DE4142157A1

DE4142157A1 - Von weizenproteinen abgeleitete opioid-peptide, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen

Info

Publication number: DE4142157A1
Application number: DE4142157A
Authority: DE
Inventors: Masaaki Yoshikawa; Shin-Ichi Fukudome
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1990-12-27
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1992-07-02
Anticipated expiration: 2011-12-21
Also published as: GB2251435A; FR2671086B1; GB2251435B; US5338668A; JPH0586094A; FR2671086A1; GB9126329D0; US5268360A; DE4142157B4; JP3130080B2

Description

Die Erfindung betrifft neue Peptide mit einer Opioid-Akti vität, die von Weizenproteinen, insbesondere Weizenglu ten, abgeleitet sind, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese Peptide als aktiven Bestandteil (Wirkstoff) enthalten.

Es ist bekannt, daß die von Lebensmittelproteinen (Casein, Gluten) abgeleiteten Peptide Opioid-Aktivitäten aufweisen, wie z. B. morphin-artige narkotische, analgetische Ak tivitäten, und daß sie physiologisch wichtig sein können.

C. Zioudrou et al. haben darüber berichtet, daß Peptide mit einer Opioid-Aktivität in Pepsin-Hydrolysaten von Wei zengluten und α-Casein gefunden wurden und es wurde auch deren Aktivität nachgewiesen durch Anwendung von Bioassays einschließlich der Naloxon-reversiblen Inhibierung von Adenylat-Cyclase in Homogenaten von Neuroplastom-X-Gliom- Hybridzellen und von elektrisch stimulierten Kontraktionen des Maus-Vas deferens (Samenleiters der Maus) ("J. Biol. Chem.", Band 254, Nr. 7, Seiten 2446-2449 (1979)).

F. R. Huebner et al. haben die Opioid-Aktivitäten in den von der Gliadin-Fraktion abgeleiteten Fragmenten mittels des Radiorezeptor-Assays erkannt ("Peptides", Band 5, Seiten 1139-1147 (1984)).

John E. Morley et al. haben darüber berichtet, daß hydroly siertes Gluten die Intestinal-Durchgangszeit verlängert und daß dieser Effekt umgekehrt wird durch die gleichzei tige Verabreichung von Naloxon und daß auch hydrolysiertes Gluten eine Naloxon-reversible Erhöhung der somatostatin- artigen Aktivität im Plasma mit sich bringt, die für die verzögerte Durchgangszeit verantwortlich sein kann ("Gastroenterology", Band 84, Nr. 6, S. 1517-1523).

In diesen Berichten wurde zwar erkannt, daß Opioid-Peptide in Gluten-Hydrolysaten nachgewiesen wurden, es hat sich bis jetzt aber als nicht möglich erwiesen, die Struktur und den Charakter dieser Peptide aufzuklären.

Es wurde nun gefunden, daß die aktiven Peptide aus den Pepsinhydrolysaten von Weizengluten nicht isoliert werden konnten wegen ihrer sehr geringen Aktivität. Die vorlie gende Erfindung ist das Ergebnis fortgesetzter Bemühungen, neue Opioid-Peptide mit den angegebenen Strukturen aus den Gluten-Hydrolysaten zu isolieren.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue Opioid- Peptide mit der angegebenen Aminosäuresequenz, die aus den Hydrolysaten von Weizenproteinen isoliert wurden, zur Ver fügung zu stellen. Ziel der Erfindung ist es ferner, Ver fahren zur Herstellung von Opioid-Peptiden durch enzymati sche Hydrolyse oder chemische Synthese anzugeben. Ziel der Erfindung ist es schließlich, pharmazeutische Zusammenset zungen zu schaffen, welche die Opioid-Peptide als aktive Komponente (Wirkstoff) enthalten.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 die Trennung von aktiven Opioid-Fraktionen I, II, III und IV in einer Octadecylsilan-(ODS-)Ko lonne und

Fig. 2 die Gewinnung der aktiven Opioid-Fraktion V aus der ODS-Kolonne.

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide mit einer Opioid-Aktivität (Opioid-Peptide), die hergestellt werden durch Hydrolyse von Weizenproteinen mittels Proteasen. Die erfindungsgemäßen Opioid-Peptide umfassen solche mit einer festgelegten Struktur und solche mit einer nicht festgelegten Struktur, die beide in den Rahmen der vorlie genden Erfindung fallen. Unter den erfindungsgemäßen Pep tiden können diejenigen mit einer festgelegten Struktur Opioid-Peptide umfassen, die jeweils die folgende Amino säuresequenz aufweisen.

Gly-Tyr-Tyr-Pro (SEQ ID NO: 1) (1)

Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr (SEQ ID NO: 2) (2)

Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr-Ser (SEQ ID NO: 3) (3)

Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu (SEQ ID NO: 4) (4)

Die vier Opioid-Peptide mit den Sequenzen (1), (2), (3) und (4), nämlich (SEQ ID NO: 1), (SEQ ID NO: 2), (SEQ ID NO: 3) und (SEQ ID NO: 4) sind neu und werden hier der Ein fachheit halber als "Peptid A", "Peptid B", "Peptid C" bzw. "Peptid D" bezeichnet. Soweit bekannt, gibt es bisher keinen Bericht über die Herstellung und Isolierung der vier Peptide aus Weizenproteinen durch enzymatische Hydro lyse oder chemische Synthese.

Unter den erfindungsgemäßen Peptiden sind die Opioid-Pep tide, welche jeweils die nachfolgende Aminosäuresequenz aufweisen

Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu (SEQ ID NO: 5) (5)

Tyr-Gly-Gly-Trp (SEQ ID NO: 6) (6)

bekannt aus "J. Med. Chem." 1978, Band 21, Nr. 11, S. 1110-1115, es gibt jedoch keinen Bericht über die Herstel lung und Isolierung dieser beiden Peptide aus Weizenpro teinen durch enzymatische Hydrolyse. Die beiden Opioid- Peptide mit den Sequenzen (5) und (6) (SEQ ID NO: 5) und (SEQ ID NO: 6) werden hier der Einfachheit halber als "Peptid E" bzw. "Peptid F" bezeichnet. Die die erfin dungsgemäßen Opioid-Peptide aufbauenden Aminosäuren können in jeder beliebigen der D-, L- und DL-Konfigurationen vor liegen.

Die erfindungsgemäßen Peptide können hergestellt werden durch ein neues enzymatisches Verfahren, das umfaßt die Hydrolyse von Weizenproteinen mittels einer sauren Pro tease, die weitere Hydrolyse der Hydrolysate mittels einer neutralen Protease oder einer alkalischen Protease und gegebenenfalls die Fraktionierung, Isolierung und Reini gung des resultierenden Peptidgemisches auf konventionelle Weise. Die Aminosäuresequenz der so isolierten Peptide kann beispielsweise durch Verwendung eines Protein-Sequen zers festgelegt werden.

Auf der Basis der festgelegten Aminosäuresequenz können die erfindungsgemäßen Peptide auch unter Anwendung eines konventionellen Verfahrens synthetisiert werden, bei spielsweise durch eine Festphasen-Synthese nach der t-Boc- Strategie.

Die Weizenproteine, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können Gluten allein oder ein Gemisch aus Gluten mit ande ren Proteinen im Weizen, wie Albumin, Gliadin und Globu lin umfassen.

Die sauren Proteasen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können umfassen Pepsin und Asparagin-Proteinasen, die aus Pycnoporus coccineus, Aspergillus und Penicillium stammen. Sie können entweder allein oder in Kombination unter einander verwendet werden, solange sie keinen nachteili gen Einfluß aufeinander haben. Wenn eine Vielzahl von sau ren Proteasen verwendet wird, kann die Hydrolyse unter gleichzeitiger Verwendung unterschiedlicher Proteasen oder aufeinanderfolgender Verwendung jeder Protease durchgeführt werden.

Die neutralen Proteasen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können umfassen Metallproteasen, die aus Mikroorga nismen stammen einschließlich der wärmebeständigen Protea sen aus Bacillus, wie z. B. Thermolysin, derjenigen, die aus Aspergillus streptomyces und Rhizopus stammen; derje nigen, die aus Pflanzen, wie Papain, Bromelain stammen; und derjenigen, die in vivo in Tieren vorkommen, wie Tryp sin, Chymotrypsin, Plasmin und Thrombin.

Die alkalischen Proteasen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können umfassen Cerin-Proteasen, die aus Bacillus oder dgl. stammen.

Die neutralen oder alkalischen Proteasen können allein oder in Kombination untereinander verwendet werden, so lange sie keinen nachteiligen Einfluß aufeinander haben. Wenn eine Vielzahl von neutralen Proteasen verwendet wird, kann die Hydrolyse unter gleichzeitiger Verwendung unter schiedlicher Proteasen oder aufeinanderfolgender Verwendung jeder Protease durchgeführt werden.

Die Fraktionierung, Isolierung und Reinigung kann auf be kannte Weise durchgeführt werden, beispielsweise durch Membrantrennung und unter Anwendung eines chromatographi schen Verfahrens. In dem erfindungsgemäßen Verfahren be vorzugt ist eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) einschließlich der Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Octadecylsilan-(ODS-)Kolonne, einer Phenyl- Kolonne, einer Cyanopropyl-Kolonne und einer Phenethyl-Ko lonne.

Die erfindungsgemäßen Peptide weisen Opioid-Aktivitäten auf, die beteiligt sind an der Analgesie, der Narkose, der Affektion, der Atmung, dem Pulsschlag, der Körpertempera tur, der Gastrointestinalfunktion, der Athrocytose, der Immunität, der Regulierung der Hormonsekretion, wie Insu lin und Somatostatin, der verbesserten Elektrolytabsorp tion und der regulierten Kontraktion des Myocards, so daß sie verwendbar sein können als Analgetikum und Narkotikum, als Hypnotikum, als Gastrointestinalhormon-Sekretionsver besserungsmittel, als Elektrolyt-Absorptionsverbesserungs mittel oder dgl.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch pharmazeutische Zu sammensetzungen, die als aktiven Bestandteil (Wirkstoff) Opioid-Peptide enthalten, die jeweils die Aminosäurese quenz der obengenannten Formeln (1) bis (6) aufweisen, oder physiologisch akzeptable Salze davon.

Die erfindungsgemäßen Opioid-Peptide oder ihre Salze kön nen, da sie ein wasserlösliches weißes Pulver darstellen, in der Form, in der sie vorliegen, oder in einer in Wasser gelösten Form oral oder parenteral verabreicht werden. Je nach Art der Verabreichung kann das Opioid-Peptid mit ei ner großen Vielzahl von physiologisch akzeptablen Trägern formuliert sein. Die Dosierungsformen können umfassen Ta bletten, Kapseln, Suppositorien, Pastillen, Sirupe, Granu late, Pulver, injizierbare Lösungen oder Suspensionen.

Die geeignete Dosis kann ausgewählt werden in Abhängigkeit von der Dosierungsform, dem Alter und dem Geschlecht der Patienten, dem Grad der Symptome und dgl.

Die erfindungsgemäßen Opioid-Peptide können Lebensmitteln und Futtermitteln zugesetzt werden.

Die Erfindung wird nachstehend anhand bevorzugter Ausfüh rungsformen näher erläutert.

Hydrolyse von Weizengluten

Weizengluten wird mit Proteasen hydrolysiert zur Herstel lung einer wasserlöslichen Peptidmischung. Anfänglich wird Weizengluten mit einer Säureprotease hydrolysiert in der Weise, daß es in einer Säurelösung, beispielsweise in ver dünnter Chlorwasserstoffsäure, dispergiert und gelöst wird. Danach wird das Hydrolysat neutralisiert oder alka lisch gemacht und weiter hydrolysiert mit einer neutralen oder alkalischen Protease zur Herstellung einer Peptidmi schung. In diesem Falle kann die Peptidmischung, welche die Petide A (SEQ ID NO: 1), B (SEQ ID NO: 2), E (SEQ ID NO: 5) und F (SEQ ID NO: 6) enthält, erhalten werden durch Verwendung von neutraler oder alkalischer Protease. Die Peptidmischung, die das Peptid D (SEQ ID NO: 4) enthält, kann erhalten werden durch Verwendung von solchen Protea sen als neutraler Protease, die in vivo in Tieren vorkom men, wie z. B. Trypsin, Chymotrypsin oder dgl. In diesem Falle können Trypsin und Chymotrypsin gleichzeitig oder nacheinander angewendet werden.

Bei der Herstellung der Peptide wird Pepsin vorzugsweise als saure Protease verwendet, da das gewünschte Produkt in hoher Ausbeute erhalten werden kann.

Bei der Herstellung der Peptide A (SEQ ID NO: 1), B (SEQ ID NO:2), E (SEQ ID NO: 5) und F (SEQ ID NO: 6) werden vorzugs weise Thermolysin, das aus Bacillus stammt, oder solche, die aus Aspergillus (insbesondere Aspergillus oryzae) stammen, bevorzugt als neutrale Proteasen verwendet, da das gewünschte Produkt in hoher Ausbeute erhalten werden kann.

Die sauren, neutralen und alkalischen Proteasen können in freier Form oder im immobilisierten Zustand verwendet wer den. Die verwendete Menge der Protease kann in dem Bereich von etwa 5000 bis etwa 100 000 Einheiten pro 100 g troc kenem Gluten liegen. Die Aktivität (Einheit) der verwende ten Protease wird bestimmt nach dem Casein-Folin-Färbever fahren A, wie es von S. Akabori in "Method of Studying En zymes", Band 2, S. 238 (1961), beschrieben ist, unter Ver wendung einer 1% Hamerstein-Caseinlösung als Substrat, die von der Firma American Merk Co. erhältlich ist. Die Reaktion wird 30 min lang bei 30°C durchgeführt. Die für die Freisetzung von 1 µg Tyrosin für 1 min erforderliche Enzymmenge wird als eine Einheit bezeichnet.

Eine Proteasebehandlung wird zweckmäßig durchgeführt unter optimalen Bedingungen des pH-Wertes, der Temperatur, der Menge der Protease, der Rate und Dauer der Behandlung, die entsprechend den Situationen, beispielsweise der Arten und der Verwendungsformen der Protease und dgl., ausgewählt werden. Bei der Durchführung der Hydrolyse von Gluten mit Pepsin und danach mit Thermolysin oder mit Pepsin und da nach mit Trypsin-Chymotrypsin wird beispielsweise eine wäßrige Lösung oder wäßrige Dispersion von Gluten auf einen pH-Wert zwischen etwa 1,5 und 5,0 eingestellt und bei einer Temperatur von etwa 30 bis 50°C mit Pepsin hy drolysiert. Anschließend wird die Lösung auf einen pH-Wert zwischen etwa 6,0 und 8,0 eingestellt und weiter hydroly siert mit Thermolysin oder Trypsin-Chymotrypsin bei einer Temperatur von etwa 30 bis 50°C, bis die Löslichkeit in 0,75 M Trichloressigsäure in dem Bereich von etwa 40 bis 80% liegt.

Zu dem Zeitpunkt, wenn eine Hydrolyse bis zu dem gewünsch ten Grad erreicht ist, werden die Proteasen durch Erhitzen und/oder Einstellung des pH-Wertes desaktiviert. Das des aktivierte Enzym und eventuelle unlösliche feste Mate rialien, wie z. B. nicht-hydrolysiertes Gluten, werden ab getrennt und entfernt auf geeignete Weise, beispielsweise durch Zentrifugieren, wobei man eine Peptidmischung aus der zurückbleibenden Lösung durch Trocknen oder dgl. er hält.

Dann wird die in Wasser gelöste Peptidmischung einer HPLC, beispielsweise einer HPLC an einer Umkehr-Kolonne, unter worfen, um das gewünschte Peptid in reiner Form zu isolie ren.

Die Isolierung der Opioid-Peptide aus der Petidmischung kann auf die folgende Weise erfolgen.

Isolierung der Peptide A, B, E und F

a₁) Die durch Hydrolyse von Weizengluten mit Pepsin und danach mit Thermolysin hergestellte Peptidmischung wird einer HPLC an einer Octadecylsilan-(ODS-)Kolonne (wie z. B. Cosmosil 5 C¹⁸-AR, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und mit einer wäßrigen 0,05%igen Trifluoressigsäure-(TFA-)Lö sung (Lösung A) und einer Acetonitril-(ACN-)Lösung, die 0,05% TFA enthält (Lösung B), mit einem linearen Gradien ten zwischen 0 und 40% der Lösung B eluiert. Eine Peak- Fraktion (Fraktion I), die in einer ACN-Konzentration zwi schen etwa 22,5 und 23,5% eluiert wird, eine Peak-Frak tion (Fraktion II), die zwischen etwa 24 und 25% eluiert wird, eine Peak-Fraktion (Fraktion III), die zwischen etwa 28 und 29% eluiert wird, und eine Peak-Fraktion (Fraktion IV), die zwischen etwa 34 und 35% eluiert wird, werden jeweils fraktioniert und bei diesen Fraktionen wird die Opioid-Aktivität bestimmt.

b₁) Die in der Stufe (a₁) hergestellten aktiven Opioid- Fraktionen werden einer Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Kolonne mit anderen Charakteristiken als der in (a₁) verwendeten unterworfen (wie z. B. Cosmosil 5 Ph, Nacalai Tesque Inc.) und auf ähnliche Weise wie in der Stufe (a₁) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion I-1), die in der ACN-Konzentration zwischen etwa 24 und 25% eluiert wird, wird von der Fraktion I abgetrennt, eine Peak-Frak tion (Fraktion II-1), die zwischen etwa 33 und 34% elu iert wird, wird von der Fraktion II abgetrennt, eine Peak- Fraktion (Fraktion III-1), die zwischen etwa 30 und 31% eluiert wird, wird von der Fraktion III abgetrennt und eine Peak-Fraktion (Fraktion IV-1), die zwischen etwa 36 und 37% eluiert wird, wird von der Fraktion IV abge trennt. Bei diesen Fraktionen wird die Opioid-Aktivität bestimmt.

c₁) Die in der Stufe (b₁) hergestellten aktiven Opioid- Fraktionen werden der Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Kolonne mit anderen Charakteristiken als der in (b₁) verwendeten unterworfen (wie z. B. Cosmosil 5 CN-R, Nacalai Tesque Inc.) und auf ähnliche Weise wie in den Stufen (a₁) und (b₁) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion I-2), die in der ACN-Konzentration zwischen etwa 18 und 19% eluiert wird, wird von der Fraktion I-1 abgetrennt, eine Peak-Fraktion (Fraktion II-2), die in der ACN-Konzentra tion von etwa 27% eluiert wird, wird von der Fraktion II- 1 abgetrennt, eine Peak-Fraktion (Fraktion III-2), die zwischen etwa 26 und 27% eluiert wird, wird von der Frak tion III-1 abgetrennt und eine Peak-Fraktion (Fraktion IV- 2), die zwischen etwa 32 und 33% eluiert wird, wird von der Fraktion IV-1 abgetrennt. Bei diesen Fraktionen wird die Opioid-Aktivität bestimmt.

d₁) Von den in der Stufe (c₁) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen werden die Fraktionen I-2, III-2 und IV- 2 der in (a₁) angewendeten Kolonnenchromatographie unter worfen und dann mit einem 10 mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄-Puffer (pH 7) (Lösung C) und einer 50%igen ACN-Lösung, die 10 mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄-Puffer (pH 7) enthält (Lösung D), mit einem linearen Gradienten zwischen 0 und 100% der Lösung D elu iert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion I-3), die in der ACN- Konzentration von etwa 18% eluiert wird, wird von der Fraktion I-2 abgetrennt, eine Peak-Fraktion (Fraktion III- 3), die bei etwa 21% eluiert wird, wird von der Fraktion III-2 abgetrennt, und eine Peak-Fraktion (Fraktion IV-3), die bei etwa 28% eluiert wird, wird von der Fraktion IV-2 abgetrennt. Bei diesen Fraktionen wird die Opioid-Aktivi tät bestimmt.

e₁) Von den in der Stufe (d₁) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen wird die Fraktion IV-3 der in (a₁) an gewendeten Kolonnenchromatographie unterworfen und dann unter Anwendung eines ähnlichen Verfahrens wie in den Stu fen (a₁), (b₁) und (c₁) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion IV-4), die in der ACN-Konzentration von etwa 31 % eluiert wird, wird von der Fraktion IV-3 abgetrennt, bei der dann die Opioid-Aktivität bestimmt wird.

f₁) Von den in der Stufe (e₁) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen wird die Fraktion IV-4 einer Umkehrpha sen-Chromatographie an einer Kolonne mit anderen Charakte ristiken als der in den Stufen (a₁), (b₁) und (c₁) verwen deten unterworfen (z. B. Develosil PhA-5, Nomura Chemical Inc.) und dann auf ähnliche Weise wie in der Stufe (d₁) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion IV-5), die in der ACN-Konzentration von etwa 29% eluiert wird, wird von der Fraktion IV-4 abgetrennt, bei der dann die Opioid-Aktivi tät bestimmt wird.

g₁) Aus der in der Stufe (c₁) erhaltenen aktiven Opioid- Fraktion (Fraktion II-2), aus den in der Stufe (d₁) erhal tenen aktiven Opioid-Fraktionen (Fraktion I-3, Fraktion III-3) und aus der in der Stufe (f) erhaltenen aktiven Opioid-Fraktion (IV-5) werden zur Gewinnung durch Trock nung die Lösungsmittel entfernt.

h₁) Die Aminosäuresequenz der in der Stufe (g₁) erhaltenen getrockneten Materialien wird mittels eines Protein-Se quenzers (wie z. B. 477 A Protein-Sequenzer, Applied Biosy stems Inc.) analysiert. Die Fraktion I-3 wurde identifi ziert als Peptid B (SEQ ID NO: 2), Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr, die Fraktion II-2 wurde identifiziert als Peptid A (SEQ ID NO: 1), Gly-Tyr-Tyr-Pro, die Fraktion III-3 wurde identifi ziert als Peptid F (SEQ ID NO: 6), Tyr-Gly-Gly-Trp und die Fraktion IV-5 wurde identifiziert als Peptid E (SEQ ID NO: 5), Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu.

Isolierung des Peptids D

(a₂) Die durch Hydrolyse von Weizengluten mit Pepsin und danach mit Trypsin-Chymotrypsin erhaltene Peptidmischung wird einer HPLC an einer Octadecylsilan-(ODS-)Kolonne (beispielsweise Cosmosyl 5 C₁₈-AR, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und mit einer wäßrigen 0,05%igen Trifluores sigsäure (TFA)-Lösung (Lösung A) und einer Acetonitril (ACN)-Lösung, die 0,05% TFA enthält (Lösung B), mit einem linearen Gradienten zwischen 0 und 40% der Lösung B elu iert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion V), die in der ACN-Kon zentration zwischen etwa 31 und 32% eluiert wird, wird abgetrennt, um die Opioid-Aktivität zu identifizieren.

b₂) Die in der Stufe (a₂) hergestellte aktive Opioid-Frak tion (Fraktion V) wird einer Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Kolonne mit anderen Charakteristiken als der in (a₂) verwendeten (wie z. B. Cosmosil 5 Ph, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und auf ähnliche Weise wie in der Stufe (a₂) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion V-1), die in der ACN-Konzentration von etwa 33% eluiert wird, wird abgetrennt, um die Opioid-Aktivität zu ermitteln.

c₂) Die in der Stufe (b₂) hergestellte aktive Opioid-Frak tion (Fraktion V-1) wird einer Umkehrphasen-Chromato graphie (RPC) an einer Kolonne mit anderen Charakteristi ken als die in den Stufen (a₂) und (b₂) verwendeten un terworfen (beispielsweise Cosmosil 5 CN-R, Nacalei Tesque Inc.) und auf ähnliche Weise wie in den Stufen (a₂) und (b₂) eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion V-2), die in der ACN-Konzentration zwischen etwa 27 und 28% eluiert wird, wird abgetrennt zur Bestimmung der Opioid-Aktivität.

d₂) Die in der Stufe (c₂) hergestellte aktive Opioid-Frak tion (Fraktion V-2) wird der in der Stufe (a₂) angewende ten Kolonnenchromatographie unterworfen und dann mit einem 10 mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄-Puffer (pH 7) (Lösung C) und einer 50igen ACN-Lösung, die 10 mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄-Puffer (pH 7) enthält (Lösung D) mit einem linearen Gradienten zwischen 0 und 100% Lösung D eluiert. Eine Peak-Fraktion (Fraktion V-3), die in der ACN-Konzentration von etwa 24% eluiert wird, wird abgetrennt zur Bestimmung der Opioid-Aktivität.

e₂) Die aktive Opioid-Fraktion (Fraktion V-3) wird ge trocknet zur Entfernung des Lösungsmittels und abgetrennt.

f₂) Die Aminosäuresequenz der in der Stufe (e₂) erhaltenen getrockneten Materialien wird mittels eines Protein-Se quenzers (beispielsweise 477 A Protein-Sequenzer, Applied Biosystems Inc.) analysiert. Die Fraktion V-3 wurde iden tifiziert als Peptid D (BEQ ID NO: 4).

Alternativ können die Peptide A bis F (SEQ ID NOS: 1-6) der Erfindung durch chemische Synthese, beispielsweise nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden.

Chemische Synthese von Peptiden

Das Peptid wird synthetisiert mittels eines Sam 2-Peptid- Synthesizers (Biosearch Inc.) entsprechend einem Standard Protokoll des Synthesizers. Ein Boc(butoxycarbonyl)-Pro harz wird mit einer Deblockierungslösung, die 45% Trifluoressigsäure enthält, behandelt und dann mit Boc- Tyr(Cl₂-Bzl) in Gegenwart von Diisopropylcarbodiimid ge kuppelt. Nach dem Deblockieren auf ähnliche Weise wie oben angegeben wird das Harz nacheinander mit Boc-Tyr (Cl₂Bzl) und Boc-Gly gekuppelt zur Herstellung eines Boc-Gly-Tyr- (Cl₂-Bzl)-Tyr(Cl₂-Bzl)-Pro-Harzes. Dieses Peptidharz wird in Fluorwasserstoff, der 10% Anisol enthält, eingeführt und 1 h lang bei 0°C gerührt. Nachdem der Fluorwasserstoff abdestilliert worden ist, wird der Rückstand mit Äther ge waschen und ein Peptid wird mit 30%iger Essigsäure extra hiert. Die Reinigung des rohen Peptids durch HPLC an der ODS-Kolonne ergibt das Peptid A (SEQ ID NO: 1).

Die Peptide B-F (SEQ ID NOS: 2-6) können auch nach einem ähnlichen Verfahren wie oben synthetisiert werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher er läutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1 Herstellung der Peptide A, B, E und F aus Weizengluten-Hy drolysaten

1) 5 g Weizengluten, dispergiert und gelöst in 100 ml 0,02 N HCl, wurden 20 min lang bei 3500 G zentrifugiert, um ein unlösliches Material zu entfernen, und der pH-Wert der Lö sung wurde mit 1 N HCl auf 2,0 eingestellt. Zu dieser Glu tenlösung wurden 5000 Einheiten Pepsin (erhältlich von der Firma Sigma Chemical Co., USA) zugegeben und die Lösung wurde 15 h lang bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde der pH-Wert der Lösung mit 1 N NaOH auf 7,0 eingestellt, es wurden 5000 Einheiten Thermolysin (erhältlich von der Firma Peptide Research Institute Inc.) zugegeben und die Mischung wurde 4 h lang bei 37°C inku biert. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung 20 min lang auf 90°C erhitzt, um das Pepsin und das Thermoly sin zu desaktivieren. Das Hydrolysat wurde 20 min lang bei 3500 G zentrifugiert, um ein unlösliches Material zu ent fernen, und die resultierende überstehende Flüssigkeit wurde lyophilisiert, wobei man etwa 3,5 g Weizengluten-Hy drolysat erhielt.

2) 80 mg des Weizengluten-Hydrolysats wurden einer Umkehr phasen-Chromatographie (RPC) an einer Octadecylsilan-Ko lonne (Cosmosil 5 C₁₈-AR, Innendurchmesser 20 mm, Länge 250 mm, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und dann mit ei ner wäßrigen 0,05%igen Trifluoressigsäure-(TFA-)Lösung (Lösung A) und einer Acetonitril-(ACN-)Lösung, die 0,05% TFA enthielt (Lösung B) in einer Strömungsrate von 10 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 40% der Lösung B über einen Zeitraum von 40 min eluiert. Das Chro matogramm bei einer Wellenlänge von 230 nm ist in der Fig. 1 dargestellt.

Bei den in Fig. 1 dargestellten Fraktionen wurde die Opioid-Aktivität bestimmt. Eine Opioid-Aktivität wurde ge funden in der Fraktion I, die zwischen etwa 22,5 und 23,5% in der ACN-Konzentration eluiert wurde, bei der Fraktion II, die zwischen etwa 24 und 25% eluiert wurde, bei der Fraktion III, die zwischen etwa 28 und 29% eluiert wurde, und bei der Fraktion IV, die zwischen etwa 34 und 35% eluiert wurde.

3) Das gleiche Verfahren wie in (2) wurde hergestellt un ter Verwendung von 2000 mg des Weizengluten-Hydrolysats, wie es im Abschnitt (1) hergestellt worden war, wobei man die aktiven Opioid-Fraktionen I, II, III und IV erhielt. Diese aktiven Fraktionen wurden einer RPC unterworfen un ter Verwendung einer Phenyl-Kolonne (Cosmosil 5 Ph, Innen durchmesser 4,6 mm, Länge 250 mm, Nacalai Tesque Inc.) und mit den Lösungen A und B bei einer Strömungsrate von 1 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 40% Lösung B über einen Zeitraum von 40 min eluiert.

Bei jeder der erhaltenen Fraktionen wurde die Opioid-Akti vität bestimmt. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden bei der Fraktion 1 in der Fraktion I-1, die in der ACN- Konzentration von etwa 24 bis 25% eluiert wurde, bei der Fraktion II in der Fraktion II-1, die in der ACN-Konzen tration von etwa 33 bis 34% eluiert wurde, bei der Frak tion III in der Fraktion III-1, die in der ACN-Konzentra tion von etwa 30 bis 31% eluiert wurde, und bei der Frak tion IV in der Fraktion IV, die bei etwa 36 bis 37% elu iert wurde.

4) Die im Abschnitt (3) hergestellten aktiven Opioid-Frak tionen in den Fraktionen I-1, II-1, III-1 und IV-1 wurden einer RPC unterworfen unter Verwendung einer Cyanopropyl- Kolonne (Cosmosil 5 CN-R, Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 250 mm, Nacalai Tesque Inc.) und unter den gleichen Bedin gungen wie im Abschnitt (3) eluiert.

Jede der Eluatfraktionen wurde gesammelt und es wurde ihre Opioid-Aktivität bestimmt. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden für die Fraktion I-1 in einer Peak-Fraktion (Fraktion I-2) in der ACN-Konzentration von etwa 18 bis 19%, bei der Fraktion II-1 in einer Peak-Fraktion (Fraktion II-2) in der ACN-Konzentration von etwa 27%, bei der Fraktion III-1 in einer Peak-Fraktion (Fraktion III-2) in der ACN-Konzentration von etwa 26 bis 27%, und bei der Fraktion IV in einer Peak-Fraktion (Fraktion IV-2) in der ACN-Konzentration von etwa 32 bis 33%.

5) Die Fraktionen I-2, III-2 und IV-2 der wie oben in (4) hergestellten aktiven Opioid-Fraktionen wurden einer Um kehrphasen-Chromatographie (RPC) an einer Octadecylsilan- Kolonne (Cosmosil 5 C₁₈-AR, Innendurchmesser 20 mm, Länge 250 mm, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und dann mit ei nem 10 mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄-Puffer (pH 7) (Lösung C) und ei ner 50%igen ACN-Lösung, die 10 mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄-Puffer (pH 7) enthielt (Lösung D), mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100% Lösung D eluiert. Jede Eluatfraktion wurde gesammelt und auf ihre Opioid-Aktivität untersucht. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden für die Fraktion I-2 in einer Peak-Fraktion (Fraktion I-3) in der ACN-Konzen tration von etwa 18%, für die Fraktion III-2 in einer Peak-Fraktion (Fraktion III-3) in der ACN-Konzentration von etwa 21% und für die Fraktion IV-2 in einer Peak- Fraktion (Fraktion IV-3) in der ACN-Konzentration von etwa 28%.

6) Die Fraktion IV-3 der im obigen Abschnitt (5) herge stellten aktiven Opioid-Fraktionen wurde erneut einer RPC unterworfen unter Verwendung der gleichen Kolonne wie im Abschnitt (5) und unter den gleichen Bedingungen wie im Abschnitt (4) eluiert. Jede Eluatfraktion wurde gesammelt und auf ihre Opioid-Aktivität untersucht. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden bei einer Peak-Fraktion (Frak tion IV-4) in der ACN-Konzentration von etwa 31%.

7) Die Fraktion IV-4 der wie oben unter (6) hergestellten aktiven Opioid-Fraktion wurde weiter einer Phenethyl-Ko lonne (Develosil PhA-T-5, Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 250 mm, Nomura Chemical Inc.) unterworfen und unter den gleichen Bedingungen wie im Abschnitt (5) eluiert. Die Be stimmung der Opioid-Aktivität bei jeder Eluatfraktion er gab, daß eine Opioid-Aktivität gefunden wurde bei einer Peak-Fraktion (Fraktion IV-5) in der ACN-Konzentration von etwa 29%.

8) Die im Abschnitt (4) erhaltene Fraktion II-2, die im Abschnitt (5) erhaltenen Fraktionen I-3 und III-3 und die im Abschnitt (7) erhaltene Fraktion IV-5 wurden abge trennt, eingeengt und getrocknet.

Die wie oben hergestellten getrockneten Materialien wurden analysiert zur Bestimmung der Aminosäuresequenz unter Ver wendung eines 477-A Protein-Sequenzers (Applied Biosystems Inc.). Aus dem getrockneten Material der Fraktion I-3 wur den L-Gly, L-Tyr, L-Tyr, L-Pro und L-Thr nacheinander aus dem N-Terminus freigesetzt, das dann als "Peptid B" iden tifiziert wurde mit der Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr-Pro- Thr, wobei alle Aminosäure-Bestandteile L-Aminosäuren wa ren.

Aus dem getrockneten Material der Fraktion II-2 wurden L- Gly, L-Tyr, L-Tyr und L-Pro nacheinander freigesetzt aus dem N-Terminus, das als Peptid A (SEQ ID NO: 1) identifi ziert wurde mit der Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr-Pro, wo bei alle Aminosäure-Bestandteile L-Aminosäuren waren.

Aus dem getrockneten Material der Fraktion III-3 wurden L- Tyr, L-Gly, L-Gly und L-Trp nacheinander freigesetzt aus dem N-Terminus, das als Peptid F (SEQ ID NO: 6) identifi ziert wurde mit der Aminosäuresequenz Tyr-Gly-Gly-Trp, wo bei alle Aminosäure-Bestandteile L-Aminosäuren waren.

Aus dem getrockneten Material der Fraktion IV-5 wurden L- Tyr, L-Gly, L-Gly, L-Trp und L-Leu nacheinander freige setzt aus dem N-Terminus, das als Peptid E (SEQ ID NO: 5) identifiziert wurde mit der Aminosäuresequenz Tyr-Gly-Gly- Trp-Leu, wobei alle Aminosäure-Bestandteile L-Aminosäuren waren.

Die Ausbeuten an den Peptiden A, B, E und F wurden be stimmt anhand der Molekulargewichte und des molekularen Extinktionskoeffizienten bei Abs. 280, die Werte von etwa 4×10^-2 (%), 4×10^-3 (%), 1×10^-5 (%) bzw. 3×10^-4 (%) ergaben. Die Rf-Werte der Peptide A, B, E und F wurden durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-Platten be stimmt unter Verwendung von Butanol, Essigsäure, Pyridin, Wasser (15/3/10/12) als Entwicklungslösungsmittel, wobei die Werte 0,58, 0,54, 0,77 bzw. 0,61 erhalten wurden.

Beispiel 2 Herstellung einer Peptidmischung, welche die Peptide A, B, E und F enthält, aus Weizengluten-Hydrolysaten

Die Hydrolyse von Weizengluten wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei jedoch als saure Protease die gleichen Einheiten einer Asparagin-Pro tease, die aus Aspergillus niger stammte (erhältlich von der Firma Yakult Co. unter dem Handelsnahmen "Protease YP- SS") anstelle von Pepsin verwendet wurde und die Wei zengluten-Lösung, die auf pH 3,0 eingestellt worden war, 15 h lang bei 37°C inkubiert wurde. Das resultierende Hy drolysat wurde einer Umkehrphasen-Chromatographie auf ähn liche Weise wie in Beispiel 1 (2) unterworfen. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden bei den Fraktionen I, II, III und IV, wie in der Fig. 1 dargestellt, der gleichen Stärke wie in Beispiel 1. In diesem Beispiel erhält man somit eine Peptidmischung mit einer Opioid-Aktivität, wel che die Peptide A, B, E und F (SEQ ID NOS: 1, 2, 5 & 6) enthielt.

Beispiel 3 Herstellung einer die Peptide A, B, E und F enthaltenden Peptidmischung aus Weizengluten-Hydrolysaten

Die Hydrolyse von Weizengluten wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei jedoch als neutrale Protease die gleichen Einheiten einer neutralen Protease, die aus Aspergillus oryzae stammte (erhältlich von der Firma Yamato Chemical Co. unter dem Handelsnamen "Protin FN") anstelle von Thermolysin verwendet wurde. Das resultierende Hydrolysat wurde einer Umkehrphasen-Chroma tographie auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 (2) unter worfen. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden bei den Fraktionen I, II, III und IV, wie in Fig. 1 dargestellt, mit der gleichen Stärke wie in Beispiel 1. Man erhielt so in diesem Beispiel eine Peptidmischung mit einer Opioid- Aktivität, welche die Peptide A, B, E und F (SEQ ID NOS: 1, 2, 5 & 6) enthielt.

Beispiel 4 Herstellung einer die Peptide A, B, E und F enthaltenden Peptidmischung aus Weizengluten-Hydrolysaten

Die Hydrolyse von Weizengluten wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei jedoch als neutrale Protease die gleichen Einheiten einer Cerin-Pro tease, die aus Bacillus stammte (erhältlich von der Firma Nagase Sangyo Co. unter dem Handelsnamen "Bioprase SP-4") anstelle von Thermolysin verwendet wurden. Das resultie rende Hydrolysat wurde einer Umkehrphasen-Chromatographie auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 (2) unterworfen. Eine Opioid-Aktivität wurde gefunden bei den Fraktionen I, II, III und IV, wie in Fig. 1 dargestellt, mit der gleichen Stärke wie in Beispiel 1. In diesem Beispiel erhielt man somit eine Peptid-Mischung mit Opioid-Aktivität, welche die Peptide A, B, E und F (SEQ ID NOS:1, 2, 5 & 6) enthielt.

Beispiel 5 Herstellung des Peptids D aus Weizengluten-Hydrolysaten

1) 5 g Weizengluten, dispergiert und gelöst in 100 ml ei ner 0,02 N HCl, wurden 20 min lang bei 3500 G zentri fugiert, um ein unlösliches Material zu entfernen, und der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 N HCl auf 2,0 eingestellt. Zu dieser Weizengluten-Lösung wurden 5000 Einheiten Pepsin (erhältlich von der Firma Sigma Chemical Co., USA) zugege ben und die Lösung wurde 15 h lang bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde der pH-Wert der Lösung mit einer wäßrigen 1 N NaOH-Lösung auf 7,0 eingestellt, es wurden jeweils 5000 Einheiten von Trypsin (erhältlich von der Firma Sigma Chemical Co.) und Chymotrypsin (erhältlich von der Firma Sigma Chemical Co.) zugegeben und die Mi schung wurde 4 h lang bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung 20 min lang auf 90°C er hitzt, um die Enzyme zu desaktivieren. Das Hydrolysat wurde 20 min lang bei 3500 G zentrifugiert, um ein unlös liches Material zu entfernen, und die resultierende über stehende Flüssigkeit wurde lyophilisiert, wobei man etwa 3,0 g eines Weizengluten-Hydrolysats erhielt.

2) Das in dem Abschnitt (1) hergestellte Weizengluten- Hydrolysat wurde einer Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) unterworfen unter Verwendung einer Octadecylsilan-Kolonne (Cosmosil 5 C₁₈-AR; Innendurchmesser 20 mm, Länge 250 mm, Nacalai Tesque Inc.) und dann mit einer wäßrigen 0,05%igen Trifluoressigsäure (TFA)-Lösung (Lösung A) und ei ner Acetonitril (ACN)-Lösung, die 0,05% TFA enthielt (Lösung B), bei einer Strömungsrate von 10 ml/min mit ei nem linearen Gradienten von 0 bis 40% der Lösung B über einen Zeitraum von 40 min eluiert. Das Chromatogramm bei einer Wellenlänge von 230 nm bei dieser Zeit ist in Fig. 2 dargestellt.

Bei den in der Fig. 2 dargestellten Fraktionen wurde die Opioid-Aktivität bestimmt. Eine Opioid-Aktivität wurde ge funden bei der Fraktion V, die zwischen etwa 31 und 32% in der ACN-Konzentration eluiert wurde.

3) Das gleiche Verfahren wie im Abschnitt (2) wurde wie derholt unter Verwendung von 2000 mg des im Abschnitt (1) hergestellten Weizengluten-Hydrolysats, wobei man eine ak tive Opioid-Fraktion der Fraktion V erhielt. Diese Frak tion wurde einer RPC an einer Phenyl-Kolonne (Cosmosil 5 Ph, Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 250 mm, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und mit den Lösungen A und B bei einer Strömungsrate von 1 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 40% Lösung B über einen Zeitraum von 40 min eluiert.

Bei jeder der eluierten Fraktionen wurde die Opioid-Akti vität bestimmt. Eine Opioid-Aktivität wurde gefunden bei der Fraktion V-1, die in der ACN-Konzentration von etwa 33% eluiert wurde.

4) Die aktive Opioid-Fraktion in der Fraktion V-1, wie sie im Abschnitt (3) hergestellt worden war, wurde einer RPC an einer Cyanopropyl-Kolonne (Cosmosil 5 CN-R, Innendurch messer 4,6 mm, Länge 250 mm, Nacalai-Tesque Inc.) unter worfen und unter den gleichen Bedingungen wie im Abschnitt (3) eluiert.

Jede der Eluat-Fraktionen wurde gesammelt und auf ihre Opioid-Aktivität untersucht. Es wurde eine Opioid-Aktivi tät gefunden in einer Peak-Fraktion (Fraktion V-2) in der ACN-Konzentration von etwa 27 bis 28%.

5) Die wie im obigen Abschnitt (4) hergestellte aktive Opioid-Fraktion der Fraktion V-2 wurde einer Umkehrphasen- Chromatographie (RPC) an einer Octadecylsilan-(ODS-)Ko lonne (Cosmosil 5 C₁₈-AR; Innendurchmesser 4,6 mm, Länge 150 mm, Nacalai Tesque Inc.) unterworfen und mit einem 10 mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄-Puffer (pH 7) (Lösung C) und einer 50%igen ACN-Lösung, die 10 mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄-Puffer (pH 7) enthielt (Lösung D), mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100% Lösung D eluiert. Jede eluierte Fraktion wurde gesammelt und auf ihre Opioid-Aktivität untersucht. Es wurde eine Opioid-Aktivität gefunden in einer hohen Absorp tions-Peak-Fraktion (Fraktion V-3) in der ACN-Konzentra tion von etwa 24%.

6) Die im Abschnitt (5) hergestellte Fraktion V-3 wurde abgetrennt, eingeengt und getrocknet.

Das oben hergestellte getrocknete Material wurde auf seine Aminosäuresequenz untersucht unter Verwendung des gleichen Modell 477-A-Protein-Sequenzers, wie er in Beispiel 1 ver wendet worden war. Es wurde gefunden, daß L-Tyr, L-Pro, L- Ile, L-Ser und L-Leu aus dem N-Terminus nacheinander frei gesetzt wurden, der als Peptid D (SEQ ID NO: 4) mit der Aminosäuresequenz Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu identifiziert wurde, wobei alle sie aufbauenden Aminosäuren L-Aminosäuren wa ren.

Die Ausbeute an Peptid D aus Weizengluten wurde aus den Molekulargewichten und dem Molekularextinktionskoeffizien ten bei Abs. 280 bestimmt, wobei ein Wert von etwa 4×10^-4 (%) erhalten wurde. Der Rf-Wert des Peptids D wurde durch Dünnschichtchromatographie an Silicagel-Platten auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 bestimmt, wobei ein Wert von 0,73 erhalten wurde.

Beispiel 6 Herstellung der Peptide A-F durch chemische Synthese 1) Synthese des Peptids A

Eine Mischung aus 0,75 g eines handelsüblichen Boc(but oxycarbonyl)-Pro-Harzes (Substitution 0,4 meq/g) und 20 ml Methylenchlorid, enthaltend 45% Trifluoressigsäure und 2,5% Anisol, wurde 25 min lang in dem Reaktionsgefäß ei nes Sam 2-Peptid-Synthesizers (hergestellt von der Firma Biosearch Inc.) bei Raumtemperatur reagieren gelassen, um eine Boc-Gruppe zu entfernen.

Das Pro-Harz mit der entfernten Boc-Gruppe wurde dann mit Methylenchlorid gewaschen, mit Methylenchlorid, das 10% Diisopropylethylamin enthielt, neutralisiert und mit Me thylenchlorid weiter gewaschen.

Dieses Harz wurde mit 5 ml einer Lösung von 0,4 M Boc- Tyr(Cl₂-Bzl) in Dimethylformamid und 5 ml einer Lösung von 0,4 M Diisopropylcarbodiimid in Methylenchlorid gemischt und die Mischung wurde in das Reaktionsgefäß eingeführt und 2 h lang unter Rühren bei Raumtemperatur reagieren ge lassen.

Das resultierende Harz wurde nacheinander mit Dimethylfor mamid, Methylenchlorid, Methylenchlorid, das 10% Diiso propylethylamin enthielt, Methylenchlorid und Methylen chlorid/Dimethylformamid gewaschen, wobei man ein Boc- Tyr(Cl₂-Bzl)-Pro-Harz erhielt.

Die wiederholte Entfernung einer Boc-Gruppe und das Ankup peln einer Boc-Aminosäure auf die vorstehend beschriebene Weise ergab ein Produkt, das aus Boc-Gly-Tyr(Cl₂-Bzl)- Tyr(Cl₂-Bzl)-Harz bestand.

Dieses Harz wurde in 20 ml Fluorwasserstoff, der 10% An isol enthielt, eingeführt und 2 h lang bei 0°C gerührt, um aus dem Harz ein Peptid freizusetzen.

Anschließend wurde der Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit 30%iger Essigsäure extrahiert und lyophilisiert, wobei man 150 mg eines rohes Peptids erhielt. Das rohe Peptid wurde durch Umkehrphasen-Chromatographie (RPC) unter Verwendung einer Octadecylsilan-(ODS-)Kolonne (Cosmosil 5 C₁₈-AR, Nacalai Tesque Inc.) gereinigt, wobei man 40 mg eines Endprodukts mit der Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) Gly : Tyr : Tyr : Pro = 1 : 1 : 1 : 1 erhielt. Durch Analyse mit dem gleichen Protein-Sequenzer, wie er in Beispiel 1 verwendet worden war, wurde das synthetisierte Peptid als Peptid A (SEQ ID NO: 1) mit der Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr-Pro identifiziert. Der durch Dünnschichtchromatographie (TLC) ermittelte Rf-Wert betrug, wie gefunden wurde, 0,58 wie im Produkt des Beispiels 1.

2) Synthese des Peptids B

30 mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 1 g eines handelsüblichen Boc(butoxycarbonyl)-Thr(Bzl)-Harzes (Sub stitution 0,3 meq/g) auf die gleiche Weise wie für das Peptid A angegeben. Die Aminosäure-Zusammensetzung (Mol verhältnis) des Produkts war Gly : Tyr : Tyr : Pro : Thr = 1 : 1 : 1 : 1 : 1. Durch Analyse mit dem in Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthetisierte Peptid als Pep tid B (SEQ ID NO: 2) mit der Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr- Pro-Thr identifiziert. Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug 0,54 wie im Produkt des Beispiels 1.

3) Synthese des Peptids C

30 mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 0,77 g eines handelsüblichen Boc-Ser(Bzl)-Harzes (Substitution 0,39 meq/g) auf die gleiche Weise wie für das Peptid A an gegeben. Die Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) war die folgende Gly : Tyr : Tyr : Pro : Thr : Ser = 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1. Durch Analyse mit dem in Beispiel 1 verwendeten Protein- Sequenzer wurde das synthetisierte Peptid als Peptid C (SEQ ID NO: 3) mit der Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr-Pro- Thr-Ser identifiziert. Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug 0,53.

4) Synthese des Peptids E

40 mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 0,6 g ei nes handelsüblichen Boc-Leu-Harzes (Substitution 0,5 meq/g) auf die gleiche Weise wie für das Peptid A be schrieben. Die Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) betrug Tyr : Gly : Gly : Tyr : Leu = 1 : 1 : 1 : 1 : 1. Durch Analyse mit dem in Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthetisierte Peptid als Peptid E (SEQ ID NO: 5) mit der Aminosäuresequenz Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu identifiziert. Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug, wie ge funden wurde, 0,77 wie beim Produkt des Beispiels 2.

5) Synthese des Peptids F

30 mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 1 g eines handelsüblichen Boc-Trp-Harzes (Substitution 0,3 meq/g) auf die gleiche Weise wie für das Peptid A angegeben. Die Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) des Peptids E betrug Tyr : Gly : Gly : Trp = 1 : 1 : 1 : 1. Durch Analyse mit dem in Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthe tisierte Peptid als Peptid F (SEQ ID NO: 6) mit der Amino säuresequenz Tyr-Gly-Gly-Trp identifiziert. Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, betrug 0,61 wie beim Produkt des Beispiels 2.

6) Synthese des Peptids D

40 mg eines Endprodukts wurden synthetisiert aus 0,6 g ei nes handelsüblichen Boc-Leu-Harzes (Substitution 0,5 meq/g) auf die gleiche Weise wie für das Peptid A angege ben. Die Aminosäure-Zusammensetzung (Molverhältnis) war die folgende Tyr : Pro : Ile : Ser : Leu = 1 : 1 : 1 : 1 : 1. Durch Ana lyse mit dem in Beispiel 1 verwendeten Protein-Sequenzer wurde das synthetisierte Peptid als Petid D (SEQ ID NO: 4) mit der Aminosäuresequenz Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu identifi ziert. Der Rf-Wert des Produkts, bestimmt durch TLC, be trug 0,73 wie beim Produkt des Beispiels 3.

Assay zur Bestimmung der Opioid-Aktivität

Zwei aus männlichen ICR-Mäusen mit einem Gewicht von 30-35 g entnommene Maus-Vas deferens (Samenleiter) wurden mit einem isotonischen Wandler (TB 612-T der Firma Nippon Ko den Kogyo Inc., Japan) unter einer Spannung von 0,4 g ver bunden. Jedes der Maus-Vas deferens wurde in ein 2 ml-Ma gnus-Reagensglas, das bei 36°C gehalten wurde, einge taucht, in das eine Krebs-Lösung eingefüllt wurde, die 118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 2,54 mM CaCl₂, 25 mM NaHCO₃, 1,19 mM KH₂PO₄ und 11 mM Glucose enthielt, und aus einer Bombe wurde eine O₂-Behandlung (Belüftung) (95% O₂, 5% CO₂) durchgeführt. Nach etwa 2stündiger Stabilisierung auf diese Weise wurde eine elektrische Stimulierung (30 V, 1 msec) an das Maus-Vas deferens angelegt zur Erzielung ei ner elektrischen Kontraktion. Nachdem die elektrische Kon traktion stabilisiert war, wurden 50 µl eines Inhibitors (enthaltend einen Aminopeptidase-Inhibitor und dgl.) zum Inhalt des Magnus-Reagensröhrchens zugegeben. Dann wurde jede durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie aus Wei zengluten-Hydrolysaten abgetrennte Fraktion in das Röhr chen gegeben und die Änderung der elektrischen Kontraktion des Maus-Vas deferens wurde aufgezeichnet. Die Opioid-Ak tivität wurde beurteilt anhand der Inhibierung der elek trischen Kontraktion nach der Zugabe jeder Fraktion und die Umkehrung der Inhibierung wurde beurteilt anhand der Zugabe von 20 µl 10^-4 M Naloxon. Bei jeder Fraktion wurde die Konzentration (IC₅₀) bestimmt, welche die elektrisch stimulierte Kontraktion des Maus-Vas deferens um 50% in hibierte.

Die IC₅₀-Werte der Peptide A bis D sind in der folgenden Tabelle I angegeben.

Peptide
IC₅₀ (µM)
Peptid A
70
Peptid B	40
Peptid C	75
Peptid D	15

Sequenz-Liste

1) Information für SEQ ID NO: 1
- i) Sequenzcharakteristiken:
  - A) Länge: 4 Aminosäuren
  - B) Typ: Aminosäure
  - D) Topologie: linear
- ii) Molekül-Typ: Peptid
- iii) Sequenz-Beschreibung:
2) Information für SEQ ID NO: 2:
- i) Sequenzcharakteristiken:
  - A) Länge: 5 Aminosäuren
  - B) Typ: Aminosäure
  - D) Topologie: linear
- ii) Molekül-Typ: Peptid
- iii) Sequenz-Beschreibung:
3) Information für SEQ ID NO: 3:
- i) Sequenzcharakteristiken:
  - A) Länge: 6 Aminosäuren
  - B) Typ: Aminosäure
  - D) Topologie: linear
- ii) Molekül-Typ: Peptid
- iii) Sequenz-Beschreibung:
4) Information für SEQ ID NO: 4:
- i) Sequenzcharakteristiken:
  - A) Länge: 5 Aminosäuren
  - B) Typ: Aminosäure
  - D) Topologie: linear
- ii) Molekül-Typ: Peptid
- iii) Sequenz-Beschreibung:
- SEQ ID NO: 4
- Tyr Pro Ile Ser Leu
5) Information für SEQ ID NO: 5:
- i) Sequenzcharakteristiken:
  - A) Länge: 5 Aminosäuren
  - B) Typ: Aminosäure
  - D) Topologie: linear
- ii) Molekül-Typ: Peptid
- iii) Sequenz-Beschreibung:
6) Information für SEQ ID NO: 6:
- i) Sequenzcharakteristiken:
  - A) Länge: 4 Aminosäuren
  - B) Typ: Aminosäure
  - D) Topologie: linear
- ii) Molekül-Typ: Peptid
- iii) Sequenz-Beschreibung:

Claims

1. Opioid-Peptid, das jeweils die folgende Aminosäurese quenz aufweist: Gly-Tyr-Tyr-Pro (SEQ ID NO: 1),Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr (SEQ ID NO: 2),Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr-Ser (SEQ ID NO: 3) oderTyr-Pro-Ile-Ser-Leu (SEQ ID NO: 4)

2. Opioid-Peptid oder Mischung davon, das (die) gewonnen (abgetrennt) wird aus einem Hydrolysat eines Weizenpro teins mit einer sauren Protease und ferner mit einer neu tralen oder alkalischen Protease.

3. Opioid-Peptid nach Anspruch 2, das die Aminosäurese quenz Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu (SEQ ID NO: 5) oder Tyr-Gly-Gly- Trp (SEQ ID NO: 6) aufweist.

4. Verfahren zur Herstellung eines Opioid-Peptids, das umfaßt die Hydrolyse eines Weizenproteins mit einer sauren Protease, sowie ferner die Hydrolyse eines Hydrolysats mit einer neutralen oder alkalischen Protease und die Abtren nung (Gewinnung) des gewünschten Peptids mit einer Opioid- Aktivität aus dem resultierenden Hydrolysat.

5. Verfahren nach Anspruch 4, das außerdem umfaßt die Abtrennung und Reinigung des Hydrolysats des Weizenpro teins.

6. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die neutrale Pro tease aus Bacillus oder Aspergillus stammt, die alkalische Protease aus Bacillus stammt und das Opioid-Peptid die Aminosäuresequenz Gly-Tyr-Tyr-Pro (SEQ ID NO: 1), Gly-Tyr- Tyr-Pro-Thr (SEQ ID NO: 2), Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu (SEQ ID NO: 5) oder Tyr-Gly-Gly-Trp (SEQ ID NO: 6) aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die neutrale Pro tease Trypsin-Chymotrypsin ist und das Opioid-Peptid die Aminosäuresequenz Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu (SEQ ID NO: 4) auf weist.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Opioid-Pep tid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder ein physiolo gisch akzeptables Salz desselben in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.