（画分ＩＩＩ−３），工程
（ｆ１）で得たオピオイド活性画分（画分ＩＶ−５）か
ら溶媒を乾燥等により除去して回収する；そして
性画分（画分ＩＩ−２），工程（ｄ１）で得たオピオイ
ド活性画分（画分Ｉ−２）（画分ＩＩＩ−３），工程
（ｆ１）で得たオピオイド活性画分（画分ＩＶ−５）か
ら溶媒を乾燥等により除去して回収する；そして
【００３３】（ｈ１）工程（ｇ１）で得た乾燥物のアミ
ノ酸配列を，例えばアプライドバイオシステムス社製の
プロテインシーケンサー（４７７−Ａ型）等を使用して
調べて，画分Ｉ−３は配列番号２，画分ＩＩ−２は配列
番号１，画分ＩＩＩ−３は配列番号５，そして画分ＩＶ
−５は配列番４で表されるペプチドであることを確認す
る。
ノ酸配列を，例えばアプライドバイオシステムス社製の
プロテインシーケンサー（４７７−Ａ型）等を使用して
調べて，画分Ｉ−３は配列番号２，画分ＩＩ−２は配列
番号１，画分ＩＩＩ−３は配列番号５，そして画分ＩＶ
−５は配列番４で表されるペプチドであることを確認す
る。
【００３４】また，上記したペプチド混合物を含有する
水溶液からの配列番号６で表されるペプチドの単離は，
例えば次の（ａ２）〜（ｆ２）の工程からなる方法で行
うことができる。
水溶液からの配列番号６で表されるペプチドの単離は，
例えば次の（ａ２）〜（ｆ２）の工程からなる方法で行
うことができる。
【００３５】配列番号６で表されるペプチドの単離 （ａ２） 小麦グルテンをペプシンで加水分解した後ト
リプシンおよびキモトリプシンによって加水分解して得
られたペプチド混合物を，高速液体クロマトグラフィー
（使用カラムは例えばナカライテスク社製のＯＤＳカラ
ムであるＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲに供して，
０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０．０５
％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ
液）で，Ｂ液の濃度を０％から４０％まで直線的に増加
する濃度勾配にて溶出し，アセトニトリルの濃度が約３
１〜３２％の範囲のピーク画分（画分Ｖ）を分取し，こ
れらの画分のオピオイド活性を確認する；
リプシンおよびキモトリプシンによって加水分解して得
られたペプチド混合物を，高速液体クロマトグラフィー
（使用カラムは例えばナカライテスク社製のＯＤＳカラ
ムであるＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲに供して，
０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０．０５
％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ
液）で，Ｂ液の濃度を０％から４０％まで直線的に増加
する濃度勾配にて溶出し，アセトニトリルの濃度が約３
１〜３２％の範囲のピーク画分（画分Ｖ）を分取し，こ
れらの画分のオピオイド活性を確認する；
【００３６】（ｂ２）工程（ａ２）で得たオピオイド活
性画分（画分Ｖ）を上記工程（ａ２）で使用したカラム
と特性の異なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィ
ー（使用したカラムは例えばナカライテスク社製のＣｏ
ｓｍｏｓｉｌ ５Ｐｈ）に供して工程（ａ２）と同様に
して溶出し，アセトニトリル濃度約３３％付近のピーク
画分（画分Ｖ−１）を分取し，この画分のオピオイド活
性を確認する；
性画分（画分Ｖ）を上記工程（ａ２）で使用したカラム
と特性の異なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィ
ー（使用したカラムは例えばナカライテスク社製のＣｏ
ｓｍｏｓｉｌ ５Ｐｈ）に供して工程（ａ２）と同様に
して溶出し，アセトニトリル濃度約３３％付近のピーク
画分（画分Ｖ−１）を分取し，この画分のオピオイド活
性を確認する；
【００３７】（ｃ２）工程（ｂ２）でオピオイド活性画
分（画分Ｖ−１）を工程（ａ２）および（ｂ２）で使用
したカラムとは特性の異なるカラムを使用した逆相クロ
マトグラフィー（使用カラムは例えばナカライテスク社
製のＣｏｓｍｏｓｉｌ ５ＣＮ−Ｒ）に供して工程（ａ
２）および（ｂ２）と同様にして溶出し，アセトニトリ
ル濃度が約２７〜２８％の範囲のピーク画分（画分Ｖ−
２）を分取し，この画分のオピオイド活性を確認する；
分（画分Ｖ−１）を工程（ａ２）および（ｂ２）で使用
したカラムとは特性の異なるカラムを使用した逆相クロ
マトグラフィー（使用カラムは例えばナカライテスク社
製のＣｏｓｍｏｓｉｌ ５ＣＮ−Ｒ）に供して工程（ａ
２）および（ｂ２）と同様にして溶出し，アセトニトリ
ル濃度が約２７〜２８％の範囲のピーク画分（画分Ｖ−
２）を分取し，この画分のオピオイド活性を確認する；
【００３８】（ｄ２）工程（ｃ２）で得たオピオイド活
性画分（画分Ｖ−２）を上記工程（ａ２）で使用したカ
ラムに供して１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４
緩衝液（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−
Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル
溶液（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１０
０％まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出し，アセト
ニトリル濃度が約２４％付近の高吸収ピーク画分（画分
Ｖ−３）を分取し，このオピオイド活性を確認する；
性画分（画分Ｖ−２）を上記工程（ａ２）で使用したカ
ラムに供して１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４
緩衝液（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−
Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル
溶液（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１０
０％まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出し，アセト
ニトリル濃度が約２４％付近の高吸収ピーク画分（画分
Ｖ−３）を分取し，このオピオイド活性を確認する；
【００３９】（ｅ２） 工程（ｄ２）で得たオピオイド
活性画分（画分Ｖ−３）から溶媒を乾燥等により除去し
て回収する；そして （ｆ２）工程（ｅ２）で得た乾燥物のアミノ酸配列を例
えばアプライドバイオシステムス社製のプロテインシー
ケンサー（４７７−Ａ型）等を使用して調べて，画分Ｖ
−３は配列番号６で表されるペプチドであることを確認
する。
活性画分（画分Ｖ−３）から溶媒を乾燥等により除去し
て回収する；そして （ｆ２）工程（ｅ２）で得た乾燥物のアミノ酸配列を例
えばアプライドバイオシステムス社製のプロテインシー
ケンサー（４７７−Ａ型）等を使用して調べて，画分Ｖ
−３は配列番号６で表されるペプチドであることを確認
する。
【００４０】また，配列番号１〜配列番号６で表される
本発明のペプチドを化学合成により製造する場合は，例
えば次の方法を採用することができる。本発明のペプチドの化学合成法 米国バイオサーチ社のＳＡＭ ＴＷＯ型自動ペプチド合
成装置を使用して同装置の標準プロトコールにしたがっ
て合成を行う。すなわち，Ｂｏｃ（ブトキシカルボニ
ル）−Ｐｒｏ−樹脂を４５％トリフルオロ酢酸を含むデ
ブロック液で処理した後に，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−
Ｂｚｌ）をジイソプロピルカルボジイミドの存在下でカ
ップリングさせる。以下，上記と同様にデブロッキング
した後に，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）およびＢ
ｏｃ−Ｇｌｙを順次カップリングさせてＢｏｃ−Ｇｌｙ
−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ
−Ｐｒｏ−樹脂を得る。このペプチド樹脂を１０％アニ
ソールを含むフッ化水素中に入れて０℃で１時間撹拌す
る。フッ化水素を留去した後，エーテルで残渣を洗浄
し，３０％酢酸でペプチドを抽出する。抽出して得た粗
ペプチドをＯＤＳカラムによる高速液体クロマトグラフ
ィーを使用して精製することにより，配列番号１で表さ
れるペプチドを得る。また，配列番号２〜配列番号６で
表されるペプチドも同様の操作により合成および精製す
ることにより得られる。
本発明のペプチドを化学合成により製造する場合は，例
えば次の方法を採用することができる。本発明のペプチドの化学合成法 米国バイオサーチ社のＳＡＭ ＴＷＯ型自動ペプチド合
成装置を使用して同装置の標準プロトコールにしたがっ
て合成を行う。すなわち，Ｂｏｃ（ブトキシカルボニ
ル）−Ｐｒｏ−樹脂を４５％トリフルオロ酢酸を含むデ
ブロック液で処理した後に，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−
Ｂｚｌ）をジイソプロピルカルボジイミドの存在下でカ
ップリングさせる。以下，上記と同様にデブロッキング
した後に，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）およびＢ
ｏｃ−Ｇｌｙを順次カップリングさせてＢｏｃ−Ｇｌｙ
−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ
−Ｐｒｏ−樹脂を得る。このペプチド樹脂を１０％アニ
ソールを含むフッ化水素中に入れて０℃で１時間撹拌す
る。フッ化水素を留去した後，エーテルで残渣を洗浄
し，３０％酢酸でペプチドを抽出する。抽出して得た粗
ペプチドをＯＤＳカラムによる高速液体クロマトグラフ
ィーを使用して精製することにより，配列番号１で表さ
れるペプチドを得る。また，配列番号２〜配列番号６で
表されるペプチドも同様の操作により合成および精製す
ることにより得られる。
【００４１】そして，上記のようにして製造された配列
番号１〜配列番号６で表されるペプチドおよびその塩，
並びにその化学構造は未だ解明されていないが小麦蛋白
を酸性プロテアーゼで加水分解した後，中性プロテアー
ゼまたはアルカリ性プロテアーゼで更に加水分解して得
られるオピオイドペプチドおよびその塩を有効成分とし
て含有する剤は，鎮痛，麻酔，情動，呼吸，脈動，体
温，消化管機能，摂食，免疫，インシュリンやソマトス
タチン等のホルモンの分泌調節，心筋の収縮調節等に関
与している可能性があり，例えば，鎮痛麻酔剤，催眠
剤，消化管ホルモン促進剤，電解質吸収促進剤，腸管ぜ
ん動抑制による下痢改善剤性剤等として，人間や種々の
動物に投与することができる。その際に，上記オピオイ
ドペプチドおよびその塩は，１種類のみを使用してもま
たは２種以上のペプチドを含む混合物の形態で使用して
もよい。本発明のオピオイド活性を有する剤の好適な投
与量は，投与される人間や動物の年令，体重，性別，症
状，動物の種類等の種々の条件によって異なる。
番号１〜配列番号６で表されるペプチドおよびその塩，
並びにその化学構造は未だ解明されていないが小麦蛋白
を酸性プロテアーゼで加水分解した後，中性プロテアー
ゼまたはアルカリ性プロテアーゼで更に加水分解して得
られるオピオイドペプチドおよびその塩を有効成分とし
て含有する剤は，鎮痛，麻酔，情動，呼吸，脈動，体
温，消化管機能，摂食，免疫，インシュリンやソマトス
タチン等のホルモンの分泌調節，心筋の収縮調節等に関
与している可能性があり，例えば，鎮痛麻酔剤，催眠
剤，消化管ホルモン促進剤，電解質吸収促進剤，腸管ぜ
ん動抑制による下痢改善剤性剤等として，人間や種々の
動物に投与することができる。その際に，上記オピオイ
ドペプチドおよびその塩は，１種類のみを使用してもま
たは２種以上のペプチドを含む混合物の形態で使用して
もよい。本発明のオピオイド活性を有する剤の好適な投
与量は，投与される人間や動物の年令，体重，性別，症
状，動物の種類等の種々の条件によって異なる。
【００４２】そして，本発明のオピオイド活性を有する
剤は経口および非経口のいずれによっても投与可能であ
り，更に単独で投与しても，また製薬工業において通常
使用されている固体担体や液状担体と一緒に投与しても
よく，或は他の薬剤と混合または組合わせて使用するこ
とができる。また投与形態は，錠剤，丸剤，顆粒剤，カ
プセル，散剤，水溶液，注射剤等の任意の形態が可能で
ある。更に，本発明のオピオイド活性を有する剤は食品
や飼料中に添加して，またはそれらと一緒に投与するこ
ともでき，その場合小麦グルテンから得られたオピオイ
ドペプチドが安全性が高く望ましい。以下に，本発明を
例を挙げて具休的に説明するが本発明はそれらによって
限定されない。
剤は経口および非経口のいずれによっても投与可能であ
り，更に単独で投与しても，また製薬工業において通常
使用されている固体担体や液状担体と一緒に投与しても
よく，或は他の薬剤と混合または組合わせて使用するこ
とができる。また投与形態は，錠剤，丸剤，顆粒剤，カ
プセル，散剤，水溶液，注射剤等の任意の形態が可能で
ある。更に，本発明のオピオイド活性を有する剤は食品
や飼料中に添加して，またはそれらと一緒に投与するこ
ともでき，その場合小麦グルテンから得られたオピオイ
ドペプチドが安全性が高く望ましい。以下に，本発明を
例を挙げて具休的に説明するが本発明はそれらによって
限定されない。
【００４３】
【実施例】実施例 １ ［小麦グルテンの加水分解による配列番号１，配列番号
２，配列番号４および配列番号５で表される本発明のペ
プチドの調製］ （１）小麦グルテン５ｇを０．０２Ｎ塩酸１００ｍｌに
分散溶解させた後，３５００Ｇで２０分間遠心分離して
不溶物を除き，１Ｎ塩酸を加えてｐＨを２．０に調整し
た。この小麦グルテン液にペプシン（米国シグマ社製）
５０００ｕｎｉｔｓを加えて３７℃で１５時間インキュ
ベートした。反応終了後１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液
を加えてｐＨを７．０に調整した後，サーモライシン
（ペプチド研究所製）５０００ｕｎｉｔｓを加えて３７
℃において４時間インキュベートした。反応終了後，９
０℃で２０分間加熱して酵素を失活させ，３５００Ｇで
２０分間遠心分離して不溶物を除き，得られた上澄液を
凍結乾燥してぺプシンとサーモライシンによる小麦グル
テンの加水分解物約３．５ｇを得た。
２，配列番号４および配列番号５で表される本発明のペ
プチドの調製］ （１）小麦グルテン５ｇを０．０２Ｎ塩酸１００ｍｌに
分散溶解させた後，３５００Ｇで２０分間遠心分離して
不溶物を除き，１Ｎ塩酸を加えてｐＨを２．０に調整し
た。この小麦グルテン液にペプシン（米国シグマ社製）
５０００ｕｎｉｔｓを加えて３７℃で１５時間インキュ
ベートした。反応終了後１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液
を加えてｐＨを７．０に調整した後，サーモライシン
（ペプチド研究所製）５０００ｕｎｉｔｓを加えて３７
℃において４時間インキュベートした。反応終了後，９
０℃で２０分間加熱して酵素を失活させ，３５００Ｇで
２０分間遠心分離して不溶物を除き，得られた上澄液を
凍結乾燥してぺプシンとサーモライシンによる小麦グル
テンの加水分解物約３．５ｇを得た。
【００４４】（２） 上記（１）で得た小麦グルテンの
加水分解物８０ｍｇをナカライテスク社製オクタデシル
シラン（ＯＤＳ）カラムであるＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ
１８−ＡＲ（内径 ２０ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を使用
した逆相クロマトグラフィーに供した。次いで０．０５
％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）および０．０５％ト
リフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）
を使用して，Ｂ液の濃度を０％から４０％まで４０分か
けて直線的に増加する濃度勾配にて１０ｍｌ／分の流速
で溶出させた。その時の波長２３０ｎｍにおけるフロー
チャートを図１に示す。図１に示したフローチャートに
おける各画分を分取してそのオピオイド活性を測定した
ところ，アセトニトリルの濃度が約２２．５〜２３．５
％の範囲で溶出してくる画分（画分Ｉ），約２４〜２５
％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＩ），約２８〜２
９％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＩＩ），および
約３４〜３５％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＶ）
にオピオイド活性が認められた。
加水分解物８０ｍｇをナカライテスク社製オクタデシル
シラン（ＯＤＳ）カラムであるＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ
１８−ＡＲ（内径 ２０ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を使用
した逆相クロマトグラフィーに供した。次いで０．０５
％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）および０．０５％ト
リフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）
を使用して，Ｂ液の濃度を０％から４０％まで４０分か
けて直線的に増加する濃度勾配にて１０ｍｌ／分の流速
で溶出させた。その時の波長２３０ｎｍにおけるフロー
チャートを図１に示す。図１に示したフローチャートに
おける各画分を分取してそのオピオイド活性を測定した
ところ，アセトニトリルの濃度が約２２．５〜２３．５
％の範囲で溶出してくる画分（画分Ｉ），約２４〜２５
％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＩ），約２８〜２
９％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＩＩ），および
約３４〜３５％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＶ）
にオピオイド活性が認められた。
【００４５】（３） そこで，上記で（１）で得た小麦
グルテンの加水分解物２０００ｍｇを使用して上記
（２）と同じ工程を繰り返して，画分Ｉ，画分ＩＩ，画
分ＩＩＩおよび画分ＩＶのオピオイド活性画分を得て，
これらの画分を次にナカライテスク社製のフェニルカラ
ムＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｐｈ（内径４．６ｍｍ，長さ２
５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグラフィーに供した。
上記したＡ液とＢ液を使用してＢ液の濃度を０％から４
０％まで４０分かけて直線的に増加する濃度勾配にて１
ｍｌ／分の流速で溶出させた。溶出してくる各画分のオ
ピオイド活性を測定したところ，画分Ｉについてはアセ
トニトリルの濃度が約２４〜２５％の範囲で溶出してく
る画分（画分Ｉ−１），画分ＩＩについては約３３〜３
４％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＩ−１），画分
ＩＩＩについては約３０〜３１％の範囲で溶出してくる
画分（画分ＩＩＩ− １），そして画分ＩＶについては
約３６〜３７％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＶ−
１）にオピオイド活性が認められた。
グルテンの加水分解物２０００ｍｇを使用して上記
（２）と同じ工程を繰り返して，画分Ｉ，画分ＩＩ，画
分ＩＩＩおよび画分ＩＶのオピオイド活性画分を得て，
これらの画分を次にナカライテスク社製のフェニルカラ
ムＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｐｈ（内径４．６ｍｍ，長さ２
５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグラフィーに供した。
上記したＡ液とＢ液を使用してＢ液の濃度を０％から４
０％まで４０分かけて直線的に増加する濃度勾配にて１
ｍｌ／分の流速で溶出させた。溶出してくる各画分のオ
ピオイド活性を測定したところ，画分Ｉについてはアセ
トニトリルの濃度が約２４〜２５％の範囲で溶出してく
る画分（画分Ｉ−１），画分ＩＩについては約３３〜３
４％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＩ−１），画分
ＩＩＩについては約３０〜３１％の範囲で溶出してくる
画分（画分ＩＩＩ− １），そして画分ＩＶについては
約３６〜３７％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＶ−
１）にオピオイド活性が認められた。
【００４６】（４） 次に，上記（３）で得た画分Ｉ−
１，画分ＩＩ−１，画分ＩＩＩ−１および画分ＩＶ−１
のオピオイド活性画分をナカライテスク社製のシアノプ
ロピルカラムＣｏｓｍｏｓｉｌ ５ＣＮ−Ｒ（内径４．
６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグラフ
ィーに供して，上記（３）におけるのと同条件で溶出さ
せた。溶出してくる各画分を分取してそのオピオイド活
性を測定したところ，画分Ｉ−１についてはアセトニト
リルの濃度が約１８〜１９％付近の高吸収ピーク画分
（画分Ｉ−２），画分ＩＩ−１については約２７％付近
の高吸収ピーク画分（画分ＩＩ−２），画分ＩＩＩ−１
については約２６〜２７％の範囲のピーク画分（画分Ｉ
ＩＩ−２），そして画分ＩＶについては約３２〜３３％
の範囲のピーク画分（画分ＩＶ−２）にオピオイド活性
が認められた。
１，画分ＩＩ−１，画分ＩＩＩ−１および画分ＩＶ−１
のオピオイド活性画分をナカライテスク社製のシアノプ
ロピルカラムＣｏｓｍｏｓｉｌ ５ＣＮ−Ｒ（内径４．
６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグラフ
ィーに供して，上記（３）におけるのと同条件で溶出さ
せた。溶出してくる各画分を分取してそのオピオイド活
性を測定したところ，画分Ｉ−１についてはアセトニト
リルの濃度が約１８〜１９％付近の高吸収ピーク画分
（画分Ｉ−２），画分ＩＩ−１については約２７％付近
の高吸収ピーク画分（画分ＩＩ−２），画分ＩＩＩ−１
については約２６〜２７％の範囲のピーク画分（画分Ｉ
ＩＩ−２），そして画分ＩＶについては約３２〜３３％
の範囲のピーク画分（画分ＩＶ−２）にオピオイド活性
が認められた。
【００４７】（５） 次に，上記（４）で得たオピオイ
ド活性画分のうち，画分Ｉ−２，画分ＩＩＩ−２と画分
ＩＶ−２については，更にナカライテスク社製のオクタ
デシルシラン（ＯＤＳ）カラムであるＣｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｃ１８−ＡＲ（内径４．６ｍｍ，長さ１５０ｍｍ）
を使用して，逆相クロマトグラフィーに供した。次い
で，１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液
（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２
ＨＰＯ４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル溶液
（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１００％
まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出させた。溶出し
てくる各画分を分取して，そのオピオイド活性を測定し
たところ，画分Ｉ−２については，アセトニトリル濃度
が約１８％の高吸収ピーク画分（画分Ｉ−３），画分Ｉ
ＩＩ−２については，約２１％付近の高吸収ピーク画分
（画分ＩＩＩ−３），そして画分ＩＶ−２についてはア
セトニトリル濃度が約２８％付近の高吸収ピーク画分
（画分ＩＶ−３）にオピオイド活性が認められた。
ド活性画分のうち，画分Ｉ−２，画分ＩＩＩ−２と画分
ＩＶ−２については，更にナカライテスク社製のオクタ
デシルシラン（ＯＤＳ）カラムであるＣｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｃ１８−ＡＲ（内径４．６ｍｍ，長さ１５０ｍｍ）
を使用して，逆相クロマトグラフィーに供した。次い
で，１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液
（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２
ＨＰＯ４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル溶液
（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１００％
まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出させた。溶出し
てくる各画分を分取して，そのオピオイド活性を測定し
たところ，画分Ｉ−２については，アセトニトリル濃度
が約１８％の高吸収ピーク画分（画分Ｉ−３），画分Ｉ
ＩＩ−２については，約２１％付近の高吸収ピーク画分
（画分ＩＩＩ−３），そして画分ＩＶ−２についてはア
セトニトリル濃度が約２８％付近の高吸収ピーク画分
（画分ＩＶ−３）にオピオイド活性が認められた。
【００４８】（６） 次に，上記（５）で得たオピオイ
ド活性画分のうち画分ＩＶ−３については，再び上記
（５）で用いたカラムを使用した逆相クロマトグラフィ
ーに供し，次いで，上記（４）におけるのと同条件で溶
出させた。溶出してくる各画分を分取してそのオピオイ
ド活性を測定したところ，アセトニトリル濃度が約３１
％付近の高吸収ピーク画分（画分ＩＶ−４）にオピオイ
ド活性が認められた。
ド活性画分のうち画分ＩＶ−３については，再び上記
（５）で用いたカラムを使用した逆相クロマトグラフィ
ーに供し，次いで，上記（４）におけるのと同条件で溶
出させた。溶出してくる各画分を分取してそのオピオイ
ド活性を測定したところ，アセトニトリル濃度が約３１
％付近の高吸収ピーク画分（画分ＩＶ−４）にオピオイ
ド活性が認められた。
【００４９】（７） 更に，上記（６）で得たオピオイ
ド活性画分のうち画分ＩＶ−４については，更に野村化
学社製のフェネチルカラムであるＤｅｖｅｌｏｓｉｌ
ＰｈＡ−Ｔ−５（内径４．６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）に
供して，上記（５）におけるのと同条件で溶出させた。
溶出してくる各画分のオピオイド活性を測定したとこ
ろ，アセトニトリル濃度が約２９％付近の高吸収ピーク
画分（画分ＩＶ−５）にオピオイド活性が認められた。
ド活性画分のうち画分ＩＶ−４については，更に野村化
学社製のフェネチルカラムであるＤｅｖｅｌｏｓｉｌ
ＰｈＡ−Ｔ−５（内径４．６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）に
供して，上記（５）におけるのと同条件で溶出させた。
溶出してくる各画分のオピオイド活性を測定したとこ
ろ，アセトニトリル濃度が約２９％付近の高吸収ピーク
画分（画分ＩＶ−５）にオピオイド活性が認められた。
【００５０】（８） 上記（４）で得た画分ＩＩ−２，
上記（５）で得た画分Ｉ−３および画分ＩＩＩ−３，並
びに上記（７）で得た画分ＩＶ−５を回収し，濃縮乾燥
した。なお，上記図１において，左側縦軸は溶離してき
た液の Ａｂｓ．２３０を，右側縦軸は溶離液中のアセ
トニトリル濃度（％）を示す。
上記（５）で得た画分Ｉ−３および画分ＩＩＩ−３，並
びに上記（７）で得た画分ＩＶ−５を回収し，濃縮乾燥
した。なお，上記図１において，左側縦軸は溶離してき
た液の Ａｂｓ．２３０を，右側縦軸は溶離液中のアセ
トニトリル濃度（％）を示す。
【００５１】上記で得た乾燥物をアプライドバイオシス
テム社製のプロテインシーケンサー４７７−Ａ型を使用
してそのアミノ酸配列を調べたところ，画分Ｉ−３の乾
燥物については，Ｎ末端から順次Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｔｙ
ｒ，Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−ＰｒｏおよびＬ−Ｔｈｒが遊離し
てきた。このことから，その構成アミノ酸のすべてがＬ
−アミノ酸である配列番号２で表されるペプチドである
ことが確認された。また，画分ＩＩ−２の乾燥物につい
てはＮ−末端から順次Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−Ｔ
ｙｒおよびＬ−Ｐｒｏが遊離してきた。このことから，
その構成アミノ酸すべてがＬ−アミノ酸である配列番号
１で表されるペプチドであることが確認された。
テム社製のプロテインシーケンサー４７７−Ａ型を使用
してそのアミノ酸配列を調べたところ，画分Ｉ−３の乾
燥物については，Ｎ末端から順次Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｔｙ
ｒ，Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−ＰｒｏおよびＬ−Ｔｈｒが遊離し
てきた。このことから，その構成アミノ酸のすべてがＬ
−アミノ酸である配列番号２で表されるペプチドである
ことが確認された。また，画分ＩＩ−２の乾燥物につい
てはＮ−末端から順次Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−Ｔ
ｙｒおよびＬ−Ｐｒｏが遊離してきた。このことから，
その構成アミノ酸すべてがＬ−アミノ酸である配列番号
１で表されるペプチドであることが確認された。
【００５２】また，画分ＩＩＩ−３の乾燥物について
は，Ｎ末端から順次Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｇ１
ｙおよびＬ−Ｔｒｐが遊離してきた。このことからその
構成アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番号５
で表されるペプチドであることが確認された。そして，
画分ＩＶ−５から得た乾燥物については，Ｎ末端から順
次Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｔｒｐお
よびＬ−Ｌｅｕが遊離してきた。このことからその構成
アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番号４で表
されるペプチドであることが確認された。
は，Ｎ末端から順次Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｇ１
ｙおよびＬ−Ｔｒｐが遊離してきた。このことからその
構成アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番号５
で表されるペプチドであることが確認された。そして，
画分ＩＶ−５から得た乾燥物については，Ｎ末端から順
次Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｔｒｐお
よびＬ−Ｌｅｕが遊離してきた。このことからその構成
アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番号４で表
されるペプチドであることが確認された。
【００５３】配列番号１，配列番号２，配列番号４およ
び配列番号５で表される各ペプチドの原料グルテンから
の収率（％）を，その分子量とＡｂｓ．２８０における
分子吸光係数から求めたところ，順に約４×１０
−２（％），４×１０−３（％），１×１０−５（％）
および３×１０−４（％）であることが確認された。
び配列番号５で表される各ペプチドの原料グルテンから
の収率（％）を，その分子量とＡｂｓ．２８０における
分子吸光係数から求めたところ，順に約４×１０
−２（％），４×１０−３（％），１×１０−５（％）
および３×１０−４（％）であることが確認された。
【００５４】また，シリカゲルプレートによる薄層クロ
マトグラフィーでＲｆ値を求めたところ，ブタノール：
酢酸：ピリジン：水＝１５：３：１０：１２の展開溶媒
を使用した場合のＲｆ値は，配列番号１，配列番号２，
配列番号４および配列番号５で表される各ペプチドで，
順に，０．５８，０．５４，０．７７および０．６１で
あった。
マトグラフィーでＲｆ値を求めたところ，ブタノール：
酢酸：ピリジン：水＝１５：３：１０：１２の展開溶媒
を使用した場合のＲｆ値は，配列番号１，配列番号２，
配列番号４および配列番号５で表される各ペプチドで，
順に，０．５８，０．５４，０．７７および０．６１で
あった。
【００５５】実施例 ２ 「小麦グルテンの加水分解による配列番号１，配列番号
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］酸性プロテアーゼと
してペプシンの代わりにアスペルギルスニガー起源のア
スパルティクプロティナーゼ（商品名「プロテアーゼＹ
Ｐ−ＳＳ」；ヤクルト本社製）をペプシンの場合と同じ
量（ｕｎｉｔｓ）で使用し，小麦グルテン溶液をｐＨ
３．０に調整して，３７℃で１５時間インキュベートし
た他は実施例１と全く同様にして小麦グルテンの加水分
解を行ったところ，実施例１の（２）と同様の逆相クロ
マトグラフィーにて，図１とにされた画分Ｉ，画分Ｉ
Ｉ，画分ＩＩＩおよび画分ＩＶに実施例１と同程度のオ
ピオイド活性が認められた。したがって，この実施例に
おいても，配列番号１，配列番号２，配列番号４および
配列番号５で表されるペプチドを混合含有するオピオイ
ド活性を有するペプチド混合物が得られた。
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］酸性プロテアーゼと
してペプシンの代わりにアスペルギルスニガー起源のア
スパルティクプロティナーゼ（商品名「プロテアーゼＹ
Ｐ−ＳＳ」；ヤクルト本社製）をペプシンの場合と同じ
量（ｕｎｉｔｓ）で使用し，小麦グルテン溶液をｐＨ
３．０に調整して，３７℃で１５時間インキュベートし
た他は実施例１と全く同様にして小麦グルテンの加水分
解を行ったところ，実施例１の（２）と同様の逆相クロ
マトグラフィーにて，図１とにされた画分Ｉ，画分Ｉ
Ｉ，画分ＩＩＩおよび画分ＩＶに実施例１と同程度のオ
ピオイド活性が認められた。したがって，この実施例に
おいても，配列番号１，配列番号２，配列番号４および
配列番号５で表されるペプチドを混合含有するオピオイ
ド活性を有するペプチド混合物が得られた。
【００５６】実施例 ３ 「小麦グルテンの加水分解による配列番号１，配列番号
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］中性プロテアーゼと
してサーモライシン代わりにアスペルギルオリゼー起源
の中性プロテアーゼ（商品名「プロチンＦＮ」；大和化
成製）をサーモライシンの場合と同じ量（ｕｎｉｔｓ）
で使用した他は実施例１と全く同様にして小麦グルテン
の加水分解を行ったところ，実施例１の（２）と同様の
逆相クロマトグラフィーにて，図１と示された画分Ｉ，
画分ＩＩ，画分ＩＩＩおよび画分ＩＶに実施例１と同程
度のオピオイド活性が認められた。したがって，この実
施例においても，配列番号１，配列番号２，配列番号４
および配列番号５で表されるペプチドを混合含有するオ
ピオイド活性を有するペプチド混合物が得られた。
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］中性プロテアーゼと
してサーモライシン代わりにアスペルギルオリゼー起源
の中性プロテアーゼ（商品名「プロチンＦＮ」；大和化
成製）をサーモライシンの場合と同じ量（ｕｎｉｔｓ）
で使用した他は実施例１と全く同様にして小麦グルテン
の加水分解を行ったところ，実施例１の（２）と同様の
逆相クロマトグラフィーにて，図１と示された画分Ｉ，
画分ＩＩ，画分ＩＩＩおよび画分ＩＶに実施例１と同程
度のオピオイド活性が認められた。したがって，この実
施例においても，配列番号１，配列番号２，配列番号４
および配列番号５で表されるペプチドを混合含有するオ
ピオイド活性を有するペプチド混合物が得られた。
【００５７】実施例 ４ 「小麦グルテンの加水分解による配列番号１，配列番号
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］中性プロテアーゼの
代わりにバチルス起源のセリンプロテアーゼ（商品名
「ビオプラーゼＳＰ−４」；長瀬産業製）をサーモライ
シンの場合と同じ量（ｕｎｉｔｓ）で使用した他は実施
例１と同様にして小麦グルテンの加水分解を行ったとこ
ろ，実施例１の（２）と同様の逆相クロマトグラフィー
にて，図１と示された画分Ｉ，画分ＩＩ，画分ＩＩＩお
よび画分ＩＶに実施例１と同程度のオピオイド活性が認
められた。したがって，この実施例においても，配列番
号１，配列番号２，配列番号４および配列番号５で表さ
れるペプチドを混合含有するオピオイド活性を有するペ
プチド混合物が得られた。
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］中性プロテアーゼの
代わりにバチルス起源のセリンプロテアーゼ（商品名
「ビオプラーゼＳＰ−４」；長瀬産業製）をサーモライ
シンの場合と同じ量（ｕｎｉｔｓ）で使用した他は実施
例１と同様にして小麦グルテンの加水分解を行ったとこ
ろ，実施例１の（２）と同様の逆相クロマトグラフィー
にて，図１と示された画分Ｉ，画分ＩＩ，画分ＩＩＩお
よび画分ＩＶに実施例１と同程度のオピオイド活性が認
められた。したがって，この実施例においても，配列番
号１，配列番号２，配列番号４および配列番号５で表さ
れるペプチドを混合含有するオピオイド活性を有するペ
プチド混合物が得られた。
【００５８】実施例 ５ ［小麦グルテンの加水分解による配列番号６で表される
本発明のペプチドの調製］ （１）小麦グレテン５ｇを０．０２Ｎ塩酸１００ｍｌに
分散溶解させた後，３５００Ｇで２０分間遠心分離して
不溶物を除き，１Ｎ塩酸を加えてｐＨを２．０に調整し
た。この小麦グルテン液にペプシン（米国シグマ社製）
５０００ｕｎｉｔｓを加えて３７℃で１５時間インキュ
ベートした。反応終了後１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液
を加えてｐＨを７．０に調整した後，トリプシン（米国
シグマ社製）およびキモトリプシン（米国シグマ社製）
を各５０００ｕｎｉｔｓづつ加えて３７℃において４時
間インキュベートした。反応終了後，９０℃で２０分間
加熱して酵素を失活させ，３５００Ｇで２０分間遠心分
離して不溶物を除き，得られた上澄液を凍結乾燥してペ
プシンとトリプシンおよびキモトリプシンによる小麦グ
ルテンの加水分解物約３．０ｇを得た。
本発明のペプチドの調製］ （１）小麦グレテン５ｇを０．０２Ｎ塩酸１００ｍｌに
分散溶解させた後，３５００Ｇで２０分間遠心分離して
不溶物を除き，１Ｎ塩酸を加えてｐＨを２．０に調整し
た。この小麦グルテン液にペプシン（米国シグマ社製）
５０００ｕｎｉｔｓを加えて３７℃で１５時間インキュ
ベートした。反応終了後１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液
を加えてｐＨを７．０に調整した後，トリプシン（米国
シグマ社製）およびキモトリプシン（米国シグマ社製）
を各５０００ｕｎｉｔｓづつ加えて３７℃において４時
間インキュベートした。反応終了後，９０℃で２０分間
加熱して酵素を失活させ，３５００Ｇで２０分間遠心分
離して不溶物を除き，得られた上澄液を凍結乾燥してペ
プシンとトリプシンおよびキモトリプシンによる小麦グ
ルテンの加水分解物約３．０ｇを得た。
【００５９】（２） 上記（１）で得た小麦グルテンの
加水分解物をナカライテスク社製オクタデシルシラン
（ＯＤＳ）カラムであるＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−
ＡＲ（内径２０ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を使用した逆相
クロマトグラフィーに供した。次いで０．０５％トリフ
ルオロ酢酸水溶液（Ａ液）および０．０５％トリフルオ
ロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）を使用し
て，Ｂ液の濃度を０％から４０％まで４０分かけて直線
的に増加する濃度勾配にて１０ｍｌ／分の流速で溶出さ
せた。その時の波長２３０ｎｍにおけるフローチャート
を図２に示す。図２に示したフローチャートにおける，
各画分を分取してそのオピオイド活性を測定したとこ
ろ，アセトニトリルの濃度が約３１〜３２％の範囲で溶
出してくる画分（画分Ｖ）にオピオイド活性が認められ
た。
加水分解物をナカライテスク社製オクタデシルシラン
（ＯＤＳ）カラムであるＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−
ＡＲ（内径２０ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を使用した逆相
クロマトグラフィーに供した。次いで０．０５％トリフ
ルオロ酢酸水溶液（Ａ液）および０．０５％トリフルオ
ロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）を使用し
て，Ｂ液の濃度を０％から４０％まで４０分かけて直線
的に増加する濃度勾配にて１０ｍｌ／分の流速で溶出さ
せた。その時の波長２３０ｎｍにおけるフローチャート
を図２に示す。図２に示したフローチャートにおける，
各画分を分取してそのオピオイド活性を測定したとこ
ろ，アセトニトリルの濃度が約３１〜３２％の範囲で溶
出してくる画分（画分Ｖ）にオピオイド活性が認められ
た。
【００６０】（３） そこで，上記（１）で得た小麦グ
ルテンの加水分解物２０００ｍｇを使用して，工程
（２）と同じ処理を繰り返して，画分Ｖのオピオイド活
性画分を得て，この画分を次にナカライテスク社製のフ
ェニルカラムＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｐｈ（内径 ４．６
ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグラフィ
ーに供した。上記したＡ液とＢ液を使用してＢ液の濃度
を０％から４０％まで４０分かけて直線的に増加する濃
度勾配にて１ｍｌ／分の流速で溶出させた。溶出してく
る画分のオピオイド活性を測定したところ，アセトニト
リルの濃度が約３３％付近で溶出してくる画分（画分Ｖ
−１）にオピオイド活性が認められた。
ルテンの加水分解物２０００ｍｇを使用して，工程
（２）と同じ処理を繰り返して，画分Ｖのオピオイド活
性画分を得て，この画分を次にナカライテスク社製のフ
ェニルカラムＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｐｈ（内径 ４．６
ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグラフィ
ーに供した。上記したＡ液とＢ液を使用してＢ液の濃度
を０％から４０％まで４０分かけて直線的に増加する濃
度勾配にて１ｍｌ／分の流速で溶出させた。溶出してく
る画分のオピオイド活性を測定したところ，アセトニト
リルの濃度が約３３％付近で溶出してくる画分（画分Ｖ
−１）にオピオイド活性が認められた。
【００６１】（４） 次に，上記（３）で得た画分Ｖ−
１のオピオイド活性画分をナカライテスク社製のシアノ
プロピルカラムＣｏｓｍｏｓｉｌ ５ＣＮ−Ｒ（内径
４．６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグ
ラフィーに供して，上記（３）におけるのと同条件で溶
出させた。溶出してくる各画分を分取してそのオピオイ
ド活性を測定したところ，アセトニトリルの濃度が約２
７〜２８％の範囲のピーク画分（画分Ｖ−２）にオピオ
イド活性が認められた。
１のオピオイド活性画分をナカライテスク社製のシアノ
プロピルカラムＣｏｓｍｏｓｉｌ ５ＣＮ−Ｒ（内径
４．６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグ
ラフィーに供して，上記（３）におけるのと同条件で溶
出させた。溶出してくる各画分を分取してそのオピオイ
ド活性を測定したところ，アセトニトリルの濃度が約２
７〜２８％の範囲のピーク画分（画分Ｖ−２）にオピオ
イド活性が認められた。
【００６２】（５） 次に，上記（４）で得た画分Ｖ−
２のオピオイド活性画分を，ナカライテスク社製のオク
タデシルシラン（ＯＤＳ）カラムであるＣｏｓｍｏｓｉ
ｌ ５Ｃ１８−ＡＲ（内径４．６ｍｍ，長さ１５０ｍ
ｍ）を使用して逆相クロマトグラフィーに供した。次い
で，１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液
（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２
ＨＰＯ４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル溶液
（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１００％
まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出させた。溶出し
てくる各々の画分を分取して，そのオピオイド活性を測
定したところ，アセトニトリル濃度が約２４％付近の高
吸収ピーク画分（画分Ｖ−３）にオピオイド活性が認め
られた。
２のオピオイド活性画分を，ナカライテスク社製のオク
タデシルシラン（ＯＤＳ）カラムであるＣｏｓｍｏｓｉ
ｌ ５Ｃ１８−ＡＲ（内径４．６ｍｍ，長さ１５０ｍ
ｍ）を使用して逆相クロマトグラフィーに供した。次い
で，１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液
（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２
ＨＰＯ４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル溶液
（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１００％
まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出させた。溶出し
てくる各々の画分を分取して，そのオピオイド活性を測
定したところ，アセトニトリル濃度が約２４％付近の高
吸収ピーク画分（画分Ｖ−３）にオピオイド活性が認め
られた。
【００６３】（６） 上記（５）で得られた画分Ｖ−３
を回収し，濃縮乾燥した。上記で得た乾燥物を実施例１
で使用したのと同じプロテインシーケンサー４７７−Ａ
型を使用してそのアミノ酸配列を調べたところ，Ｎ末端
から順次Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−Ｐｒｏ，Ｌ−Ｉｌｅ，Ｌ−Ｓ
ｅｒおよびＬ−Ｌｅｕが遊離してきた。このことからそ
の構成アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番号
６で表されるペプチドであることが確認された。配列番
号６で表されるペプチドの原料グルテンからの収率
（％）は，その分子量とＡｂｓ．２８０における分子吸
光係数より，約４×１０−４（％）であることが確認さ
れた。また，実施例１と同様にシリカゲルプレートによ
る薄層クロマトグラフィーでＲｆ値を求めたところ０．
７３であった。
を回収し，濃縮乾燥した。上記で得た乾燥物を実施例１
で使用したのと同じプロテインシーケンサー４７７−Ａ
型を使用してそのアミノ酸配列を調べたところ，Ｎ末端
から順次Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−Ｐｒｏ，Ｌ−Ｉｌｅ，Ｌ−Ｓ
ｅｒおよびＬ−Ｌｅｕが遊離してきた。このことからそ
の構成アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番号
６で表されるペプチドであることが確認された。配列番
号６で表されるペプチドの原料グルテンからの収率
（％）は，その分子量とＡｂｓ．２８０における分子吸
光係数より，約４×１０−４（％）であることが確認さ
れた。また，実施例１と同様にシリカゲルプレートによ
る薄層クロマトグラフィーでＲｆ値を求めたところ０．
７３であった。
【００６４】実施例 ６ ［合成による本発明のペプチドの製造］配列番号１で表
されるペプチドの合成は以下の方法で行った。市販のＢ
ｏｃ（ブトキシカルボニル）−Ｐｒｏ−樹脂（置換率
０．４ｍｅｑ／ｇ）０．７５ｇと４５％トリフルオロ酢
酸および２．５％アニソールを含む塩化メチレン２０ｍ
ｌをバイオサーチ社のペプチド合成装置ＳＡＭ ＴＷＯ
の反応槽の中で室温で２５分間反応させてＢｏｃ基を除
去した。次にＢｏｃ基の除去されたＰｒｏ−樹脂を塩化
メチレンで洗浄し，次いで１０％のジイソプロピルエチ
ルアミンを含む塩化メチレンにより中和した後，更に塩
化メチレンで洗浄した。この樹脂に０．４Ｍ Ｂｏｃ−
Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）のジメチルホルムアミド溶液
５ｍｌ，０．４Ｍジイソプロピルカルボジイミドの塩化
メチレン溶液５ｍｌを混合して反応槽に入れて室温で２
時間撹拌下に反応させた。
されるペプチドの合成は以下の方法で行った。市販のＢ
ｏｃ（ブトキシカルボニル）−Ｐｒｏ−樹脂（置換率
０．４ｍｅｑ／ｇ）０．７５ｇと４５％トリフルオロ酢
酸および２．５％アニソールを含む塩化メチレン２０ｍ
ｌをバイオサーチ社のペプチド合成装置ＳＡＭ ＴＷＯ
の反応槽の中で室温で２５分間反応させてＢｏｃ基を除
去した。次にＢｏｃ基の除去されたＰｒｏ−樹脂を塩化
メチレンで洗浄し，次いで１０％のジイソプロピルエチ
ルアミンを含む塩化メチレンにより中和した後，更に塩
化メチレンで洗浄した。この樹脂に０．４Ｍ Ｂｏｃ−
Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）のジメチルホルムアミド溶液
５ｍｌ，０．４Ｍジイソプロピルカルボジイミドの塩化
メチレン溶液５ｍｌを混合して反応槽に入れて室温で２
時間撹拌下に反応させた。
【００６５】上記で得られた樹脂を，順にジメチルホル
ムアミド，塩化メチレン，ジイソプロピルエチルアミン
を１０％含有する塩化メチレン，塩化メチレンおよび塩
化メチレン／ジメチルホルムアミド混合液で洗浄して，
Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ−樹脂を得
た。引き続き上記と同様にしてＢｏｃ基の除去，Ｂｏｃ
アミノ酸のカップリングを繰り返してＢｏｃ−Ｔｙｒ
（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｐｒ
ｏ−樹脂からなる生成物を得た。更に同様にしてＢｏｃ
基の除去，Ｂｏｃアミノ酸のカップリングを繰り返し
て，Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｔｙ
ｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ−樹脂からなる生成物を
得た。
ムアミド，塩化メチレン，ジイソプロピルエチルアミン
を１０％含有する塩化メチレン，塩化メチレンおよび塩
化メチレン／ジメチルホルムアミド混合液で洗浄して，
Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ−樹脂を得
た。引き続き上記と同様にしてＢｏｃ基の除去，Ｂｏｃ
アミノ酸のカップリングを繰り返してＢｏｃ−Ｔｙｒ
（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｐｒ
ｏ−樹脂からなる生成物を得た。更に同様にしてＢｏｃ
基の除去，Ｂｏｃアミノ酸のカップリングを繰り返し
て，Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｔｙ
ｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ−樹脂からなる生成物を
得た。
【００６６】この樹脂を１０％のアニソールを含有する
フッ化水素２０ｍｌに入れて０℃で２時間撹拌してペプ
チドを樹脂から遊離させた。その後，フッ化水素を減圧
留去し，残渣を３０％酢酸で抽出し，それを凍結乾燥し
て粗ペプチド１５０ｍｇを得た。これをナカライテスク
株式会社製のオクタデシルシラン（ＯＤＳ）カラムであ
るＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲを用いた逆相クロ
マトグラフィーにより精製して最終生成物４０ｍｇを得
た。そのアミノ酸組成（モル比）は，Ｇｌｙ：Ｔｙｒ：
Ｔｙｒ：Ｐｒｏ＝１：１：１：１であった。更に実施例
１で使用したのと同じプロテインシーケンサーにより分
析したところ，配列番号１で表されるアミノ酸配列を有
するペプチドであることが判明した。また該生成物の薄
層クロマトグラフィーのＲｆ値は，実施例１の生成物と
同様に０．５８であった。
フッ化水素２０ｍｌに入れて０℃で２時間撹拌してペプ
チドを樹脂から遊離させた。その後，フッ化水素を減圧
留去し，残渣を３０％酢酸で抽出し，それを凍結乾燥し
て粗ペプチド１５０ｍｇを得た。これをナカライテスク
株式会社製のオクタデシルシラン（ＯＤＳ）カラムであ
るＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲを用いた逆相クロ
マトグラフィーにより精製して最終生成物４０ｍｇを得
た。そのアミノ酸組成（モル比）は，Ｇｌｙ：Ｔｙｒ：
Ｔｙｒ：Ｐｒｏ＝１：１：１：１であった。更に実施例
１で使用したのと同じプロテインシーケンサーにより分
析したところ，配列番号１で表されるアミノ酸配列を有
するペプチドであることが判明した。また該生成物の薄
層クロマトグラフィーのＲｆ値は，実施例１の生成物と
同様に０．５８であった。
【００６７】また，配列番号２で表されるペプチドの場
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て市販のＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−樹脂（置換率０．
３ｍｅｑ／ｇ）１ｇから最終生成物３０ｍｇを得た。そ
のアミノ酸組成（モル比）は，Ｇｌｙ：Ｔｙｒ：Ｔｙ
ｒ：Ｐｒｏ：Ｔｈｒ＝１：１：１：１：１であり，そし
て実施例１で使用したプロテインシーケンサーにより分
析したところ，配列番号２で表されるアミノ酸配列を有
するペプチドであることが判明した。またこの生成物の
薄層クロマトグラフィーのＲｆ値は実施例１の生成物と
同様に０．５４であった。
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て市販のＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−樹脂（置換率０．
３ｍｅｑ／ｇ）１ｇから最終生成物３０ｍｇを得た。そ
のアミノ酸組成（モル比）は，Ｇｌｙ：Ｔｙｒ：Ｔｙ
ｒ：Ｐｒｏ：Ｔｈｒ＝１：１：１：１：１であり，そし
て実施例１で使用したプロテインシーケンサーにより分
析したところ，配列番号２で表されるアミノ酸配列を有
するペプチドであることが判明した。またこの生成物の
薄層クロマトグラフィーのＲｆ値は実施例１の生成物と
同様に０．５４であった。
【００６８】更に，配列番号３で表されるペプチドの場
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て市販のＢｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−樹脂（置換率０．
３９ｍｅｑ／ｇ）０．７７ｇから最終生成物３０ｍｇを
得た。そのアミノ酸組成（モル比）は，Ｇｌｙ：Ｔｙ
ｒ：Ｔｙｒ：Ｐｒｏ：Ｔｈｒ：Ｓｅｒ＝１：１：１：
１：１：１であり，そして実施例１で使用したプロテイ
ンシーケンサーにより分析したところ，配列番号３で表
されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが判明
した。またこの生成物の薄層クロマトグラフィーのＲｆ
値は０．５３であった。
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て市販のＢｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−樹脂（置換率０．
３９ｍｅｑ／ｇ）０．７７ｇから最終生成物３０ｍｇを
得た。そのアミノ酸組成（モル比）は，Ｇｌｙ：Ｔｙ
ｒ：Ｔｙｒ：Ｐｒｏ：Ｔｈｒ：Ｓｅｒ＝１：１：１：
１：１：１であり，そして実施例１で使用したプロテイ
ンシーケンサーにより分析したところ，配列番号３で表
されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが判明
した。またこの生成物の薄層クロマトグラフィーのＲｆ
値は０．５３であった。
【００６９】そして，配列番号４で表されるペプチドの
場合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様に
して，市販のＢｏｃ−Ｌｅｕ−樹脂（置換率０．５ｍｅ
ｑ／ｇ）０．６ｇから最終生成物４０ｍｇを得た。その
アミノ酸組成（モル比）は，Ｔｙｒ：Ｇｌｙ：Ｇｌｙ：
Ｔｒｙ：Ｌｅｕ＝１：１：１：１：１であった。更に，
実施例１で使用したプロテインシーケンサーにより分析
したところ，配列番号４で表されるアミノ酸配列を有す
るペプチドであることが判明した。また，該生成物の薄
層クロマトグラフィーのＲｆ値は，実施例２の生成物と
同様に０．７７であった。
場合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様に
して，市販のＢｏｃ−Ｌｅｕ−樹脂（置換率０．５ｍｅ
ｑ／ｇ）０．６ｇから最終生成物４０ｍｇを得た。その
アミノ酸組成（モル比）は，Ｔｙｒ：Ｇｌｙ：Ｇｌｙ：
Ｔｒｙ：Ｌｅｕ＝１：１：１：１：１であった。更に，
実施例１で使用したプロテインシーケンサーにより分析
したところ，配列番号４で表されるアミノ酸配列を有す
るペプチドであることが判明した。また，該生成物の薄
層クロマトグラフィーのＲｆ値は，実施例２の生成物と
同様に０．７７であった。
【００７０】更に，配列番号５で表されるペプチドの場
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て，市販のＢｏｃ−Ｔｒｐ−樹脂（置換率０．３ｍｅｑ
／ｇ）１ｇから最終生成物３０ｍｇを得た。そのアミノ
酸組成（モル比）は，Ｔｙｒ：Ｇｌｙ：Ｇｌｙ：Ｔｒｐ
＝１：１：１：１であり，そして実施例１で使用したプ
ロテインシーケンサーにより分析したところ，配列番号
５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであること
が判明した。また，該生成物の薄層クロマトグラフィー
のＲｆ値は，実施例２の生成物と同様に０．６１であっ
た。
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て，市販のＢｏｃ−Ｔｒｐ−樹脂（置換率０．３ｍｅｑ
／ｇ）１ｇから最終生成物３０ｍｇを得た。そのアミノ
酸組成（モル比）は，Ｔｙｒ：Ｇｌｙ：Ｇｌｙ：Ｔｒｐ
＝１：１：１：１であり，そして実施例１で使用したプ
ロテインシーケンサーにより分析したところ，配列番号
５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであること
が判明した。また，該生成物の薄層クロマトグラフィー
のＲｆ値は，実施例２の生成物と同様に０．６１であっ
た。
【００７１】そして，配列番号６で表されるペプチドの
場合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様に
して，市販のＢｏｃ−Ｌｅｕ−樹脂（置換率０．５ｍｅ
ｑ／ｇ）０．６ｇから最終生成物４０ｍｇを得た。その
アミノ酸組成（モル比）は，Ｔｙｒ：Ｐｒｏ：Ｉｌｅ：
Ｓｅｒ：Ｌｅｕ＝１：１：１：１：１であった。そして
実施例１で使用したプロテインシーケンサーにより分析
したところ，配列番号６で表されるアミノ酸配列を有す
るペプチドであることが判明した。また，該生成物の薄
層クロマトグラフィーのＲｆ値は，実施例３の生成物と
同様に０．７３であった。
場合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様に
して，市販のＢｏｃ−Ｌｅｕ−樹脂（置換率０．５ｍｅ
ｑ／ｇ）０．６ｇから最終生成物４０ｍｇを得た。その
アミノ酸組成（モル比）は，Ｔｙｒ：Ｐｒｏ：Ｉｌｅ：
Ｓｅｒ：Ｌｅｕ＝１：１：１：１：１であった。そして
実施例１で使用したプロテインシーケンサーにより分析
したところ，配列番号６で表されるアミノ酸配列を有す
るペプチドであることが判明した。また，該生成物の薄
層クロマトグラフィーのＲｆ値は，実施例３の生成物と
同様に０．７３であった。
【００７２】上記の実施例１〜６における各画分のオピ
オイド活性および配列番号１〜配列番号６で表されるペ
プチド，ならびに既知のオピオイドペプチドのオピオイ
ド活性は，いずれも次のようにして測定した。
オイド活性および配列番号１〜配列番号６で表されるペ
プチド，ならびに既知のオピオイドペプチドのオピオイ
ド活性は，いずれも次のようにして測定した。
【００７３】《オピオイド活性の測定法》体重３０〜３
５ｇのＩＣＲ系の雄マウスより摘出した２本の輸精管を
アイソトニックトランスデューサー（日本光電工業株式
会社製：ＴＢ ６１２−Ｔ）に接続して０．４ｇの張力
をかける。３６℃に保温した２ｍｌ容量のマグヌス管内
に，Ｋｒｅｂｓ等張液（ＮａＣｌ １１８ｍＭ，ＫＣｌ
４．７５ｍＭ，ＣａＣｌ２２．５４ｍＭ，ＮａＨＣＯ
３２５ｍＭ，ＫＨ２ＰＯ４１．１９ｍＭ，グルコース１
１ｍＭ）を満たしたものの中に輸精管を浸して，ボンベ
から通気（０２９５％：ＣＯ２５％）を行った。このよ
うにして約２時間安定化させた後，３０Ｖで１ｍｓｅｃ
の電気刺激を与え，マウス輸精管を電気収縮させた。電
気収縮が安定した後，アミノペプチダーゼ阻害剤等を含
むインヒビター５０μｌを加え，小麦グルテンの酵素分
解物の高速液体クロマトグラフィーにより分画された各
画分を添加し，マウス輸精管の電気収縮の変化をレコー
ダーで記録した。オピオイド活性は画分添加後電気収縮
の抑制と１０−４Ｍナロキソン２０μｌ添加による抑制
の解除によって判定した。そしてマウス輸精管の電気収
縮を５０％抑制する濃度（ＩＣ５０）を測定した。
５ｇのＩＣＲ系の雄マウスより摘出した２本の輸精管を
アイソトニックトランスデューサー（日本光電工業株式
会社製：ＴＢ ６１２−Ｔ）に接続して０．４ｇの張力
をかける。３６℃に保温した２ｍｌ容量のマグヌス管内
に，Ｋｒｅｂｓ等張液（ＮａＣｌ １１８ｍＭ，ＫＣｌ
４．７５ｍＭ，ＣａＣｌ２２．５４ｍＭ，ＮａＨＣＯ
３２５ｍＭ，ＫＨ２ＰＯ４１．１９ｍＭ，グルコース１
１ｍＭ）を満たしたものの中に輸精管を浸して，ボンベ
から通気（０２９５％：ＣＯ２５％）を行った。このよ
うにして約２時間安定化させた後，３０Ｖで１ｍｓｅｃ
の電気刺激を与え，マウス輸精管を電気収縮させた。電
気収縮が安定した後，アミノペプチダーゼ阻害剤等を含
むインヒビター５０μｌを加え，小麦グルテンの酵素分
解物の高速液体クロマトグラフィーにより分画された各
画分を添加し，マウス輸精管の電気収縮の変化をレコー
ダーで記録した。オピオイド活性は画分添加後電気収縮
の抑制と１０−４Ｍナロキソン２０μｌ添加による抑制
の解除によって判定した。そしてマウス輸精管の電気収
縮を５０％抑制する濃度（ＩＣ５０）を測定した。
【００７４】その結果，上記実施例で得られた配列番号
１〜配列番号６で表される本発明のペプチドのＩＣ５０
は表１に示すとおりであった。参考のため，既知のペプ
チドのオピオイド活性を上記と同様にして測定したとき
のＩＣ５０を表１に併記する。
１〜配列番号６で表される本発明のペプチドのＩＣ５０
は表１に示すとおりであった。参考のため，既知のペプ
チドのオピオイド活性を上記と同様にして測定したとき
のＩＣ５０を表１に併記する。
【００７５】
【表１】
【００７６】表１の結果から，本発明のオピオイド活性
剤は低濃度でＩＣ５０を達成できることがわかる。
剤は低濃度でＩＣ５０を達成できることがわかる。
【００７７】
【発明の効果】本発明の方法によるときは，小麦グルテ
ン等の小麦蛋白を使用して，目的とするオピオイドペプ
チド，特に，配列番号１，２，４，５および６で表され
るペプチドを確実に得ることができる。また，合成によ
って配列番号３で表されるペプチドを得ることができ
る。
ン等の小麦蛋白を使用して，目的とするオピオイドペプ
チド，特に，配列番号１，２，４，５および６で表され
るペプチドを確実に得ることができる。また，合成によ
って配列番号３で表されるペプチドを得ることができ
る。
【００７８】本発明のペプチドおよびその塩はオピオイ
ド活性を有しているので，該ペプチドおよびその塩を有
効成分とする剤は極めて少量の投与で，鎮痛，麻酔，情
動，呼吸，脈動，体温，消化管機能，摂食，免疫，イン
シュリンやソマトスタチン等のホルモンの分泌調節，電
解質の吸収促進，心筋の収縮調節機能を示す可能性があ
るため，鎮痛麻酔剤，催眠剤，消化管ホルモン分泌促進
剤，電解質の吸収促進剤，胃腸輸送筋収縮による下痢改
善剤としての利用が期待できる。その場合に，本発明の
ペプチドおよびその塩は，水溶性の白色粉末であるた
め，そのままでまたは水等に溶解させて経口および非経
口のいずれの方法によっても極めて簡単に投与すること
ができる。
ド活性を有しているので，該ペプチドおよびその塩を有
効成分とする剤は極めて少量の投与で，鎮痛，麻酔，情
動，呼吸，脈動，体温，消化管機能，摂食，免疫，イン
シュリンやソマトスタチン等のホルモンの分泌調節，電
解質の吸収促進，心筋の収縮調節機能を示す可能性があ
るため，鎮痛麻酔剤，催眠剤，消化管ホルモン分泌促進
剤，電解質の吸収促進剤，胃腸輸送筋収縮による下痢改
善剤としての利用が期待できる。その場合に，本発明の
ペプチドおよびその塩は，水溶性の白色粉末であるた
め，そのままでまたは水等に溶解させて経口および非経
口のいずれの方法によっても極めて簡単に投与すること
ができる。
【００７９】更に，本発明のペプチドおよびその塩は４
〜６個のアミノ酸が配列しただけの極めて簡単な構造を
有する低分子量化合物であるため化学合成によっても簡
単に製造することができる。また，本発明のペプチド
は，小麦グルテンの酵素による加水分解物として得られ
るために安全性が高い。
〜６個のアミノ酸が配列しただけの極めて簡単な構造を
有する低分子量化合物であるため化学合成によっても簡
単に製造することができる。また，本発明のペプチド
は，小麦グルテンの酵素による加水分解物として得られ
るために安全性が高い。
【００８０】
【配列表】
【００８１】配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００８２】配列番号：２ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００８３】配列番号：３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００８４】配列番号：４ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００８５】配列番号：５ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００８６】配列番号：６ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００８７】配列番号：７ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００８８】配列番号：８ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００８９】配列番号：９ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００９０】配列番号：１０ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【図面の簡単な説明】
【図１】小麦グルテンをペプシンで加水分解した後，サ
ーモライシンで加水分解して得られたペプチド混合物を
高速液体クロマトグラフィーに通し，その吸着成分を直
線濃度勾配を有する特定の溶離液により溶離した時の該
成分の吸光度を測定したフローチャートである。
ーモライシンで加水分解して得られたペプチド混合物を
高速液体クロマトグラフィーに通し，その吸着成分を直
線濃度勾配を有する特定の溶離液により溶離した時の該
成分の吸光度を測定したフローチャートである。
【図２】小麦グルテンをペプシンで加水分解した後，ト
リプシンとキモトリプシンで加水分解して得られたペプ
チド混合物を高速液体クロマトグラフィーに通し，その
吸着成分を直線濃度勾配を有する特定の溶離液により溶
離した時の該成分の吸光度を測定したフローチャートで
ある。
リプシンとキモトリプシンで加水分解して得られたペプ
チド混合物を高速液体クロマトグラフィーに通し，その
吸着成分を直線濃度勾配を有する特定の溶離液により溶
離した時の該成分の吸光度を測定したフローチャートで
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/12 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/06 8214−4Ｂ // Ｃ０７Ｋ 99:70
Claims (8)
- 【請求項１】 小麦蛋白を酸性プロテアーゼを使用して
加水分解した後，中性プロテアーゼまたはアルカリ性プ
ロテアーゼを使用して更に加水分解し，得られる加水分
解物からオピオイド活性を有するペプチドを回収するこ
とを特徴とするオピオイドペプチドの製造方法。 - 【請求項２】 中性プロテアーゼがバチルス起源の中性
プロテアーゼまたはアスペルギルス起源の中性プロテア
ーゼであり，またアルカリ性プロテアーゼがバチルス起
源のアルカリ性プロテアーゼであり，オピオイドペプチ
ドが配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４
および配列番号５で表されるペプチドである請求項１の
製造方法。 - 【請求項３】 中性プロテアーゼがトリプシンおよびキ
モトリプシンであり，オピオイドペプチドが配列番号６
で表されるペプチドである請求項１の製造方法。 - 【請求項４】 請求項１の方法により製造されたオピオ
イドペプチドおよびその塩。 - 【請求項５】 請求項１〜請求項３のいずれか１項の方
法により製造された配列番号１，配列番号２，配列番号
３，配列番号４，配列番号５および配列番号６で表され
るペプチドおよびその塩。 - 【請求項６】 化学合成によって，配列番号１，配列番
号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５および配列
番号６で表されるペプチド並びにその塩を製造する方
法。 - 【請求項７】 配列番号１，配列番号２，配列番号３，
配列番号４，配列番号５および配列番号６で表されるペ
プチド並びにその塩。 - 【請求項８】 配列番号１，配列番号２，配列番号３，
配列番号４，配列番号５，配列番号６で表されるペプチ
ドおよびその塩の１種または２種以上を有効成分として
含むオピオイド活性を有する剤。
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|---|---|---|---|
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| US07/801,388 US5268360A (en) | 1990-12-27 | 1991-12-02 | Opioid peptides derived from wheat proteins |
| GB9126329A GB2251435B (en) | 1990-12-27 | 1991-12-11 | Opioid peptides from wheat proteins by hydrolysis with protease enzymes |
| DE4142157A DE4142157B4 (de) | 1990-12-27 | 1991-12-20 | Opioid-Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung |
| FR9116021A FR2671086B1 (fr) | 1990-12-27 | 1991-12-23 | Peptides opiouides, leur procede de preparation, et composition pharmaceutique contenant ces peptides. |
| US08/061,065 US5338668A (en) | 1990-12-27 | 1993-05-14 | Opioid peptides derived from wheat proteins |
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|---|---|---|---|
| JP2-418333 | 1990-12-27 | ||
| JP41833390 | 1990-12-27 | ||
| JP3-53745 | 1991-02-27 | ||
| JP5374591 | 1991-02-27 | ||
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|---|---|---|---|---|
| KR19980061477A (ko) * | 1996-12-31 | 1998-10-07 | 백운화 | 펩타이드 혼합물의 제조방법 |
| JP2007106683A (ja) * | 2005-10-11 | 2007-04-26 | Nisshin Pharma Inc | 脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤 |
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| JP2013518589A (ja) * | 2010-02-02 | 2013-05-23 | アマノ エンザイム ユーエスエー，リミテッド | グルテン不耐性に対するプロテアーゼの使用 |
| WO2021107080A1 (ja) * | 2019-11-28 | 2021-06-03 | 国立大学法人京都大学 | ペプチド |
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- 1991-12-11 GB GB9126329A patent/GB2251435B/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-20 DE DE4142157A patent/DE4142157B4/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-23 FR FR9116021A patent/FR2671086B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-05-14 US US08/061,065 patent/US5338668A/en not_active Expired - Lifetime
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